방법 논문

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법

DOI:

10.3791/66647

⸱

2024년 3월 29일

 ,  ,  , 
1Medicines and Healthcare Regulatory Agency, South Mimms laboratories, 2Hull York Medical School, University of Hull

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

과산화물 음이온의 생성은 혈소판의 자극에 필수적이며, 조절이 잘 되지 않는 경우 혈전성 질환에 매우 중요합니다. 여기에서는 과산화물 음이온의 선택적 검출과 산화 환원 의존성 혈소판 조절 연구를 위한 세 가지 프로토콜을 제시합니다.

초록

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활성 산소종(ROS)은 매우 불안정한 산소 함유 분자입니다. 화학적 불안정성으로 인해 반응성이 매우 높고 단백질, 핵산 및 지질과 같은 중요한 생물학적 분자와 반응할 수 있는 능력을 제공합니다. 과산화물 음이온은 분자 산소 환원의 감소(즉, 하나의 전자 획득)에 의해 생성되는 중요한 ROS입니다. 초기에는 노화, 퇴행성 및 병원성 과정에만 영향을 미쳤지만, 중요한 생리적 반응에 대한 참여가 최근에 명백해졌습니다. 혈관 시스템에서 과산화물 음이온은 혈관 평활근 세포의 분화 및 기능, 혈관 신생에서 혈관 내피 세포의 증식 및 이동, 면역 반응 및 지혈에서 혈소판의 활성화를 조절하는 것으로 나타났습니다. 과산화물 음이온의 역할은 혈소판의 조절 장애와 암, 감염, 염증, 당뇨병 및 비만을 포함한 다양한 상태와 관련된 심혈관 합병증에 특히 중요합니다. 따라서 인간 혈소판에 의한 과산화물 음이온의 생성을 효과적으로 측정하고, 지혈과 혈전증 사이의 균형을 조절하는 산화 환원 의존 메커니즘을 이해하고, 궁극적으로 혈전증 및 심혈관 합병증으로 이어지는 혈소판 반응의 조절을 위한 새로운 약리학적 도구를 식별할 수 있는 것이 심혈관 연구에서 매우 중요해졌습니다. 이 연구는 혈소판에서 과산화물 음이온을 검출하고 지혈 및 혈전증을 조절하는 산화 환원 의존성 메커니즘에 대한 연구를 위해 성공적으로 채택된 세 가지 실험 프로토콜을 제시합니다: 1) 유세포 분석에 의한 디하이드로에티듐(DHE) 기반 과산화물 음이온 검출; 2) 단일 혈소판 이미징에 의한 DHE 기반 과산화물 음이온 시각화 및 분석; 3) 전자 상자성 공명(EPR)에 의한 혈소판의 과산화물 음이온 출력의 스핀 프로브 기반 정량화.

서론

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과산화물 음이온(O2•-)은 혈소판1에서 생성된 가장 기능적으로 관련성이 높은 ROS이다. O2 • -는 분자 산소의 환원의 산물이며 많은 다른 ROS 2 의 전구체입니다. O2 • -의 변이는 수용액에서의 자발적 반응 또는 과산화물 이산 효소 (SOD3 )에 의해 촉매 된 반응을 통해 과산화수소 (H2O2 )의 생성으로 이어집니다. 다양한 효소 공급원이 제안되었지만(예: 크산틴 산화효소4, 리폭시게나제5, 사이클로옥시게나제6 및 산화질소 합성효소7), 미토콘드리아 호흡 8,9 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산 산화효소(NOX)10가 진핵 세포에서 과산화물 음이온의 가장 두드러진 공급원입니다. 이것은 또한 미토콘드리아 호흡(11,12)으로부터의 전자 누출과 NOX(13,14)의 효소 활성이 과산화물 음이온 출력의 주요 원인으로 설명 된 혈소판의 경우로 보입니다.

여러 연구가 O2 • -에 의한 혈소판의 조절에 초점을 맞추었지만 책임이있는 분자 메커니즘에 대해서는 합의가 이루어지지 않았습니다. 직접 산화 및 이황화물 결합 형성을 통한 표면 수용체 활성의 조절은 다양한 혈소판 수용체에 대해 제안되었습니다. 시스테인 잔기의 직접 산화를 통한 ROS에 의한 인테그린 αIIbβ3의 양성 조절이 제안되었습니다 15,16,17. 마찬가지로, 콜라겐에 대한 혈소판 반응은 이황화물 의존성 이량체화와 그에 따른 당단백질 VI(GPVI)18의 이량체화에 의존하기 때문에, ROS 의존성 산화에 의한 수용체 활성 강화가 제안되었지만, 실험적으로 완전히 입증되지는 않았지만19. 마지막으로, 당단백질 Ib(GPIb)의 sulfhydryl 그룹의 ROS 유도 산화는 염증 중 혈소판 접착 및 혈소판-백혈구 상호 작용을 촉진하는 것으로 나타났습니다20. 반대로, sulfhydryl 그룹 산화 및 수용체 활성화 감소의 가능한 결과로서, GPVI 및 GPIb 모두의 ectodomain의 흘림은 조건21을 감소시킴으로써 감소된다.

