여기에서는 두개골 거근 장뇨근(LAL)의 생체 내 전기천공법(in vivo electroporation)과 탈질법(denervation)을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차를 통해 신경근 시냅스의 재생에서 근육 유래 단백질의 잠재적 역할을 연구할 수 있습니다.
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방법 논문
In Vivo Electroporation과 Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle의 단기 신경 재생이 결합되었습니다.
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
신경근 접합부(NMJ)는 골격근 섬유의 수축을 제어하여 많은 유기체의 조정된 움직임을 허용하는 말초 시냅스입니다. NMJ에서 시냅스전 운동 축삭돌기 말단은 근육 시냅스 후 도메인과 접촉하고 말단 Schwann 세포로 덮여 있습니다. NMJ의 무결성과 기능은 노화, 신경근 질환 및 외상성 부상을 포함한 여러 조건에서 손상됩니다. NMJ 유지 및 재생에 대한 근육 유래 단백질의 잠재적 기여도를 분석하기 위해 기계적 신경 손상 후 두개골 거근 장(LAL) 근육의 탈관화와 생체 내 유전자 전달 전략이 결합되었습니다. 이전의 연구 결과는 대조군 형광 단백질의 강제 발현이 NMJ 조직이나 신경 전달을 변화시키지 않는다는 것을 보여주었습니다. 이 절차는 LAL 근육의 생체 내 전기천공법 후 두개근육을 자극하는 안면 신경의 특정 가지를 절개 또는 분쇄하여 각각 NMJ 탈뇌 및 재신경 분포를 유도하는 자세한 방법을 설명하는 것을 목표로 합니다. 편리한 LAL 근육에서 이러한 실험 전략의 조합은 단기 NMJ 재신경 분포의 맥락에서 근육 단백질 과발현 또는 침묵의 잠재적 기여를 연구하는 효율적인 방법을 구성합니다.
서론
신경근 접합부(neuromuscular junction, NMJ)는 근육 수축을 조절하고 간접적으로 유기체의 조정된 움직임을 조절하는 말초 시냅스입니다1. 그것은 시냅스전 운동 축삭 말단, 아세틸콜린 수용체(AChRs)가 풍부한 근육 시냅스 후 도메인 및 축삭 말단 2,3,4를 덮고 있는 비수초 말단 Schwann 세포에 의해 형성됩니다. 외상성 말초 신경 손상, 질병 또는 약물 중재로 인한 NMJ 탈관되면 수축 근육 활동이 손실됩니다 5,6. 특정 허용 미세환경이 시기적절하고 효율적인 기능 회복을 가능하게 하기 때문에 재생 과정에 도움이 될 수 있는 단백질을 찾는 것은 영구적인 필요성입니다. 여기에서는 신경 손상 후 NMJ의 단기 재생에서 근육 단백질 발현 조작의 잠재적 역할을 구체적으로 평가하기 위해 두 가지 절차가 결합되었습니다.
두개골의 등쪽 표면에 위치한 LAL(....
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프로토콜
모든 실험 절차는 칠레 오스트랄 대학교(Universidad Austral de Chile)의 생명윤리위원회(프로토콜 Nr. 503/2023)의 승인을 받았으며, 칠레 국립연구개발청(ANID)의 생명윤리위원회(Bioethics Committee)에서 부과한 규범과 실험동물 관리에 대한 유럽이사회 지침(European Council Directive for the Care of Laboratory Animals)의 지침을 따랐습니다. 본 연구는 남녀 모두(30-45g)의 성인(3-6개월령) CF-1 마우스를 사용했습니다. 안락사는 흡입제, 마취제, 과다 투여 후 출혈에 의해 이루어졌다. 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 생체 내 LAL 근육 전기천공법
- 준비
- 0.8L/min 산소와 함께 2.5% 이소플루오란을 흡입한 상태에서 아크릴 유도 챔버에서 마우스를 부드럽게 진정시킵니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 그 후, 해부 실체 현미경 아래에서 흡입 마취 기계에 연결된 코 튜브 마스크를 사용하여 마우스 진정을 유지합니다.
알림: 절차를 시작....
