이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

하대정맥(Inferior Vena Cava)에서 순차적 혈액 채취 후 문맥(portal vein)을 통해 생쥐의 장내 미생물 대사산물을 평가합니다.

4.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66673

⸱

2024년 6월 21일

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco and San Francisco General Hospital

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 장내 미생물 대사 산물의 생산 및 흡수를 평가하기 위해 마우스의 문맥 및 하대정맥에서 혈액을 순차적으로 수집하는 방법을 보여줍니다.

초록

장내 미생물 제품은 장 내에서 국소적으로 작용하고 순환계로 흡수되는 것으로 알려져 있으며, 그 영향은 멀리 떨어진 수많은 장기 시스템으로 확장될 수 있습니다. 단쇄 지방산(SCFA)은 소화되지 않는 식이섬유를 발효시키는 동안 장내 미생물에 의해 생성되는 대사 산물의 한 종류입니다. 그들은 이제 장내 마이크로바이옴이 장-폐, 장-뇌 및 숙주 전체의 기타 장-장기 축을 통해 장 외 장기 시스템에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 중요한 기여자로 인식되고 있습니다. SCFA는 결장에서 장 조직을 통해 문맥(PV)으로 흡수됩니다. 그런 다음 간을 통과하여 뇌, 근육, 지방 조직 및 폐와 같은 다양한 기관에서 소비됩니다. SCFA는 배출된 분변 물질에서 가장 쉽게 측정되지만 결장 내 분변 내용물에서 더 정확한 측정이 얻어졌습니다. 여기서 우리는 단일 피험자의 PV 및 전신 순환 혈장을 샘플링하는 것이 마우스에서 SCFA의 흡수, 수송 및 전신 수준을 연구하는 데 바람직할 수 있음을 제안합니다. 우리는 PV 및 하대정맥(IVC)에서 효율적인 혈액 샘플링을 위한 새로운 기술을 제시하여 문맥 및 전신 순환에서 상대적으로 많은 양의 혈액을 수집할 수 있습니다. 이것은 PV를 결찰함으로써 달성되며, 그로 인해 PV로 배출되는 장간막 정맥에서 다시 채워짐에 따라 PV의 확장 또는 확대를 허용합니다. 이 방법을 사용하여 성공적인 채취율과 채취된 혈액의 총량(IVC에서 최대 0.3mL, PV에서 최대 0.5mL)을 개선할 수 있었습니다.

서론

단쇄 지방산(SCFA)은 장내 미생물군에 의해 생성되는 주요 대사 산물 종류입니다. 장내 미생물군집과 다른 멀리 떨어진 장기 간의 상호 작용에서 이들이 중요한 역할을 하는 것은 염증을 조절하고, 전용 수용체를 통해 신호를 보내고, 세포 대사에서 기질 역할을 하는 방법을 설명하는 연구에 의해 뒷받침되었습니다 2,3,4,5. 우리 그룹의 최근 연구는 SCFA가 장-폐 축을 통한 생체 내 폐 면역 톤의 생체 내 염증 조절의 핵심이라고 제안했습니다 6,7. 추가 보고서에서는 장-뇌 축 8,9를 통해 신진 대사에 대한 기능적 영향을 설명했습니다. 전반적으로, SCFA가 숙주 생리학 및 병리학에 미치는 영향은 광범위한 질병 과정에 걸쳐 수많은 연구 그룹에 의해 적극적이고 집중적인 조사가 이루어지고 있습니다.

아세테이트(C2), 프로피오네이트(C3) 및 부티레이트(C4)는 주요 SCFA이며 맹장과 대장에서 섭취 가능한 식이 섬유의 발효를 통해 장내 미생물군에 의해 생성됩니다. 세 가지 SCFA는 모두 식단에서 직접 얻을 수 있으며 아세테이트만 포유류 세포에서 생산될 수도 있습니다. SCFA는 결장에서 흡수되며 장 상피 세포에서 부분적으로 활용됩니다(에너지원, 국소 조직 면역 조절 및 장 장벽 유지 지원). 그들은 또한 장간막 정맥 시스템(10)을 통해 문맥으로 운반됩니다. 부티레이트는 주로 장 상피에 의해 소비되고, 프로피오네이트는 간11,12에 의해 소비되며, 아세테이트는 말초 순환에 진입한 후 근육과 지방 조직에 작용하는 것으로 보고되었습니다13,14.

