마우스 췌장 내피 세포의 분리

신진대사 조절과 항상성의 핵심인 췌장은 고도로 혈관화된 기관입니다. 췌장은 내분비와 외분비 기능을 모두 가지고 있어 각각 혈당과 소화 효소의 조절을 조절합니다. 이 두 구획은 췌장 혈관의 광범위한 네트워크로 함께 연결되어 산소, 호르몬 및 효소의 교환 및 운반을 촉진합니다. 결정적으로, 이 조밀한 모세혈관 네트워크는 글루카곤 분비 알파(α) 세포, 인슐린 분비 베타(β) 세포 및 소마토스타틴 분비 델타(δ) 세포 ^1,2로 구성된 췌장 내 호르몬 조절 세포 클러스터인 랑게르한스 섬을 관통합니다. 이 섬은 췌장 질량의 1-2%에 불과하지만 총 혈류의 20%를 받으며³ 이는 섬 혈관 구조의 중요성을 강조합니다. 췌장 모세혈관은 주로 벽화 주피세포(pericyte)로 둘러싸인 고도로 창호화된 내피 세포(EC)로 구성되어 있습니다. 이러한 모세관 EC는 섬의 발달, 성숙 및 (기능 장애)에 중요한 역할을 하며 다양한 내분비 세포 및 외분비 세포와 밀접한 누화를 형성합니다⁴ (그림 1).

내피 기능 장애는 제1형 당뇨병과 제2형 당뇨병 모두에서 관찰되었으며, 이는 췌장 섬 기능 장애로 인해 발생하는 가장 흔한 질환입니다 ^5,6. 섬의 미세혈관 밀도와 형태는 모두 당뇨병에서 바뀔 수 있다⁷. 더욱이, 당뇨병으로도 나타날 수 있는 매우 공격적인 종양인 췌장암은 높은 미세혈관 밀도와 낮은 관류를 특징으로 한다⁸. 정상 췌장 조직과 질병이 있는 췌장 조직 모두에서 EC의 중추적인 구조적 및 기능적 역할을 감안할 때, 건강이나 질병을 유발하는 메커니즘을 밝히기 위해 발달, 생리학 및 병리학 분야에서 pEC를 연구할 필요가 있습니다.

서로 다른 쥐(예: 뇌 ^9,10, 폐¹¹, 심장¹², 간¹³, 골격근¹⁴, 지방 조직⁽¹⁵)와 인간(예: 뇌¹⁶, 내장 지방 조직^17,18, 말초 신경¹⁹, 폐^20,21,22 및 장간막 동맥²³)에서 EC를 분리하기 위한 수많은 프로토콜이 개발되었습니다) 조직. 이러한 프로토콜은 일반적으로 효소 분해(예: 콜라겐분해효소, 트립신 24, 디스파제^24,25 및 리베라제²⁶)의 사용과 항체 기반 농축 단계를 포함합니다. 더욱이, 이러한 프로토콜은 37°C에서 격렬한 교반과 함께 고농도의 효소에서 장시간 소화에 의존하는 경향이 있습니다(표 1). 췌장에는 과다한 내인성 소화 효소가 있다는 것을 포함한 췌장의 독특한 특성으로 인해 이러한 기존 프로토콜은 pEC를 분리하는 데 직접 적용할 수 없습니다. 첫째, 췌장의 세포외 기질(ECM) 구성이 다른 조직과 다릅니다. 콜라겐 분해 효소는 EC 분리에 일반적으로 사용되지만, 서로 다른 조직 특이적 해리 기능을 가진 여러 하위 유형이 있으므로 최적화가 필요합니다. 둘째, pEC 분리에 중요한 것은 췌장 내인성 효소의 방출 및 활성화가 분리 과정을 크게 방해할 수 있다는 것입니다. 이를 위해 외분비 아시나르 세포(zymogens, protease, RNase²⁷의 주요 공급원)의 파열을 최소화하기 위해 주의를 기울여야 하는데, 이는 추가적인 세포 손상을 유발하고 세포 생존율을 낮추고 전반적인 회복율에 영향을 미칠 수 있다 27,28,29.

이러한 문제를 해결하기 위해 기존 EC 분리 프로토콜의 방법을 채택하고 마우스 췌장에서 EC 분리에 적합한 새로운 프로토콜을 수립했습니다. 구체적으로, 여기에서는 콜라겐분해효소 유형 I(일반적으로 폐 EC 분리를 위해 구현됨), 낮은 소화 온도 및 교반 없음(췌장 효소 유발 물질의 활성화를 방지하기 위해) 및 DNase^30,31,32 보충(DNA 유도 세포사멸 방지 및 세포 생존력 개선을 위해) 및 CD31에 대한 항체를 사용하는 워크플로우(그림 2)를 설명합니다³³ (PECAM1, pan-EC 마커). 설명된 프로토콜은 유전자 발현 프로파일링 및 단백질 분석에 사용할 수 있는 마우스 췌장에서 분리된 EC 집단을 생성합니다.

조직 분리는 City of Hope(미국 캘리포니아주 두아르테)에 있는 Beckman Research Institute의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 연구 프로토콜 #17010에 따라 수행되었습니다. 여기서는 Tie-2CreERT2를 사용합니다. 생후 8-12주령에 C57BL/6 배경의 Rosa26-TdTomato 마우스 라인. 이 라인에서, EC는 앞서 설명한 바와 같이 타목시펜으로 유도될 때 TdTomato로 표지됩니다³⁴. 그러나 이 프로토콜은 유전자형과 유전적 배경이 다른 모든 연령대의 성인 마우스에 적용할 수 있습니다.

1. 조직 채취 (예상 시간 : 1-2 시간)

참고: 예상 시간은 동물당 15분이며, 해리 샘플당 최대 3마리의 동물을 모으는 것이 좋습니다.

1. 이산화탄소(CO₂) 과다 투여로 동물을 안락사시킨 후 2차 사망 확인. 해부 전에 전신에 70% 에탄올(EtOH)을 분사하여 수술 부위를 완전히 소독합니다.
2. 핀을 사용하여 팔다리를 쭉 뻗고 고정합니다. 수술용 가위를 사용하여 하복부에서 시작하여 흉부 부위까지 피부와 복막을 통해 작은 정중선을 절개합니다.
3. 횡격막을 절단하여 흉곽을 노출시키고 흉곽을 들어 올려 심장을 노출시킵니다.
4. 얼음처럼 차가운 멸균 PBS가 들어있는 주사기에 연결된 바늘(25G-30G)을 심장의 좌심실에 삽입합니다.
5. 5 - 10 mL/분의 속도로 심장을 통해 PBS를 주입하여 관류를 시작합니다. 10mL 주입 후 또는 간과 신장이 변색될 때까지 중단하십시오.
6. 관류 후 췌장(위 아래 십이지장에 부착됨)³⁵ (그림 3A)을 찾아 해부 가위와 집게를 사용하여 조심스럽게 제거합니다.
7. 분리가 완료되면 췌장을 얼음처럼 차가운 PBS 10mL + 0.2mg/mL 트립신 억제제가 들어 있는 50mL 튜브로 옮기고 얼음에 보관합니다(그림 3B).
   참고: 이 단계에서 최대 3마리 마우스의 췌장을 모아 1개의 튜브로 옮길 수 있습니다. 샘플은 최대 2시간 동안 얼음 위에 보관할 수 있습니다.

2. 콜라겐 분해 효소 준비 (예상 시간 : 15-30 분)

1. 아래 설명된 대로 솔루션과 버퍼를 준비합니다.
   1. 해리 용액: 콜라겐분해효소 I형을 50mL 튜브에 추가하여 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS 1x(Ca²⁺, Mg²⁺, 재료 표 참조) 및 0.001 U/mL DNase I + 0.2 mg/mL 트립신 억제제에서 최종 농도 1mg/mL까지 추가합니다.
   2. 해리 중지 용액: 인산염 완충 식염수(PBS 1x, Ca²⁺ 없음, Mg²⁺, 이 프로토콜의 나머지 모든 PBS에 대해 동일, 재료 표 참조), 5% 소 혈청 알부민(BSA), 0.001 U/mL DNase I 또는 DMEM + 10% FBS + 0.001 MU/mL DNase I를 추가합니다.
   3. 세척 완충액: PBS 1x, 0.5% 소 혈청 알부민(BSA), 0.001 U/mL DNase I + 0.05 mg/mL 트립신 억제제를 추가합니다.
2. 완충액을 완전히 용해하고 0.22μm 필터를 통해 여과합니다. 따로 보관하고 얼음 위에 보관하십시오.

3. 소화 (예상 시간 : 40 분-1 시간)

1. 얼음처럼 차가운 PBS에서 췌장을 제거하고 얼음 위에 페트리 접시를 놓습니다. 수술용 가위와 핀셋으로 여분의 조직(예: 비장, 지방, 파편)을 조심스럽게 제거합니다(그림 3C).
   참고: 과도한 지질은 조직 소화를 방해할 수 있으므로 지방을 제거하는 것이 중요합니다.
2. 트리밍된 마우스 췌장을 1mL의 해리 용액이 들어 있는 5mL 튜브로 옮깁니다.
3. 튜브를 얼음 위에 올려놓고 해부 가위로 췌장 조직을 0.5mm 또는 1mm와 같은 미세한 피펫 조각으로 다집니다. 용해물을 50mL 튜브에 옮기고 얼음에 보관합니다.
4. 처음에 췌장 조직을 다지는 데 사용되는 5mL 튜브에 췌장을 추가하고 콜라겐분해효소 1mL를 추가로 추가합니다. 여러 췌장 제제에 대해 필요에 따라 반복합니다.
5. 5mL 튜브에 콜라겐분해효소 용액 2mL를 추가하여 잔여 췌장 조직을 제거하고 50mL 튜브로 옮깁니다. 총 콜라겐분해효소 부피는 췌장 3개의 경우 5mL, 단일 췌장의 경우 3mL여야 합니다.
6. 모든 샘플이 기계적 해리를 거친 후 균질화된 조직 용해물이 포함된 50mL 튜브를 37°C 수조로 옮기고 10분 동안 배양합니다.
   참고: 이 과정에서 조직 혼합물을 세게 교반하거나 와류로 일으키지 마십시오. 이는 acinar 조직의 파열과 풍부한 내인성 효소 및 DNA의 방출을 유발할 수 있습니다.
7. 수조에서 튜브를 제거하고 부드럽게 휘젓어 잘 섞은 다음 수조에 10분 더 그대로 둡니다(총 시간: 20분).
   알림: 과도한 소화를 방지하기 위해 30°C 수조에서 37분을 초과하지 마십시오.
8. 얼음 위에 튜브를 놓고 균질화액이 중력에 의해 가라앉도록 합니다. 침전되면 70μm 필터를 통해 상층액을 옮기고 5mL의 해리 정지 용액을 추가합니다.
9. 남은 펠릿에 해리 용액 1mL를 추가로 추가하고 18G 바늘로 분쇄합니다.
10. 남은 균질액을 필터에 통과시키고 추가로 5mL의 해리 정지 용액으로 세척합니다.
11. 스핀 셀 현탁액, 300 x g , 4°C에서 10분 동안. 흡인에 의해 상층액을 완전히 제거하고 세포 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.
12. 세포 펠릿을 1mL의 세척 버퍼로 재현탁하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
13. 재현탁 세포 펠릿(10 μL)에서 작은 부분 표본을 취하여 트리판 블루와 1:1 비율로 혼합하여 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하고 생존율을 측정합니다.

4. 내피 세포(EC) 농축(예상 시간: 2-3시간)

1. 계수된 1 x 10⁷ 개 세포마다 1μL의 항-CD31-비오틴 항체를 추가하고 회전체에서 4°C에서 30분 동안 배양합니다(췌장 3개당 약 5μL).
2. 20 μL의 항비오틴 마이크로비드를 첨가하고 튜브 로테이터에서 4 °C에서 40분 동안 배양합니다.
3. 컬럼 분리 홀더가 있는 마그네틱 스탠드를 설치하고 컬럼을 적용합니다. 3mL의 세척 버퍼와 평형 컬럼.
4. 컬럼에 샘플을 추가하고 총 9mL의 세척 버퍼로 세척합니다.
   참고: 세포 농도가 높으면 별도의 튜브에 2mL의 세척 버퍼로 세포를 희석합니다. 한 번에 1mL의 샘플을 컬럼에 추가하여 컬럼이 막히는 것을 방지합니다.
5. 컬럼 홀더에서 컬럼을 제거하고 15mL 튜브에 넣습니다. 컬럼에 5mL의 세척 버퍼를 추가합니다. 플런저를 사용하여 컬럼의 세포를 아래로 밀어 넣고 용리액(농축 EC 포함)을 수집합니다.
6. 300 x g 에서 4°C에서 10분 동안 스핀다운 플로우 스루 및 용리/EC 분획. 3.13단계와 같이 세포를 세고 생존력을 측정합니다.
7. 플로우 스루(flow-through) 및 EC 분획의 qPCR을 통해 EC 농축을 검증합니다. NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1)을 내분비 세포에 대한 일반 마커로 사용하고 혈소판 및 내피 세포 접착 분자(Pecam1)를 EC³³에 대한 마커로 사용합니다. 36B4 (Rplp0, 산성 리보솜 인단백질 p0)를 유전자 발현 정상화를 위한 내부 대조군으로 사용합니다.
   참고: 수집된 샘플은 이 단계에서 단백질 또는 RNA 분석에 사용할 수 있습니다.

5. pECs 배양

1. M199 매체를 준비합니다. M199 배지를 최종 농도 20% 소 태아 혈청(FBS) 및 0.1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충합니다.
2. 60mm 세포 배양 플레이트에 콜라겐 I형(0.1M 아세트산 중 1mg/mL)을 코팅하고 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다.
3. 콜라겐 유형 I을 제거하고 1X PBS로 플레이트를 두 번 헹굽니다. 준비된 M199 배지 2mL를 추가하고 세포 배양 플레이트를 표준 세포 배양 인큐베이터(5% CO₂, 37°C)에 5분 동안 놓습니다.
4. 세포가 분리되면 분리된 세포를 예열된 M199 세포 배양 플레이트에 추가합니다. 세포를 약 14일 동안 배양 상태로 유지하고 2-3일마다 배지를 교체하십시오.

이 프로토콜에 따라, 3개의 마우스 췌장을 풀링할 때 약 2 x 106 개의 살아있는 세포를 얻을 수 있으며, 단일 마우스 췌장에서 750,000개의 세포를 얻을 수 있습니다. EC의 농축을 검증하기 위해 다음과 같은 분석을 수행했습니다: 1) 정량적 PCR: 플로우 스루(FT) 샘플(즉, non-CD31 항체 결합 분획)과 비교하여, EC 분획은 Pecam1 (CD31 인코딩) 및 Kdr (VEGFR2 인코딩) 수치가 현저히 높았고, 두 개의 EC 마커 유전자33 및 췌장 내분비 세포의 전사 인자인 NK6 homeobox 1 (Nkx6.1) 수치가 낮았습니다(그림 4A); 2) 웨스턴 블로팅(western blotting): 3가지 제제(pEC-1-3)의 EC가 풍부한 샘플은 예상 크기(~130kDa)에서 CD31의 강력한 신호를 보여주었습니다. 이에 비해 입력 샘플과 FT 샘플은 최소한의 CD31 신호를 보여주었습니다. 양성 대조군으로서, pEC 세포주인 MS1 세포의 용해물도 강한 CD31 신호를 보였습니다(그림 4B). 3) 트리판 블루 염색: 분리된 세포의 생존율이 약 50%임을 발견했습니다(그림 4C). 4) 발표된 프로토콜에 따른 유세포 분석15 : 살아있는 세포 집단에 대한 게이팅(Gating)을 통해 CD31+ 세포는 88%, TdTomato+ 세포는 76%임을 확인했습니다. 주목할 점은 대부분의 분리된 세포가 CD31과 TdTomato를 동시에 발현한다는 것입니다(그림 4E). 음성 대조군으로, 염색되지 않은 MS1 세포와 IgG로 배양된 MS1은 CD31로 표시된 살아있는 세포를 보여주지 않았습니다. 양성 대조군, 즉 CD31로 염색된 MS1 세포는 100%에 가까운 살아있는 CD31+ 세포를 보여주었습니다(그림 4F). 또한 분리된 세포를 배양하고, 발표된 프로토콜36에 따라 PECAM1의 면역형광 염색을 수행하고, 분리된 세포에서 두 마커의 강력한 신호를 보여 EC의 존재를 암시하는 TdTomato를 이미지화했습니다(그림 4G).

