환자 유래 종양 오가노이드에서 세포 방사선 민감도를 정량화하기 위한 Live Imaging

요약

여기에서는 전리 방사선에 대한 환자 유래 종양 오가노이드의 민감도를 정량화하기 위한 간단한 실시간 이미징 접근 방식에 대해 자세히 설명합니다.

초록

방사선 치료(RT)는 현대 임상 암 관리의 핵심 중 하나입니다. 그러나 모든 암 유형이 방사선 조사에 똑같이 민감한 것은 아니며, 이온선에 의해 유도된 산화적 DNA 손상을 복구하는 악성 세포의 능력의 차이 때문에 종종(항상 그런 것은 아님) 방사선 조사에 민감합니다. Clonogenic assay는 이온화 방사선 조사에 대한 배양 암세포의 민감도를 평가하기 위해 수십 년 동안 사용되어 왔는데, 이는 주로 방사선 조사된 암세포가 단기 유세포 분석 또는 현미경 보조 기술로 정량화하기 어려운 지연된 방식으로 죽기 때문입니다. 안타깝게도, 클론생성 분석은 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)와 같은 더 복잡한 종양 모델에는 사용할 수 없습니다. 실제로, 확립된 PDTO를 조사하는 것은 줄기와 같은 구획이 완전히 제거되지 않는 한 다세포 단위로서의 성장을 반드시 포기하지는 않을 수 있습니다. 더욱이, PDTO 유래 단일세포 현탁액을 조사하는 것은 확립된 PDTO의 맥락에서 RT에 대한 악성 세포의 민감도를 적절하게 재현하지 못할 수 있다. 여기에서는 확립된 PDTO를 전리 방사선에 노출시키는 것과 관련된 기존 클론 생성 분석의 적응에 대해 자세히 설명한 다음 단일 세포 해리, 적절한 배양 조건에서의 도금 및 실시간 이미징을 수행합니다. 방사선 조사되지 않은(대조) PDTO 유래 줄기 세포는 PDTO 특이적 효율로 성장하는 PDTO를 재형성하며, 이는 용량 의존적 방식으로 방사선 조사에 의해 부정적인 영향을 받습니다. 이러한 조건에서, PDTO 형성 효율 및 성장률은 제어 PDTO가 사전 정의된 공간 점유를 달성할 때까지 수집된 타임랩스 이미지에 대한 방사선 민감도의 척도로 정량화할 수 있습니다.

서론

외부 빔 방사선 치료(RT)는 현대 종양학의 주류를 이루는 방법 중 하나로, 일반적으로 관리 가능한 부작용의 잘 정의된 스펙트럼과 관련된 뚜렷한 항암 활성을 반영할 뿐만^{아니라1 예외}적으로 널리 퍼진 임상적 가용성(선진국의 대부분의 암 센터에는 외부 빔 RT를 위한 최신 선형 가속기가 장착되어 있음)^을 반영합니다2. 이러한 개념에 따라, RT는 일반적으로 초기 단계^{의 질병3,4}과 전이성 종양으로 인한 증상(예: 통증)을 억제하기 위한 완화적 응용 프로그램 모두에서 전 세계적으로 성공적으로^{사용되고 있다5}. 즉, 모든 악성 종양이 RT에 동등하게 민감한 것은 아니며, 이는 암세포의 내재적 및 미세환경적 특징을 반영합니다 6,7,8,9. 독립적인 예로서, DNA 복구 및 산화 환원 항상성에 영향을 미치는 다양한 암 관련 유전적 및 후성유전학적 변화는 내재적 방사선 민감성의 증가 또는 감소와 관련이 있으며, 이는 주로 DNA 및 기타 거대분자에 직접적이고 반응성 산소종(ROS) 의존적 손상을 일으켜 암세포를 죽이는 RT의 능력을 반영합니다 10,11,12,13.