- 0.8L/min 산소와 함께 2.5% 이소플루오란을 흡입한 상태에서 아크릴 유도 챔버에서 마우스를 부드럽게 진정시킵니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 그 후, 해부 실체 현미경 아래에서 흡입 마취 기계에 연결된 코 튜브 마스크를 사용하여 마우스 진정을 유지합니다.
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결과
tdTomato 단백질20의 높은 형광 양자 수율은 전기천공법 효율에 적합한 추적자입니다. 따라서, in vivo electroporation에 의한 LAL 근육에서의 tdTomato 단백질의 발현을 평가하였다(그림 1). LAL 근육은 전기천공법 21일 후에 절개하였다. 전체 마운트 준비는 두 개의 신경 분포 영역이 있는 LAL 근육의 얇은 꼬리 밴드(cLAL, 청록색 다각형)와 5개의 신경 분포 영역 8,10이 있는 두꺼운 로스트랄 밴드(rLAL, 노란색 다각형)를 보여줍니다(그림 1B). DNA 주입 부위와 전극의 위치에 따르면, 특히 rLAL 부분의 근육 섬유의 높은 비율이 tdTomato의 발현에 양성이었습니다(그림.......
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토론
in vivo muscle electroporation과 denervation의 조합은 NMJ4에서 재생 틈새를 조사하는 데 유용한 실험적 접근 방식입니다. LAL 근육은 표면적으로 노출되어 있기 때문에, 이러한 결합된 절차는 단백질 발현 또는 활성에 영향을 미칠 수 있는 프로브 또는 약물의 전달로 쉽게 보완될 수 있다12. 또한, 리포터 유전자를 LAL 근육에 전기천공하는 것은 신경 손상 및/또는 NMJ 재생의 맥락에서 신호 전달 경로의 활성화 또는 억제를 추적하는 유용한 도구를 제공할 수 있습니다.
두 절차 모두 빠르고, 재현성이 높으며, 특히 일부 실험 세부 사항을 주의 깊게 복제하는 경우 식별 가능한 마커를 통해 쉽게 식별할 수 있습니다. 예를 들어, 안면 신경의 특정 후방 귓바퀴 가지의 적절한 신경 손상은 언급.......
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공개 사항
저자는 밝힐 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업에 대한 유용한 토론과 의견을 제시해 주신 NeSt Lab 회원들의 매우 협력적이고 고무적인 환경에 감사드립니다. NeSt Lab에서의 작업은 현재 FONDECYT 1221213에서 자금을 지원하고 있습니다. 그림 1A 의 구성표는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| #5/45 Dumont 펜치 | 고급 과학 도구 | 11251-35 | 사용 전 살균 |
| 안티 2H3 | DSHB | 희석 1 : 300 | |
| 안티 S100 사용 준비 완료 | Dako | IR504 | 희석 1 : 5 |
| 안티 SV2 | DSHB | 희석 1 : 50 | |
| 클로르헥시딘 글루코네이트 2% | DifenPharma | ||
| 냉광 해부 실체 현미경 | Motic | 모델 SMZ-171 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 희석 1 : 100 |
| Dumont #5SF 펜치 | 파인 사이언스 도구 | 11252-00 | 사용 전에 소독하십시오 |
| Dumont 미니 펜치 – 스타일 5 | 파인 사이언스 도구 | 11200-14 | 사용 전에 살균하십시오 |
| ECM 830 전기포레이터 | BTX 하버드 장치 | ||
| 금 바늘형 전극 | Genetrodes, BTX | 45-0114 | 10mm 스트레이트 |
| 해밀턴 주사기 | Hamilton | 80400 | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3884 | |
| 흡입 마취기 | SciVerma Scientific | M3000 테이블 탑 | |
| Isoflurane | Baxter | 218-082 | |
| 마우스 | Instituto de Salud Publica - 칠레 | 성인 (3-6개월) CF-1 마우스, 남녀 모두 (30-45 g) | |
| 면도날 | Schick | ||
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| &알파;-BTX Alexa Fluor 488 | Invitrogen | B13422 | 희석 1 : 500 |
참고문헌
- Slater, C. R. The functional organization of motor nerve terminals. Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robi....
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