Method Article

저산소증 민감성 키메라 항원 수용체-T 세포의 생성 및 기능 검증

DOI:

10.3791/66697

⸱

June 14th, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Clinical Center of Biotherapy at Zhongshan Hospital, Fudan University, 3Department of Oncology and Bio-therapeutic Center, Shenzhen Third People's Hospital, Southern University of Science and Technology, 4Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 저산소증 민감성 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포의 생성 및 기능 검증을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 저산소증 민감성 CAR-T 세포의 렌티바이러스 기반 생성과 저산소증 의존성 CAR 발현 및 선택적 세포 독성의 검증을 포함한 특성 분석을 제시합니다.

Abstract

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광범위한 연구를 통해 혈액 악성 종양 치료에 있어 키메라 항원 수용체 T(CAR-T) 세포 치료의 가능성을 입증했습니다. 그러나 고형 종양의 치료는 여전히 어려운 과제이며, 이는 CAR-T 세포가 표적 항원을 발현하는 정상 세포를 공격할 때 발생하는 안전성 문제에서 알 수 있습니다. 연구자들은 CAR-T 세포 치료제의 종양 선택성을 향상시키기 위해 다양한 접근법을 탐구해 왔습니다. 이와 관련된 대표적인 전략 중 하나는 저산소증 민감성 CAR-T 세포의 구축으로, 이 세포는 산소 의존적 분해 도메인을 CAR 부분에 융합하여 설계되고 저산소 환경인 종양 미세환경(TME)에서만 높은 CAR 발현을 달성하도록 전략화됩니다. 이 논문은 이동식 인큐베이터 챔버에 의해 설정된 다양한 산소 농도에 대한 CAR 발현 및 사멸 능력의 변화를 분석하는 방법을 포함하여 이러한 CAR-T 세포의 생성 및 기능적 특성화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 구축된 CAR-T 세포는 산소에 민감한 방식으로 CAR 발현 및 세포 독성을 입증할 것으로 예상되며, 이를 통해 선택적 활성화를 위해 저산소 TME와 정상 정상 조직을 구별할 수 있는 능력을 지원할 수 있습니다.

Introduction

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키메라 항원 수용체 T 세포(CAR-T) 치료는 암 치료에서 중요한 돌파구를 제시했습니다. 2017년 미국 식품의약국(FDA)이 진행성/저항성 림프종 및 급성 림프모구성 백혈병 치료를 위한 최초의 CAR-T 치료제를 승인한 이래 전 세계적으로 CD19 또는 B세포 성숙 항원(BCMA)을 표적으로 하는 CAR-T 치료제 1,2,3,10개가 승인을 받았다4. 그러나 광범위한 연구에도 불구하고 혈액 악성 종양 치료에서 CAR-T 요법의 놀라운 효능을 재현하는 것은 고형 종양에 적용하는 데 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다 5,6,7,8.

면역억제 종양미세환경(TME)은 고형 종양 환경에서 CAR-T의 낮은 효능에 대한 주요 원인입니다. TME는 영양소 부족, 저산소증, 산성 pH 및 대사 폐기물의 축적으로 인해 CAR-T 세포의 활동과 생존을 방해합니다 9,10,11,12. 추가적인 적대감은 조절 T 세포(Tregs), 골수 유래 억제 세포(MDSC) 및 종양 관련 대식세포(TAM)와 같은 면역 억제 세포에 침투하는 것에서 비롯되며, 이들은 종양 세포와 함께 CAR-T 세포가 종양에 진입할 때 추가적인 억제를 유발하는 면역 억제 사이토카인을 분비합니다13,14.

만족스럽지 못한 치료 효과 외에도, 안전성 문제는 고형 종양을 다룰 때 CAR-T 세포의 또 다른 아킬레스건이다15,16. 안전성에 대한 우려는 지금까지 확인된 종양 특이적 항원(TSA) 중 어느 것도 종양 세포에 엄격하게 국한되지 않는다는 사실에서 비롯됩니다. 즉, CAR의 표적으로 선택된 종양 관련 항원(tumor-associated antigens, TAA)은 종양 세포에서 더 높은 발현을 보이지만, 종종 정상 조직에서도 발현된다17. 따라서 CAR이 정상 조직을 효율적으로 인식할 때 CAR-T 세포가 예기치 않게 활성화되어 표적 이상, 종양 외 효과가 발생할 수 있으며, 이로 인해 사이토카인 방출 증후군(CRS), CAR-T 관련 뇌병증 증후군(CRES)18 및 기타 부작용이 발생할 수 있다19.