지난 수십 년 동안 클론 생성 분석은 배양 된 인간 및 쥐 암 세포의 방사선 민감도를 평가하기 위해 일상적으로 사용되어 왔습니다 14,15,16. 실제로, 화학요법 및 기타 스트레스 요인은 종종 상당히 빠른 방식으로 악성 세포를 죽이는 반면, 임상적으로 유의미한 용량으로 사용되는 RT는 대부분 세포독성 자극에 노출된 후 24-72시간 후에 중요한 염료(죽은 세포를 선택적으로 염색)의 세포 흡수를 측정하는 것과 같은 단기 유세포 분석 또는 현미경 보조 기술로 단순히 정량화할 수 없는 지연된 형태의 세포 사멸을 유도합니다¹⁷. 간단하고 다소 저렴한 시약에 의존하는 것 외에도 clonogenic assay는 RT 용량 반응^18,19의 정량적 분석을 위한 매우 간단한 수학적 도구인 소위 "선형 2차" 모델의 구현을 허용하기 때문에 특히 편리했습니다. 유사한 맥락에서, 배양된 암세포(확립된 세포주 및 일차, 환자 유래 세포 포함)는 암 생물학의 다양한 측면을 검사할 수 있는 편리한 플랫폼을 제공했으며, 여기에는 치료에 대한 민감도가 포함되나 이에 국한되지 않음이 다소 간단하지만 단순화된 방식으로 제공되었으며, 주요 제한 사항 중 하나는 구조화된 종양 미세환경(TME)이 없다는 것입니다^{.20 21}. 실제로, 2차원 암세포 배양은 본질적으로 세포간 통신 및 세포외 기질과의 상호 작용을 재현할 수 없으며, 암에서 발생하는 것처럼^22,23 . 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)는 적어도 부분적으로 이러한 제한을 우회하는 종양 모델로 등장했다 24,25,26.

불행히도, 기존의 클론 생성 분석은 PDTO의 방사선 민감성을 평가하기 위해 사용할 수 없습니다. 한편으로는, 확립된 PDTO를 조사하는 것이 다세포 단위로서의 성장을 반드시 손상시키지는 않을 수 있으며, 이는 PDTO의 형성 및 성숙을 담당하지만 더 분화된 PDTO^{구성 세포에} 비해 DNA 손상에 대한 저항력이 증가된 줄기와 같은 구획이 완전히 박멸되지 않는 한 가능합니다. 반면에, PDTO-유래 단일-세포 현탁액을 조사하는 것은, 형성된 PDTO의 맥락에서 나타나는 PDTO-구성(줄기-유사 포함) 세포의 방사선 민감도를 적절하게 요약하지 못할 수 있다. 여기에서는 유방암 PDTO의 실시간 이미징을 활용하여 이전에 전리 방사선 조사에 노출된 PDTO 유래 세포의 PDTO 형성 효능 및 성장 속도를 방사선 조사되지 않은 세포와 비교하여 모니터링하는 기술에 대해 자세히 설명합니다. 개별 PDTO의 차등 생물학(예: 배양 배지 요구 사항, 성장률)을 크게 반영하는 필수 변형이 있기 때문에 이 프로토콜은 유방 및 비유방 기원의 광범위한 PTDO 패널에서 방사선 민감도 연구에 적합할 것으로 기대합니다.

프로토콜

연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 오가노이드 배양

참고: TNBC#1 PDTO는 삼중음성 유방암(TNBC) 환자로부터 수술로 제거된 종양 조직을 기반으로 우리 실험실에서 확립되었으며, 환자는 바이오뱅킹 프로토콜(IRB21-06023682)에 참여하기 위해 정보에 입각한 동의를 제공했습니다. 조직학 및 RNA 염기서열분석(RNAseq)에 의한 검증 후, TNBC#1 PDTO는 농축된 DMEM/F12 배양 배지(표 1)의 66% 마트리겔 방울(소위 '돔')에서 배양되고 1:2-1:10 비율로 2-3주마다 통과한다²⁸.

