방법 논문

대뇌 혈관의 해부학적 구조를 손상시키지 않고 중간 대뇌 동맥 폐색/재관류의 쥐 모델

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DOI:

10.3791/66635

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2024년 5월 17일

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1Department of Neurosurgery, The Third Hospital of Hebei Medical University, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation, Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

이 논문에서

요약

현재 프로토콜은 손상을 입히지 않고 뇌 혈관의 해부학적 구조를 보존하는 중대뇌 동맥 폐색/재관류의 쥐 모델을 설명합니다.

초록

허혈성 뇌졸중은 전 세계 성인의 장기 장애 및 사망의 주요 원인입니다. 허혈성 뇌졸중의 동물 모델은 허혈성 뇌졸중의 병리학적 메커니즘에 대한 이해와 잠재적 치료법의 개발에 크게 기여했습니다. 현재 뇌허혈의 동물 모델을 유도하기 위해 필라멘트(혈관내 봉합사) 기술과 관련된 두 가지 일반적인 방법이 있습니다. 그러나 이러한 방법에는 뇌로의 혈액 관류 감소, 외부 경동맥 시스템 손상, 음식 및/또는 수분 섭취 장애, 얼굴의 감각 기능 장애와 같은 고유한 한계가 있습니다. 이 기사에서는 대뇌 혈관 해부학적 구조를 손상시키지 않고 쥐 허혈성 뇌졸중 모델을 유도하는 새로운 방법을 소개합니다. 이 연구에서는 Sprague-Dawley 쥐의 총경동맥(CCA)을 노출시키고 절개를 했습니다. 그런 다음 절개 부위를 통해 내부 경동맥에 필라멘트를 삽입하여 중대뇌동맥을 폐색했습니다. 유도 허혈 1.5시간 후, 내부 경동맥과 CCA 모두에서 폐색 필라멘트를 완전히 제거했습니다. CCA의 절개 부위는 이후 현미경으로 11-0 미세수술 봉합사를 사용하여 봉합했습니다(배율 4배). CCA를 복구하기 위한 미세수술 기법을 활용함으로써 본 연구는 뇌혈관의 해부학적 무결성을 보존하면서 쥐에서 허혈성 뇌졸중 모델을 유도하는 독특한 방법을 성공적으로 개발했습니다.

서론

전 세계 성인의 주요 사망 원인이자 장기 신경 기능 장애인 뇌졸중은 다양한 유형을 포함하며, 허혈성 뇌졸중이 약 81.9%를 차지하고 뇌출혈과 지주막하 출혈이 각각 14.9%와 3.1%를 차지합니다1. 허혈성 뇌졸중은 종종 죽상동맥경화증 또는 중대뇌동맥(MCA)의 폐색으로 인해 발생하며, 국소 뇌혈류 감소와 그에 따른 뇌 손상을 초래합니다. 허혈성 세포에 대한 영양소 공급의 감소는 에너지 고갈을 유발하여 막 무결성 손실, 세포 팽창 및 궁극적인 용해를 유발합니다. 또한 세포 내 칼슘 증가, 흥분성 아미노산 방출, 활성산소 생성 증가 및 염증성 세포 활성화와 같은 요인이 뇌졸중 후 뇌 조직 손상에 기여합니다2.

허혈성 뇌졸중의 치료 목표는 다각적입니다: 지속적인 신경학적 손상을 줄이고 사망률 및 장기 장애를 낮추며, 부동성 및 신경 기능 장애로 인한 합병증을 예방하고, 뇌졸중 재발 위험을 최소화합니다. 허혈성 뇌졸중 병태생리학의 복잡성을 감안할 때, 허혈성 뇌졸중을 표적으로 하는 치료법의 연구 및 개발에는 강력한 뇌졸중 모델이 필수적입니다.

현재 중대뇌동맥 폐색(MCAo)은 허혈성 뇌졸중의 흔한 동물 모델입니다3. MCAo는 일반적으로 중대뇌동맥(MCA)의 원점에 도달할 때까지 경추 혈관을 통해 실리콘 팁 또는 화염 무딘 모노필라멘트를 삽입하여 수행됩니다. 1986년, Koizumi와 동료들은 총경동맥(CCA)의 절개를 통해 실리콘 팁 모노필라멘트를 삽입하여 MCA 입구에 도달하여 혈류를 차단할 수 있도록 하는 기술을 개발했습니다4. 1989년, Longa의 그룹은 외부 경동맥(ECA)의 절개를 통해 모노필라멘트를 도입하는 것과 관련된 또 다른 MCAo 방법을 보고했습니다. 그런 다음 모노필라멘트는 MCA5의 시작점에 도달하기 전에 내부 경동맥(ICA)과 ECA의 분기점을 횡단합니다.