CAR-T 세포가 표적 TAA의 발현 수준에 따라 종양 세포를 정상 세포와 구별할 수 있도록 CAR의 친화도를 감소시키는 것을 포함하여 이러한 효과를 피하기 위해 많은 전략이 모색되었습니다. CAR-T 세포에 자살 유전자 또는 제거 마커와 같은 오프 스위치를 장착하여 예기치 않은 활성화 시 제거를 촉진합니다. CD3ζ 및 공동 자극 신호를 CAR-T 세포의 효과적인 활성화를 위해 동시 결합이 필요한 두 개의 CAR 부분으로 분할하는 단계; CAR-T 세포의 활성을 두 개의 서로 다른 TAA를 동시 발현하는 표적 세포로 제한하는 합성 노치(synNotch) 기반 회로를 이용하는 단계; 변화하는 환경 신호 20,21,22,23,24,25,26에 따라 CAR 발현을 조정하는 메커니즘을 구현하여 TME 감도를 달성하도록 CAR-T 세포를 엔지니어링합니다.

위에서 설명한 TME 민감도 옵션의 주요 고려 사항은 종양 세포의 급속한 증식으로 인한 TME의 낮은 산소 수준입니다. 저산소증에 대한 종양 세포의 적응은 유도성 소단위인 HIF-1α와 구성적으로 발현된 소단위인 HIF-1β로 구성된 이종이형성체 전사 인자인 저산소증 유발 인자-1(HIF-1)의 활성화에 달려있습니다. 정상 산소 조건에서 HIF-1α 단백질은 산소 의존 분해 도메인(ODD)28에 따라 유비퀴틴화(ubiquitination)와 급격한 프로테아솜 분해를 겪습니다. 세포의 산소 공급이 제한되면 HIF-1이 안정화되고 저산소증 반응 요소(HRE)29에 결합하여 다운스트림 표적 유전자의 전사를 활성화합니다. 산소에 민감한 요소로서의 ODD 및 HRE의 특성을 감안할 때, 저산소 TME30 내에서 CAR의 조건부 발현을 실현하기 위해 연구되었습니다. 여기에서는 저산소증에 민감한 CAR-T 세포의 표현형 및 기능적 특성 분석 방법에 초점을 맞춘 프로토콜을 제시하고, CAR 설계 및 이러한 세포의 준비 절차에 대한 간략한 설명을 제공합니다. 이 프로토콜은 저산소증 반응성 CAR을 활용하여 종양 외 독성이 억제된 CAR-T 세포를 생성하기 위한 유용한 지침을 제공하고자 합니다.

Protocol

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이 연구에서는 HER2(유전자 ID: 2064)를 표적으로 하는 저산소증 민감성 CAR인 HER2-BBz-ODD를 일반 CAR2-BBz와 비교했습니다. 두 CAR의 개략도는 그림 1A에 나와 있으며, 이는 HER2-BBz-ODD가 ODD 시퀀스를 CD3ξ의 C-터미널에 추가하여 HER2-BBz에서 파생됨을 보여줍니다. 두 CAR을 발현하는 렌티바이러스 벡터의 구축과 293T 세포 transfection에 의한 해당 렌티바이러스의 생성은 이전에 설명되었습니다31.

1. 렌티바이러스 감염에 의한 저산소증 민감성 CAR-T 세포 생성

  1. 냉동 보존된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 수조에서 37°C에서 빠르게 해동합니다. 해동된 PBMC를 400IU의 IL-2, 5ng/mL IL-7 및 10ng/mL IL-15(인간 T 세포 성장 배지, 이후 TGM 이라고 함)가 보충된 9mL의 무혈청 림프구 배양 배지가 들어 있는 15mL 튜브에 넣습니다.
  2. 세포 계수를 위해 부분 표본을 채취한 후 튜브를 300× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿화된 PBMC를 4 × 106 cells/mL의 밀도에서 TGM으로 재현탁시키고 현탁액을 6웰 플레이트로 옮깁니다.
  3. 항-hCD3/hCD28 코팅 면역비드를 준비합니다.
    1. 100μL의 마우스 IgG 마그네틱 비드를 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 옮기고 PBS가 있는 마그네틱 스탠드를 사용하여 2회 세척합니다.
    2. 비드를 100 μL의 PBS에 재현탁시키고 0.2 μg의 마우스 항-인간 CD3 항체와 2 μg의 마우스 -안티-휴먼 CD28 항체를 추가합니다. 피펫을 사용하여 혼합물을 부드럽게 혼합하고 4°C에서 밤새 흔들어 줍니다.
    3. PBS가 있는 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 2번 세척하고 100μL의 PBS에 재현탁합니다.
  4. 1.2단계에서 1:1의 bead-to-cell 비율로 anti-hCD3/hCD28 코팅된 immunobeads를 플레이트에 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 가습 된 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.
  5. 48시간 배양 후 세포를 피펫으로 부드럽게 혼합한 후 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 3분 동안 놓고 상층액을 새 15mL 튜브에 조심스럽게 옮겨 PBMC에서 면역비드를 제거합니다.
  6. 세포 계수를 위해 부분 표본을 취한 다음 300μL의 TGM에서 5 × 105 세포/웰에서 PBMC를 48웰 평판에 파종합니다. 200 μL의 렌티바이러스 스톡을 해당 웰에 넣고 프로타민 설페이트를 최종 농도 10 μg/mL까지 첨가합니다.
  7. 32°C에서 1,000×g으로 플레이트를 1.5시간 동안 원심분리하고 피펫을 사용하여 각 웰에서 300μL의 상층액을 조심스럽게 제거하고 버립니다. 그런 다음 피펫을 사용하여 1mL의 신선한 TGM을 추가하고 37°C에서 5% CO2 가 있는 가습 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다.
  8. 새로운 TGM을 추가하여 세포 밀도를 0.5-2 ×10-6 cells/mL로 2-3일마다 조정합니다. 먼저 세포를 12-웰 플레이트로 옮긴 다음 6-웰 플레이트로 옮깁니다. 4mL 부피에서 총 수가 6 × 106 에 도달할 때까지 세포를 계속 배양합니다.
    참고: 이와 병행하여 TGM을 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유RPMI1640 배지로 교체하는 경우를 제외하고는 위에서 설명한 것과 동일한 절차에 따라 Jurkat T 세포의 CAR transduction을 수행합니다.

