여기에서는 감염성 질환 병원체의 핵산 바이오마커 또는 기타 관심 유전자 마커의 검출에 사용할 수 있는 사전 혼합, 동결건조 재조합 효소 기반 등온 증폭 및 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기반 반응의 단계별 준비를 제시합니다.
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방법 논문
Premixed and Freeze-dryed Reagents를 사용한 현장 진단 CRISPR 기반 진단
이 논문에서
요약
초록
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기반 검출에 의한 분자 진단은 높은 진단 정확도와 특성을 가지고 있으며, 빠른 결과 처리 시간, 편리한 간단한 판독 및 복잡한 기기의 필요 없음과 같은 현장 진료 환경에서 사용하기에 적합한 특성을 가지고 있습니다. 그러나 이러한 반응은 많은 구성 요소와 수동 처리 단계로 인해 진료 현장에서 수행하는 것이 번거로울 수 있습니다. 여기에서 당사는 재조합 효소 기반 등온 증폭 및 CRISPR 기반 시약을 사용하여 질병 병원체 및 유전자 마커의 강력한 검출을 위한 단계적이고 최적화된 프로토콜을 제공하며, 이러한 시약은 사전 혼합된 다음 쉽게 보관하고 바로 사용할 수 있는 형식으로 동결 건조됩니다. 사전 혼합된 동결 건조 시약은 즉시 사용할 수 있도록 재수화할 수 있으며 높은 증폭 및 검출 효율성을 유지할 수 있습니다. 또한 CRISPR 기반 진단을 위한 사전 혼합 동결 건조 시약을 준비하고 사용할 때 일반적으로 발견되는 문제에 대한 문제 해결 가이드를 제공하여 더 넓은 진단/유전자 검사 커뮤니티에서 검출 플랫폼에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.
서론
핵산 바이오마커 검출을 위한 CRISPR 기반 진단은 2017년 1,2,3,4에 처음 보고되었으며, 그 이후 여러 국가에서 특히 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) RNA 검출을 위한 식품의약국(FDA) 승인 테스트를 통해 차세대 진단으로 입증되었습니다 5,6,7,8 . 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 넘어 다양한 바이러스 및 박테리아 9,10,11,12,13, 유전성 질환 돌연변이 및 결실을 감지하는 데 효과적인 것으로 입증되었으며, 단백질 및 소분자 바이오<....
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프로토콜
1. 동결건조된 RT-RPA 사전 혼합 시약의 준비
- 장비 준비
- 반응의 급속 동결을 위해 액체 질소 듀어 또는 트레이를 준비합니다. 듀어 또는 트레이에 액체 질소를 채웁니다.
- 동결 건조기
- 배수관과 챔버 내부에 응축수가 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 물을 제거하십시오.
- 챔버 내부와 1.5mL 미세 원심분리기 튜브 금속 랙을 RNase 오염 제거 용액으로 청소한 다음 70% 에탄올을 사용합니다.
- 챔버 도어와 진공 방출 밸브를 닫습니다.
- 동결 건조기를 켭니다.
- 선반 온도를 -30 °C로 수동으로 설정합니다.
- 분자 생물학 장비
- RNase 오염 제거 용액으로 피펫, 피펫 팁 랙, 와류 믹서, 스핀다운 미니 원심분리기 및 영구 마커를 세척하십시오.
- 수돗물로 다음을 청소한 다음 청소용 물티슈로 닦으십시오: 미세 원심분리기 튜브용 플라스틱 랙과 얼음용 폼 상자.
- RNase 오염 제거 용액과 70% 에탄올로 세척하여 가열 블록(트리글리신 용액을 용해/재용해하는 데 사용)을 ....
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결과
SARS-CoV-2의 s 및 n 유전자의 결합 검출을 통한 FAM 형광 신호 생성의 역학과 이 정보가 동결건조된 사전 혼합 반응 제형을 위한 최적의 조건을 결정하는 데 어떻게 사용되었는지 강조합니다. 모든경우에 Ct값이 결정된 검출한계(LoD) 내에 있는 샘플(CT~31-33)과 LoD(CT~35-37)7 내에 있는 샘플과C-t가 있는 샘플을 포함하여 더 나은 감도로 프로토콜을 구별할 수 있도록 했습니다.
동결건조된 사전 혼합 RT-RPA의 경우, 사전 혼합 반응에 KOAc를 포함하면 반응 민감도에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다(그림 2A). 따라서 사전 혼합 반응에서 KOAc를 생략하고 RNA 샘플이 첨가된 후 반응 개시제인 Mg(OAc)2와.......