혈소판 표면 수용체의 직접적인 산화와 독립적인 작용 방식도 제안되었습니다. O2 • -를 포함한 ROS는이 수용체(22)의 신호 캐스케이드를 부정적으로 조절하는 Src 상동 영역 2 함유 단백질 티로신 인산 효소 2 (SHP-2)의 활성을 약화시킴으로써 콜라겐 수용체 GPVI를 긍정적으로 조절하는 것으로 나타났습니다. 또한,O2•-는 일반적으로 NO-민감성 구아닐릴 사이클라아제(NO-GC)를 통해 혈소판을 억제하는 산화질소(NO)와 빠른 반응에 의해 ONOO-(퍼옥시아질산염)를 생성할 수 있으며, 음극 혈소판 조절제 고리형 GMP(cGMP)23,24의 생성을 억제합니다. 그 결과 NO 수치가 감소하면 혈소판 강화가 발생할 수 있습니다. 대안적으로, NOX2에 의한O2•-의 생성은 혈소판 활성화 및 접착에 필수적인 지질 과산화 및 이소프로스테인 형성에 기여하는 것으로 제안되었습니다25. 마지막으로, 혈소판(26)에서 산화 환원 스트레스 센서로 제안된 단백질 키나아제인 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 세포외 신호 조절 키나아제 5(ERK5)는O2•-에 의해 활성화되고 혈소판에서 응고제 표현형을 유도합니다(포스파티딜세린 외부화의 유세포 측정 기반 측정에 의해 추정됨)27.

혈소판에서O2•- 및 기타 ROS 생성의 조절 장애는 죽상동맥경화증, 진성 당뇨병, 고혈압, 비만 및 암과 관련된 혈전성 심혈관 합병증을 유발하는 과장된 지혈 반응과 관련이 있습니다28,29. 이러한 병리학적 환경에서 혈소판에 의한 ROS 출력이 증가하여 혈소판의 접착 및 응집 반응이 강화됩니다. 혈소판 반응에 미치는 영향 외에도, 혈소판의 활성산소 분비는 다른 혈액 세포 및 혈관 구조에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 심혈관 건강의 잘 이해되지 않고 충분히 연구되지 않은 영역이다30. 산화 스트레스와 혈전 상태를 연결하는 분자 메커니즘에 대한 이해가 제한적임에도 불구하고 심혈관 질환에 대한 보호를 위한 항산화제의 임상적 관련성은 상당한 주목을 받았습니다. 혈장 항산화제 수치는 심혈관 질환 발병 위험과 반비례하는 것으로 나타났으며, 식이 항산화제 섭취는 관상 동맥 질환을 예방하는 것으로 나타났습니다31,32. 결과적으로, 식이 항산화제의 사용은 심혈관 질환 예방을 위한 유망한 접근법으로 옹호되어 왔습니다 33,34,35. 혈소판에서 ROS 생성의 영향 중에서, 세포사멸의 증가는 중요한 병태생리학적 영향을 미칠 수 있다36,37. 전반적으로, 혈소판에 의한 O2•- 출력을 검출하고 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜은 심혈관 연구에서 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다.

현재 ROS 검출에 사용 가능한 기술은 특이성(즉, 검출된 산화제 분자의 화학적 특성은 알려지지 않음) 및 신뢰성(즉, 생물학적 분자 및 실험 시약과의 원치 않는 상호 작용이 편향된 비생리학적 결과로 이어짐)의 중요한 한계가 있습니다38,39. 혈소판에서 ROS를 검출하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 접근법은 디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA)의 사용을 기반으로 하며, 이는 세포 내 에스테라아제에 의해 디클로로디하이드로플루오레세인(DCFH)으로 전환되고 결과적으로 하이드록실 라디칼 및 과산화효소-H2O2중간체를 포함한 세포 산화제에 의해 고형광 디클로로플루오레세인(DCF)으로 전환됩니다(40,41). 광범위한 사용에도 불구하고 세포 내 ROS38 측정을 위한 이 접근법의 신뢰성에 대해 심각한 의문이 제기되었습니다. DCFH에서 DCF로의 산화는 실제로 ROS42 대신 전이 금속 이온(예: Fe2+) 또는 헴 함유 효소(예: 시토크롬)에 의해 유도될 수 있습니다. 더욱이, DCFDA는 세포 과산화효소에 의해 세미퀴논 자유 라디칼 형태(DCF•-)로 전환되고, 이는 다시 분자 산소(O2)와O2•-의 방출과 함께 DCF로 산화되어 산화 반응의 인위적 증폭으로 이어진다 41,43,44. 따라서, DCFDA에 의한 세포내 ROS의 검출은 초기 통찰력을 얻는 데 유용하지만, 신중한 고려와 광범위한 실험적 통제가 필요하다38,39.

이 연구는 혈소판 기능 O2 • -1의 주요 조절자의 검출 및 측정을위한 세 가지 대체 기술을 제시합니다. 첫 번째 기법은 DHE와 유세포 분석을 사용한 검출로, DCFDA에 비해 신뢰성과 특이성의 이점을 제공합니다. 여기에서 제안하는 두 번째 기술도 DHE를 사용하지만 검출 방법은 실시간 혈소판 형광 이미징으로, 빠른 역학 및 단일 세포 분해능으로 혈소판 신호 전달 시 O2•-의 생성을 연구할 수 있습니다. 마지막으로, EPR 공명 실험에서 하이드록실아민 스핀 프로브 1-하이드록시-3-메톡시카르보닐-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘(CMH)의 사용을 기반으로 하는 프로토콜은 혈소판에 의한O2•- 생성 속도를 정량화하고 다른 조건에서 비교할 수 있는 가능성을 제공합니다.

