이 프로토콜은 설치류 심장의 복잡한 심장 구조를 조사하기 위해 적응된 조직 투명화 방법과 함께 고급 광시트 현미경을 활용하여 심장 형태 형성 및 리모델링을 이해하는 데 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
광시트 현미경(LSM)은 심장의 복잡한 3차원(3D) 구조를 이해하는 데 중추적인 역할을 하며, 기본적인 심장 생리학 및 병리학적 반응에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 이로써 우리는 마우스 모델에서 심장의 미세 구조를 밝히기 위해 LSM 기술의 개발 및 구현에 대해 탐구합니다. 이 방법론은 맞춤형 LSM 시스템과 조직 투명화 기술을 통합하여 체적 이미징을 위해 심장 조직 내 광 산란을 완화합니다. 기존 LSM과 이미지 스티칭 및 멀티뷰 디콘볼루션 접근 방식을 결합하면 심장 전체를 캡처할 수 있습니다. 축 방향 해상도와 시야(FOV) 사이의 본질적인 균형을 해결하기 위해 ASLM(Axially Swept Light-Sheet Microscopy) 방법을 도입하여 초점에서 벗어난 빛을 최소화하고 전파 방향에 걸쳐 심장을 균일하게 비춥니다. 한편, iDISCO와 같은 조직 투명화 방법은 빛 투과를 향상시켜 심부 구조의 시각화를 용이하게 하고 심장 전체의 심근을 종합적으로 검사할 수 있도록 합니다. 제안된 LSM과 조직 투명화 방법의 조합은 설치류 심장의 심장 구조를 해결하는 연구자에게 유망한 플랫폼을 제공하며, 심장 형태 형성 및 리모델링에 대한 이해를 위한 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
서론
심부전은 전 세계적으로 주요 사망 원인으로 남아 있으며, 주로 성숙한 심근세포의 재생 능력 부족에 기인합니다1. 심장의 복잡한 구조는 심장의 기능에 중요한 역할을 하며 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 심장 구조에 대한 깊은 이해는 심근 경색에 대한 반응으로 심장 형태 형성 및 리모델링의 기본 과정을 설명하는 데 필수적입니다. 최근의 연구 결과에 따르면 신생아 마우스는 부상 후 심장 기능을 회복할 수 있는 반면, 성체 마우스는 이러한 재생 능력이 부족하다2. 이는 마우스 모델의 구조적 및 기능적 이상과 관련된 단서를 조사하기 위한 기반을 마련합니다. 컨포칼 현미경과 같은 기존 이미징 방법은 제한된 침투 깊이, 느린 포인트 스캐닝 방식, 레이저 광에 장기간 노출로 인한 사진 손상 등 기술적 한계가 있습니다. 이는 온전한 심장의 포괄적인 3차원(3D) 이미징을 방해합니다. 이러한 맥락에서 광시트 현미경(LSM)은 고속 이미징, 사진 손상 감소 및 탁월한 광학 절편 기능의 이점을 제공하는 강력한 솔루션으로 부상하고 있습니다 3,4,5. LSM....
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프로토콜
동물 프로토콜 및 실험은 텍사스 대학교 댈러스 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC #21-03)의 감독하에 승인 및 수행되었습니다. 이 연구에는 출생 후 1일차(P1)의 신생아와 8주 된 성인을 포함한 C57BL6 마우스가 사용되었습니다. 남성과 여성 사이에는 차이가 관찰되지 않았다. 모든 데이터 수집 및 이미지 후처리는 연구 또는 교육용 라이선스가 있는 오픈 소스 소프트웨어 또는 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다. 리소스는 합당한 요청에 따라 저자가 사용할 수 있습니다.
1. 시료 전처리 및 조직 투명화(6 - 10일)
- 조직 투명화 절차를 시작하기 전에 조직 투명화 방법에 필요한 재료 표 의 모든 화학 용액을 준비하십시오.
알림: 특히 독성 화학 물질을 취급할 때는 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 흄 후드에서 모든 절차를 수행하십시오. - CO2가 있는 동물을 P1 및 8주와 같은 원하는 시점에CO2 챔버에 넣어 전체 심장 채취를 위해 안락사시키고 갓 격리된 심장을 0.2M KCl의 실온(RT)에 담가 이완기16에서 정지시킵니다.
- 4x 인....
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결과
LSM은 명시야 및 포인트 스캐닝 기술과 같은 다른 광학 이미징 방법과 달리 사진 손상의 위험이 최소화되고 공간 해상도가 높으며 광학 절편이 가능하기 때문에 심장 연구(31,32,33,34,35,36,37)를 촉진하는 것으로 입증되었습니다 6,8,38,39,40
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토론
이미징, 계산 및 조직 투명화 방법의 발전은 심장 구조와 기능을 광범위하게 조사할 수 있는 비할 데 없는 기회를 제공했습니다. 이는 온전한 설치류 심장 모델을 사용하여 심장 형태 형성 및 발병 기전에 대한 이해를 심화할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 유사한 접근법40,41,42,43을 사용한 제브라피쉬 심장의 생체 내 연구와 대조적으로, 고급 LSM 기술과 조직 투명화 방법의 통합으로 설치류 모델 9,44를 이미징할 때 공간 해상도와 침투 깊이 사이의 문제를 극복할 수 있습니다. 조직 투명화 기술은 지질 및 기타 광 산란 요소를 제거하여 심장을 광학적으로 투명하게 만들어 더.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
동물 모델을 아낌없이 공유해 주신 UT Southwestern Medical Center의 Eric Olson 박사 그룹에 감사를 표합니다. UT Dallas의 D-incubator 회원들이 제공한 모든 건설적인 의견에 감사드립니다. 이 연구는 NIH R00HL148493(Y.D.), R01HL162635(Y.D.) 및 UT Dallas STARS 프로그램(Y.D.)의 지원을 받았습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
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참고문헌
- Sadek, H., Olson, E. N. Toward the goal of human heart regeneration. Cell Stem Cell. 26, 7-16 (2020).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331, 1078-1080 (2011).
- Stelzer, E. H. K. K., et al.
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