SCFA 생성, 흡수 및 기능적 활성에 대한 포괄적인 평가는 결장 내강, 문맥 순환 및 말초 혈액 내의 SCFA 수준에 대한 지식을 필요로 합니다. 이것은 문맥(PV)에서 혈액 채취와 전신 순환을 동시에 또는 동일한 동물에서 순차적으로 수행할 수 있습니다. SCFA는 휘발성이 높기 때문에15 배출된 분변 알갱이에서 SCFA의 수치를 측정하는 것은 결장 내 수치를 정확하게 반영하지 못할 수 있습니다. 더욱이, 결장 내용물로부터의 측정과 비교하여, PV에 존재하는 SCFAs의 수준은 결장의 길이에 걸쳐서 장내 미생물군집에 의해 생성된 불균일한 수준에 비해 숙주에 의해 흡수된 정상 상태 수준의 순 합계를 더 정확하게 반영할 수 있다11. 따라서 이러한 PV SCFA 수준은 장 내 국소적 효과를 넘어 숙주 생리학 및 병리학에 대한 SCFA의 영향을 연구하는 데 더 관련성이 높고 적절할 수 있습니다.

PV와 전신 순환 혈액의 조정되고 거의 동시적인 수집을 수행하기 위해 횡격막은 정상적인 혈액 순환을 유지하고 자발적인 호흡을 지원할 수 있도록 손상되지 않아야 합니다. 따라서 하대정맥(IVC)은 PV 혈액을 수집하면서 전신 순환 혈액을 얻을 수 있는 이상적인 부위를 제공합니다. 이 IVC 혈액은 전신 염증을 평가하기 위해 순환 사이토카인을 측정하는 것과 같은 다른 목적으로도 사용할 수 있습니다.

현재, 전신 순환 및 PV로부터 혈액을 수집하는 몇 가지 방법만이 더 큰 설치류에서 보고되었다16,17. 쥐에서 혈관의 캐뉼레이션(cannulation)을 필요로 하는 기존의 방법은 마우스에서 기술적으로 수행하기 어렵습니다. 또한, 이러한 방법에 의해 수집된 혈액의 최대량은 일반적으로 0.3mL 이하이다18.

이 논문에서는 동일한 동물에서 마우스 IVC에서 이중 혈액 채취 후 PV를 채취하는 과정을 단순화하는 새로운 방법을 제시합니다. 이 방법의 독특한 특징은 PV 혈액 샘플링 직전에 간 힐럼 근처에서 PV를 결찰하는 것입니다. 이 접근법은 PV의 치수를 확장하여 성공률을 크게 향상시킬 뿐만 아니라 최대 수집 가능한 혈액량을 최대 0.5mL까지 증가시킬 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

이 비생존 절차의 모든 단계는 캘리포니아 대학교 샌프란시스코(University of California San Francisco)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 사용된 마우스 성별 및 균주는 수컷 C57BL/6J 마우스(체중 25-35g, 12-15주 령)였습니다. 암컷 및/또는 다른 표준 마우스 균주도 사용할 수 있습니다.

1. 마취

  1. 70% 에탄올 면봉으로 마우스 복부의 아래쪽 절반을 닦습니다. 트리브로모에탄올(250-400mg/kg)을 복강 내 주사하여 마취를 투여합니다. 케타민/자일라진 또는 이소플루란 마취도 사용할 수 있습니다. 각막 손상을 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오.
  2. 진통을 위해 부프레노르핀(0.05-0.1mg/kg)을 복강내로 주사합니다.
    참고: 부프레노르핀은 개복술 절차와 관련된 통증 때문에 필요합니다.

