Premixed and Freeze-dryed Reagents를 사용한 현장 진단 CRISPR 기반 진단

요약

여기에서는 감염성 질환 병원체의 핵산 바이오마커 또는 기타 관심 유전자 마커의 검출에 사용할 수 있는 사전 혼합, 동결건조 재조합 효소 기반 등온 증폭 및 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기반 반응의 단계별 준비를 제시합니다.

초록

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기반 검출에 의한 분자 진단은 높은 진단 정확도와 특성을 가지고 있으며, 빠른 결과 처리 시간, 편리한 간단한 판독 및 복잡한 기기의 필요 없음과 같은 현장 진료 환경에서 사용하기에 적합한 특성을 가지고 있습니다. 그러나 이러한 반응은 많은 구성 요소와 수동 처리 단계로 인해 진료 현장에서 수행하는 것이 번거로울 수 있습니다. 여기에서 당사는 재조합 효소 기반 등온 증폭 및 CRISPR 기반 시약을 사용하여 질병 병원체 및 유전자 마커의 강력한 검출을 위한 단계적이고 최적화된 프로토콜을 제공하며, 이러한 시약은 사전 혼합된 다음 쉽게 보관하고 바로 사용할 수 있는 형식으로 동결 건조됩니다. 사전 혼합된 동결 건조 시약은 즉시 사용할 수 있도록 재수화할 수 있으며 높은 증폭 및 검출 효율성을 유지할 수 있습니다. 또한 CRISPR 기반 진단을 위한 사전 혼합 동결 건조 시약을 준비하고 사용할 때 일반적으로 발견되는 문제에 대한 문제 해결 가이드를 제공하여 더 넓은 진단/유전자 검사 커뮤니티에서 검출 플랫폼에 더 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.

서론

핵산 바이오마커 검출을 위한 CRISPR 기반 진단은 2017년 1,2,3,4에 처음 보고되었으며, 그 이후 여러 국가에서 특히 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) RNA 검출을 위한 식품의약국(FDA) 승인 테스트를 통해 차세대 진단으로 입증되었습니다 5,6,7,8 . 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 넘어 다양한 바이러스 및 박테리아 9,10,11,12,13, 유전성 질환 돌연변이 및 결실을 감지하는 데 효과적인 것으로 입증되었으며, 단백질 및 소분자 바이오마커 ^2,12를 감지하도록 엔지니어링할 수 있습니다. CRISPR 기반 진단은 종종 재조합 효소 중합효소 증폭(RPA) 또는 루프 매개 등온 증폭(LAMP)^14,15과 같은 등온 증폭 방법을 RNA 유도 CRISPR 연관(Cas) 효소를 사용하는 CRISPR 기반 검출과 표적 인식 후 "부수적" 엔도뉴클레아제 활성을 결합합니다³. 등온 증폭과 CRISPR 기반 검출의 이중 사용은 기술에 몇 가지 바람직한 속성, 특히 골드 스탠다드 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 근접하는 높은 진단 정확도와 단일 뉴클레오티드 다형성 ^1,9을 포함한 작은 염기서열 차이를 다중화 및 검출할 수 있는 기능을 제공합니다.

그러나 CRISPR 기반 진단의 가장 정확한 버전에는 여러 구성 요소와 단계가 포함되어 있으며 비전문가 또는 현장 진료(POC)에서 수행하기가 복잡할 수 있습니다. 매우 정확한 CRISPR 기반 진단의 사용을 POC 설정으로 확장하는 이러한 문제를 해결하기 위해 당사는 사용하기 쉽고 저장이 용이한 premixed, 동결건조, 재조합 효소 기반 등온 증폭 및 CRISPR 기반 검출 반응을 준비하기 위한 프로토콜을 개발했습니다⁷. 이러한 프로토콜은 CRISPR^{기반 진단(}CRISPR-based diagnostics)14에 필요한 생화학적 성분의 생산에 대한 추가 정보, 설계 가이드라인(design guidelines)¹ 및 대체 등온 증폭 기법(^isothermal amplification techniques) 2,14,15,16 및 Cas 효소(Cas enzymes⁾¹²를 사용하는 제형에 대한 추가 정보를 포함하는 CRISPR 기반 진단법^{(CRISPR-based} diagnostics)14에 대한 기존의 우수한 프로토콜(protocol)을 보완해야 한다. 궁극적으로, CRISPR 기반 진단이 휴대용 및 기기가 필요 없는 분석이 필요한 환경에서 빠르고 저렴하며 민감한 핵 검출을 실현하는 데 도움이 될 수 있기를 바랍니다 ^1,9,17.

우리는 주로 프로토콜에서 RPA와 Cas13 기반 탐지의 조합을 사용합니다. RPA는 주변 온도(37-42°C)에 가까운 온도에서 작동하므로 에너지 및 장비 요구 사항이 적습니다. 다른 등온 증폭 반응에는 더 높은 온도가 필요합니다(LAMP, 60-65°C, 가닥 변위 증폭(SDA), 60°C, 지수 증폭 반응(EXPAR), 55°C, 헬리카제 종속 증폭(HDA), 65°C)². RPA 프라이머의 설계도 LAMP 프라이머와 달리 복잡하지 않으며 다중증폭 ^7,9,14로 확장할 수 있습니다. RPA로 두 개 이상의 대상을 다중화하는 것은 실제로 어렵지만, 간섭을 최소화하기 위해 다중화 RPA 프라이머를 설계하는 방법에 대한 명확한 지침이 있다¹⁸.