프로토콜

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동의한 지원자의 말초 혈액 수집은 지역 윤리 위원회와 National Health Service Health Research Authority의 승인을 받습니다(REC 참조: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. 방법 1: 유세포 분석에 의한 DHE를 사용한 과산화물 음이온 검출

  1. 예열(37°C) 구연산나트륨 용액(4% w/v)을 넣고 정맥 천자 시 1:7(0.5% w/v final)의 비율로 혈액에 직접 첨가하여 항응고제로 사용합니다.
  2. 정중 입방정맥 정맥 천자로 건강한 지원자로부터 말초 인간의 혈액을 채취합니다.
  3. 20분 동안 200 x g 에서 초기 원심분리 단계를 통해 전혈에서 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 얻습니다.
  4. PRP를 500 x g 에서 10분 동안 가역적 혈소판 억제제인 인도메타신(indomethacin, 10μM) 및 PGE1(40ng/mL)과 함께 원심분리합니다.
  5. 생성된 혈소판 펠릿을 변형된 Tyrode의 완충액(145mM NaCl, 2.9mM KCl, 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid(HEPES), 1mM MgCl2, 5mM glucose, pH 7.3)(37°C)에 2 x 108 혈소판/mL의 밀도로 재현탁합니다.
  6. 분리 후 37°C에서 30분 동안 혈소판을 휴지시킵니다.
  7. 5mM의 스톡 농도에서 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 DHE를 준비합니다.
  8. 5 μM 최종 농도에서 혈소판 현탁액에 DHE를 첨가하고(원액을 1-1,000으로 희석, 최종 DMSO 농도 0.1% v/v) 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
  9. 원하는 생리적 자극과 농도(예: 0.1단위/mL 트롬빈 또는 3μg/mL 콜라겐)로 자극하기 전에 약리제수 및/또는 ROS 제거제로 혈소판을 치료합니다.
  10. 자극 후, 얼음처럼 차가운 변형 HEPES 완충액에 혈소판 현탁액 1-10을 희석합니다.
  11. 유세포 분석의 경우 측면 산란(SSC) 및 전방 산란(FSC) 이득을 각각 40mV 및 220mV로 설정하고 로그 스케일 산점도를 사용하여 현탁액의 입자 집단을 시각화합니다( 그림 1A의 예).
  12. (선택 사항) 항-CD41 항체를 사용하여 혈소판 현탁액의 1개 분취액을 면역염색하여 혈소판에 해당하는 사건 집단을 식별합니다(예: 그림 1B).
  13. 405nm(보라색 레이저)에서의 여기와 580nm 파장의 방출을 사용하여 유세포 분석으로 시료를 분석하며, 이를 통해 과산화물 음이온 특이적 산물인 2-hydroxy-ethidium(2OH-Et+)을 선택적으로 검출할 수 있습니다(그림 2).
    참고: 파라포름알데히드에 고정하고 장기간 샘플을 보관하는 것은 권장되지 않습니다.

2. 방법 2: 단일 혈소판 형광 이미징에 의한 DHE를 사용한 과산화물 음이온 검출

  1. 실험 당일 8웰 μ슬라이드에 말 힘줄(Horm collagen)의 0.1mg/mL fibrillar collagen I, 0.2mg/mL fibrinogen 또는 1mg/mL poly-L-lysine(PLL)을 변형된 Tyrode의 완충액에 37°C에서 2시간 동안 코팅합니다.
  2. 변형된 Tyrode의 버퍼로 두 번 세척합니다(각 10분).
  3. 변형된 Tyrode의 완충액과 5mg/mL 소 혈청 알부민(BSA)을 최소 30분 동안(또는 실험 때까지) 배양하여 비특이적 접착을 퀜칭합니다.
  4. 예열(37°C) 구연산나트륨 용액(4% w/v)을 넣고 정맥 천자 시 1:7(0.5% w/v final)의 비율로 혈액에 직접 첨가하여 항응고제로 사용합니다.
  5. 정중 입방정맥 정맥 천자로 건강한 지원자로부터 말초 인간의 혈액을 채취합니다.
  6. 20분 동안 200 x g 에서 초기 원심분리 단계를 통해 전혈에서 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 얻습니다.
  7. PRP를 500 x g 에서 10분 동안 가역적 혈소판 억제제인 인도메타신(indomethacin, 10μM) 및 PGE1(40ng/mL)과 함께 원심분리합니다.
  8. 생성된 혈소판 펠릿을 변형된 Tyrode의 완충액(145mM NaCl, 2.9mM KCl, 10mM HEPES, 1mM MgCl2, 5mM 포도당, pH 7.3)(37°C)에 4 x 107 혈소판/mL의 밀도로 재현탁시킵니다.
  9. 분리 후 37°C에서 30분 동안 혈소판을 휴지시킵니다.
  10. 10mM의 스톡 농도에서 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 DHE를 준비합니다.
  11. 혈소판 현탁액에 10μM 최종 농도의 DHE를 첨가하고(원액을 1-1,000으로 희석하고 최종 DMSO 농도 0.1% v/v) 1분(37°C) 동안 배양합니다.
  12. DHE로 1분 배양한 후 선택한 웰에서 차단 용액을 제거하고 μ-슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 이미징 준비를 한 다음 혈소판을 부드럽게 분배합니다.
  13. 10분(405/580nm ex/em) 동안 역 컨포칼 이미징을 통해 DHE를 2OH-Et+로 변환하는 것을 모니터링하고 40x 오일 이멀젼 렌즈로 10초마다 이미지를 수집합니다.
  14. (선택 사항) PLL로 코팅된 웰의 경우, 2.13단계에 설명된 대로 혈소판 분주 및 형광 이미지 수집 10분 후에 작용제를 추가하여 가용성 작용제(예: 0.1단위/mL 트롬빈 또는 3μg/mL 콜라겐)에 대한 반응으로 과산화물 음이온 생성을 모니터링합니다.
  15. (선택 사항) 필요한 경우 시간 경과 동안 웰 측면에 부드럽게 분주하여 과산화물 음이온 제거제 또는 선택적 억제제(예: NOX 억제제)를 추가하고 2.13에 설명된 대로 추가로 10분 동안 형광 이미지를 수집합니다.
  16. 대표적인 단일 혈소판을 포함하는 관심 영역(ROI)을 선택하고 이미징 제품군 ImageJ 1.53t의 측정 도구를 사용하여 다양한 프레임에서 형광 강도를 분석하여 단일 세포 형광 분석을 정량화합니다.