1. 방사선 조사 약 2주 전에 1:2-1:10 비율로 PDTO를 별도의 비부착 6웰 플레이트에 파종하며, 테스트한 각 방사선 선량당 하나씩 파종합니다(전리 방사선에 노출되지 않은 PDTO에서 제공되는 음성 대조군 포함).
2. 3-4일마다 3mL의 신선하게 농축된 DMEM/F12 배양 배지를 PDTO에 추가합니다.
   참고: 파종 및 배양 조건은 PDTO가 현미경으로 코어 괴사를 나타내는 매우 눈에 띄는 고리 모양의 모양을 획득하는 것을 방지하고 방사선 조사에서 최적의 생존력을 보장하기 위해 약간의 적응이 필요할 수 있습니다.

2. 방사선

1. PDTO는 평균 크기(약 100μm, 스케일 참조가 있는 명시야 현미경으로 예비 측정) 및 돔 점유율(약 80%)에 도달하면 조사할 준비가 됩니다. 과밀을 피하기 위해 이 단계에서 PDTO를 통과시키십시오.
2. SARRP(Small Animal Research Radition Platform) 방사선 조사기(또는 시험관 내 또는 생체 내 응용 분야를 위한 대체 조사기)를 개방형 필드 모드(콜리메이터 없음)에서 사용하여 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy 및 10 Gy의 단일 선량을 제공하는 PDTO 함유 돔을 방사선합니다. 방사선 조사가 이루어지지 않은 PDTO는 적절한 음성 제어 조건을 제공합니다.
   참고: Matrigel 동봉된 PDTO가 계획된 방사선량을 받을 수 있도록 각 실험 전에 선량 검사 보정을 수행해야 합니다. 이러한 용량은 TNBC#1 PDTO의 방사선 민감도에 대한 예비 평가에 기초하여 선택되었으며, 따라서 다른 PDTO에 대한 조정이 필요할 수 있다.

3. 해리

1. 방사선 조사 직후, 각 PDTO 함유 마트리겔 돔을 2mL의 농축 DMEM/F12 배양 배지로 세척하고 p1000 마이크로피펫을 사용하여 1-3mL의 TrypL-E에 재현탁시킵니다. 각 웰에 대해 약 30회 반복합니다.
2. 세포 현탁액을 50mL 원심분리 튜브에 모으고 37°C의 수조에서 ~5분 동안 배양합니다.
3. 실온에서 800 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.
4. 과도한 TrypL-E를 제거하여 튜브에 ~1mL를 남기고 농축된 DMEM/F12 배지의 원래 효소 부피의 3배(단계 3.1 참조)를 추가하여 세포를 세척합니다.
5. 40μm 메쉬 필터를 사용하여 셀 현탁액을 필터링합니다. 이 단계는 도금 시 세포 클러스터가 남아 있지 않고 각각의 새로운 PDTO가 단일 세포에서 시작되도록 합니다.
6. PBS에서 10% 트리판 블루로 염색한 후 자동 세포 카운터에서 세포를 계수하고 4°C에서 50μL의 농축된 DMEM/F12 배지에 66% 마트리겔을 더한 800개의 세포를 갖도록 재현탁합니다(1 돔에 대한 조건).
7. 기포가 형성되지 않도록 하면서 라이브 이미징 호환 48웰 배양 플레이트에서 개별 웰의 각 돔을 플레이트합니다. 각 방사선량에 대한 기술적 삼중도가 권장됩니다.
8. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5% CO₂)에 30분 동안 넣어 마트리겔을 응고시킵니다.
9. 0.5-1mL의 농축 DMEM/F12 배지를 추가하고, 잠재적인 기포를 제거하고, 세포 배양 인큐베이터 내부의 라이브 이미징 시스템에 플레이트를 배치합니다. 이미징하기 전에 플레이트가 약 30분 동안 설정 온도와 평형을 이루도록 합니다.
   알림: Matrigel은 >4°C의 온도에서 응고되며, 이는 응고가 필요할 때까지 이 온도를 보존해야 함을 의미합니다.