캐리오버 오염은 2단계 워크플로우에서 여전히 큰 문제로 남아 있지만, RPA에서 생성된 앰플리콘은 LAMP¹⁴의 대형 연결 앰플리콘에 비해 크기가 작고 캐리오버 오염을 일으킬 가능성이 적습니다. RPA 프라이머는 표준 가이드라인¹⁴에 따라 설계할 수 있으며, 일반적으로 뉴클레오티드 길이가 25-35이고 용융 온도는 54-67°C입니다. 앰플리콘 크기는 200 염기쌍보다 작아야 합니다. 역전사효소(RT)를 RPA에 첨가하여 RNA로부터 증폭을 가능하게 할 수 있으며, 역전사-RPA(RT-RPA)에서는 생성된 RNA(DNA hybrid)를 분해하고^{증폭 반응을 촉진}하기 위해 일반적으로 다른 효소 Ribonuclease H(RNase H)를 소량으로 첨가^합니다. Cas13 기반 검출을 위한 T7 전사를 허용하기 위해 T7 RNA 중합효소 프로모터를 전방 RPA 프라이머의 5' 말단에 배치할 수 있습니다.

RPA에서 앰플리콘을 생성한 후 crRNA 프로그래밍된 Cas 효소로 검출할 수 있습니다. 앰플리콘 검출에 사용할 수 있는 다양한 Cas 효소 중에서, 당사는 높은 절단 활성¹ 및 잘 특성화된 폴리뉴클레오티드 절단 선호도 ^7,9로 인해 RNA 표적화 Cas13 변이체를 선호하며, 후자는 다중 검출에 사용할 수 있습니다. Cas13에 대한 crRNA 염기서열은 spacer 및 direct repeat(DR) 염기서열을 사용하여 생산된 RNA의 표적 부위에 상보(역보체)하도록 설계되었습니다. crRNA 염기서열과 RPA 프라이머는 배경 및 위양성을 증가시키는 off-target 증폭 산물의 원치 않는 Cas 기반 검출을 피하기 위해 겹치지 않아야 합니다¹⁴.

Cas 기반 검출은 리포터 핵산 분자(Cas13 기반 반응의 경우 RNA 리^{포터)1,2,14}의 절단을 모니터링하기 위해 다양한 검출 방식에 의존합니다. 다양한 검출 방식에는 비색계, 전기화학적 판독, 형광, 염기서열분석 판독 및 측면 플로우 스트립이 포함됩니다². 우리는 단일 청색 LED 광원을 사용하여 효과적으로 여기시킬 수 있는 시아닌 5(Cy5), 로다민 X(ROX) 및 카르복시플루오레세인(FAM)과 같은 다양한 형광단 및 리포터를 고려한 형광 판독값과 마이크로플레이트 리더 또는 실시간 열 순환기 ^7,14로 분석한 형광 판독에 중점을 둡니다. 또한 형광 판독은 설정이 쉽고 지속적인 모니터링이 가능하여 실시간 정량 분석이 가능합니다. Cas 효소를 사용한 다중화 RPA 전증폭 및 다중화 Cas13 기반 검출은 여러 유전자 표적의 동시 검출을 위해 다색 형광 판독과 결합될 수 있습니다 ^2,7.

당사의 프로토콜에서는 먼저 RNA 샘플을 동결건조된 형태의 RT-RPA 시약에 추가하여 RT-RPA로 RNA를 등온 증폭합니다(그림 1). RT-RPA 동안, T7 프로모터는 생성된 이중 가닥 DNA 앰플리콘에 첨가됩니다. 그 후, RPA 제품은 T7 RNA 중합효소를 포함하는 동결건조된 Cas13 기반 검출로 전송됩니다. 이 검출 반응은 DNA 앰플리콘을 RNA(T7 RNA 중합효소를 통해)로 변환하며, 이는 crRNA 프로그래밍된 Cas13으로 쉽게 검출할 수 있습니다. 표적 활성화 Cas13은 리포터 분자를 절단하여 감지 가능한 형광 신호 ^2,7,14를 생성합니다. 여기의 프로토콜은 Leptotrichia wadei(LwaCas13a)에 의한 검출과 관련이 있지만, 직교 Cas13 및 Cas12 효소 ^7,9를 사용하여 최대 4개의 표적을 동시에 다중 검출하도록 확장할 수 있습니다. RPA 및 Cas 기반 검출 반응은 감도 손실이 있더라도 단일 튜브로 결합할 수 있습니다¹⁴.

그림 1: CRISPR 기반 검출 워크플로우. 워크플로우는 두 개의 표적 유전자 검출을 보여줍니다. 첫째, DNA 타겟 내의 관심 영역은 RPA로 등온 증폭됩니다. RNA 표적을 검출할 때 역전사(RT-RPA)로 반응을 수행할 수 있습니다. 그 후, T7 전사는 dsDNA 앰플리콘을 RNA로 변환하고, 이는 다시 표적 결합 시 부수적 RNase 활성을 유도할 수 있는 Cas13-crRNA 복합체에 의해 인식됩니다. 소멸된 형광 리포터의 절단은 마이크로플레이트 리더를 사용하여 모니터링하거나, LED 투광 기기로 시각화하거나, 실시간 열 순환기와 함께 사용할 수 있는 형광 신호를 생성합니다. 약어: CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; RT = 역전사; RPA = 재조합 효소 중합효소 증폭; Cas = CRISPR 관련 단백질; LED = 발광 다이오드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