3. 방법 3: 전자 상자성 공명(EPR)을 이용한 혈소판에 의한 과산화물 음이온 검출

  1. 예열(37°C) 구연산나트륨 용액(4% w/v)을 넣고 정맥 천자 시 1:7(0.5% w/v final)의 비율로 혈액에 직접 첨가하여 항응고제로 사용합니다.
  2. 정중 입방정맥 정맥 천자로 건강한 지원자로부터 말초 인간의 혈액을 채취합니다.
  3. 20분 동안 200 x g 에서 초기 원심분리 단계를 통해 전혈에서 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 얻습니다.
  4. PRP를 500 x g 에서 10분 동안 가역적 혈소판 억제제인 인도메타신(indomethacin, 10μM) 및 PGE1(40ng/mL)과 함께 원심분리합니다.
  5. 생성된 혈소판 펠릿을 변형된 Tyrode의 완충액(145mM NaCl, 2.9mM KCl, 10mM HEPES, 1mM MgCl2, 5mM 포도당, pH 7.3)(37°C)에 2 x 108 혈소판/mL의 밀도로 재현탁시킵니다.
  6. 분리 후 37°C에서 30분 동안 혈소판을 휴지시킵니다.
  7. 혈소판 현탁액에 5μM 디에틸디티오카르바메이트(DETC)와 25μM 데페록사민을 추가합니다.
  8. 배양하지 않고 200μM 1-하이드록시-3-메톡시카르보닐-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘(CMH)을 추가합니다.
  9. 응집 큐벳(테프론 코팅된 교반 자석 포함) 내의 응집계에 샘플을 로드합니다.
  10. 1분 후 원하는 농도(예: 1단위/mL 트롬빈 또는 3μg/mL 콜라겐)로 자극을 추가합니다. 10분 동안 배양합니다.
  11. (선택 사항) 원하는 시간에 3.12 단계로 진행하여 다른 시점에서 과산화물 음이온 생성을 얻습니다.
  12. 혈소판 현탁액을 응집 큐벳에서 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 10초 동안 6,000 x g 에서 빠르게 스핀다운합니다.
  13. 모세관 마이크로피펫에 50μL의 상층액을 로드하고 EPR 밀봉 왁스로 밀봉합니다.
  14. 샘플을 EPR 스캐너로 이송합니다.
  15. EPR 스캐너를 다음과 같이 설정합니다: 중심 필드 3,492.5G, 필드 스윕 60G, 변조 진폭 2G, 스윕 시간 10초, 스캔 수 10, 마이크로파 주파수 9.39GHz, 마이크로파 전력 20mW, 변환 시간 327.68ms, 시간 상수 5242.88ms.
  16. 위의 매개변수를 사용하여 기록된 EPR 피크의 곡선 아래 면적(AUC)으로 CM● 에 대한 CMH 산화를 추정합니다.
  17. 단계 3.16에서 설명한 대로 측정된 EPR 강도를 y축에서 플로팅하고 x축에서 상업적으로 이용 가능한 CM● 의 농도(예: 0, 0.3, 1, 3, 10 및 30μM)를 플로팅하는 보정 곡선을 만듭니다.
  18. 샘플의 CM● 농도에서 대표 결과 섹션에 설명된 공식을 사용하여 샘플의 혈소판에 의해 생성된 과산화물 음이온의 양을 얻습니다.

결과

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DHE 형광의 유세포 분석 검출을 위해 휴지 상태(그림 3A) 또는 0.1 unit/mL 트롬빈으로 자극된 혈소판(그림 3B)에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. O2•- 출력은 0.1 unit/mL 트롬빈(그림 3C) 또는 3μg/mL 콜라겐 관련 펩타이드(CRP)를 사용한 자극에 대해 표시된 바와 같이 혈소판 평균 형광 강도(MFI)로 정량화되었습니다(그림 3D). 혈소판 자극의 결과로 DHE 염색의 2/3배 증가가 관찰되었습니다. O2 • -가 측정되었는지 확인하기 위해 세포 투과성 O2 • - 제거제 페길 화 과산화물 디스 뮤타 제 (PEG-SOD, 100 units / mL)를 사용하는 것이 좋으며, O2 •-의 출처를 확인하기 위해 NOX 억제제 VAS2870 (10 μM)를 사용했습니다. 콜라겐과 트롬빈 모두에 대해 PEG-SOD 및 VAS2870는 혈소판 활성화로 인한 DHE 형광의 증가를 폐지하여 측정이 O2•-에 대해 특이적이며 이러한 조건에서의 소스가 NOX 효소임을 확인했습니다.

DHE 형광의 이미징 검출을 위해 콜라겐 또는 피브리노겐에 접착되는 순간(그리고 다음 10분)에 O2•- 의 생성을 평가하는 실험의 데이터(그림 4A) 또는 트롬빈으로 자극을 받았을 때 이전에 PLL에 부착된 혈소판에서 O2•- 생성을 평가하기 위한 실험의 데이터를 제시합니다(그림 4B). 예상대로, PLL에 대한 접착력은O2•-의 견고한 생성을 유발하지 않는다. 가장 가능성이 높은 이유는 이러한 형태의 접착이 어떠한 신호 반응(45)의 개시 없이 정전기 상호 작용에 의존하기 때문이며, 이는 이 접근법을 용해성 작용제의 첨가에 대한 응답으로O2•- 출력을 측정하는 데 적합하게 만든다. 이 프로토콜이 O2•-의 검출을 허용하는지 확인하기 위해 스캐빈저 또는 선택적 억제제를 사용할 수 있습니다. 우리는 이전 연구에서 N-아세틸-시스테인(NAC)이O2•- 를 청소하고 혈소판 형광을 제거할 수 있음을 보여주었습니다46. 여기에서 선택적 NOX 억제제가 콜라겐 또는 피브리노겐에 부착되거나(그림 4A) 트롬빈(그림 4B)에 반응하는 혈소판의 형광을 효과적이고 즉각적으로 감소시킬 VAS2870 있음을 보여줍니다. 이것은 NOX가 이러한 실험 조건에서 O2•- 의 원인임을 시사합니다. 콜라겐 또는 피브리노겐에 대한 접착 또는 PLL에 부착된 혈소판의 트롬빈에 의한 자극에 반응하는 DHE 형광(405nm 여기)의 대표적인 동영상이 각각 보충 파일 1, 보충 파일 2, 보충 파일 3에 포함되어 있습니다. 주목할 점은 다른 실험 설정에서 O2•- 제거제로 성공적으로 사용된 PEG-SOD는 이러한 유형의 실험에서 효과적이지 않다는 것입니다. 현재로서는 이에 대한 명확한 설명이 없습니다. 우리는 PEG-SOD가 O2•- 가 효율성이 낮거나 느린 역학으로 이미징 기반 분석에서 증가된 형광을 유도하는 세포 구획에 도달한다는 가설을 세울 수 있습니다. 이 점을 명확히 하기 위해 더 집중적인 조사가 필요할 수 있습니다.

우리는 이전에 발표된 다른 연구 1,13,47,48,49,50에서 혈소판에서 EPR에 의한 O 2•-의 측정을 적용했습니다. 이 기술의 중요한 단계는 상업적으로 이용 가능한 CM●(즉, 스핀 프로브 CMH와O2•- 및 EPR로 측정된 공진 종 사이의 반응 생성물)를 사용하여 보정선을 준비하는 것입니다. CMH와O2•-의 반응은 그림 5A에 나타나 있으며, 서로 다른 농도의 CM●에 의해 유도되는 EPR 신호의 대표적인 예가 그림 5B에 나타나 있다. 다양한 CM● 농도의 데이터를 사용하여 산화된 CMH의 양과 샘플의 EPR 신호 강도 간의 선형 상관 관계를 설명하는 보정 곡선을 작성했습니다(그림 5C). 아래 방정식은 CM● 농도와 EPR 신호 강도 간의 상관 관계를 설명하며 이 연구의 실험에 대한 검량선 계산의 시작점입니다(방정식 1).

figure-results-1

CM● 농도와 해당 EPR 강도를 모두 실험적으로 얻었으므로 검량선의 기울 기 및 Y축 절편 을 계산할 수 있습니다. 그림 5C에 표시된 예에서 기울기 = 1,002,169 및 절편 = 596,383. 따라서 검량선에 대한 방정식은 다음과 같이 다시 작성할 수 있습니다.

figure-results-2

위의 방정식을 재배열하면 EPR 강도 값을 기반으로 다른 샘플에 대한 CM● 농도를 계산할 수 있습니다(방정식 2).

figure-results-3

샘플에서 CM● 의 농도가 알려지면 아래 방정식(방정식 3)을 사용하여 혈소판당 생성 속도와 시간 단위를 계산할 수 있습니다.

figure-results-4

수식 2를 사용하면 수식 3을 (수식 4)로 다시 쓸 수 있습니다.

figure-results-5

그림 5C에 표시된 예에서 다음과 같이 다시 작성할 수 있습니다.

figure-results-6

CMH 산화 속도는 분당 혈소판당 생성되는 CM●의 아토몰로 표현됩니다. 이 값은 실험과 공여체 간의 O2•- 생성 속도를 비교하는 데 사용할 수 있으며, 이는 DHE(또는 DCFDA)와 같은 형광 프로브에서는 불가능합니다. 형광 프로브는 일반적으로 동일한 실험 내에서 형광 강도의 변화로O2•- 생성에 대한 다른 조건의 효과만 추정할 수 있습니다. 이 기사에서 설명하는 모든 기술과 마찬가지로 ROS 제거제(예: PEG-SOD, NAC) 또는 과산화물 음이온을 생성하는 효소의 선택적 억제제(예: NOX 억제 VAS2870)로 검출의 특이성을 확인했습니다. 여기에서는 트롬빈(그림 6A,C,E) 또는 콜라겐(그림 6B,D,F)을 사용한 혈소판 자극(그림 6)에 대한 데이터를 제시합니다. 두 작용제 모두에 대해 PEG-SOD를 사용하여 O2•-가 검출되었음을 확인했지만, 페길화 카탈라아제(PEG-Cat.)에 대한 효과가 없다는 것은 이 기술로 과산화수소가 검출되지 않음을 시사합니다(각각 그림 6C,D). VAS2870는 트롬빈-(그림 6E) 및 콜라겐 유도(그림 6F) EPR 신호를 제거하며, 이는 NOX가 이 두 작용제에 대한 반응으로 혈소판 O2•-의 주요 공급원임을 시사합니다.

figure-results-7
그림 1: 혈소판 현탁액의 유세포 분석 (A) 분리된 혈소판에 대한 전방(FSC) 및 측면 산란(SSC) 플롯의 일반적인 표현. (B) 항-CD41 항체를 이용한 혈소판 현탁액의 면역염색은 제제에 있는 입자의 >98%를 혈소판으로 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-8
그림 2: DHE와 과산화물 음이온 및 기타 ROS의 화학 반응 및 제품의 스펙트럼 특성. DHE와 그 두 가지 산화 생성물인 2-하이드록시-에티듐(2OH-Et+)은 과산화물 음이온과 반응하여 생성되고, 에티듐(Et+)은 다른 유형의 ROS(예: 하이드록실 라디칼 및 과산화수소)와 반응하여 생성됩니다. 그림에서 파란색 점선 사각형으로 강조 표시된 405nm의 여기 피크는 2OH-Et+에 대해 고유하므로 O2•-를 검출/측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: DHE 및 유세포 분석으로 검출된 트롬빈 및 콜라겐 의존성 과산화물 음이온 생성. (A) 휴지 및 (B) 트롬빈 자극 혈소판의 DHE 염색에 대한 대표 히스토그램. 이 막대는 DHE 염색 값이 500 미만임을 나타내며, 이는 휴지 및 트롬빈 자극 혈소판에 대해 각각 70.7% 및 16.1%입니다. 이 기법은 (C) 0.1 unit/mL 트롬빈 및 (D) 3 μg/mL 콜라겐 자극 혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 추정하는 데 사용되었습니다. 이 실험에서 PEG-SOD(100 unit/mL)를 사용하여 과산화물 음이온이 측정되었음을 확인했으며, 10μM VAS2870를 사용하여 과산화물 음이온의 공급원으로 NOX 효소를 식별했습니다. 각 데이터 포인트는 50,000개의 혈소판에서 평균 형광 강도(MFI)로 계산되었으며, 각 실험은 그래프에 표시된 평균 ± SEM을 사용하여 5회 독립적으로 반복되었습니다(n = 5). 통계적 유의성은 쌍별 비교를 위해 Tukey 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석으로 평가되었습니다(** = p < 0.01, *** = p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: DHE 형광 이미징으로 검출된 콜라겐, 피브리노겐 및 트롬빈 의존성 과산화물 음이온 생성. (A) 콜라겐 또는 피브리노겐에 부착하는 혈소판에 대해 과산화물 음이온 생성 역학을 평가했습니다. 혈소판은 이미징 시작 후 1분 후에 코팅된 μ-슬라이드에 분주되었으며, 이미지 수집 시작 5분 후에 10μM VAS2870이 추가되었습니다. (B) 트롬빈으로 자극할 때 혈소판에 대한 과산화물 음이온 생성 역학. 혈소판은 이미지 수집이 시작되기 전에 10분 동안 PLL-코팅된 μ-슬라이드에 부착되도록 했습니다. 2분 후 0.1 unit/mL 트롬빈을 첨가하고 5분 더 VAS2870 후 10μM 트롬빈을 첨가했습니다(즉, 이미징 시작으로부터 7분 후). 실험 방식은 패널 상단에 표시되며 0분, 1분, 3분, 6분 및 9분의 대표 이미지가 패널 중앙에 표시됩니다. 단일 혈소판 DHE 형광 정량화는 패널 하단에 표시되며 ImageJ를 사용한 형광 강도 분석으로 얻었습니다. 데이터는 4개의 독립적인 실험에서 조건당 8-12개의 혈소판에서 SEM± 평균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-11
그림 5: 검량선 및 CMH 산화율 계산. (A) CMH 및 CM●의 화학 구조 및 EPR 특성. (B) CM● (100 nM - 10 μM)의 다양한 농도에 대한 EPR 데이터의 대표적인 예. (C) EPR 강도 대 CM● 농도의 보정 곡선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 트롬빈 또는 콜라겐 자극 시 혈소판에 의한 과산화물 음이온 생성 감지. 과산화물 음이온 출력은 (A) 0.1 단위/mL 트롬빈 또는 (B) 3 μg/mL 콜라겐으로 자극된 혈소판에서 스핀 프로브 CMH를 사용하여 EPR로 측정했습니다. (씨, 디) 과산화물 음이온 제거제 PEG-SOD 100단위/mL 또는 과산화수소 제거제 페길화 카탈라제(PEG-Cat.) 100단위/mL의 농도가 두 작용제에 대해 테스트된 조건에 포함되었습니다. 과산화물 음이온의 출처는 NOX 억제제 VAS2870(10μM)와 함께 공동 배양하여 조사했습니다. (E) 트롬빈과 (F) 콜라겐은 모두 과산화물 음이온의 생성을 위한 NOX 활성에 의존합니다. 그림 전체에서, CMH/과산화물 음이온 반응 속도는 원고에 설명된 대로 EPR 트레이스로부터 계산되었습니다(방정식 4). 데이터는 5 (C, D) 및 4 개의 독립적 인 실험 (E, F)의 SEM± 평균입니다. 통계적 유의성은 쌍별 비교를 위해 Tukey 사후 테스트를 사용한 일원 분산 분석으로 평가되었습니다(** = p < 0.01, *** = p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 콜라겐에 대한 접착에 반응하는 DHE 형광(405nm excitation)의 대표 동영상. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: 접착 피브리노겐에 반응하는 DHE 형광(405nm excitation)의 대표 동영상. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: PLL에 부착된 혈소판의 트롬빈에 의한 자극에 대응하여 DHE 형광(405nm excitation)을 대표하는 동영상입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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이 원고에서는 O2•-의 선택적 검출을 통해 혈소판 기능의 산화 환원 의존성 조절을 조사할 수 있는 능력을 향상시킬 수 있는 세 가지 다른 기술을 제시합니다. 처음 두 가지 방법은 산화 환원 프로브가 사용되었기 때문에 기존 기술을 개선한 것입니다(더 일반적이지만 덜 신뢰할 수 있는 DCFDA 대신 DHE). 따라서 이러한 기술은 쉽게 접근할 수 있으며 대부분의 실험실에서 특정 장비나 교육 비용 없이 효과적으로 채택할 수 있습니다. 세 번째 기술은 EPR에 의한 스핀 프로브 CMH의 산화 분석을 위한 특수 장비의 사용을 기반으로 합니다. 이 기술을 사용하려면 특수 장비 및 시약을 구입하고 실험실 사용자의 전담 교육을 받아야 합니다. 결과적으로, 혈소판(또는 다른 세포)의 산화 환원 의존성 이벤트 연구에 특별히 초점을 맞춘 실험실에 적합한 것으로 보입니다.

DHE를 활용하는 기술의 경우, 여기(excitation)를 위한 파장 선택은 O2•-의 특정 검출을 얻는 데 매우 중요합니다. DHE와 O2•-의 반응에 의해 생성된 2-하이드록시-에티듐(2OH-Et+)은 405nm에서 여기되는 반면, DHE와 ROS(예: 하이드록실 라디칼 및 과산화수소)의 일반적인 반응에 의해 생성된 에티듐(Et+)은 약 520nm에서 여기 피크를 갖지만 405nm에서는 여기가 없습니다(그림 1)51. DCFDA 대신 DHE를 사용하면 이 프로브가 과산화효소, 기타 헴 함유 효소 및 금속 이온 환원제와 같은 세포 구성 요소와 직접 반응하여 발생하는 아티팩트로부터 보호합니다(42,43,44). DHE는 세포 산화 환원 연구를 위한 보다 안전한 도구로 제안되었습니다38,39. 여기에서는 두 가지 다른 판독 기술인 1) 유세포 분석 및 2) 형광 이미징과 함께 DHE를 사용할 것을 제안합니다.

유세포 분석은 일반적으로 저처리량에서 중처리량으로 여러 샘플을 동시에 처리할 수 있는 기술이다52. 불행히도 이 연구에 사용된 접근 방식은 샘플 고정을 허용하지 않습니다. 얼음처럼 차가운 변형 Tyrode의 완충액으로 시료를 희석하면 최대 30분 동안 시료의 형광이 안정화되지만 이 시간 내에 모든 시료의 분석을 수행해야 합니다. 이로 인해 실험당 샘플 수가 크게 제한됩니다. 같은 날 동일한 혈소판 전처리를 사용하여 내부적으로 통제된 여러 실험을 실행할 수 있지만, 결과는 대조군으로 정규화되어야 하며 독립적인 실험으로 간주되어서는 안 됩니다. 이 기술은 이 원고의 저자에 의해 다른 작용제 및 조절제에 대한 반응에서 산화 환원 의존성 혈소판 조절의 역할을 강조하기 위해 사용되었다46,50. 이 방법은 미토콘드리아(즉, Mitosox)53를 표적으로 할 수 있는 화학적으로 변형된 버전의 DHE를 채택함으로써 수정할 수 있으며, 이는 NOX2(54)에 초점을 맞춘 혈소판 연구에 사용되어 왔다. 이것은 우리 실험실에서 아직 추구하지 않은 흥미로운 기회입니다.

여기에서 제안하는 DHE를 사용하는 형광 이미징 기술은 접착(이미징 웰 표면에 흡수된 작용제) 또는 자극(현탁액의 작용제) 시 혈소판에서O2•- 생성의 시간 경과를 결정하는 장점이 있습니다. 이를 통해 혈소판 활성화 과정의 여러 단계의 상호 작용을 해석하고 다양한 O2•- 공급원(예: 다양한 ROS 생성 효소, 예: NOX)의 기여도를 평가할 수 있습니다. 이러한 유형의 조사를 허용하는 기존 기술은 없습니다. 이는 분석 처리량 측면에서 비용이 발생하며, 테스트된 각 조건에는 30분이 소요됩니다(μ-슬라이드 설정, 초점 및 필드 선택, 이미징 및 데이터 저장 포함). 따라서 이 기술을 사용하면 근무일당 적은 수의 조건(즉, 10개 미만)을 테스트할 수 있습니다. 여기에 표시된 데이터에는 컨포칼 현미경이 사용되었지만, 405nm 여기 기능이 있는 에피형광 현미경으로도 동일한 우수한 결과를 얻을 수 있음을 확인했습니다. 이를 통해 값비싼 컨포칼 현미경 설정에 대한 요구 사항이 줄어들고 이 기술을 보다 저렴하게 사용할 수 있습니다.

EPR 프로토콜은 다양한 세포 유형(55)에 대한 이전 연구를 기반으로 개발되었다. 이 기술은 ROS 생성 연구 및 세포38의 산화 환원 의존성 이벤트 조사를 위한 가장 신뢰할 수 있는 도구로 널리 알려져 있습니다. 무산소 라디칼(56)과 히드록실아민 스핀 프로브의 반응의 특이성으로 인해 다른 기술에 비해 우수한 신뢰성 외에도, EPR은O2•- 생성 속도의 정량화 및 다른 개체 및 실험 간의 비교를 가능하게 합니다. 이는 형광 기반 기술로는 불가능하며, 단일 실험 및 혈소판 준비 내에서 선택한 조건의 형광 강도에 대한 효과만 추정할 수 있습니다. 이 EPR 프로토콜은 혈소판 활성화 및O2•- 1세대의 병렬 모니터링을 위해 혈소판 응집과 결합하는 기술로 개발되었지만, 이러한 실험은 응집의 병렬 분석 없이 수행할 수 있습니다. 혈소판 응집의 병렬 분석이 없더라도 효과적인 혈소판 자극을 보장하기 위해 응집계에서 배양을 수행하는 것이 좋으며, 이를 위해서는 연속 교반에 의해 제공되는 전단 응력이 필요합니다. 교반하지 않고 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에서 실험을 수행해야 하는 경우 O2•- 생산 수준이 현저히 낮아집니다. 따라서 이 실험적 접근 방식을 선택한 경우 회전 휠에서 더 조밀하게 농축된 혈소판(즉, 1 x 109/mL)을 사용하여 CMH 배양을 수행하는 것이 좋습니다.

요약하면, 여기에서는 혈소판에서 O2•- 를 검출하기 위한 세 가지 검증된 기술을 제시합니다. 그들은 다른 이점을 제공하며 실험 목표와 우선 순위에 따라 선택할 수 있습니다. 유세포 분석에서 DHE를 사용하는 첫 번째 기법은 가장 힘들고 시간이 많이 걸리지 않기 때문에 초급 수준의 분석으로 선택할 수 있습니다. 형광 현미경에 의한 DHE의 사용을 기반으로 하는 두 번째 기법은O2•- 생성의 빠른 동역학을 이해하고 다양한 신호 캐스케이드가 초 시간 척도에서 산화 반응에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 대한 연구를 가능하게 합니다(다른 기법은 자극 후 몇 분 이내에 발생하는 이벤트에 대한 종점 조사만 허용함). 마지막으로, EPR을 사용하면 O2•- 생성 속도를 정량화하고 실험과 개체를 비교할 수 있습니다. 이러한 이유로, 후자의 기법은 서로 다른 개인의 혈소판에서 산화 반응을 특성화하려는 임상 연구에 특히 유용합니다(예: 환자 또는 환자 와 건강한 대조군 간의 비교). 전반적으로, 이 세 가지 기법은 기존 방법에 비해 상당한 이점을 제공하며 혈소판의 산화 환원 의존성 이벤트를 연구하기 위해 사용할 수 있는 실험 도구에서 상당한 발전을 나타냅니다.

공개 사항

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저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 영국 심장 재단(PG/15/40/31522), 영국 알츠하이머 연구(ARUK-PG2017A-3) 및 유럽 연구 위원회(#10102507)의 지원으로 G. Pula에 지원되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgEPR용 시약(스핀 프로브)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NA유세포 분석기
소 혈청 알부민Merck/SigmaA7030μ-슬라이드 코팅용
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH  녹스-E.11-BES EPR 분광계
카탈라제– 폴리에틸렌 글리콜 (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963과산화수소 청소제 (특이성 제어)
ChronoLog 모델 490+4Labmedics/ChronologNA어그리고미터
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg EPR용 시약(교정 제어)
데페록사민 Noxygen Science 운송 및 진단 GmbHNOX-09.1-100mg EPR용 시약
디에틸디티오카르바메이트(DETC) Noxygen 과학 운송 및 진단 GmbHNOX-10.1-1g EPR용 시약
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347슈퍼옥사이드 음이온 프로브
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869원액 준비용 
EPR 밀봉 왁스 플레이트Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMEPR
EPR 등급 물Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L EPR용 시약
인간 플라즈마에서 피브리노겐Merck/SigmaF4883μ-슬라이드 코팅용
FITC anti-human CD41 항체BioLegend303704플로우 사이토메트리를 위한 혈소판 특정 염색
유리 큐벳 Labmedics/ChronologP/N 312응집체에서 인큐베이션용
소모품 Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385혈소판 자극용
이미지J 미국 국립보건원(NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378혈소판 분리용
마이크로피펫 DURAN 50µ lNoxygen 과학 운송 및 진단 GmbHNOX-G.6.1-50µ L EPR용 소모품
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658μ슬라이드 코팅용
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515혈소판 분리용
구연산나트륨(4% w/v 용액)Merck/SigmaS5770혈소판 분리용
교반 바(테프론 코팅)Labmedics/ChronologP/N 313응집계에서 배양을 위해 소모품
Superoxide dismutase– 폴리에틸렌 글리콜 (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549슈퍼옥사이드 음이온 제거제(특이성 조절)
인간 플라즈마의 트롬빈Merck/SigmaT6884혈소판 자극 및 μ슬라이드 코팅용
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM 컨포칼 현미경ZeissNA컨포칼 현미경
용 소모품

참고문헌

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