4. 라이브 이미징

1. Incucyte 소프트웨어에서 Schedule to Aquire를 선택합니다.
2. Launch Add Vessel의 왼쪽 상단 모서리에 있는 더하기 기호를 클릭합니다.
3. 반복해서 또는 한 번 스캔하려면 Scan on Schedule(일정에 따라 스캔)을 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다.
4. 선박을 생성하거나 복원하려면 Create Vessel New(선박 새로 생성)를 선택한 후 Next(다음)를 클릭합니다.
5. 스캔 유형을 선택하려면 Organoid를 선택한 후 Next(다음)를 클릭합니다.
6. 스캔 설정: QC < ' 위상 + 명시야 이미지 채널을 선택합니다. '4x 목표'가 자동으로 선택됩니다. 그런 다음 다음을 클릭하십시오.
7. 선박 선택: 카탈로그 번호에 따라 적절한 소프트웨어 검증 플레이트를 선택하십시오.
8. 선박 위치: 레이아웃에 따라 기기에서 플레이트의 위치를 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다.
9. 스캔 패턴: 플레이트 레이아웃에 따라 웰을 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다.
10. 선박 노트북: 명판(선택 사항: 이름, 셀 유형 및 통로). 플레이트 레이아웃의 오른쪽 상단 모서리에 있는 더하기 기호인 '플레이트 맵 만들기'를 클릭하여 플레이트 맵을 만듭니다.
11. 플레이트 맵 편집기에서 Cells(셀) 섹션의 Create New Cell(새 셀 생성) 아이콘을 클릭하여 셀 유형을 표시하고, 더하기 아이콘을 클릭하여 적절한 well에 적용하고, 적절한 well을 선택합니다. 선택 사항: 시드된 셀과 통로의 수를 표시할 수 있습니다. 각 세포주에 대해 반복합니다.
12. Growth Conditions(성장 조건) 섹션에서 Create New Cell(새 세포 생성) 아이콘을 클릭하여 처리를 표시하고, 더하기 아이콘을 클릭하여 적절한 well에 적용하고, 적절한 well을 선택합니다. 각 실험 조건에 대해 반복합니다. 그런 다음 확인 > 다음을 클릭합니다.
13. 해석 설정: '나중으로 해석 연기'가 자동으로 선택됩니다. 다음을 클릭합니다.
14. 스캔 일정: 하루에 두 번 무기한으로 스캔하도록 선택합니다. 다음을 클릭합니다. 제어 PDTO의 어둡기를 모니터링하여 이상적인 종점을 찾습니다.
15. 요약: 요약을 확인하고 Add to Schedule(일정에 추가)을 클릭합니다.
    참고: 스캔 속성을 시각화할 수 있으며 필요한 경우 스캔 타임라인을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 일정을 편집할 수 있습니다.

5. 분석

1. 호환되는 소프트웨어에서 View(보기)를 선택합니다. 인트라넷을 통해 시스템에 연결된 컴퓨터에서도 작동할 수 있습니다.
2. 원하는 실험을 두 번 클릭하여 선택합니다.
3. 분석 시작 아이콘을 선택합니다.
4. Create New Analysis Definition(새 분석 정의 생성)을 선택하고 Next(다음)를 클릭합니다.
5. 분석 유형: Organoid를 선택하고 Next를 클릭합니다.
6. 이미지 채널: 'Phase + Brightfield'가 기본적으로 선택되어 있으면 'Next'를 클릭합니다.
7. 분석할 대표 이미지 세트를 선택합니다. 다음을 클릭합니다. 이른 시점과 늦은 시점, 그리고 다른 치료 조건(예: 제어 및 다른 방사선 선량)을 선택하는 것이 좋습니다.
8. 아래 단계에 따라 TNBC#1에 대한 해석 정의를 수행합니다.
   1. 이미지: 현재 이미지 미리보기 또는 '모두 미리보기'를 선택하여 현재 이미지 또는 선택한 이미지의 기본 마스크를 시각화합니다. 해석 매개변수가 변경될 때 반복하여 마스크를 업데이트합니다.
   2. 세분화: 반경을 300으로, 배경 민감도를 80으로, 가장자리 분할을 켜기로, 가장자리 민감도를 70으로 설정합니다.
   3. 정리: 구멍 채우기를 5E+05 μm² 로 설정하고 크기를 0 픽셀로 조정합니다.
   4. 필터: 최소 또는 최대 면적을 설정하지 않고, 최소 편심을 0.19로 설정하고, 최대 편심을 설정하지 않습니다. 다음을 클릭합니다.
9. 스캔 시간 및 웰: 원하는 모든 스캔 시간 지점과 웰을 선택합니다. 다음을 클릭합니다. 선택 사항: 향후 스캔 분석을 선택합니다.
10. Save and Apply Analysis Definition(분석 정의 저장 및 적용): Definition Name(정의 이름)을 입력하고 Next(다음)를 클릭합니다.
11. Summary(요약)를 시각화하고 Finish(마침)를 클릭합니다.
12. 분석이 분석 대기열에 들어갔음을 사용자에게 알리는 팝업 창이 나타납니다. 확인을 클릭합니다. 분석 대기열 창이 열리면 나머지 작업을 시각화할 수 있습니다.
13. 필요한 경우 Vessel Name(용기 이름) 옆에 있는 Analyses(분석) 열에서 파란색 화살표를 선택하고 Analysis Definition Name(분석 정의 이름)을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 View(보기)에서 완료된 분석을 검색합니다. 그런 다음 그래프 분석 메트릭을 클릭하여 소프트웨어에서 원시 데이터를 시각화하거나 분석 정의 내보내기를 선택하여 추가 분석을 위해 내보냅니다.
    참고: 원시 데이터 내보내기는 그래프 분석 메트릭 창에서 사용자 지정할 수 있습니다. Organoid Count, Total Area, Average Eccentricity 및 Darkness를 별도로 내보낼 수 있으며, None, Columns, Rows 또는 plate Map Replicates를 클릭하여 Select Grouping 롤다운 메뉴에서 데이터를 구성할 수 있습니다. TNBC#1의 경우 원시 데이터 내보내기, 그래프 분석 메트릭 및 그룹화 선택 롤다운 옵션의 경우 없음 옵션이 선택되었습니다. 이러한 가져오기 매개변수는 TNBC#1 PDTO를 사용한 예비 평가를 기반으로 선택되었습니다. 따라서 다른 PDTO에 대한 조정이 필요할 수 있으며, 이는 "미리보기" 기능을 기반으로 하는 소프트웨어에서 가능합니다. (1) 대부분 단일 세포 또는 작은 PDTO를 포함하는 초기 이미지와 (2) 제어 및 처리 조건 모두에서 큰 PDTO도 획득할 수 있도록 늦은 시점에 수집된 이미지에 가져오기 매개변수를 적용하는 것이 좋습니다.

결과

TNBC#1 PDTO는 0일째에 0(방사선 조사되지 않은 대조군), 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy 또는 10 Gy의 단일 방사선 선량에 노출되었습니다. 그 직후, PDTO를 해리시켜 각 실험 조건에 대한 단일세포 현탁액을 얻었다. 다음으로 PDTO 유래 세포를 웰 중앙에 증착된 66% 마트리겔 돔(각 50μL) 내의 48웰 플레이트에 파종했으며, 조건당 3번의 기술 복제를 수행했습니다. 플레이트를 실시간 이미징 시스템에 배치하고 총 30일 동안 오가노이드 모듈 4X 대물렌즈를 사용하여 6시간마다 이미징했습니다. TNBC#1 PDTO에 RT를 2Gy의 단일 투여량으로 조사하면 PDTO 재성장이 유의하게 지연된 반면, 방사선 선량≥4Gy(최대 10Gy)가 완료되면 PDTO의 재생이 지연되었습니다(그림 1).

그림 1: 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)의 실시간 이미징. 유방암 TNBC#1 환자 유래 종양 오가노이드(PDTO)를 치료하지 않고 방치하거나 표시된 방사선 선량에 노출시킨 후 곧바로 해리, 재도금 및 라이브 셀 이미징 시스템을 사용한 이미징을 수행했습니다. 대비 조정(A) 및 정량적 평가(B, 평균 ± SEM)에 따른 대표 이미지가 보고됩니다. 이미지 크기 : 1.19 x 1.16 mm (1.38 mm²). 눈금 막대: 400 μm; 삽입: 200 μm. ****p < 0.001 (양방향 ANOVA, 0 Gy와 비교); ^####p < 0.001(2 Gy와 비교한 양방향 분산분석). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

구성 요소	농도
드멤 F/12	1배
글루타맥스	1배
헤페스	10 mM
펜스트렙	100U/mL
나27	1배
nAC	1.25 밀리미터
니코틴아미드	10 mM
TGFbeta 수용체 억제제 A83-01	0.5 마이크로미터
p38 MAP 억제제 p38i SB202190	1 마이크로미터
머리	10%
Rspondin 미디어	10%
FGF10 시리즈	20ng/mL
FGF7	5ng/mL
NR (헤레굴린)	5 nM 수준
프리모신	100μg/mL
Y-27632 (로키)	5 마이크로미터
표피 성장 인자 hEGF	5ng/mL

표 1: PDTO 배양 배지 조성.

토론

여기에서는 (1) 시험관 내 PDTO 방사선 조사 시 PTDO 형성 줄기 유사 세포의 지속성 및 (2) 이러한 세포가 생성할 수 있는(가능한) PDTO의 성장 속도를 기반으로 PDTO 방사선 민감도를 정량화하기 위해 유방암 PDTO와 실시간 이미징을 활용하는 기존 클론생성 분석의 적응에 대해 설명합니다. 이 프로토콜의 중요한 단계에는 (1) 양호한 생존력을 가능하게 하는 돔 점유에 대한 PDTO의 설정, (2) 모의 방사선 조사 제어 조건을 포함하여 다양한 용량의 전리 방사선 조사에 대한 PDTO 노출이 포함됩니다. (3) PDTO가 단일세포로 해리되는 단계; (4) PDTO 유래 단일세포의 재도금; (5) 제어 조건에서 사전 정의된 돔 점유까지 실시간 이미징.

제어 조건에서의 PDTO 형성 효율 및 PDTO 성장률과 관련된 최소한의 수정으로(PDTO마다 상당히 다를 수 있음) 이 프로토콜은 유방 및 비유방 유도체의 수많은 PDTO뿐만 아니라 상업적으로 이용 가능한 여러 라이브 이미징 플랫폼에 적용할 수 있을 것으로 기대합니다. 한편으로는, 단일 세포 분산에 대한 기준선 PDTO 형성 효율은 이미지 기반 PDTO 정량화뿐만 아니라 처리되지 않은 PDTO의 정상적인 성장을 가능하게 하는 밀도에서 새로운 PDTO를 얻기 위해 재seeding되는 단일 세포의 수에 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 반면에, PDTO 성장률은 최적의 분석 용량을 유지하기 위해 인접한 PDTO의 병합을 피해야 하기 때문에 분석 기간에 영향을 미칠 것으로 예상됩니다. 따라서, 각 개별 PDTO에 대한 제어 조건에서 PDTO 형성 효율 및 PDTO 성장률을 결정하는 것은 이 프로토콜의 올바른 구현에 매우 중요하다.

이 방법은 매우 간단하지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, PDTO 형성 세포의 수가 과도하게 적으면 단일 세포 해리 시 정상적으로 성장하는 PDTO의 재생을 손상시킬 수 있습니다. 실제로, 일상적인 PDTO passaging은 불완전한 해리에 의해 달성될 수 있지만, 이 프로토콜에서 제공하는 정량적 평가는 단일 세포 현탁액의 생성(계수 중에 육안으로 확인할 수 있음)에 의존합니다. 둘째, 성장 속도가 과도하게 느리면 분석 기간이 상당히 길어질 수 있으며 잠재적으로 방사선 민감도를 부정확하게 추정할 수 있습니다. 느리게 성장하는 PDTO가 종말점 호환 크기에 도달하는 데 필요한 배양 시간을 연장하면 치사사하 방사선 조사된 PDTO 형성 세포가 스트레스로부터 회복하고 검출 가능한(느리게 성장하긴 하지만) PDTO를 복원할 수 있는 추가 기회를 제공할 수 있습니다. 마지막으로, 방사선 조사 직후 PDTO를 해리하면 PDTO 형성 세포에 추가적인 스트레스가 가해질 것으로 예상되며, 회복 초기 단계에서 세포 간 통신의 변화로 인해 방사선 민감도가 증가할 수 있습니다. 24-72시간의 해리 지연은 RT에 의해 부과된 고분자 손상으로부터 회복하는 PDTO 형성 세포의 능력에 대한 보존된 세포 간 통신의 상대적 기여도에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

실시간 이미징 플랫폼은 PDTO 형성 및 성장을 종단적으로 모니터링할 수 있는 편리한 방법을 제공하지만, 단일 엔드포인트 이미지도 동일한 대물렌즈에 사용할 수 있습니다. 이 경우 이미징 전에 인접한 PDTO가 병합되지 않도록 주의를 기울여야 하며, 성장률은 분석 기간에 따라 정규화된 PDTO 크기의 함수로 평가할 수 있습니다.

개인 맞춤형 암 의학 시대에는 치료에 대한 개별 종양의 민감도를 평가하는 것이 가장 중요한데, 이는 효능이 향상된 개별화된 치료 전략을 설계하기 위한 몇 가지 힌트를 제공하기 때문이다²⁹. 본원에 기술된 프로토콜은 이온화 방사선에 대한 개별 PDTO의 세포 민감도를 추정하기 위한 편리한 접근법을 제공함으로써 이러한 노력에 부합한다(단독으로 또는 다른 치료 양식과 결합). 즉, PDTO에서 암세포 방사선 민감도를 측정하는 것이 국소 RT에 대한 개별 암 환자의 반응을 정확하게 예측하는지 여부는 입증되어야 합니다. 방사선 조사에 대한 뚜렷한 PDTO의 방사선 민감도를 각 기증자의 RT에 대한 임상적 반응과 연관시키는 것은 이러한 가능성에 대한 중요한 통찰력을 제공할 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
40 & 마이크로; m 메시 필터	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
셀로미터 자동 T4 밝은 필드 셀 카운터	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
표피 성장 인자 hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL 디지털 반전 형광 현미경	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
글루타맥스	인비트로젠
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte 소프트웨어 2021A	Sartorius		버전: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		모델 SX1
Incucyte 인증 48 웰 플레이트	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	시그마 Aldrich	A9165-5G
니코틴아미드	시그마-알드리치	N0636
Noggin			미국 웨일 코넬의 잉글랜드 정밀 의학 연구소에서 구매
비처리 6웰 플레이트	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP 억제제 p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	코닝	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			미국 웨일 코넬의 잉글랜드 정밀 의학 연구소에서 구매
소동물 방사선 연구 플랫폼 (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta 수용체 억제제 A83-01	Tocris	2939
Trypan 블루 스테인 (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049