여기에 제시된 프로토콜의 주요 특징은 동결건조를 위한 프리믹스 제형입니다. 프리믹싱은 반응 사용을 단순화하고 재현성을 향상시키지만, RPA 및 Cas 기반 검출 내의 많은 구성 요소, 특히 역전사 및 ATP와 같은 일부 불안정한 보조 인자는 용액에서 안정적이지 않습니다. 그러므로, 우리는 장기 저장을 위해 동결 건조될 수 있고 쉬운 수송 및 배치 ^1,9,20 할 수 있는 미리 혼합된 해결책을 공식화합니다. 또한 사전 혼합된 동결 건조 시약은 더 많은 샘플 부피(따라서 더 높은 DNA/RNA 입력)를 추가하여 반응을 재구성할 수 있으므로 검출 감도를 개선하는 데 도움이 됩니다¹⁰. 당사의 제형에서는 주로 trehalose²¹을 동결건조된 RPA 및 Cas 기반 검출 반응에서 동결 보호제로 사용합니다⁷. 시약 보존 외에도 트레할로스는 효소 안정화 16,22,23,24를 증가시키고 dsDNA²³의 용융 온도를 감소시킴으로써 반응을 촉진합니다. 트레할로스 이외의 다른 안정제(5,7,21,25,26)를 탐색하면 다양한 사용 시나리오에 대해 훨씬 더 최적화된 제형을 얻을 수 있습니다.

프로토콜

1. 동결건조된 RT-RPA 사전 혼합 시약의 준비

1. 장비 준비
   1. 반응의 급속 동결을 위해 액체 질소 듀어 또는 트레이를 준비합니다. 듀어 또는 트레이에 액체 질소를 채웁니다.
   2. 동결 건조기
      1. 배수관과 챔버 내부에 응축수가 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 물을 제거하십시오.
      2. 챔버 내부와 1.5mL 미세 원심분리기 튜브 금속 랙을 RNase 오염 제거 용액으로 청소한 다음 70% 에탄올을 사용합니다.
      3. 챔버 도어와 진공 방출 밸브를 닫습니다.
      4. 동결 건조기를 켭니다.
      5. 선반 온도를 -30 °C로 수동으로 설정합니다.
   3. 분자 생물학 장비
      1. RNase 오염 제거 용액으로 피펫, 피펫 팁 랙, 와류 믹서, 스핀다운 미니 원심분리기 및 영구 마커를 세척하십시오.
      2. 수돗물로 다음을 청소한 다음 청소용 물티슈로 닦으십시오: 미세 원심분리기 튜브용 플라스틱 랙과 얼음용 폼 상자.
      3. RNase 오염 제거 용액과 70% 에탄올로 세척하여 가열 블록(트리글리신 용액을 용해/재용해하는 데 사용)을 준비합니다. 그런 다음 전원을 켜고 온도를 60°C로 설정합니다.
2. 사전 혼합된 RPA 반응 준비
   참고: 이 제형은 10회 반응(3개의 RPA 펠릿 사용)에 대한 것입니다.
   1. 사용하기 전에 트리글리신 용액에 침전물이 있는지 확인하십시오. 침전물이 있는 경우 60°C에서 배양하고 사용하기 전에 완전히 혼합하여 용해하십시오. 열에 민감한 다른 시약을 추가하기 전에 트리글리신 용액을 식히십시오.
      알림: 튜브를 장기간 실온에 두면 침전물이 쉽게 형성될 수 있습니다.
   2. 냉동고에서 3개의 RPA 펠릿 스트립 튜브를 제거합니다. 스트립 튜브를 실험실 벤치에 부드럽게 두드려 흰색 펠릿을 제거합니다.
   3. 3개의 펠릿을 모두 1.5mL 미세 원심분리기 튜브 A에 넣습니다.
   4. 25μL의 뉴클레아제가 없는 물을 피펫팅하여 스트립 튜브에 남아 있는 RPA 분말을 헹구고 헹굼 용액을 새 1.5mL 미세 원심분리기 튜브 B로 옮깁니다.
   5. 0.57M 트리글리신 용액 10μL와 프라이머 혼합물 10μL(각 10μM)를 마스터믹스 튜브 B에 추가합니다.
   6. 와류 믹스 튜브 B; 그런 다음 회전하여 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
   7. 28.4x RPA 완충액 5 μL (50 % (w / v) PEG20000 500 μL, 250 μL의 1 M Tris pH 7.4 및 100 mM dithiothreitol (DTT) 100 μL)를 마스터 믹스 튜브 B에 넣고 여러 번 강하게 두드리거나 흔들어 철저히 혼합합니다.
      알림: 우리는 RPA 펠릿을 용해시키기 위해 모든 것을 추가하기 전에 마스터믹스 튜브에서 PEG의 점도를 희석/감소시키는 데 도움이 되도록 이러한 방식으로 솔루션을 만듭니다.
   8. 1.2.3단계에서 튜브 A에 수집된 펠릿을 마스터믹스 튜브 B로 옮긴 다음 마스터믹스 튜브를 여러 번 뒤집어 혼합합니다. 용액이 균질하고 단상 것처럼 보이는지 관찰한 다음(약간 불투명하게 보이기도 함) 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
      알림: 혼합이 철저하지 않으면 PEG로 인해 용액/현탁액이 상 분리될 수 있습니다.
   9. 0.71 μL의 200 Unit/μL RT와 2.84 μL의 5 Unit/μL RNase H를 마스터믹스 튜브에 추가합니다. 마스터믹스 튜브를 위아래로 여러 번 부드럽게 두드리 거나 뒤집습니다. 튜브를 아래로 돌려 얼음 위에 놓습니다.
      참고: RT 및 RNase H는 혼합으로 인한 전단에 민감하기 때문에 이전 단계를 많이 혼합한 후 이러한 효소를 추가합니다. RT/RNase H 첨가 후 더 이상 소용돌이가 발생하지 않습니다.
   10. 마스터믹스 용액 8.4μL를 예냉된 1.5mL 튜브 10개에 분취하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 이렇게 하려면 피펫 팁을 마스터믹스 용액에 넣고 마스터믹스 용액을 팁에 천천히 꾸준히 끌어들여 기포가 형성되는 것을 방지하고 정확한 부피 측정을 보장합니다. 마스터믹스 용액을 사전 냉각된 1.5ml 튜브에 분주합니다.
       알림: 8.4 μL 분탁을 사용하면 경험상 마스터믹스 튜브에 ~1-2 μL 현탁액이 남게 됩니다. 실험자는 10가지 반응 모두에 충분한 시약을 확보하기 위해 분취량을 약간 낮출 수 있습니다. 점성 용액을 취급할 때 적절한 피펫팅 기술을 사용하십시오.
   11. 부분 표본화가 완료된 후 액체 질소에 잠긴 금속 랙에 튜브를 넣어 동결 건조를 준비합니다. 튜브를 액체 질소에 5분 동안 담그십시오.
       참고: 동결건조는 과도한 용액을 제거하므로 더 많은 DNA/RNA 입력을 추가할 수 있어 감도를 높이는 데 도움이 됩니다. 동결 건조된 사전 혼합 RPA 반응은 -20°C에서 8개월 동안 보관할 수 있습니다. 동결건조는 동일한 배치로 준비된 RPA 마스터믹스를 사용하여 주어진 실험을 수행하는 경우 재현성에 도움이 되므로 더 큰 배치를 만드는 것도 도움이 됩니다.
3. 동결건조(Lyophilization)
   1. 동결 건조기에서 수집기와 선반 온도를 확인하십시오. 필요한 경우 수집기 온도가 -75 ± 5 °C에 도달하고 선반 온도가 -30 ± 1 °C에 도달할 때까지 기다리십시오.
   2. 금속 랙의 열린 튜브를 청소용 물티슈 시트로 덮고 열린 튜브와 함께 금속 랙을 동결 건조기 선반에 놓고 선반 문을 닫습니다.
   3. 표 1에 표시된 프로그램을 선택하고 시작을 누릅니다. 2차 건조 단계(20°C, <0.1mbar, 단계 시간을 "무한"으로 설정하여 온도가 무한 유지됨)의 30분 후 프로그램을 중지합니다.
      알림: 수분 응결을 방지하기 위해 튜브를 동결 건조기에서 예열합니다.
   4. 진공 방출 밸브를 열어 압력을 해제한 다음 선반에서 랙을 제거합니다. 튜브를 즉시 캡을 닫고 동결건조된 반응을 -20°C에서 보관합니다.
      참고: 동결건조된 RPA 및 CRISPR-Cas13a 사전 혼합 반응은 -20°C에서 8개월 동안 보관할 수 있습니다.