2. 개복술

  1. 마취된 마우스를 앙와위 위치의 수술 표면(아래에 가열 패드가 있음)에 놓습니다. 수술 보드의 모든 쥐 팔다리를 테이프로 고정합니다. 페달 철수 반사 없이 발가락 꼬집으로 적절한 마취 깊이가 달성되었는지 확인합니다.
  2. 피부를 들어 올리고 배꼽에서 xiphoid 돌기까지의 정중선을 따라 그리고 복부 기저부(외부 생식기 기관)를 향해 꼬리 방향으로 절개하여 절개가위로 세로로 절개합니다.
  3. 창자, 횡격막 또는 간을 천공하거나 손상시키지 않고 절개 가위로 복막을 유사하게 절개하십시오.
  4. 배꼽 양쪽에 가위로 전신 횡절개(복부 너비 확장)를 하여 수술 영역을 확장합니다.
  5. 따뜻한 PBS에 적신 깨끗한 거즈를 사용하여 대장과 소장을 외과 의사의 오른쪽으로 이동하여 아래의 IVC를 노출시킵니다.

3. PV를 위한 합자 준비

  1. 면봉으로 수술 부위 내의 장 분절을 부드럽게 조작하여 장간막의 뿌리에서 PV를 찾습니다.
  2. 혈관 및 기타 복부 구조를 시각화하기 위해 해부 현미경을 사용하여 간 hilum(십이지장 정맥과 비장 정맥 사이)19 근처의 PV 뒤에 7-0 prolene 봉합사를 조심스럽게 통과시켜 5단계에서 결찰을 준비할 수 있도록 합니다(그림 1).
    참고: 이 단계부터 현미경을 사용하는 것은 필수는 아니지만 전체 절차의 성공률을 크게 향상시킵니다.

4. IVC에서 혈액 샘플 채취

  1. 헤파린화된 1cc 인슐린 주사기의 28G 1/2인치 바늘을 IVC에 삽입합니다. 0.2-0.3mL의 혈액 샘플을 수집합니다.
    알림: 이 단계에서 너무 많은 혈액을 제거하면 5단계에서 수집된 PV 혈액의 양이 줄어듭니다.
  2. 제거 시 발생할 수 있는 출혈을 피하기 위해 바늘을 IVC 내부에 두십시오.

5. PV에서 혈액 샘플 수집

  1. PV 주위에 7-0 프롤렌 합자를 부드럽게 묶습니다. PV는 되메우기에 따라 확장 및 확장되어야 합니다. 다른 헤파린화 된 28cc 인슐린 주사기의 1G 2G 1 / 1 인치 바늘을 PV에 삽입합니다.
  2. PV에서 최대 0.3-0.5mL의 혈액을 수집하기 위해 천천히 흡인합니다. PV는 붕괴될 수 있지만 장간막 정맥계에서 혈액이 다시 채워지면서 점차적으로 다시 팽창해야 합니다.

6. 샘플 보관

  1. 채혈 후 IVC 및 PV에서 바늘을 제거합니다.
  2. 혈액 검체를 주사기에서 1.5 mL 헤파린화 된 eppendorf 튜브로 옮기고 얼음 위에 올려 나중에 플라즈마로 처리하여 필요에 따라 보관 및 분석합니다.
  3. 마취제 과다 투여 후 자궁 경부 탈구를 사용하여 마우스를 안락사시킵니다(UCSF IACUC 승인 지침에 따름).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

위에서 설명한 방법을 사용하면 동일한 마우스에서 IVC 및 PV의 혈액 샘플을 순차적으로 수집하여 95% 이상의 성공률을 얻을 수 있습니다. 수집된 혈액 샘플의 평균 부피는 IVC의 경우 0.25mL, PV의 경우 0.35mL입니다.

가스 크로마토그래피-질량분석법(GC-MS)을 사용하여 대변, PV 혈액 및 IVC 혈액 내 SCFA의 농도를 측정하여 장내 세균을 발효시켜 생성되는 결장 구획에서 아세테이트(C2), 프로피오네이트(C3) 및 부티레이트(C4)가 전신 순환계로 흡수 및 이동하는 과정을 추적할 수 있었습니다.

구체적으로, 이 실험에서는 식이섬유 섭취가 생쥐의 SCFA 생성에 미치는 영향을 조사했습니다. 생쥐에게 1주 또는 2주 동안 고섬유질 식단(섬유질 35%)을 제공하고 섬유질이 없는 식단을 먹인 쥐와 비교했습니다. 우리는 고섬유질 그룹에서 섬유 발효 박테리아 분류군의 증가를 예상하고 관찰했습니다(데이터는 표시되지 않음...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

이 논문은 동일한 실험용 마우스에서 IVC 및 PV에서 혈액 샘플을 거의 동시에 순차적으로 수집하기 위한 혁신적인 in vivo 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 문맥 순환을 통해 이동하는 SCFA와 같은 장내 미생물군 생성 제품의 수준을 측정하는 데 유용합니다. 마우스(체중 25-30g)에서 말기 시술 중에 수집할 수 있는 평균 최대 혈액량은 약 1mL/마우스이며, 이는 총 순환 혈액량18의 50%를 차지한다. 그러나 두 개의 상호 작용하고 인접한 정맥 시스템에서 원하는 실험 측정에 충분한 혈액을 얻는 것은 어려울 수 있습니다. 마우스에서 PV의 혈관 내 압력은 IVC25보다 3-5mmHg 높기 때문에 PV의 압력 감소는 IVC의 압력 감소로 이어질 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 또한, 장간막과 비장(2...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

AP는 NIH/NHLBI(1R01HL146753)의 R01 상으로 자금을 지원합니다. DM은 NIH의 T32 펠로우십과 UCSF Benioff Center for Microbiome Medicine의 연수생/직원 파일럿 어워드의 자금 지원을 받습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2,2,2 트리브로모에탄올, 97%(Avertin)Sigma Aldrich T48402-25G마취제 
부프레노르핀 하이드로클로라이드 주사 0.3 mg/mLPAR 제약 NDC 42023-179-05진
드레싱 펜치Miltex 6-100해부 
그레이프 펜치로보즈RS-5136해부 
Hepatin sodium 1000 USP 단위/mLHikmaNDC 0641-0391-12혈액 샘플 주사기/튜브 간화
Prolene 7-0Ethicon8696G포털 정맥 결찰
가위F.S.T14058-11해부 
학생 Halsted-Mosquito HemostatsF.S.T 91308-12해부 
수술 용 테이프 3M Transpore1527-1마우스 팔다리 고정
U-100 인슐린 주사기 28G1/2EXEL26027혈액 샘플 수집 
통제