2. 유세포 분석을 이용한 CAR-T 세포의 산소 의존성 CAR 발현 평가

  1. 1.8단계에서 CAR 형질주입된 T 세포를 TGM 2mL에서 2.5 × 106 cells/well의 밀도로 2개의 12웰 플레이트로 패팅합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 (정상 산소 상태, 세포 배양의 표준 조건은 21 % O2 임)가습 된 인큐베이터에 한 플레이트를 직접 놓고 다른 플레이트를 O2 수준이 1 % (저산소 상태)로 사전 설정된 이동식 CO2 / O2 / N2 인큐베이터 챔버에 놓고 챔버를 가습 된 상태로 유지하십시오. 37 ° C에서 5 % CO2 / 94 % N2 인큐베이터.
  2. 24시간마다 저산소 또는 정상 산소 조건에서 플레이트에서 5 × 105 세포를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 수집합니다. 500× g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 상층액을 제거한 다음 피펫팅을 통해 PBS 1mL의 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다. PBS 세척을 한 번 더 반복합니다.
  3. 각 튜브에서 50μL의 FACS 완충액(PBS에 2% FBS가 보충됨)에 펠릿 셀을 재현탁시킵니다. 1:100 희석액의 PE 복합 항-플래그 항체 50μL(0.2μg/mL)를 추가하고 피펫팅으로 철저히 혼합합니다. 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 배양합니다.
  4. 배양이 끝나면 각 튜브에 1mL의 FACS 완충액을 추가합니다. 피펫팅으로 완전히 혼합한 다음 500× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  5. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 버리고 2.4단계를 한 번 더 반복합니다.
  6. 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 200 μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁시킨 다음 생성된 세포 현탁액을 5mL 유관으로 옮깁니다.
  7. 2.6단계에서 세포 현탁액에 대한 유세포 분석을 수행하여 표면 CAR 발현을 확인합니다. transfection되지 않은 T 세포를 음성 대조군으로 포함합니다.
    1. FSC/SSC 및 FSC-A/FSC-H 게이트를 사용하여 살아있는 단일 세포를 스크리닝합니다. 모든 샘플에 대해 1 × 104 개의 라이브 단일 이벤트를 수집합니다. EGFP(성공적으로 transduction된 T 세포의 지표로 렌티바이러스 벡터에 포함된 구성 마커)에 양성인 세포를 게이트시킨 다음 피코에리트린(PE)(CAR 발현 세포)에 양성인 세포를 게이트하여 PE 양성률과 평균 형광 강도(MFI)를 측정합니다.

3. 웨스턴 블롯에 의한 CAR 변형 Jurkat T 세포의 CAR 발현의 산소 의존성 분석

  1. 섹션 1의 CAR 형질주입된 Jurkat T 세포를 2개의 48웰 플레이트에 5 × 105 세포의 밀도(500μL 배양 부피)로 10% FBS가 있는 배지에서 플레이트RPMI1640 만듭니다.
  2. 한 플레이트의 경우 CoCl2를 실험 웰에 0 μM, 50 μM 또는 200 μM의 최종 농도로 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 37°C(정상 산소 상태)에서 가습된 5% CO2 인큐베이터에 넣습니다. 다른 플레이트의 경우 CoCl2를 추가하지 말고 동일한 인큐베이터로 옮기기 전에 O2 레벨이 1%(저산소 상태)로 사전 설정된 이동식 CO2/O2/N2 인큐베이터 챔버에 넣으십시오.
  3. 24시간 배양 후 세포 현탁액을 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 옮깁니다. 튜브를 500× g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 먼저 1mL 피펫을 사용한 다음 100μL 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 제거하고 폐기한 다음 세포 펠릿을 50μL의 1x SDS-PAGE 샘플 버퍼에 재현탁시킵니다.
  4. 끓는 물 욕조에서 샘플을 10분 동안 가열합니다. 즉시 튜브를 얼음 위에 30초 동안 놓은 다음 16,000× g 에서 30초 동안 원심분리합니다.
  5. 투명화된 샘플 30μL를 두께가 1.5mm인 10웰, 10% SDS PAGE 겔의 각 슬롯에 로드합니다. 겔을 80V에서 30분 동안 작동시킨 다음 전압을 100V로 높이고 1.5시간 동안 실행합니다.
  6. 전기영동이 끝나면 표준 습식 전달 방법을 사용하여 겔에서 PVDF 멤브레인으로 단백질을 전달하며, 전류 및 지속 시간은 각각 400mA 및 1시간으로 설정됩니다.
  7. 실온에서 1시간 동안 차단 완충액(PBST(PBS+0.05% Tween-20)의 5% 우유(w/v))로 멤브레인을 차단합니다. 그런 다음 GAPDH 하중 제어 검출을 위해 30kD에서 40kD 사이의 조각을 잘라내고 CAR 분자 검출을 위해 50kD에서 70k D 사이의 조각을 잘라냅니다.
  8. 30-40 kD 및 50-70 kD 조각을 마우스 항-GAPDH 항체(1:2,000 희석) 및 마우스 항-플래그 항체(1:2,000 희석)와 함께 각각 3mL의 차단 완충액에 실온에서 2시간 동안 또는 4°C에서 밤새 배양합니다.
  9. 플랫폼 로커에서 실온에서 PBST로 멤브레인을 3 x 5분 동안 세척합니다.
  10. HRP-conjugated goat anti-mouse 항체 (1:5,000 희석)로 멤브레인을 3mL의 차단 완충액에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 PBST로 멤브레인을 5 x 10분 동안 세척합니다.
  11. HRP 기질로 배양하여 멤브레인을 개발한 다음 발광 이미지 분석기를 사용하여 검출된 단백질 띠를 시각화합니다.

4. 저산소증 민감성 CAR-T 세포에 의해 매개되는 세포독성의 산소 의존성에 대한 시험관 내 평가

  1. 0일차에 2개의 검은색 평면 바닥 96웰 조직 배양 플레이트에 10% FBS가 포함된 200μL의 DMEM에 실험 웰당 1 × 10개의4 표적 세포(SKOV3-Luc 세포)를 파종합니다.
  2. 1일차에 각 웰 상단에서 상층액 100μL를 조심스럽게 제거합니다. 10% FBS를 함유한 100μL의 DMEM 배지에 1:1, 2:1 및 4:1의 effector-to-target 비율로 CAR-T 세포 또는 non-transducted T 세포를 추가합니다.
  3. 21단계에서 설명한 대로 이동식 CO2/O2/N 2 인큐베이터 챔버를 사용하여 한 플레이트를 21% O2 분위기에 놓고 다른 플레이트를 1% O2 분위기에 놓습니다.
    참고: 이동식 CO2/O2/N2 인큐베이터 챔버를 사용할 수 없는 경우 배양 배지에 CoCl2 를 추가하여 저산소 상태를 모방할 수 있습니다.
  4. 2일차, 24시간의 공동 배양 후 피펫을 사용하여 모든 상층액(약 150-200μL)을 새로운 U-바닥 96웰 플레이트에 조심스럽게 옮깁니다. 나중에 사이토카인을 검출할 수 있도록 -20°C에서 보관하고 섹션 5에 설명된 절차에 따라 보관합니다.
  5. 60 μL의 1x 수동 용해 완충액을 4.4단계에서 검은색 평평한 바닥 96웰 플레이트의 각 실험 웰에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 셰이커에 놓고 효율적인 세포 용해를 위해 30분 동안 흔듭니다.
  6. 각 실험 웰에 60μL의 반딧불이 루시페라아제 기질을 추가하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 루시페라아제 활성을 즉시 측정합니다.
  7. 방정식 (1)을 사용하여 정규화된 세포독성(%)을 계산합니다.
    정규화 된 세포 독성 (%) = 100 - figure-protocol-1 ×100 (1)

5. 저산소증 민감성 CAR-T 세포에 의한 IL-2 및 IFN-γ 분비 검출

  1. 0일차에 코팅 완충액에서 IL-2 또는 IFN-γ 포획 항체를 1:250 희석하여 준비합니다. 희석된 항체 100μL를 96웰 ELISA 플레이트의 각 웰에 추가하고 플레이트를 4°C에서 밤새 배양합니다.
    참고 : 코팅 완충액은 증류수 1L에 NaHCO3 7.13g 과 Na2CO3 1.59g을 용해시키고 pH를 9.5로 조정하여 만듭니다.
  2. 1일차에 플레이트를 세게 뒤집어 흡착되지 않은 포획 항체를 제거한 다음 200μL의 세척 완충액(0.05% Tween 20 함유 PBS)으로 웰을 3회 세척합니다.
  3. 각 웰에 200μL의 분석 희석제(10% FBS를 함유한 PBS)를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  4. 접시를 세게 뒤집어 용액을 버리십시오. 그런 다음 200μL의 세척 버퍼로 웰을 3번 세척합니다.
  5. 4.4단계에서 얼어붙은 상층액 샘플/플레이트를 실온에서 해동합니다. 완전히 해동되면 샘플과 표준물질을 Assay Diluent로 희석합니다. 100μL의 희석된 샘플 또는 표준물질을 코팅된 ELISA 플레이트의 각 웰에 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
    참고: IL-2 검출의 경우 10배 희석이 권장되는 반면 IFN-γ 검출의 경우 50배 희석이 선호됩니다.
  6. 플레이트를 세게 뒤집어 샘플과 표준물질을 제거한 다음 웰당 200μL의 세척 버퍼로 웰을 5번 세척합니다.
  7. IL-2 검출 항체 또는 IFN-γ 검출 항체/Streptavidin-HRP(SAv-HRP)를 분석 희석액에서 1:250 비율로 희석하여 작동하는 검출 솔루션을 준비합니다. 각 웰에 100 μL의 작업 검출 용액을 추가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
  8. 용액을 버리고 200μL의 세척 완충액으로 웰을 7번 세척합니다.
  9. 각 웰에 100 μL의 기질 시약을 추가하고 어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.
  10. 각 웰에 50μL의 정지 용액(1 M H2SO4)을 추가합니다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 즉시 판독합니다.

Results

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HIF-1α의 ODD 도메인을 CAR 부분에 융합하는 것은 저산소증에 민감한 CAR을 생성하기 위한 주요 전략입니다. 이 연구에서 분석된 저산소증 민감성 HER2 표적 CAR인 HER2-BBz-ODD는 ODD 염기서열을 기존 HER2-BBz에 통합하여 이 전략을 사용하여 구성되었습니다(그림 1A). 이 연구에서는 렌티바이러스 형질도입을 사용하여 HER2-BBz-ODD CAR 또는 HER2-BBz CAR을 발현한 후 인간 PBMC와 Jurkat T 세포의 두 가지 세포 유형에서 산소 민감도를 조사했습니다.

첫 번째 검사는 저산소 조건과 정상 산소 조건에서의 CAR 발현으로, 유세포 분석에 의한 CAR 형질도입 PBMC 유래 T 세포와 웨스턴 블로팅에 의한 CAR 형질도입 Jurkat T 세포 모두에서 수행되었습니다. CAR 형질도입된 PBMC 유래 T 세포의 설정에서, HER2-BBz-ODD CAR은 CAR 양성 세포의 비율과 형광 강도(MFI) 중앙값 모두에서 21%O2 미만보다 1%O2 미만에서 유의하게 더 많이 발현되는 것을 관찰했다(그림 1B). CAR-transduced Jurkat T 세포의 면역블로팅 분석에서도 HER2-BBz-ODD의 저산소증 의존성 유도가 확인되었습니다.

이러한 맥락에서 저산소증의 화학적 유도제인 CoCl2를 배양 배지에 첨가하여 저산소 상태를 편리하게 모방할 수 있다는 점은 주목할 가치가 있습니다. 그림 1C에서 볼 수 있듯이, 당사의 면역블로팅 결과는 50 또는 200 μM CoCl2에 대한 노출이 1%O2에 대한 노출의효과를 재현하여 HER2-BBz-ODD CAR의 발현을 현저하게 유도하지만 HER2-BBz CAR의 발현을 유도하지는 않음을 보여주었습니다. 저산소증 민감성 CAR의 기능적 특성 분석은 PBMC 유래 CAR-T 세포로 수행되었습니다. 이 연구에서는 반딧불이 루시페라아제 운반 SKOV-3 세포주를 표적 세포주로 활용했습니다. 이 설정을 통해 공동 배양된 CAR-T 세포에 의해 매개되는 세포 독성을 평가하기 위한 대리물로서 표적 세포 관련 루시페라아제 활성을 측정할 수 있었습니다.

그림 1D에서 볼 수 있듯이 측정 결과 HER2-BBz CAR-T 세포는 대기가 정상산소 상태인지 저산소 상태인지에 관계없이 표적 세포를 효과적으로 죽이는 것으로 나타났습니다. 대조적으로, HER2-BBz-ODD CAR-T 세포는 조사된 세 가지 E:T 비율 모두에 대해 정상 산소 조건에서 훨씬 약한 세포 독성을 나타냈습니다. 그러나, 그들의 cytotoxicity는 저산소 상태에 드러낼 때 두드러지게 강화되었습니다. IL-2 및 IFN-γ의 상층액 수준은 CAR-T 세포와 표적 세포를 24시간 동안 공동 배양한 후 ELISA로 측정했습니다. 두 사이토카인 모두에 대해 HER2-BBz-ODD CAR-T 세포에서 21%O2에 비해 1%O2 미만에서 더 높은 분비가 관찰되었으며, 이는 세포독성 데이터와 일치합니다. 대조적으로, HER2-BBz CAR-T 세포는 21%O2에 비해 1%O2 미만으로 두 사이토카인의 분비가 더 낮았으며, 이는 저산소증이 세포 활성에 부정적인 영향을 미친다는 것을 나타냅니다(그림 1E). 이러한 결과를 종합해 볼 때, HER2-BBz-ODD CAR의 저산소증 민감성을 설득력 있게 입증했습니다.

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그림 1: 저산소증에 민감한 CAR-T 세포의 구성 및 특성화. (A) 저산소증에 민감한 CAR HER2-BBz-ODD 및 기존 대응 제품인 HER2-BBz의 설계를 개략적으로 나타낸 것입니다. 두 CAR 모두 N-말단 CD8α 신호 펩타이드, FLAG 태그, 인간 HER2 표적 scFv, CD8 힌지 및 막관통 도메인, 4-1BB의 costimulatory domain, CD3ξ signaling domain, IRES 및 EGFP로 구성된 세포 내 부분으로 구성됩니다. HER2-BBz-ODD는 ODD 도메인을 CD3ξ 신호 도메인의 C-말단에 융합한다는 점에서 HER2-BBz와 다르며, 정상 상태에서 유비퀴틴 의존적 분해를 촉진하여 저산소 의존적 발현을 허용합니다. (나,씨) HER2-BBz-ODD CAR의 산소 의존성 발현 평가. (B) 유세포분석을 사용하여 24시간, 48시간 또는 72시간 동안 1% 또는 21%O2 미만으로 배양한 후 인간 PBMC 유래 CAR-T 세포로 한 가지 평가를 수행했습니다. (C) 다른 평가는 CAR-transduced Jurkat T cell을 사용한 것으로, 21%O2, 50 또는 200 μM CoCl2 또는 1%O2 미만으로 배양한 후 24시간 후에 세포 용해물을 수확하고 HER2-BBz CAR-transducted 세포를 대조군으로 포함하여 western blotting을 사용하여 CAR 발현을 분석했습니다. (D,E) 다양한 산소 조건에서 CAR-T 세포의 시험관 내 세포 독성 및 사이토카인 분비. (D) CAR-T 세포는 1% 또는 21% O2 미만의 표시된 E:T 비율로 반딧불 루시페라아제 발현 SKOV3 세포와 공동 배양하였다. 24시간의 공동 배양 후, 비형질도입된 T 세포와 비교하여 세포 관련 반딧불이 루시페라아제 활성의 변화를 측정하여 표적 세포 사멸 효율을 측정했습니다. (E) 분비된 IL-2 및 IFN-γ의 검출을 위해 상층액을 수집하였다. 결과는 평균 ± SEM(n = 건강한 기증자 3명)(****p < 0.0001)으로 표시됩니다. 약어: scFv = 단일 사슬 단편 변수; CAR = 키메라 항원 수용체. 패널 C와 D는 Liao et al.31에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

안전성 문제는 모든 CAR-T 세포 치료제가 임상적으로 사용되기 위해 반드시 해결해야 하는 중요한 문제입니다. 종양 세포 또는 TME의 고유한 특성을 활용하는 것이 주요 연구 방향이 되었으며, 종양 조직을 선택적으로 표적으로 하는 CAR-T 세포 개발에 중점을 두고 있습니다. 저산소증에 민감한 CAR-T를 설계하는 것은 이 방향에서 매력적인 전략이며, 이 연구에서 제시된 CAR 부분을 자연적으로 발생하는 저산소증 감지 ODD 단백질 도메인과 융합하는 방법을 포함하여 여러 가지 접근 방식이 모색되고 있습니다. 대안적인 접근법은 CAR 발현을 유도하는 데 일반적으로 사용되는 구성적 프로모터를 이전 연구에서 가능성을 보여준 저산소증 반응 요소(HRE)로 대체하는 것입니다. HRE와 ODD 요소(보다 엄격한 발현 제어를 제공하는 와일드 타입 또는 엔지니어링 버전)를 결합하는 것이 저산소증 유발 CAR을 위한 최적의 설계를 나타낸다고 믿어집니다.

이 프로토콜은 저산소증에 민감한 CAR-T 세포를 생성하고 검증하기 위한 실험 절차를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜의 구현에는 몇 가지 주요 고려 사항이 포함됩니다. 주요 고려 사항은 저산소 조건을 만드는 것입니다. 두 가지 접근법 사이에서, 배양 배지에 CoCl2 를 첨가하는 것은 주로 그 편의성 덕분에 이전의 저산소증 관련 연구에서 널리 사용되었습니다32,33. 그러나 이 접근법에 의해 모방된 저산소증의 정도를 측정하는 것은 불가능합니다. 대조적으로, 이동식CO2/O2/N2 배양 챔버를 사용하는 것은O2 수준을 정밀하게 설정할 수 있다는 점에서 유리하며, 따라서 CAR-T 세포의 저산소증 민감도의 미세 분석에 적합합니다. 이러한 점에서, 종양 내의 저산소증 수준은 서로 다른 유형의 고형 종양 및 종양 진행의 상이한 기간에 따라 다르며(34), 단지 1%O2만이 프로토콜에서 예시된다. 연구원은 실제 요구량에 따라 산소 수준을 조정하는 것이 가장 좋습니다. CoCl2 분석법이 유일하게 사용 가능한 접근법인 경우 다양한 산소 수준을 시뮬레이션하기 위해 분석에 CoCl2 농도 범위를 포함하는 것이 좋습니다.

저산소증 의존성 CAR 발현을 검사하기 위한 적절한 방법을 선택하는 것은 또 다른 주요 고려 사항입니다. CAR-transduced Jurkat T cell의 면역블로팅 분석은 CAR construct optimization 중에 편리한 옵션이지만, 유세포 분석을 통해 CAR-transduced human PBMC의 표면 CAR 발현에 대한 산소 수준의 영향을 분석하는 것이 궁극적인 검증 역할을 합니다. 이전에 저산소증에 민감한 CAR의 개선된 버전, 즉HiTA-CAR 35를 사용하여 했던 것처럼 저산소 상태에서 정상산소 상태로 전환에 반응하여 CAR 발현의 역학을 조사하는 것이 가장 좋습니다. 이는 저산소증 제한 CAR 발현을 추가로 입증할 수 있습니다.

저산소증에 민감한 CAR-T 세포의 기능적 검증을 위해 프로토콜에 설명된 세포독성 분석에는 반딧불이 루시페라아제 운반 표적 세포를 사용하는 것이 포함됩니다. 이 리포터 기반 분석은 변형되지 않은 종양 세포를 사용할 수 있는 CCK8 방법 및 실시간 세포 분석(RTCA) 방법과 같은 다른 사멸 평가 방법으로 대체할 수 있습니다. RTCA 분석은 CAR-T 세포의 실시간 사멸 역학을 측정하는 데에도 유리합니다. CAR-T 세포에 의한 특이적 세포독성을 측정하기 위해서는 non-transduced PBMC를 대조군으로 포함시켜야 합니다. PBMC의 높은 transduction 효율은 실험군과 대조군 간에 검출된 세포독성의 차이가 첨가된 다양한 양의 effector cell에 의해 매개되는 비특이적 사멸로 인해 발생한다는 우려를 피하기 위해 바람직합니다.

이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 저산소 상태는 표적 세포와 T 세포 모두의 생존력에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 CAR-T 세포 매개 세포 독성과 관련이 없는 세포 사멸이 분석 결과의 해석을 혼란스럽게 할 수 있다는 우려를 불러일으킵니다. 이러한 우려를 피하거나 최소화하기 위해 분석 직전에 CAR-T 세포와 표적 세포가 모두 우수한 생존율을 갖도록 하는 것이 좋습니다. 또한 in vitro 검증이 성공적인 in vivo translation을 보장하지 않는다는 점에 유의해야 합니다. 저산소증 민감성 CAR-T 후보물질이 표적 항원을 발현하는 정상 조직을 표적으로 하는 것을 피할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 항상 생체 내 평가가 필요합니다

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국가 중점 연구 개발 프로그램(2016YFC1303402), 국가 주요 전염병 메가프로젝트(2017ZX10202102, 2017ZX10304402-002-007) 및 상하이시 위생건강위원회 일반 프로그램(201740194)의 보조금으로 지원되었습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5mL 원심분리기 튜브QSP509-GRD-Q상등액 및 세포 Cellection
프로토콜 단계 2,3,4
10% ExpressCast PAGENCM biotechP2012Immunoblotting
프로토콜 Step 3
10xPBS NCM 생명공학20220812세포 배양
프로토콜 Step 4
10mL 피펫YueyibioYB-25HPipetting
프로토콜 Step 1
10xTRIS-Glycine-SDS 전기영동 완충액에피자임3673020Immunoblotting
프로토콜 Step 3
15mL 원심분리기 튜브, Thermo Scientific339650상등액 및 세포 cellection
프로토콜 Step 1
25cm2 EasYFlaskThermo Scientific156367세포 배양
프로토콜 Step 3,4
4x 단백질 SDS 페이지 로딩 버퍼Takara9173Immunoblotting
프로토콜 Step 3
6웰 평면 조직 배양 플레이트Thermo Scientific140675T 세포 배양
프로토콜 Step 1
96웰 검은색 평면 바닥 조직 배양 플레이트Greiner655090세포 독성 분석
프로토콜 Step 4
96웰 ELISA 플레이트Corning3590ELISA
프로토콜 단계 5
96웰 플레이트 쉐이커QILINBEIERMH-2쉐이크
프로토콜 단계 4
96웰 U-하단 조직 배양 플레이트: Thermo Scientific268200상층액 cellection
프로토콜 단계 4,5
항-FLAG 항체SigmaF1804-50UGImmunoblotting
프로토콜 3단계
카르비놀Sinopharm10010061Immunoblotting
프로토콜 Step 3
이산화탄소 인큐베이터Thermo Scientific360세포 배양
프로토콜 Step 1,2,3,4
세포 계수판Hausser Scientific1492세포 계수
프로토콜 Step 1,3,4
CELLection Pan Mouse IgG KitThermo Scientific11531DMouse IgG magnetic beads
프로토콜 Step 1
원심분리기Thermo Scientific75002432세포 배양
프로토콜 Step 1,3,4
Chemiluminescence gel imaging systemBIO-RAD12003154Immunoblotting
프로토콜 Step 3
Cobalt chloride solution (0.5 M)bioleaperBR4000203저산소 상태
프로토콜 Step 2,3,4
DMEMCorning10-103- CV세포 배양
프로토콜 단계 4
전자 저울SartoriusPRACTUM612-1CN무게
프로토콜 단계 5
FBSBI04-001-1ACS세포 배양
프로토콜 단계 3,4
GAPDH 마우스 mAbABclonalAC002면역 블로팅
프로토콜 단계 3
겔 전기 영동 장치BIO-RAD1645070Immunoblotting
프로토콜 단계 3
GloMax Microplate ReadersPromegaGM3000루시페라제 활성 측정
프로토콜 단계 4
염소 항-마우스 IgG (H+L)YeasenP1126151면역 블로팅
프로토콜 단계 3
고속 마이크로프리징 원심분리기eppendorf5810  R세포 배양
프로토콜 단계 1
인간 IFN-&감마; ELISA 세트BD555142ELISA
프로토콜 단계 5
항목: 재조합 인간 IFN-&감마; 동결 건조 표준, 검출 항체 비오틴 안티 인간 IFN-&감마; , 캡처 항체 정제 항 인간 IFN-&감마;, 효소 시약 Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
Human IL-2 ELISA SetBD555190ELISA
프로토콜 단계 5
항목 : 재조합 인간 IL-2 동결 건조 표준, 검출 항체 비오틴 항 인간 IL-2 , 캡처 항체 정제 항 인간 IL-2, 효소 시약 Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (SAv-HRP)
IL-15R& D 시스템P40933T 세포 배양
프로토콜 단계
1 IL-21노보단백질GMP-CC45T 세포 배양
프로토콜 1단계
IL-7R& D 시스템P13232T 세포 배양
프로토콜 단계 1
도립 현미경OlympusCKX41세포 배양
프로토콜 단계 1,3,4
JurkatATCC TIB-152CAR-Jurkat 구성
프로토콜 3단계
LSRFortessaBDLSRFortessa유세포 분석
프로토콜 2단계
루시페라제 분석 시스템PromegaE1501루시페라제 리포터 분석
프로토콜 단계 4
항목: 수동 용해 버퍼, 반딧불이 루시페라제 기판
마이크로플레이트 리더BioTekHTXELISA
프로토콜 단계 5
모바일 CO2/O2/N2 인큐베이터 챔버China Innovation Instrument Co., 주식 회사.Smartor118저산소 상태
프로토콜 단계 2, 3, 4
마우스 안티 헥사 히스티딘 태그시그마SAB2702218면역 블로팅
프로토콜 3단계
NcmBlot Rapid Transfer BufferNCM 생명공학WB4600면역 블로팅
NcmECL 울트라NCM 생명공학P10300면역블로팅
프로토콜 단계 3
항목: NcmECL 울트라 루미놀/인핸서 시약(A), NcmECL 울트라 안정화 과산화물 시약(B) 
NovoNectin 코팅 48웰 평판NovoproteinGMP-CH38CAR-T 세포 구조
프로토콜 단계 1
OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride) 정제 세트SigmaP9187기질 시약
프로토콜 단계 5
항목: OPD 정제(은박), 요소 과산화수소 정제(금박)
PE 접합 항-DYKDDDDKBiolegend637310유세포 분석
프로토콜 단계 2
프로타민 설페이트시그마P3369-1OG렌티바이러스 감염
프로토콜 단계 1
단백질 마커 10 Kda-250 KDa에피자임WJ102면역블로팅
프로토콜 단계 3
  Purifed NA/LE Mouse Anti-Human CD3BD566685T Cells 배양
프로토콜 Step 1
정제된 NA/LE Mouse Anti-Human CD28BD555725T 세포 배양
프로토콜 Step 1
PVDF membraneMillipore168627Immunoblotting
Protocol Step 3
RPMI 1640Corning10-040-CVRCCell culture
Protocol Step 3
탈지 분유YeasenS9129060Immunoblotting
프로토콜 단계 3
SKOV3-LucATCCHTB-77세포 독성 분석
프로토콜 단계 4
Trypsin-EDTANCM 생명공학C125C1세포 배양
프로토콜 단계 4
Tween 20Sinopharm30189328Immunoblotting
프로토콜 단계 3
수조keelreinNB014467Heating
프로토콜 단계 1
X-VIVO 15 LONZA04-418Q무혈청 림프구 배양 배지
프로토콜 Step 1
: : : : , : : :

References

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