2. 동결건조된 CRISPR-Cas13a premixed 검출 시약의 제조

알림: 장비 준비를 위해 1.1단계를 따르십시오.

1. CRISPR-Cas13a 프리믹스 반응 제제(10회 반응)
   1. 10 μL의 LwaCas13a (^7,8,14 자체 생산) (2 mg / mL), Cas 저장 완충액, 10 ng / μL (225 nM) crRNA, 25 mM rNTP, 50 Unit / μL T7 RNA polymerase, 2 μM의 FAM 형광 리포터.
   2. 13 μL의 Cas 저장 완충액 (148.8 mM Tris-HCl pH 50, 7.4 M NaCl, 0.6 % 글리세롤, 2 mM DTT)을 10 mg / mL LwaCas13a의 10 μL에 첨가하여 13 μg / mL (900 nM)에서 LwaCas13a의 작업 용액을 준비합니다.
   3. CRISPR-Cas13a 마스터믹스 반응을 다음과 같이 준비합니다: RNase-free 물 71μL, 20mM Tris pH 7.4 40μL, 60%(w/v) 트레할로스 20μL, 10ng/μL(225nM) crRNA 10μL(여기서는 SARS-CoV-2의 s 및 n 유전자 대상), 100mM rNTP 믹스 8μL(각 25mM), 50 Unit/μL T7 RNA 중합효소 6μL, 25μL의 2μM FAM 형광 리포터 및 10μL의 126μg/mL(900nM) LwaCas13a. 마스터믹스 튜브를 뒤집어 잘 섞는다. 그런 다음 스핀 다운합니다.
   4. 마스터믹스 17μL를 얼음 위에 놓인 10개의 1.5mL 튜브에 분취합니다. 액체 질소에 잠긴 랙에 튜브를 놓고 튜브를 액체 질소에 5분 동안 담그십시오.
2. 동결건조(Lyophilization)
   1. 동결 건조기에서 수집기 및 선반 온도를 확인하고 수집기 온도가 -75 ± 5°C에 도달하고 선반 온도가 -30 ± 1°C에 도달할 때까지 기다립니다.
   2. 튜브를 동결 건조기에 넣습니다. 표 1 에 표시된 프로그램을 선택하고 시작을 누릅니다. 2차 건조 단계(25°C, <0.1mbar, 단계 시간을 "무한"으로 설정하여 온도를 무한 유지)의 30분 후 프로그램을 중지 합니다.
   3. 진공 방출 밸브를 열어 압력을 해제하고 선반에서 랙을 제거합니다. 튜브를 즉시 캡을 닫고 동결건조된 반응을 -20°C에서 보관합니다.
      참고: 동결건조된 RPA 및 CRISPR-Cas13a 사전 혼합 시약은 -20°C에서 8개월 동안 보관할 수 있습니다.