MCAo를 유도하는 두 가지 기존 방법의 한계는 분명합니다. Koizumi의 방법은 동측 CCA의 영구적인 차단을 필요로 하며, 재관류가 Willis4의 원에만 전적으로 의존하기 때문에 MCA 관류를 감소시킵니다. 반대로, Longa의 방법은 ECA를 절단하여 ECA 시스템을 손상시키고 그에 따라 안면 근육 기능을 손상시키는 것입니다5. 이러한 손상은 음식과 수분 섭취에 영향을 미칠 수 있을 뿐만 아니라 얼굴의 감각 기능 장애를 일으켜 재활 및 허혈성 뇌졸중 후 신경 기능 평가에 영향을 미칠 수 있습니다6.

현재 프로토콜은 뇌혈관의 해부학적 구조를 손상시키지 않고 허혈성 뇌졸중 모델을 유도하는 새로운 방법을 개발하여 이러한 한계를 해결하려고 합니다. 이 새로운 접근 방식은 미세 수술 기술을 활용하여 CCA를 복구함으로써 이전 방법과 관련된 단점을 피할

수 있습니다.

프로토콜

실험 절차는 옌타이 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호: YTDX20230410)의 승인을 받았으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 지침을 준수했습니다. 이 연구에는 300-350g 사이의 수컷 Sprague-Dawley 쥐가 사용되었습니다. 사용된 동물, 시약 및 장비의 전체 목록은 Table of Materials에 나와 있습니다.

1. 동물 준비

  1. 12시간의 명암 주기, 제어된 온도 및 습도를 유지하는 환경에 동물을 수용합니다. 음식과 물에 제한 없이 접근할 수 있도록 합니다.

2. 마취

  1. 케타민(80mg/kg)과 자일라진(20mg/kg)을 함유한 혼합물로 복강내 주사를 통해 쥐를 마취합니다.
    알림: 쥐의 머리와 몸을 아래쪽으로 기울이십시오. 주사 부위는 동물의 복부 오른쪽 아래 사분면에 있습니다. 주입하기 전에 플런저를 뒤로 당기십시오. 평균 주입량은 0.4mL입니다.
  2. 뒷발의 금단 반사와 깜박임 반사를 평가하여 마취 유도를 확인합니다. 적절한 마취 깊이가 이루어지지 않으면 수술 중에 이소플루란을 보충하십시오.

3. 허혈성 모델링 절차

  1. 오토클레이브를 사용하여 수술 도구를 살균합니다. 수술대 및 관련 장비를 70% 에탄올로 소독하십시오.
  2. 예상되는 절개 부위 주변의 털을 면도하여 수술 부위를 준비합니다. 수술 부위의 피부를 베타딘과 70% 에탄올로 3회 소독합니다.
  3. 약 1.5cm 길이의 복부 쪽을 정중선으로 절개하고 표재성 근막을 엽니다.
  4. 앞에서 설명한 방법에 따라 외부 경동맥(ECA), 내부 경동맥(ICA) 및 총경동맥(CCA)을 노출시키기 위해 날카롭고 뭉툭한 절개를 수행합니다7.
  5. CCA 주위에 3개의 4-0 실크 봉합사를 배치하고 ICA 분기점 근처의 ECA를 통해 다른 실크 봉합사를 배치합니다. 근위 CCA에 분리 가능한 슬립 매듭을 묶습니다. 지혈제를 사용하여 원위 CCA의 봉합사를 조여 혈류를 차단합니다. 용기가 막히지 않도록 봉합하는 동안 CCA 주위에 다른 슬립 매듭을 느슨하게 묶습니다.
    알림: 슬립 매듭이 너무 조이지 않고 혈관 봉합 중에 풀어야 하므로 혈류를 차단하기에 충분한지 확인하십시오.
  6. 가위를 사용하여 CCA의 근위 실크 봉합사와 중간 봉합사 사이를 0.5mm 절개합니다.
    알림: 절개 부위가 필라멘트(실리콘 코팅 팁)가 CCA에 들어갈 수 있도록 합니다.
  7. 3cm 길이의 4-0 필라멘트(실리콘 코팅 팁)를 CCA에 삽입합니다. CCA 주위의 실크 봉합사를 조여 내강 내 필라멘트를 고정하고 출혈을 방지합니다. 그런 다음 원위 CCA에서 봉합사를 제거합니다.
  8. 필라멘트를 MCA의 내강에 계속 삽입하고 필라멘트가 ECA에 들어가지 않도록 ECA 주변의 봉합사를 제어합니다. 삽입 길이는 일반적으로 18mm에서 20mm입니다.
  9. 타이머를 시작하고 폐색이 시작되는 시간을 기록합니다. 절개 부위에 3-0 실크 봉합사를 봉합하고 조심스럽게 회복 케이지에 동물을 넣습니다. 0.5mL의 생리식염수를 복강내로 투여합니다.