참고문헌

  1. vander Hee, B., Wells, J. M. Microbial regulation of host physiology by short-chain fatty acids. Trends Microbiol. 29 (8), 700-712 (2021).
  2. Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: Short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
  3. Vinolo, M. A. R., Rodrigues, H. G., Nachbar, R. T., Curi, R. Regulation of inflammation by short chain fatty acids. Nutrients. 3 (10), 858-876 (2011).
  4. Layden, B. T., Angueira, A. R., Brodsky, M., Durai, V., Lowe, W. L. Short chain fatty acids and their receptors: new metabolic targets. Transl Res. 161 (3), 131-140 (2013).
  5. den Besten, G., et al. The role of short-chain fatty acids in the interplay between diet, gut microbiota, and host energy metabolism. J Lipid Res. 54 (9), 2325-2340 (2013).
  6. Tian, X., et al. Elevated gut microbiome-derived propionate levels are associated with reduced sterile lung inflammation and bacterial immunity in mice. Front Microbiol. 10, 159(2019).
  7. Liu, Q., Tian, X., Maruyama, D., Arjomandi, M., Prakash, A. Lung immune tone via gut-lung axis: Gut-derived LPS and short-chain fatty acids’ immunometabolic regulation of lung IL-1β, FFAR2, and FFAR3 expression. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (1), L65-L78 (2021).
  8. De Vadder, F., et al. Microbiota-generated metabolites promote metabolic benefits via gut-brain neural circuits. Cell. 156 (1-2), 84-96 (2014).
  9. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota–gut–brain communication. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (8), 461-478 (2019).
  10. Sun, M., Wu, W., Liu, Z., Cong, Y. Microbiota metabolite short chain fatty acids, GPCR, and inflammatory bowel diseases. J Gastroenterol. 52 (1), 1-8 (2017).
  11. Cummings, J. H., Pomare, E. W., Branch, H. W. J., Naylor, C. P. E., MacFarlane, G. T. Short chain fatty acids in human large intestine, portal, hepatic and venous blood. Gut. 28 (10), 1221-1227 (1987).
  12. Macfarlane, G. T., Gibson, G. R., Cummings, J. H. Comparison of fermentation reactions in different regions of the human colon. J Appl Bacteriol. 72 (1), 57-64 (1992).
  13. Neis, E. P., et al. Distal versus proximal intestinal short-chain fatty acid release in man. Gut. 68 (4), 764-765 (2019).
  14. Yamashita, H., et al. Effects of acetate on lipid metabolism in muscles and adipose tissues of type 2 diabetic Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) Rats. Biosci Biotechnol Biochem. 73 (3), 570-576 (2009).
  15. Ríos-Covián, D., et al. Intestinal short chain fatty acids and their ink with diet and human health. Front Microbiol. 7, 185(2016).
  16. Jaworska, K., et al. An in vivo method for evaluating the gut-blood barrier and liver metabolism of microbiota products. J Vis Exp. (140), e58456(2018).
  17. Ashcroft, S. P., et al. Protocol to assess arteriovenous differences across the liver and hindlimb muscles in mice following treadmill exercise. STAR Protoc. 4 (1), 101985(2023).
  18. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  19. Cheever, A. W., Warren, K. S. Portal vein ligation in mice: Portal hypertension, collateral circulation, and blood flow. J Appl Physiol. 18, 405-407 (1963).
  20. Bloemen, J. G., et al. Short chain fatty acids exchange across the gut and liver in humans measured at surgery. Clin Nutr. 28 (6), 657-661 (2009).
  21. Hoyles, L., et al. Microbiome–host systems interactions: Protective effects of propionate upon the blood–brain barrier. Microbiome. 6 (1), 55(2018).
  22. Shimizu, J., et al. Propionate-producing bacteria in the intestine may associate with skewed responses of IL10-producing regulatory T cells in patients with relapsing polychondritis. PLoS One. 13 (9), e0203657(2018).
  23. Wang, J., et al. Propionate protects against lipopolysaccharide-induced mastitis in mice by restoring blood–milk barrier disruption and suppressing inflammatory response. Front Immunol. 8, 1108(2017).
  24. Lucas, S., et al. Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss. Nat Commun. 9 (1), 55(2018).
  25. Xie, C., Wei, W., Zhang, T., Dirsch, O., Dahmen, U. Monitoring of systemic and hepatic hemodynamic parameters in mice. J Vis Exp. (92), e51955(2014).
  26. Sänger, C., et al. Intrahepatic vascular anatomy in rats and mice - Variations and surgical implications. PLoS One. 10 (11), e0141798(2015).
  27. Phillips, B. J., Mirzaie, M., Turco, L. Portal Vein Injuries: A Review. J Emerg Trauma. 2 (2), 4(2017).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

더 많은 논문 탐색

단쇄지방산문맥 샘플링마우스 혈액 채취SCFA 흡수장내 마이크로바이옴문맥혈대사물질 운송마우스 수술 기법
하대정맥(Inferior Vena Cava)에서 순차적 혈액 채취 후 문맥(portal vein)을 통해 생쥐의 장내 미생물 대사산물을 평가합니다.
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.