3. RT-RPA 핵산 증폭

참고: 교차 오염을 방지하기 위해 작업 영역과 피펫터를 사전 증폭, 샘플 추가 및 사후 증폭을 위해 분리해야 합니다. 여과된 피펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다.

1. 열 진탕 인큐베이터를 42°C로 예열합니다.
2. 1μL의 마그네슘 아세테이트(Mg(OAc)₂) 및 초산칼륨(KOAc) 용액 혼합물(196mM Mg(OAc)₂ 및 1.5M KOAc로 구성)을 동결건조되고 사전 혼합된 RT-RPA 펠릿(섹션 1에서)이 들어 있는 튜브 측면에 추가합니다.
   참고: Mg(OAc)₂ 및 KOAc 혼합물을 추가하는 방법: 방울은 튜브의 약 1mL 부피 표시 지점에 놓아야 합니다. 여기서 드롭은 명확하게 볼 수 있으며 튜브 폐쇄 또는 기타 조치로 인해 손실될 가능성이 없습니다. 증폭은 튜브 바닥에서 방울을 수집하기 위해 회전한 후 시작됩니다. 한 번에 두 개 이상의 반응을 처리할 때 증폭을 동시에 시작할 수 있습니다.
3. RNA 샘플(또는 대조군 샘플) 12.4μL를 추가하여 RT-RPA 펠릿을 재현탁시킵니다.
   참고: 첨가 순서는 음성 샘플/음성 대조군, 검사할 RNA/DNA, 양성 샘플/양성 대조군입니다.
4. RT-RPA 반응을 시작하려면 실온에서 3초 동안 스핀다운 미니원심분리기를 사용하여 3.2단계 및 3.3단계에서 추가된 용액을 간단히 스핀다운합니다.
5. 튜브를 조심스럽게 두드려 섞은 다음 3초 동안 다시 한 번 짧은 스핀다운을 합니다.
6. 42°C에서 60분 동안 예열된 가열 블록 또는 열 진탕 인큐베이터에 넣어 반응을 배양합니다.
7. 반응이 끝나면 CRISPR-Cas 검출 단계(섹션 4)를 진행하기 전에 반응 튜브를 꺼내 얼음 위에 놓습니다.
   알림: RPA 증폭 제품은 검출 반응에 즉시 사용하거나 4°C에서 며칠 동안 또는 -20°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.

4. CRISPR-Cas13 핵산 검출

1. 형광 마이크로플레이트 리더를 켜고 가열 온도를 37°C로 설정 및 예열한 후 표 2와 같은 프로그램을 선택합니다.
2. 얼음 위에 384웰 플레이트를 놓습니다.
3. 17μL의 8mM 염화마그네슘 용액을 추가하여 동결건조된 CRISPR-Cas 사전 혼합 검출 반응(섹션 2에서)을 재현탁시킵니다. 튜브를 조심스럽게 두드려 섞는다. 그런 다음 3초 동안 잠시 회전하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
4. 재현탁 반응 혼합물 18μL를 얼음 위의 사전 냉각된 384웰 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.
5. 섹션 3에서 준비한 RPA 산물 2μL를 각 반응 웰에 첨가합니다.
6. 얼음에서 플레이트를 제거하고 예열된 형광 마이크로플레이트 리더에 빠르게 넣은 다음 시작을 누릅니다.
   참고: 384웰 플레이트를 예열된 형광 마이크로플레이트 리더로 옮길 때 반응 시작을 동기화할 수 있도록 384웰 플레이트를 얼음 위에 놓았습니다.

결과

SARS-CoV-2의 s 및 n 유전자의 결합 검출을 통한 FAM 형광 신호 생성의 역학과 이 정보가 동결건조된 사전 혼합 반응 제형을 위한 최적의 조건을 결정하는 데 어떻게 사용되었는지 강조합니다. 모든_{경우에 Ct값이} 결정된 검출한계(LoD) 내에 있는 샘플_(CT~31-33)과 LoD(_CT~35-37)⁷ 내에 있는 샘플과_C-t가 있는 샘플을 포함하여 더 나은 감도로 프로토콜을 구별할 수 있도록 했습니다.

동결건조된 사전 혼합 RT-RPA의 경우, 사전 혼합 반응에 KOAc를 포함하면 반응 민감도에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다(그림 2A). 따라서 사전 혼합 반응에서 KOAc를 생략하고 RNA 샘플이 첨가된 후 반응 개시제인 Mg(OAc)₂와 함께 첨가했습니다. 또한 동결 보호제 트레할로스의 최적 농도(그림 2B)와 동결건조된 RT-RPA 반응(그림 2C)에서 트리글리신⁷의 효과를 결정하기 위해 유사한 분석을 사용했습니다. 따라서, 최적의 동결건조, 사전 혼합된 RT-RPA 반응을 6% 트레할로스, KOAc가 없는 상태로 준비하고(그러나 RNA 샘플 후에 나중에 추가됨) 프로토콜 섹션 1에 설명된 대로 트리글리신을 보충했습니다.