4. CCA의 미세 수술 봉합

  1. 허혈 후 1.5시간 후에 쥐를 재마취합니다. 절개 부위를 70% 에탄올로 3회 소독하고 절개 부위를 다시 엽니다.
  2. CCA 절개 부위 근처에서 흰색 팁이 명확하게 보일 때까지 폐색 필라멘트를 부드럽게 빼냅니다. 마이크로 cl을 놓습니다.amp CCA 분기 근처에 고정된 내강 내 봉합사 매듭에 수평으로 가깝습니다.
    알림: 피하십시오amp실리콘 분리와 그에 따른 혈전증을 방지하기 위해 흰색 필라멘트 팁을 ping하십시오.
  3. 고정된 내강내 봉합사 매듭을 풀고 필라멘트를 완전히 제거합니다.
  4. 근위 CCA 매듭의 심장 끝 쪽 근처에 다른 마이크로 클램프를 놓습니다. 그런 다음 근위 CCA.
    주위의 봉합사 매듭을 제거합니다. 참고: 클램프의 적절한 배치는 미세혈관 봉합을 용이하게 하기 위해 이후 단계에서 고정 혈관을 들어 올리는 데 중요합니다. cl을 놓습니다.amp미끄러짐을 방지하기 위해 주변 근육에 수평
    5. 으로 고정합니다.
  5. 절개 부위를 생리식염수로 헹구고 멸균 면봉으로 해당 부위를 건조시켜 혈액을 제거하고 깨끗한 수술 부위를 만듭니다.
  6. 현미경(4배 확대)으로 11-0 미세수술 봉합사를 단절된 패턴으로 사용하여 CCA 절개 부위를 봉합하며, 일반적으로 절개 크기에 따라 두 바늘을 꿰매야 합니다.
  7. 봉합 후 CCA의 양쪽 끝에서 마이크로 클램프를 제거하여 혈류를 회복합니다.
  8. 멸균 면봉으로 CCA 봉합 부위를 30초 동안 압박합니다. 출혈이 발생하지 않는지 확인하기 위해 2분 동안 CCA를 관찰합니다. 쥐의 목 절개 부위를 봉합하고 마취 회복을 위해 동물을 35°C 케어 박스에 넣은 후 케이지로 되돌립니다.
    참고: 수술 후 진통제를 위해 2mg/kg의 용량으로 meloxicam을 복강내로 투여합니다.

5. 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)로 염색

  1. 허혈-재관류 3일 후, 4%의 이소플루란과 자궁경부 탈구로 깊은 마취 하에 동물을 안락사시킵니다.
  2. 뇌를 제거하고 메스 날을 사용하여 2mm 두께의 관상 절편으로 자릅니다8.
  3. 37°C에서 20분 동안 2% TTC로 뇌 절편을 배양합니다.
  4. 10% 포르말린으로 뇌 부위를 두 번 헹군 다음 10% 포르말린으로 실온에서 30분 동안 고정합니다.
  5. 연속된 슬라이스의 디지털 사진을 캡처하고 Image J 소프트웨어를 사용하여 경색 영역을 정량적으로 측정합니다.

6. 신경 기능 검사

참고: 신경학적 기능은 이전 보고서9에 따라 Garcia 테스트를 사용하여 평가되었습니다.

  1. 자발적인 활동, 네 팔다리 모두의 움직임의 대칭, 앞발 뻗기, 오르기, 신체 고유 감각 및 vibrissae 터치에 대한 반응을 평가합니다. Garcia 테스트 기준에 따라 점수를 할당하며 최대 점수는 정상적인 신경 기능을 나타냅니다.

7. 통계 분석

  1. GraphPad Prism을 활용하여 스튜던트의 t-test를 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 데이터를 표준 편차± 평균으로 표현합니다. P가 0.05인 경우 통계적으로 유의한 평균 간의 차이를 고려합니다<.

결과

미세봉합 과정
흰색 필라멘트 끝부분이 보일 때까지 총경동맥(CCA) 절개 부위 근처에서 필라멘트를 끌어냈습니다 (그림 1A). 그런 다음 CCA에 미세 클램프를 배치하였습니다 (그림 1B). 4배율 현미경 하에서 미세수술용 봉합사를 사용하여 CCA 절개 부위를 단속 봉합하였습니다 (그림 1C). 이후 CCA에서 미세 클램프를 제거하여 해부학적 구조와 혈류를 복원하였습니다 (그림 1D).

TTC 염색 및 사망률
총 12마리의 성체 수컷 쥐를 sham군과 model군 두 그룹으로 무작위 배정하였다(각 그룹당 n = 6). 불행히도 sham군의 동물 한 마리가 마취제 과다 투여로 사망하였고, model군의 동물 한 마리가 24시간 이내에 사망하였다. 뇌허혈로 인한 경색은 선조체와 피질 모두에서 관찰되었다(그림 2A). 허혈성 뇌졸중 발생 3일 후, 총 경색 비율은 뇌반구의 29.3% ± 1.6%로 측정되었으며(그림 2B), 수술 후 사망률은 16.7%였다.

신경학적 기능 평가
허혈성 뇌졸중 유도 후 1일 및 3일 차에, 모델군의 점수는 샴(sham)군에 비해 유의하게 감소하였습니다(각 17.8 ± 0.4 vs. 8.2 ± 1.5, 그림 3A; 17.6 ± 0.9 vs. 9.6 ± 1.3, 그림 3B).

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그림 1미세봉합 과정. (A) 필라멘트를 총경동맥(CCA)에서 제거합니다. 파란색 화살표는 미세혈관 클램프를 나타냅니다. (B) 검은색 화살표는 필라멘트가 완전히 제거된 후의 절개 부위를 나타냅니다. 파란색 화살표는 미세혈관 클램프를 나타냅니다. (C현미경 하에서(4배 확대), 1-0 미세수술용 봉합사를 사용하여 CCA 절개 부위를 단속 봉합하였습니다. 파란색 화살표는 미세혈관 클램프를 나타냅니다. 검은색 화살표는 봉합된 절개 부위를 나타냅니다.D마이크로 클램프를 제거하고 총경동맥(CCA)의 혈류를 복구합니다. 검은색 화살표는 총경동맥의 봉합 부위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2허혈 모델의 TTC 염색 결과. (A) 뇌허혈 후 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)로 염색한 뇌 절편의 대표 이미지. 살아있는 조직에서 TTC는 탈수소효소에 의해 효소적으로 환원되어 붉은색을 띠는 1,3,5-트리페닐포르마잔이 된다. 괴사 부위의 조직은 이러한 효소 활성이 없기 때문에 흰색으로 남아 있다. (B) 뇌허혈 3일 후 쥐의 허혈 부위 백분율. Sham군과 비교하여, **P < 0.01. 데이터는 평균값으로 표시되었습니다. ± 표준 편차. 각 그룹에는 5마리의 쥐가 포함되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3신경학적 기능 평가. (A) 뇌허혈 1일 후의 Garcia 점수. (B뇌허혈 3일 후의 Garcia 점수. Sham 그룹과 비교했을 때, **P < 0.01. 데이터는 평균으로 표시되었습니다. ± 표준 편차. 각 그룹에는 5마리의 쥐가 포함되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

토론

MCAo는 뇌졸중 동물 모델을 만드는 데 널리 사용되는 방법으로, 허혈 후 혈류를 회복시켜 환자에서 관찰되는 뇌졸중 과정을 효과적으로 복제합니다 10,11,12. 우리 연구실은 ECA에 손상을 입히지 않고 CCA에서 재관류를 가능하게 하는 허혈성 뇌졸중 모델을 개발했습니다. 허혈 유도 후 CCA의 미세외과적 수리가 수행됩니다. CCA 혈류의 직접적인 측정은 수행되지 않았지만 실험자들은 재관류를 진행하기 전에 CCA에서 혈관 맥동을 관찰했습니다. 이 기술은 환자의 뇌졸중 과정과 매우 유사하면서 목 혈관의 해부학적 무결성을 보존합니다. 또한, 신경학적 기능과 뇌 허혈 부위의 평가를 통해 이 외과적 접근법에 의해 유발된 뇌졸중의 타당성이 확인되었습니다.

앞서 설명한 허혈성 뇌졸중 모델은 다양한 요인의 영향을 받을 수 있습니다. Koizumi et al.4의 방법에서 혈액 재관류는 CCA의 결찰로 인해 Willis의 원에 크게 의존합니다. 그러나 뇌 맥관 구조의 변화는 최종 뇌경색 부피에 영향을 미칠 수 있으며, 낮은 혈액 관류로 인해 뇌졸중 모델의 사망률을 잠재적으로 증가시킬 수 있습니다13,14. 또한 ECA의 허혈은 안면 근육과 신경의 기능을 손상시켜 다양한 신경학적 기능의 평가에 영향을 미칠 수 있습니다15,16.

현재 방법은 세 가지 주요 단계를 통해 이러한 문제를 해결합니다: (1) CCA 절개를 가능한 한 작게 유지하고 필라멘트 삽입을 할 수 있을 만큼 충분히 크게 유지하여 혈관 봉합과 관련된 시간과 손상을 줄입니다. (2) 실리콘 박리 및 혈전증을 유발할 수 있는 흰색 필라멘트 팁을 고정하는 것을 방지하기 위해 원위 CCA를 클램핑할 때 CCA 분기에 최대한 가깝게 미세혈관 클램프를 배치합니다. (3) 혈관 복구 후 정중선 경부 절개를 봉합하기 전에 맥동 재개 및 실질적인 출혈 부족에 대한 CCA를 관찰합니다.

현재 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 봉합 부위에 색전이 형성될 가능성이 있으며, 이로 인해 색전이 분리될 경우 추가 뇌 허혈이 발생할 수 있습니다. 이러한 위험은 향후 실험에서 신중하게 고려되고 관리되어야 합니다. 둘째, 이 연구는 쥐의 체중을 모니터링하지 않았기 때문에 이 방법이 음식 섭취에 영향을 미치는지 판단하기 어렵습니다. 음식 섭취량은 이 방법의 장점을 직접적으로 나타내는 지표이며, 그 평가는 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 마지막으로, 현재의 방법은 미세수술 수술에 대한 기술적 숙련도가 필요하므로 적절한 교육과 전문 지식 없이는 광범위한 사용이 제한될 수 있습니다.

요약하면, MCAo 모델링 방법은 높은 생리학적 관련성과 구조적 무결성을 제공하지만 보다 강력한 실험을 위해 해결해야 할 한계가 있습니다. 목 혈관의 해부학적 무결성을 보존하고 환자의 뇌졸중 과정을 면밀히 시뮬레이션하는 것이 이 방법의 중요한 강점입니다. 이 접근 방식은 의심할 여지 없이 허혈성 뇌졸중 연구에 크게 기여하여 실험 모델의 신뢰성과 정확성을 향상시킬 것입니다. 궁극적으로 이는 치료 효과를 테스트하는 데 필요한 실험 그룹의 수를 줄여 보다 신뢰할 수 있는 실험 결과를 얻을 수 있습니다.

공개 사항

저자는 공개할 잠재적인 상충되는 이해관계가 없습니다.

감사의 글

이 작업은 2023년 허베이성 해외 정보 소개 프로젝트의 지원을 받았습니다. 이 원고 초안의 영어 텍스트를 편집해 주신 Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn)의 Lisa Kreiner 박사에게 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10% 포르말린베이징 Labgic 기술 Co., 주식 회사.BL913A
11-0 미세 수술 봉합Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.3/8 1×
2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC)SIGMAT8877
3-0 실크 봉합Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.3-0
4% 이소플루란   톈진 Ringpu 생물 과학 기술 Co., 주식 회사.
6-0 실크 봉합닝보 의료 봉합사 바늘 Co., Ltd.6-0
70% 에탄올Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd.
필라멘트Xinong Technologies Co Ltd.2838-A5
케타민   장쑤 성 Hengrui 약제 Co., 주식 회사.230613BL
수컷 Sprague Dawley 쥐Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.SCXK (Lu) 20190003
마이크로클립Shanghai Jinzhong 의료 기기 공장W40150
현미경ZEISSS100 OPMI 피코
간호 상자Beijing Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd.FYL-YS-100L
자일라진시그마PHR3263
사 5사 20221102사 20230408

참고문헌

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  5. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  6. Trueman, R. C., et al. A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection. Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).
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  16. Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).

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