방법 논문

Periadventitial Calcium Chloride and Elastase Infiltration에 의한 마우스 복부 대동맥류 모델

DOI:

10.3791/66674

⸱

2024년 8월 2일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of General Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 2Key Laboratory of Birth Defects and Related Diseases of Women and Children of MOE, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Second University Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 원고는 염화칼슘과 엘라스타제를 사용하여 생쥐 복부 대동맥류 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시하고 이전 모델링 방법의 장점을 결합합니다. 이 모델은 복부 대동맥류의 기저에 있는 병태생리학적 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

복부 대동맥류(AAA)는 높은 사망률과 관련하여 생명을 위협하는 질병입니다. 동맥 직경이 50% 이상 증가함에 따라 복부 대동맥이 영구적으로 확장되는 것이 특징입니다. 병태생리학적 변화를 모방하고 AAA의 기본 메커니즘을 연구하기 위해 AAA의 다양한 동물 모델이 도입되었습니다. 이러한 모델 중 염화칼슘(CaCl2) 및 엘라스타제 유도 AAA 모델은 마우스에서 일반적으로 사용됩니다. 그러나 이러한 방법에는 특정 제한 사항이 있습니다. 기존의 광강내 돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 관류는 기술적 난이도가 높고 파열률이 높은 반면, PPE의 유습 투여는 일관되지 않은 결과를 낳습니다. 또한 CaCl2 유도 AAA 모델에는 죽상혈전증 및 동맥류 파열과 같은 인간 AAA 기능이 없습니다. 따라서 CaCl2 와 PPE의 결합 적용은 AAA 동물 모델에서 성공률을 높이고 더 큰 직경 증가를 유도하는 접근 방식으로 제안되었습니다. 이 원고는 복부 대동맥의 내측에서 PPE 및 CaCl2 의 대동맥 주위 침윤을 통해 마우스 AAA 모델을 확립하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜을 따르면 기술적 단순성과 재현성으로 약 90%의 AAA 형성률을 달성할 수 있습니다. 추가 초음파 및 조직학적 실험을 통해 이 모델이 인간 AAA에서 관찰된 형태학적 및 병리학적 변화를 효과적으로 복제한다는 것을 확인했습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

복부 대동맥류(AAA)는 복부 대동맥의 직경이 50% 이상 증가하거나 최대 대동맥 직경이 3cm를 초과하는 것으로 정의됩니다. 이 질환은 생명에 심각한 위협이 되며, 동맥류 파열 시 사망률이 약 90%에 이릅니다 1,2,3. 현재 개복 수술 및 혈관 내 대동맥 수복술(EVAR)은 AAA 환자에게 사용할 수 있는 유일한 중재법이다 4,5,6. 그러나 외과적 적응증이 없는 환자에서 동맥류 형성을 억제하거나 복부 대동맥의 성장 속도를 늦추는 의학적 치료의 효과를 뒷받침하는 근거는 불충분하다7. 그럼에도 불구하고 동맥류 최대 직경에 대한 지속적인 감시, 혈압 조절, 항혈소판 요법 및 스타틴을 포함한 비특이적 치료법은 갑작스러운 동맥류 파열과 잠재적인 심혈관 및 신경학적 사건의 위험을 최대한 줄이기 위해 사용됩니다. 그럼에도 불구하고 동맥류 파열을 예방하는 항혈소판제와 스타틴의 역할은 여전히 논란의 여지가 있으며 추가 연구가 필요하다 5,7,8,9,10.

안정적인 AAA 동물 모델은 AAA의 발병 기전을 조사하는 데 필수적이며, 이러한 모델을 확립하기 위해 수많은 방법이 도입되었습니다 11,12,13. 현재 염화칼슘(CaCl2), 엘라스타제, 안지오텐신 II(Ang II), 이종이식 및 형질전환 모델이 설치류 AAA 모델을 확립하는 데 사용됩니다(11,12,13). 이 중 Ang II는 마우스에서 가장 일반적으로 사용되는 반면, CaCl2 및 엘라스타제는 마우스와 랫트에서도 널리 사용됩니다 11,12,13,14. Ang II 유도 AAA 모델은 인간 AAA 병리학과 매우 유사한 죽상동맥경화증을 유도할 수 있는 유일한 동물 모델로, 간단하고 재현 가능하며 개복술의 필요성을 없애줍니다 11,12,13. 그러나 CaCl2 또는 엘라스타제에 의해 유도된 모델과 달리 Ang II에 의해 유도된 동맥류 부위는 불확실하고 하행 대동맥 또는 복부 상부 대동맥에서 자주 관찰되며 파열 위험이 높습니다 11,12,13,14. 유전자 결핍 마우스에서 Ang II 유도 AAA 모델의 동맥류 발생률은 100%까지 높을 수 있는 반면, C57BL/6 마우스의 39%만이 동맥류를 발생시켰으며, 유전자 결핍 마우스를 얻는 데 드는 시간과 경제적 비용이 높습니다13,15.

Gertz et al.에 의해 처음 소개된 CaCl2는 경동맥에서 동맥류 형성을 유도하는 데 사용되었으며 나중에 Chiou et al.에 의해 수정되어 마우스16,17에서 AAA 모델을 확립했습니다. 그러나 탄성 섬유 파괴, 혈관 염증 및 세포외 기질 저하를 유도하는 능력에도 불구하고 CaCl2는 죽상혈전증, ILT(Intraluminal thrombus) 및 동맥류 파열12,18을 포함한 여러 인간 AAA 기능이 없습니다. 또한, 대동맥 주위 CaCl2 적용의 형성 속도 및 직경 증가 비율은 불안정한 상태로 남아 있습니다13,19. AAA를 유도하기 위한 초기 발광 내 돼지 췌장 엘라스타제(PPE) 관류 모델은 1990년 Anidjar et al.에 의해 개발되었으며, 그 후 Bhamidipati et al.의 쥐 모델에서의 유래 PPE 침투에 대한 보고서가 뒤따랐습니다 20,21. 오늘날 엘라스타제 유도 AAA 동물 모델의 대다수는 실현 가능성과 최소 침습적 특성으로 인해 Bhamidipati의 프로토콜을 사용합니다. 그러나 AAA의 발생률과 최대 직경은 다양할 수 있으며 일반적으로 대동맥 내 PPE 관류보다 낮다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 또한, 엘라스타제의 대동맥 주위 도포에 의해 유발된 동맥류는 자연 치유되는 경향을 나타낸다 11,12,20,21,22,23.

이러한 한계를 해결하기 위해 Tanaka 등은 쥐에서 AAA 모델을 확립하기 위해 광내 PPE 관류와 CaCl2 침투를 포함하는 조합 접근법을 제안했으며, 이는 만족스러운 결과를 산출했습니다24. 또한, Zhu et al.은 PPE + CaCl2 모델이 단일 PPE 그룹 및 PPE + BAPN 그룹25에 비해 더 높은 생존율 및 증가된 동맥류 형성률과 같은 이점을 제공한다는 것을 입증했습니다. 이 결합된 접근 방식은 또한 우수한 안정성과 재현성을 나타냅니다. 또한, Bi et al.은 대동맥 주위 CaCl2와 엘라스타제 배양의 조합을 통해 토끼 AAA 모델을 성공적으로 확립했습니다. 평균 팽창율은 5일째 65.3% ± 8.9%였으나, 15일째 86.5% ± 28.7%로 더욱 증가하였고,26 30일째 203.6% ± 39.1%로 크게 증가하였다. 그러나 현재 대동맥 주위 CaCl2와 엘라스타제 적용을 결합하여 설치류에서 AAA의 유도를 보고하는 기존 문헌은 없습니다.

이 원고는 intraventitial CaCl2 및 elastase infiltration의 조합을 통해 murine AAA 모델을 확립하기 위한 표준 프로토콜을 제시합니다. 다음 섹션에서는 자세한 수술 절차를 제공하고 쥐 AAA 모델의 대표적인 결과를 제시합니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

동물 실험 프로토콜은 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(NIH Pub No. 86/23, 1985)를 준수했으며, 쓰촨 대학교 화화(West China Hospital)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호 202311300012)의 승인을 받았습니다. 이 연구에는 8주에서 10주 된 C57/B6J 수컷 마우스가 사용되었습니다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 수술 전 준비

  1. 동물을 구하여 표준 조건(온도 24°C, 습도 40%-50%, 12시간 명암 주기)에서 깨끗한 물로 정상적인 차우 식단을 먹입니다.
  2. 화장솜을 40mm x 4mm 스트립으로 자르고 가위, 집게 및 기타 수술 장비와 함께 소독합니다.
  3. 동물을 마취 기계의 유도 챔버에 넣고 3%-3.5% 이소플루란을 사용하여 빠르게 마취를 유도합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름). 또한 선제적 진통제로 부토르파놀(1mg/kg, 근육주사)을 처방한다.
    1. 통증 자극에 더 이상 반응하지 않으면 챔버에서 마우스를 제거한 다음 마우스에 마스크를 놓고 1%-1.5% 이소플루란으로 마취 깊이를 유지합니다. 5-10분마다 호흡수와 깊이를 모니터링합니다.
  4. 마우스를 가열 패드의 누운 자세에 놓고 접착 테이프를 사용하여 팔다리를 고정하고 안연고를 바르어 건조를 방지합니다.
  5. 전기 면도기나 제모 로션을 사용하여 복부 부위의 털을 완전히 제거한 다음 포비돈 요오드와 에탄올에 적신 면봉으로 이 부위를 3회 이상 원을 그리며 소독합니다.

2. 수술 절차

  1. 마우스를 실체현미경 아래에 놓습니다. 가위를 사용하여 복부 정중선을 따라 약 2-2.5cm의 세로로 절개합니다.
  2. linea alba(경복부 접근법)를 통해 복막강에 들어가 견인기를 놓아 복막강을 노출시키고 생리식염수에 적신 거즈를 사용하여 장과 결장을 복부 오른쪽 절반에 포장합니다.
  3. 겸자와 면봉을 사용하여 복부 대동맥과 하대정맥(IVC)에 인접한 결합 조직과 지방 조직을 둔하게 분리합니다. 복부 대동맥을 부드럽게 절개하고 앞서 언급한 바와 같이 복부 대동맥과 그 위에 있는 대요근 사이의 틈을 노출시킨다25.
    1. 멸균된 화장솜 스트립을 그 틈에 삽입하고 요추 동맥이나 정맥이 손상되지 않도록 각별히 주의하십시오. IVC에서 복부 대동맥을 분리할 필요는 없습니다.
  4. 면봉에 0.9M CaCl2 를 적시고 복부 대동맥의 막부에 15분 동안 놓습니다. 침윤 과정에서 복강을 덮기 위해 멸균된 거즈를 사용하십시오.
  5. CaCl2에 적신 면봉을 부드럽게 제거하고 침투된 부분을 0.9% 식염수로 세척합니다.
  6. 엘라스타제를 ddH2O로 2mg/mL(8U/mL)로 희석합니다. 인슐린 주사기를 사용하여 희석된 엘라스타제 50μL를 복부 대동맥의 내측 분절에 바르고 면 패드 스트립을 감싸 복부 대동맥과 IVC를 덮습니다. 침윤 과정에서 복강을 덮기 위해 멸균된 거즈를 사용하십시오. 가짜 그룹에서는 CaCl2 및 PPE를 대체하기 위해 0.9% 생리식염수를 사용하십시오.
  7. 15분 후 거즈와 화장솜 스트립을 조심스럽게 제거합니다. 장과 결장을 원래 위치로 되돌려 놓고, 치료한 대동맥을 장간막으로 덮고, 장을 촉촉하게 하여 유착을 방지합니다.
  8. 6-0 비흡수성 폴리프로필렌 봉합사를 사용하여 근육층과 피부를 따로 닫습니다. 수술 부위를 포비돈 요오드와 에탄올로 소독합니다.
  9. 마우스를 가열 패드에 놓고 의식을 회복할 때까지 호흡 상태를 모니터링합니다. 수술 시간과 실험 동물의 수를 기록합니다. 수의사의 권고에 따라 수술 후 최소 3일 동안 수술 후 진통으로 카프로펜(5mg/kg, 피하)을 처방하십시오.

3. 초음파 검사

  1. 수술 21일 후 초음파 검사를 실시하여 AAA 발생률을 평가합니다.
  2. 쥐를 마취하고(기관에서 승인된 프로토콜에 따라) 이전에 설명한 대로 복부를 제거합니다.
  3. 설치류 초음파 기계의 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 복부에 초음파 접촉 매질을 적용하고 동맥류의 최대 직경과 복부 대동맥의 정상 분절 직경을 측정합니다.
    1. infrarenal abdominal aorta의 증가된 백분율을 계산합니다. 성공적인 AAA 형성을 위한 기준은 AAA의 최대 직경이 흉부 대동맥의 정상 분절 직경에 비해 50% 이상 증가했다는 것입니다.
  4. 검사 후 냅킨을 사용하여 남아있는 초음파 접촉 매질을 닦아내고 완전히 회복 될 때까지 마우스를 가열 패드에 올려 놓습니다.

4. 복부 대동맥 채취 및 병리학 실험

  1. 초음파 검사 다음 날에 이소플루란 과다 복용으로 마우스를 희생합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
  2. 흉강 및 복강을 열고 이전 문헌27에 설명된 절차에 따라 폐와 간이 하얗게 변할 때까지 좌심실을 통해 1x PBS로 관류를 수행합니다.
  3. 디지털 캘리퍼스를 사용하여 대동맥 내륙 대동맥의 외경을 측정합니다. 실체현미경으로 infraarenal abdominal aorta를 채취하고 혈관을 24-48시간 동안 4% 파라포름알데히드에 보관합니다.
  4. 복부 대동맥을 둘러싼 결합 및 지방 조직을 제거합니다. 대동맥을 파라핀에 삽입하여 절편을 준비하고 앞서 설명한 대로 단면을 3-5μm 조각으로 자릅니다18,28.
  5. 제조업체의 지침에 따라 각각의 염색 키트를 사용하여 탈파라핀화된 슬라이스에 대해 헤마톡실린 및 에오신(H&E), Masson의 삼색조 및 EVG(Elastic-Van Gieson) 염색을 수행합니다.
    1. H&E 염색으로 혈관 구조와 염증을 분석하고, Masson의 삼색 염색으로 세포외기질(ECM) 분해 및 콜라겐 섬유를 관찰하고, EVG 염색으로 탄성 섬유를 검사합니다.

결과

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이 연구에서는 총 24 마리의 마우스를 포함하여 무작위로 할당했습니다 : 각각 Sham 그룹에 12 명, PPE + CaCl2 그룹에 12 명. 모든 데이터는 달리 명시되지 않는 한 표준 편차 ± 평균으로 표시됩니다. 평균 작동 시간은 55.67분± 4.08분이었습니다. 수술 중 사망이나 동맥류 파열은 없었으며, 수술 후 21일 이내 생존율은 100%였다. 복부 대동맥 박리와 관련된 심각한 장 유착이나 합병증은 관찰되지 않았다.

PPE + CaCl2 그룹에서는 수술 후 21일째 되는 날에 12마리 중 11마리(91.67%)에서 AAA가 발생했으며, 샴 그룹에서는 동맥류 형성이 관찰되지 않았다. 흉부 대동맥의 평균 최대 내경은 PPE + CaCl2 그룹에서 1.29mm ± 0.18mm인 반면, Sham 그룹에서는 0.50mm ± 0.04mm였습니다. PPE + CaCl2 그룹에서 복부 대동맥 내경의 평균 증가율은 99.50% ± 25.42%였습니다. 평균 최대 외부 대동맥 직경은 PPE + CaCl2 그룹에서 1.49mm ± 0.19mm인 반면, Sham 그룹에서는 0.61mm ± 0.04mm였습니다.

실체현미경 및 초음파로 측정한 Sham 및 PPE + CaCl2 그룹의 복부 대동맥의 대표 이미지를 그림 1A,B에 나타내었습니다. PPE + CaCl2 및 Sham 그룹에서 평균 내구 복부 대동맥 최대 내부 및 외부 직경에 대한 통계 분석 결과를 그림 1C,D에 제시했습니다. H&E 염색을 사용한 추가 조직학적 검사에서 대동맥 벽이 두꺼워지고 PPE + CaCl2 그룹에서 염증 세포가 침윤하는 것으로 나타났으며, Masson의 트리크롬 염색에서는 대동맥 벽에서 세포외 기질 저하 및 콜라겐 섬유 침착이 나타났습니다. EVG 염색은 탄성 섬유 파괴를 보여주었습니다(그림 1E).

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그림 1: intraventitial CaCl2 및 엘라스타제 침투에 의해 확립된 마우스 AAA 모델의 결과. (A) 실체현미경으로 촬영한 정상 복부 대동맥 및 AAA의 대표 이미지. (B) Sham 및 PPE + CaCl2 그룹에서 복부 대동맥의 횡방향 및 종방향 초음파 이미지. (C) Sham 및 PPE + CaCl2 그룹에서 복부 대동맥의 최대 내경에 대한 통계적 분석, ****p < 0.0001. (D) Sham과 PPE + CaCl2 그룹의 외부 대동맥 직경 비교, ****p < 0.0001. (E) 복부 대동맥의 H&E, Masson 및 EVG 염색 이미지. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AAA의 분자 메커니즘에 대한 연구는 안정적인 동물 모델을 필요로 합니다. 결과적으로, 1960년대에 Economou et al.에 의해 처음 개발된 이래 수많은 AAA 동물 모델이 확립되었다29. 이러한 모델 중 CaCl2 는 비용 효율성, 기술적 단순성 및 신뢰할 수있는 재현성으로 인해 설치류에 자주 사용됩니다. 그러나, 혈관 주위 CaCl2 침윤은 AAA를 형성하는 데 불안정한 것으로 나타났습니다. Bi et al. 및 Freestone et al.은 AAA 형성의 기준이 복부 대동맥의 정상 분절에 비해 20% 증가로 정의되었을 때에도 쥐의 약 60%만이 AAA가 발생했다고 보고했습니다. 두 연구 모두 20분 동안 0.5mol/L CaCl2 의 대동맥 주위 배양 후 동맥류 형성이 관찰되지 않았다고 언급했습니다 13,19,26,30.

더욱이, 현재 기존 문헌에는 CaCl2 침투의 최적 농도, 노출 시간 및 추적 기간에 대한 합의가 없다11. 따라서 엘라스타제 유도 AAA 모델은 AAA를 연구하기 위해 두 번째로 일반적으로 사용되는 설치류 모델입니다. 그러나 대동맥 내 PPE 주입은 최대 40%의 높은 수술 전후 사망률과 관련이 있습니다. 또한, PPE 유도 AAA 모델에서 주목할만한 성별 불일치가 관찰되었으며, 암컷 마우스는 수컷 마우스에 비해 대동맥 직경의 훨씬 낮은 백분율 증가를 나타냅니다 11,20,25,31,32,33.

이러한 한계를 해결하기 위해, 혈관 주위 엘라스타제 침윤을 포함하는 엘라스타제 유도 AAA 모델의 수정된 버전이 실현 가능하고 덜 침습적인 대안으로 도입되었습니다. 그러나, 이 접근법을 사용한 동맥류 형성 속도 및 직경은 내강 내 PPE 관류 11,12,21,22보다 덜 안정적이었다는 점에 유의해야 한다. 따라서 연구자들은 토끼에서 AAA를 확립하기 위해 외래 주위 CaCl2와 엘라스타제 배양의 조합을 제안했으며, 이는 간단하고 효과적이며 재현 가능한 것으로 나타났습니다26.

한편, 또 다른 연구에서는 PPE 관류와 CaCl2 배양을 결합하여 쥐에서 AAA 모델을 확립하여 PPE + CaCl2 모델이 높은 생존율, 높은 동맥류 형성률 및 우수한 재현성을 갖는다는 것을 입증했습니다25. 그러나 현재 대동맥 주위 PPE + CaCl2 침투를 사용하여 마우스에서 AAA를 설정하는 방법과 그 결과에 대한 문헌은 없습니다.

이 논문은 초음파 및 조직학 검사에 의해 확인된 바와 같이 이 프로토콜을 사용한 AAA 발생률과 대동맥 직경 백분율의 증가가 수술 전후 사망 없이 안정적으로 유지되었음을 나타냅니다. 더욱이, 이 프로토콜은 인간 AAA에서 볼 수 있는 것과 유사한 형태학적 및 병리학적 변화를 효과적으로 유도합니다. 또한, 이 프로토콜의 평균 작동 시간은 CaCl2 침투 15분 및 PPE 배양 15분을 포함하여 1시간 미만으로 제한되었습니다. 이 수술 프로토콜은 쉽게 구할 수 있는 재료를 사용하여 견고하고 쉽게 구현할 수 있습니다. 이러한 장점은 향후 기초 연구 노력에 잠재적으로 적용될 수 있음을 시사합니다.

PPE 또는 CaCl2 유도 AAA 동물 모델에서 동맥류 발병 속도에 불일치가 존재하며, 현재의 화학적 유도 모델은 AAA 11,12,13 확립에 있어 100% 성공률을 보장할 수 없습니다. PPE 또는 CaCl2 침윤 후에는 만성 염증, 내막/매체 두께, 탄성 파괴, 석회화 및 내강 내 혈전과 같은 AAA와 관련된 병리학적 변화를 관찰할 수 있지만, 대동맥의 확장 또는 동맥류의 형성은 화학적 적용 기간이 제한되고 자극이 멈추면 지속적인 활동을 제공하지 않기 때문에 자발적으로 치유되는 경향이 있을 수 있다12, 23. 또한, AAA를 확립하기 위한 수술 절차를 완전히 표준화할 수 없기 때문에 복부 대동맥의 노출 정도에 잠재적인 변동이 발생할 수 있으며, 이는 동맥류 형성에 영향을 미칠 수 있습니다. 그러나, 모델링이 실패한 마우스에서도, 복부 대동맥의 직경은 여전히 44%의 유의한 팽창을 보였는데, 이는 이 방법이 복부 대동맥류의 진단 기준을 항상 충족하지는 않을지라도, 복부 대동맥의 상당한 확대를 유도할 수 있음을 시사한다.

특히 중요한 것은 이 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 관련되어 있다는 것입니다. 무엇보다도, 마우스 AAA 모델을 확립하는 동안 내측 복부 대동맥을 적절하게 노출시키는 것이 필수적입니다. 복부 대동맥을 둘러싼 결합 조직과 지방 조직의 분리를 최대화하면 CaCl2와 엘라스타제가 복부 대동맥의 중간층으로 더 잘 침투할 수 있어 동맥류 형성 속도가 증가한다22. 또한, CaCl2 침투 후 결합 조직과 지방 조직을 분리하는 것이 더 쉬울 수 있습니다. 따라서 주변 조직의 초기 절개가 만족스럽지 않은 경우 CaCl2 침윤 후 복부 대동맥에 인접한 결합 조직을 계속 분리하는 것이 바람직합니다. 그러나 복부 대동맥이 노출되면 요추 동맥과 정맥이 손상되어 수술 중 또는 수술 후에 심각한 출혈과 치명적인 결과를 초래할 수 있는 위험이 내재되어 있습니다. 따라서 복부 대동맥 주변의 결합 및 지방 조직을 제거할 때 각별한 주의를 기울여야 합니다. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 하대정맥(IVC)에서 복부 대동맥을 분리하는 것입니다. 이전 연구 및 실험 결과는 복부 대동맥에서 IVC를 절제할지 여부가 동맥류 형성에 영향을 미치지 않는다는 것을 일관되게 나타내므로 이 절차에 필요하지 않습니다18,22.

이 연구에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 동맥류의 발병률과 다양한 시점에서 복부 대동맥의 병리학적 변화에 대한 기준 데이터가 부족합니다. 또한 MMP2, MMP9, TIMP1 및 SMA와 같은 AAA 개발에 관련된 중요한 바이오마커의 수준을 평가하지 않았습니다. 둘째, 이 방법은 이전에 마우스에서 사용된 적이 없으며 동맥류 형성 및 병리학적 특성을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 다른 모델, 특히 PPE 또는 CaCl2 단독으로 관련된 모델과의 단면 비교가 부족합니다. 셋째, 이 방법에 의해 유도된 AAA는 죽상동맥경화증 및 벽내 혈전증을 포함한 인간 AAA의 여러 가지 특징이 결여되어 있습니다. 또한, 이 방법에 사용된 CaCl2 및 엘라스타제의 농도와 침투 시간은 이전 연구에서 사용된 것과 약간 다릅니다. 저자들은 향후 연구에서 실험적 조사를 통해 이러한 질문을 해결하는 것을 목표로 합니다.