그림 2: 동결건조되고 미리 혼합된 RT-RPA 반응 최적화. RT-RPA 반응은 SAR-CoV-2의 n 유전자를 타겟으로 하는 프라이머를 사용하여 제조하였다. Mg(OAc)₂ 는 모든 예비혼합 반응에서 제외되었습니다. 예비혼합 반응에 첨가된 (A) KOAc, (B) 트레할로스 및 (C) 트리글리신의 효과를 평가하였다. 생성된 FAM 형광을 통한 반응 모니터링은 실시간 열 순환기 또는 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 수행되었습니다. 삼중 측정의 개별 데이터가 표시됩니다. 약어: RT = 역전사; RPA = 재조합 효소 중합효소 증폭; CRISPR = 군집, 규칙적, 간격적, 짧은 회문 반복; Cas = CRISPR 관련 단백질; SAR-CoV-2 = 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2; _{CT =} 사이클 임계값; FAM = 카르복시플루오르세인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

동결건조된 사전 혼합된 Cas13a 기반 반응의 경우, 올바른 동결 보호제를 사용하는 것이 중요하다는 것을 확인했습니다: 6% 트레할로스 또는 2% 수크로스¹⁹ 가 잘 작동한 반면, 1% 또는 5% w/v PEG20000에서 더 낮은 자당은 동결건조 후 반응 효율을 보존하지 못했습니다(그림 3). _MgCl2 는 모든 반응에서 생략하고, 재수화 단계에서 첨가하였다. 최적의 동결건조된 Cas13 기반 검출 반응은 프로토콜 섹션 2에 나타난 바와 같이 6% 트레할로스로 제조하였다.

그림 3: 동결건조되고 미리 혼합된 Cas13 기반 검출 반응 최적화. 검출 반응은 SARS-CoV-2 n 유전자의 RPA 산물을 사용하여 37°C에서 수행되었습니다. 테스트는 동결 건조 전후에 수행되었습니다. _MgCl2는 모든 예비혼합 반응에서 제외되었다. (A) 트레할로스, (B) PEG20000 및 (C) 슈크로스가 동결건조 후 반응 효율을 보존하는 능력을 평가하였다. 생성된 FAM 형광을 통한 반응 모니터링은 실시간 열 순환기를 사용하여 수행되었습니다. "동결건조 후" 조건에 대한 삼중 측정의 개별 데이터와 "동결건조 전" 조건의 1회 반복 데이터가 표시됩니다. 그림 3A,B는 Patchsung et ^al.7에서 발췌한 것입니다. 약어: RPA = recombinase polymerase amplification; SAR-CoV-2 = 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2; FAM = 카르복시플루오르세인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

RT-RPA 및 Cas13 기반 반응을 위한 동결건조된 사전 혼합 시약은 -20°C에서 최소 8개월 동안 안정적입니다[그림 4].

그림 4: -20°C에서 동결건조되고 사전 혼합된 RPA 및 CRISPR-Cas13a 시약의 안정성 테스트. (A) 30일, (B) 45일, (C) 3개월, (D) 5개월, (E) 8개월에 안정성 테스트. 삼중 측정의 개별 데이터가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

SARS-CoV-2의 s 및 n 유전자 검출을 위한 동결건조된 RT-RPA 및 Cas13 기반 반응의 LoD는 그림 5에 나와 있습니다. 신호 생성의 동역학은 하나의 유전자만 검출되는 경우와 비교하여 이중 유전자 검출 시 개선될 수 있습니다.

그림 5: 단일 유전자 대 이중 유전자 검출의 분석 민감도. (A) SAR-CoV-2의 s 유전자를 표적으로 하는 동결건조된 singleplex RT-RPA 및 Cas 기반 검출의 LoD. (B) SAR-CoV-2의 n 유전자를 표적으로 하는 동결건조 단일플렉스 RT-RPA 및 Cas 기반 검출의 LoD. (C) s 및 n 유전자를 표적으로 하는 동결건조 멀티플렉스 RT-RPA 및 이중 Cas 기반 검출의 LoD. LoD는 직렬로 희석된 SARS-CoV-2 RNA를 사용하여 측정하였으며_{, 그 CT} 값은 n 유전자를 표적으로 하는 RT-qPCR 분석을 사용하여 측정되었습니다. 3-6회 반복 측정의 개별 데이터가 표시됩니다. 약어: LoD = 검출 한계; RT = 역전사; RPA = 재조합 효소 중합효소 증폭; CRISPR = 군집, 규칙적, 간격적, 짧은 회문 반복; Cas = CRISPR 관련 단백질; SAR-CoV-2 = 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2; _{CT =} 사이클 임계값; qPCR = 정량적 중합효소 연쇄 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

바이러스 검출 외에도 CRISPR 진단을 기반으로 하는 POC 유전형 분석 도구의 프로토타입을 선보이며 태국 고유종의 독사를 식별하는 데 도움을 줍니다(그림 6). 물린 상처에서 채취한 DNA 샘플을 통해 뱀 종을 빠르고 정확하게 식별하면 해독제를 신속하게 투여하여 환자의 생존 가능성을 높일 수 있습니다. 우리는 Ophiophagus hannah (King cobra)를 포함한 8 종의 뱀 종의 미토콘드리아 cytochrome b (cytb) 유전자 내 영역을 표적으로 삼았고 O. hannah cytb 유전자의 합성 DNA 대리자 검출이 민감도 수준에 도달 할 수 있음을 보여주었습니다 (그림 6B, C).