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토론
이 프로토콜에는 중요한 단계가 있습니다. 영역 분리의 경우 핵산 추출, 마스터믹스 준비(증폭 전 영역), 시료 첨가 및 앰플리콘 검출(증폭 후 영역)을 위해 별도의 공간을 사용하는 것이 좋습니다. 각 영역은 별도의 도구 및 장비 세트를 사용하여 설정해야 합니다. 한 영역에서 다른 영역으로, 특히 포스트 amp사전 amplification 영역으로amp합리화 영역. 작업 영역의 청소가 필요합니다: RNase/DNase 오염 제거 용액/3% Clorox로 작업 영역, 피펫, 볼텍서 및 영구 마커를 청소한 다음 70% 에탄올 또는 고압멸균 탈이온수로 청소해야 합니다. 기본 실험기구와 1.5mL 튜브 플라스틱 랙 및 미니 원심분리기의 로터 어댑터와 같은 기기의 분리 가능한 부품을 세척해야 합니다. 뉴클레아제가 없는 물은 음성 대조군 및 반응 성분으로 사용되므로 주의해서 다루지 않으면 오염될 수 있는 민감한 시약입니다. 따라서 한 번만 사용할 수 있도록 작은 물 부분 표본을 만.......
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공개 사항
M.P.와 C.U.는 SARS-CoV-2 RNA의 다중 검출을 위한 제형에 대한 특허를 태국에 출원했습니다. R.K.는 상충되는 이해관계를 선언하지 않습니다.
감사의 글
CU는 VISTEC-Siriraj Frontier Research Center 산하의 Siam Commercial Bank와 TSRI(Thailand Science Research and Innovation), 기본 기금, 2024 회계연도, 보조금 번호 FRB670026/0457의 자금 지원을 인정합니다. R.K.와 M.P.는 각각 VISTEC의 학생 및 연구 보조 기금으로 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Betaine 해결책 | Sigma-Aldrich | B0300-1VL | |
| DEPC-Treated water | Invitrogen | AM9915G | |
| Dithiothreitol (DTT) | Merck | 3870-25GM | |
| EpiScript reverse transcriptase | Lucigen | ERT12925K | |
| Gly-Gly-Gly& 주의; | Sigma-Aldrich | SIA-50239-1G | |
| LwaCas13a | 자체 | 균주 이름 : Leptotrichia wadei, 약어 : Lwa, 단백질 이름 : LwaCas13a | |
| 염화 마그네슘 용액, 1M | Sigma-Aldrich | M1028-10X1ML | |
| NxGenT7 RNA 중합 효소 | Lucigen | 30223-2 | |
| 폴리 (에틸렌 글리콜) | Sigma-Aldrich | 81300-1KG | |
| 칼륨 아세테이트 용액, 5M | 시그마-알드리치 | 95843-100ML-F | |
| 리오뉴클레오티드 용액 믹스 | NEB | N0466L | |
| RNase H | NEB | M0297L | |
| 자당 | TCI | TCI-S0111-500G | |
| 트레할로스 이수화물 | 시그마-알드리치 | SIA-90210-50G | |
| 트리즈마 염산염 용액, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194-100ML | |
| TwistAmp 기본 키트 | TwistDx | TABAS03KIT | |
| Equipment | |||
| BluPAD 듀얼 LED 블루/화이트 라이트 트랜스루미네이터 | Bio-Helix | BP001CU | |
| Dry Bath 듀얼 블록 | ELITE | 4-2-EL-02-220 | 모델: EL-02 |
| 형광 마이크로플레이트 | 리더 Tecan | 30050303 | 모델: Infinite 200 Pro |
| 동결 건조기 | LABCONCO | 794001030 | FreeZone Triad 벤치탑 동결 건조기 |
| 마이크로플레이트 384-well | Greiner | GDE0784076 | F-Bottom, 소량, Hibase, Med. 바인딩, 블랙 |
| 실시간 열 순환기(CFX Connect Real-Time PCR 시스템) | Bio-Rad | 185-5201 | 모델: CFX Connect 광학 모듈 |
| Oligonucleotide | |||
| s-gene forward RPA 프라이머 | IDT | GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA | |
| s-유전자 리버스 RPA 프라이머 | IDT | TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG | |
| n-유전자 포워드 RPA 프라이머 | IDT | GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG | |
| n-유전자 역 RPA 프라이머 | IDT | CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC | |
| LwaCas13a-crRNA s 유전자 | Synthego | GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG | |
| LwaCas13a-crRNA n 유전자 | Synthego | GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGCAQUAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC | |
| FAM-polyU-IABkFQ reporter | IDT | 56-FAM/rUrUrUrU/3IABkFQ | |
| O-hannah_cytb_F RPA primer | IDT | GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG | |
| O-hannah_cytb_R RPA primer | IDT | AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA | |
| synT7crRNA13a_ O_hannah | IDT | GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC |
참고문헌
- Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
- Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. CRISPR-based diagnostics. Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).
- Makarova, K. S., Koonin, E. V.
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재인쇄 및 허가