이 프로토콜의 또 다른 제한 사항은 돼지 또는 개와 같은 더 큰 동물 모델에 적용할 수 있다는 것입니다. 현재 엘라스타제, 콜라겐분해효소 또는 CaCl2와 같은 개별 화학 물질은 토끼를 제외한 비설치류에서 복부 대동맥의 50% 확장을 유도하는 능력을 입증하지 못했습니다. 화학 물질과 혈관 성형술 또는 기타 외과 수술의 조합만이 개와 돼지에서 동맥류 형성을 유발할 수 있는 잠재력을 보여주었다11,34. 이전 연구에서는 또한 엘라스타제35에 의해 유도된 토끼 AAA 모델에서 5개월 추적 관찰 중 동맥류가 재생 징후를 보였다고 밝혔습니다. Bi 등이 이 프로토콜을 사용하여 토끼에서 AAA의 유도를 입증했지만, 돼지 또는 개에서 AAA의 유효성과 장기적인 결과를 결정하기 위해서는 추가 연구가 필요하다26.

마지막 제한은 엘라스타제를 사용하여 암컷 마우스에서 AAA를 유도하는 것이 동맥류 형성 및 대동맥 확장 비율 11,13,33,36의 낮은 속도와 관련이 있기 때문에 수컷 마우스만 포함하는 것에 관한 것입니다. 그러나 Xue et al.의 연구에 따르면 엘라스타제 단독으로 혈관 주위에 적용하면 암컷 마우스에서 AAA 발생률이 90%에 달한다는 것이 입증되었습니다. 이는 이 프로토콜이 암컷 마우스(22)에서도 효과적일 수 있음을 시사하지만, 그 효능을 확인하기 위한 추가 연구가 보증된다. 또한 혈관 구조 및 탄성 섬유에 대한 손상은 CaCl2 및 엘라스타제에 의해 침윤된 측면에서만 발생하며, 하대정맥(IVC)에 인접한 측면에서는 근접성으로 인해 병리학적 변화가 나타나지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 그러나 앞서 언급했듯이 이러한 요인은 AAA 발병률이나 AAA 발달 중 복부 대동맥 크기의 증가율에 영향을 미치지 않습니다.

결론적으로, 이 논문은 높은 AAA 발병률, 복부 대동맥의 상당한 확장, 인간 AAA에서 관찰되는 것과 유사한 병태생리학적 변화를 보여주는 새롭고 안전하며 안정적이며 재현 가능한 마우스 AAA 모델을 제시합니다. 이러한 한계에도 불구하고 이 마우스 AAA 모델은 AAA의 기저에 있는 분자 메커니즘을 조사하고 이 질환을 앓고 있는 환자를 위한 효과적인 치료 접근법을 개발할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이 연구가 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 수행되었다고 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국가자연과학재단(81770471호 82300542호), 쓰촨성 과학기술프로그램(제2022YFS0359호, 2019JDRC0104호), 쓰촨대학교 화화서병원 박사후 연구 프로젝트(제2023HXBH108호)의 지원을 받았다. 연구비 지원 기관은 연구의 설계, 자료의 수집, 분석, 해석, 원고 작성에 아무런 역할도 하지 않았다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
마취 기계RWDR550
ButorphanolJiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd220608BP1ml: 1mg
C57BL/6JGpt 수컷 마우스GemPharmatechN000013
염화칼슘시그마 AldrichC4901100g
CarprofenMCEHY-B1227100mg
차우 다이어트Dossy 실험 동물 Co.Ltd
디지털 캘리퍼스GreenerIP54
에탄올Jinhe 제약 Co.Ltd53968275%/500mL
EVG 염색 키트SolarbioG1597
GraphPad 프리즘GraphPadVer 9.0.0
H& E 염색 키트ServicebioG1076
인슐린 주사기BD2143420
이소플루란RWDR510-22-4100mL
Masson 염색 키트ServicebioG1006
생리식염수ServicebioG4702500mL
파라포름알데히드BiosharpBL539A4%/500mL
PBS, 1xServicebioG4202500mL
돼지 췌장 엘라스타제시그마 알드리치E1250100mg
포비딘 요오드용안 제약 Co.Ltd5%/100mg
프롤렌 폴리프로필렌 봉합Ethicon LLC8709H
설치류 초음파 시스템FujifilmVevo 3100LT
스테레오 현미경올림푸스SZ61
초음파 접촉 매질케플러KL-250250 g
사

참고문헌

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