그림 6: 뱀에 물린 부위로부터 뱀 종을 식별하기 위한 CRISPR 기반 검출을 위한 프로토타입. (A) Ophiophagus hannah의 cytb 유전자 검출을 위한 RPA 프라이머 및 LwaCas13a crRNA 설계. T7 프로모터(T7 오버행)는 전방 RPA 프라이머의 5' 말단에 배치되었습니다. (B) 60분 동안 FAM 신호 생성의 역학 및 (C) O. hannah의 cytb 유전자 세그먼트에 해당하는 합성 dsDNA 입력의 LwaCas13a 매개 검출에서 종점 FAM 형광. 다양한 입력 농도(0, ^10-9, ^10-12, ^10-15 및 ^10-18M)가 사용되었습니다. 데이터는 삼중 측정의 평균 ± s.d.입니다. 약어: RPA = recombinase polymerase amplification; CRISPR = 군집, 규칙적, 간격적, 짧은 회문 반복; Cas = CRISPR 관련 단백질; FAM = 카르복시플루오르세인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

CRISPR-Cas13a premixed 검출 시약의 동결건조
걸음	램프 속도	선반 온도	시간(hh:mm)	진공
	(°C/분)	(°C)		(mbar)
동결 1	3	-30	끄기	-
드라이 1	3	-30	끄기	0
드라이 2	3	4	01:00	0
드라이 3	3	20	∞	0

표 1: 사전 혼합된 RT-RPA 및 CRISPR-Cas13a 검출 시약의 동결건조기 설정. 약어: RT = 역전사; RPA = 재조합 효소 중합효소 증폭; CRISPR = 군집, 규칙적, 간격적, 짧은 회문 반복; Cas = CRISPR 관련 단백질.

매개 변수		설정
온도		37 캜
키네틱 사이클	소요 시간	02:00 (mm:ss)
	인터벌 시간	02:30 (mm:ss)
흔들어	소요 시간	1초
	모드	선형
	진폭	1의 mm
Fluorescence intensity(형광 강도)	여기 파장	488 nm의
	방출 파장	520 nm의
	모드	맨 위로
	Z-위치	24470
	이득	71
	통합 시간	20 마이크로초
	깜박임 횟수	25

표 2: 핵산 검출을 위한 형광 마이크로플레이트 리더 프로그램.

토론

이 프로토콜에는 중요한 단계가 있습니다. 영역 분리의 경우 핵산 추출, 마스터믹스 준비(증폭 전 영역), 시료 첨가 및 앰플리콘 검출(증폭 후 영역)을 위해 별도의 공간을 사용하는 것이 좋습니다. 각 영역은 별도의 도구 및 장비 세트를 사용하여 설정해야 합니다. 한 영역에서 다른 영역으로, 특히 포스트 amp사전 amplification 영역으로amp합리화 영역. 작업 영역의 청소가 필요합니다: RNase/DNase 오염 제거 용액/3% Clorox로 작업 영역, 피펫, 볼텍서 및 영구 마커를 청소한 다음 70% 에탄올 또는 고압멸균 탈이온수로 청소해야 합니다. 기본 실험기구와 1.5mL 튜브 플라스틱 랙 및 미니 원심분리기의 로터 어댑터와 같은 기기의 분리 가능한 부품을 세척해야 합니다. 뉴클레아제가 없는 물은 음성 대조군 및 반응 성분으로 사용되므로 주의해서 다루지 않으면 오염될 수 있는 민감한 시약입니다. 따라서 한 번만 사용할 수 있도록 작은 물 부분 표본을 만드는 것이 좋습니다.

항상 분석 프라이머를 사용하여 음성 대조 반응을 실행하여 오염을 확인하십시오. 또한 오염 문제를 피하기 위해 시료 첨가실 대신 사전 증폭 영역에 뉴클레아제가 없는 물을 추가하여 음성 대조 반응을 준비하는 것이 좋습니다. 마그네슘 아세테이트-칼륨 아세테이트 혼합물은 캐리오버 앰플리콘으로 인한 시약 오염을 방지하기 위해 한 번만 사용되는 소량(~20 μL/tube)으로 분주해야 합니다. 마그네슘-칼륨 아세테이트 혼합물을 동결건조된 프리믹스 RPA 반응에 추가할 때는 매번 피펫 팁을 교체하는 것이 좋습니다. 실험 워크플로우의 경우, 워크플로우를 사전 증폭에서 증폭 후 실험까지 단방향으로 유지합니다. "더 깨끗한"(증폭 전) 작업 공간에서 "더 더러운"(증폭 후) 작업 공간으로 이동합니다.

앰플리콘의 캐리오버 오염을 방지하기 위한 분석법의 수정 및 문제 해결을 위해 실험의 세 가지 주요 단계를 공간적으로 분리하는 것이 좋습니다. RPA 반응 준비; 샘플 추가; 그리고 증폭 및 감지 단계. 마스터믹스는 실험실의 템플릿이 없는 공간에서 준비해야 합니다. 방을 바꿀 때는 장갑과 실험복도 갈아입습니다. 증폭 전후까지 단방향으로 작업합니다. 다른 단계에 동일한 피펫을 사용하지 마십시오. 다음 단계를 위해 다른 세트의 피펫을 배치하는 것이 가장 좋습니다 : 마스터 믹스 준비; 템플릿 DNA/RNA의 추가; 그리고 증폭된 제품의 이동. 여과된 팁을 사용하고 에어로졸 형성을 최대한 방지하고 튜브를 열 때 튜브 내부를 만지지 마십시오. 증폭 실험에서 오염이 발견되면 모든 시약을 교체해야 합니다. 가능하면 새 시약을 가지고 다른 실험실로 가서 오염이 지속되는지 확인하십시오. 시약을 제외하고 피펫을 포함한 다른 것을 가져오지 마십시오. 오토클레이브할 수 있는 피펫을 오토클레이브해 보십시오.