그림 1: 췌장과 췌장섬의 혈관형성에 대한 그림. 췌장 내피 세포(EC)와 섬 내 EC의 그림 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 워크플로우 개요. 1) 췌장 해부, 2) 기계적 분해, 3) 효소 배양, 4) 원심분리, 5a) 상층액 제거 및 5b) 상층액 제거 및 5b) 6) 및 8) 펠릿 재구성 및 항체 결합, 9) 마이크로비즈 배양, 10) MACS 컬럼 농축, 11) 생존율을 위한 세포 계수, 12) 다운스트림 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 조직 처리 단계. (A) 복강, (B) 고립된 쥐 췌장, (C) 잘린 쥐 췌장의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 마우스 췌장에서 분리된 EC 분획의 검증. (A) FT 샘플의 qPCR 및 농축을 위해 CD31을 사용한 농축된 EC 분획. Pecam1 (CD31), Kdr (VEGFR2) 및 Nkx6.1 (췌장 β세포 특이 전사 인자) 33. * t 검정을 기반으로 한 FT와 비교하여 p <0.05를 나타냅니다. n = 각각 3 마리의 마우스로 구성된 3-4 개의 풀링 샘플. (B) CD31의 웨스턴 블로팅. pEC-1-3은 3개의 개별 풀링된 마우스 샘플에서 농축된 EC를 나타냅니다. 30mg의 세포 용해물을 각 레인에 로드한 후 Ponceau S 염색을 수행했습니다. (C) 생존율 분석을 위한 농축 pEC의 세포 계수 및 트리판 블루 염색. (D) 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 및 CD31 항체로 염색된 마우스 pEC에 대한 유세포 분석 게이팅 전략. (E) 염색되지 않은 MS1(왼쪽 상단), AlexaFluor-488 2차 항체로 염색된 MS1(IgG 대조군, 오른쪽 상단), CD31로 염색된 MS1(왼쪽 하단) 및 CD31로 염색된 분리된 마우스 pECs(오른쪽 하단)의 유세포 분석 히스토그램. (F) 유세포 분석을 사용하여 정량화된 살아있는 세포의 비율. (G) DAPI(파란색) 대조염색 및 내인성 TdTomato 형광 리포터(빨간색)를 사용한 CD31 발현의 면역형광(녹색). 스케일 바 = 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 쥐 췌장에서 CD31 및 CD144 특이성. (A) CD31(마젠타) 및 CD144(시안색)를 사용한 쥐 췌장의 면역형광, DAPI 대조염색. 광시야 형광 도립 현미경에서 10x 렌즈를 사용하여 캡처한 이미지. 눈금 막대 = 100μm. 점선은 섬 지역을 구분합니다. (B) scRNA-seq (GSE128565)37에 의해 검출된 C57BL6 마우스의 섬 EC에서 Cdh5 및 Pecam1 발현을 보여주는 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 쥐 췌장 샘플을 처리하는 데 사용되는 다양한 프로토콜 요약.

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