증폭 속도를 개선하려면(분석 최적화) 먼저 TwistDx의 RPA 설명서와 같은 제조업체의 지침을 참조하여 최적의 설계를 보장하십시오. 다음으로, RPA 및 CRISPR 반응을 촉진하는 것으로 알려진 반응 첨가제를 추가하는 것과 같은 반응의 경험적 최적화를 시도하십시오⁷; 반응 시간 증가(예: RPA 반응 시간 최대 60분); 또는 다양한 프라이머 서열 및 농도. 또한 가능한 한 많은 샘플 부피를 추가하는 것이 좋습니다. 동결건조된 시약을 사용하면 더 많은 시료량을 추가할 수 있습니다. 배경 형광을 줄이기 위해 RPA가 완료된 후 검출로 이동하기 전에 열 비활성화 단계(5분 동안 75°C)를 수행하거나 리포터의 농도를 최적화할 수 있습니다. 기자가 너무 많으면 더 높은 배경 정보를 제공합니다. 또한 RNase inhibitor를 추가하면 리포터의 Cas-independent 분해를 방지하는 데 도움이 됩니다.

(RT)-RPA 및 CRISPR 기반 반응 조건과 처리 절차를 최적화하는 것 외에도 사용되는 시약의 품질이 우수하고 모든 반응에 앞서 핵산 추출 단계가 성공적인지 확인해야 합니다. 동결건조 시약은 높은 검출 감도를 제공하고, 휴대가 간편하며, POC 검사가 가능하고, 다양한 임상 샘플에 적용할 수 있습니다. 또한 동결건조(RT)-RPA는 임상 샘플에서 핵산 추출물을 추가하여 즉시 재수화할 수 있습니다. 이전 연구에서는 제한된 부피 없이 더 많은 양의 핵산 투입을 할 때 더 높은 감도를 보여주어 표적 핵산의 총량을 효과적으로 증가시켰습니다.

CRISPR 기반 진단은 비인두 및 인후 면봉, 소변 및 혈청과 같은 임상 샘플을 수집하여 병원체를 감지하도록 조정되었습니다 ^7,8,11. 또한 단일 뉴클레오티드 변이체를 구별하고, 항생제 내성 유기체에서 항생제 내성 유전자를 식별하고, 암 관련 돌연변이를 검출하는 데 적용되었습니다. 이 기술의 유용성은 등온 증폭 및 CRISPR 기반 검출을 위한 공학적 생화학 반응을 휴대용 형광계 또는 측면 플로우 스트립과 같은 현장 준비 장치 및 판독값과 결합할 수 있는 현장 응용 분야에서 가장 클 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Material
Betaine 해결책	Sigma-Aldrich	B0300-1VL
DEPC-Treated water	Invitrogen	AM9915G
Dithiothreitol (DTT)	Merck	3870-25GM
EpiScript reverse transcriptase	Lucigen	ERT12925K
Gly-Gly-Gly& 주의;	Sigma-Aldrich	SIA-50239-1G
LwaCas13a	자체		균주 이름 : Leptotrichia wadei, 약어 : Lwa, 단백질 이름 : LwaCas13a
염화 마그네슘 용액, 1M	Sigma-Aldrich	M1028-10X1ML
NxGenT7 RNA 중합 효소	Lucigen	30223-2
폴리 (에틸렌 글리콜)	Sigma-Aldrich	81300-1KG
칼륨 아세테이트 용액, 5M	시그마-알드리치	95843-100ML-F
리오뉴클레오티드 용액 믹스	NEB	N0466L
RNase H	NEB	M0297L
자당	TCI	TCI-S0111-500G
트레할로스 이수화물	시그마-알드리치	SIA-90210-50G
트리즈마 염산염 용액, 1M, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T2194-100ML
TwistAmp 기본 키트	TwistDx	TABAS03KIT
Equipment
BluPAD 듀얼 LED 블루/화이트 라이트 트랜스루미네이터	Bio-Helix	BP001CU
Dry Bath 듀얼 블록	ELITE	4-2-EL-02-220	모델: EL-02
형광 마이크로플레이트	리더 Tecan	30050303	모델: Infinite 200 Pro
동결 건조기	LABCONCO	794001030	FreeZone Triad 벤치탑 동결 건조기
마이크로플레이트 384-well	Greiner	GDE0784076	F-Bottom, 소량, Hibase, Med. 바인딩, 블랙
실시간 열 순환기(CFX Connect Real-Time PCR 시스템)	Bio-Rad	185-5201	모델: CFX Connect 광학 모듈
Oligonucleotide
s-gene forward RPA 프라이머	IDT		GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA
s-유전자 리버스 RPA 프라이머	IDT		TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG
n-유전자 포워드 RPA 프라이머	IDT		GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG
n-유전자 역 RPA 프라이머	IDT		CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC
LwaCas13a-crRNA s 유전자	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG
LwaCas13a-crRNA n 유전자	Synthego		GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGCAQUAACAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC
FAM-polyU-IABkFQ reporter	IDT		56-FAM/rUrUrUrU/3IABkFQ
O-hannah_cytb_F RPA primer	IDT		GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG
O-hannah_cytb_R RPA primer	IDT		AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA
synT7crRNA13a_ O_hannah	IDT		GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC