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방법 논문

일상적인 임상용 [68Ga]Ga-FAPI-46의 자동 방사선 합성

2.4K 조회수

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DOI:

10.3791/66708

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2024년 5월 24일

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1Radiopharmaceutical Production and Development Centre (RAPID), Medical Technology and Physics Department, Sir Charles Gairdner Hospital, 2National Imaging Facility, Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis, University of Western Australia, 3Department of Nuclear Medicine, Sir Charles Gairdner Hospital, 4Medical School, University of Western Australia

이 논문에서

요약

이 작업은 섬유아세포 활성화 단백질의 PET 이미징을 위한 iPHASE MultiSyn 합성기에서 최대 1.7GBq의 [68Ga]Ga-FAPI-46을 자동으로 생산하는 방법을 설명합니다.

초록

[68Ga]Ga-FAPI-46은 양전자 방출 단층 촬영(PET)에 의한 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)의 이미징을 위한 유망한 새로운 추적자입니다. 표지된 FAP 억제제(FAPI)는 유방암, 폐암, 전립선암, 췌장암 및 대장암을 포함한 다양한 유형의 암에서 흡수를 입증했습니다. FAPI-PET는 또한 공복 및 휴식이 필요하지 않기 때문에 FDG-PET에 비해 실질적인 이점이 있습니다. [68가]Ga-FAPI-46은 이전에 제시된 [68Ga]Ga-FAPI-02 및 [68Ga]Ga-FAPI-04보다 향상된 약동학 특성, 개선된 종양 보유 및 더 높은 대비 이미지를 나타냅니다. [68Ga] Ga-FAPI-46에 대한 수동 합성 프로토콜이 처음에 설명되었지만 최근 몇 년 동안 다른 상용 신디사이저를 사용하는 자동화 된 방법이보고되었습니다.

이 작업에서는 임상 응용을 위해 iPHASE MultiSyn 신디사이저를 사용하여 [68Ga]Ga-FAPI-46의 자동 합성 개발에 대해 설명합니다. 초기에는 반응 시간 최적화와 최종 제품 정제를 위한 4가지 고체상 추출(SPE) 카트리지의 성능 비교를 조사했습니다. 그런 다음 이러한 최적화된 매개변수를 사용하여 0.6-1.7GBq의 [68Ga]Ga-FAPI-46 생산에 대한 개발 및 검증을 수행했습니다. 생성물은 25 분에 걸쳐 89.8 ± 4.8 % 감쇠 보정 수율 (n = 6)로 합성되었다. 최종 제품은 모든 권장 품질 관리 사양을 충족했으며 합성 후 최대 3시간까지 안정적이었습니다.

서론

섬유아세포 활성화 단백질(FAP)은 암 이미징 및 치료의 저명한 표적이 되었습니다1,2. FAP는 고형암의 미세환경의 대부분을 구성하는 기질 세포 유형인 암 관련 섬유아세포(CAF)의 특이적 마커입니다. CAF는 종양 성장, 침습 및 전이에서 중요한 역할을 합니다3. 유방암, 전립선암, 췌장암을 포함한 대부분의 고형 종양에서 발견됩니다.1. 진단용 또는 치료용 방사성 핵종으로 표지된 소분자 억제제로 FAP를 표적으로 삼음으로써, 이러한 암에 대한 선택적 비침습적 이미징 및 치료를 달성할 수 있습니다4,5,6. 68Ga 및 18F로 표지된 FAPI-02, FAPI-04, FAPI-46 및 FAPI-74와 같은 FAP 억제제(FAPI) 분자는 독일 하이델베르크 대학 병원 및 독일 암 연구 센터(DKFZ)의 팀이 개발한 퀴놀린 기반 FAP 표적 제제의 한 종류를 나타냅니다7,8,9,10,11, FAP 억제를 위한 매우 유망한 N-(4-퀴놀리노일)-글리실-(2-시아노피롤리딘) 골격을 식별하는 이전 연구를 바탕으로 12,13. 보다 최근에는 FAP-228614 및 3BP-394015와 같은 사이클 펩타이드 FAP 억제제가 이미징 및 치료를 위해 개발되었습니다.

[68Ga]Ga-FAPI-04는 유방암, 폐암, 전립선암, 췌장암, 대장암을 포함한 28가지 유형의 암에서 흡수를 입증했습니다16. FAPI-PET는 단식 및 ><휴식이 필요하지 않다는 실질적인 이점 외에도 위장암, 유방암, 난소암 및 간암, 폐암의 뇌 전이17 및 FDG 결과가 결정적이지 않은 경우와 같은 FDG-PET에 비해 진단 이점(또는 보완적인 역할)을 보여주었습니다18. 68의Ga-labeled FATI는 또한 섬유증 및 류마티스 관절염과 같은 면역 관련 염증성 질환에서 몇 가지 흥미로운 비종양학적 응용을 보여주었습니다19,20. 보다 최근에 제시된 [68Ga]Ga-FAPI-46은 변형된 도데칸 테트라아세트산(DOTA) 결합을 가지고 있으며, 향상된 약동학 특성과 개선된 종양 보유를 나타내어 [68Ga]Ga-FAPI-02 또는 [68Ga]Ga-FAPI-046,10을 사용하여 얻은 것보다 더 높은 대비 이미지를 제공합니다. 진단 및 치료를 위한 라벨링된 FAP 억제제의 사용은 국제 특허21에 따라 이루어지며, [68Ga]Ga-FAPI-46의 사용은 현재 라이선스가 허가되어 있습니다22.

사이클로트론으로 생산된 68Ga 또는 68Ga 발생기에서 용출된 68Ga를 사용하여 [68Ga]Ga-FAPI-46의 보고된 준비에는 수동 프로토콜과 자동 신디사이저의 사용이 포함됩니다. [68Ga]Ga-FAPI-02 및 [68Ga]Ga-FAPI-0423,24에 대해 이전에 보고된 방법을 기반으로 [68Ga]Ga-FAPI-46에 대한 수동 라벨링 프로토콜이 설명되었습니다. 수동 라벨링에는 특수 장비가 필요하지 않지만, 이 접근 방식은 작업자의 방사선량을 증가시키고 생산 내에서 잠재적인 변동성을 유발할 수 있습니다25; 따라서 일상적인 임상 응용 프로그램을 위한 생산을 자동화해야 할 필요성이 있습니다. 또한 자동 합성기를 사용하면 국제 GMP 규정을 더 잘 준수합니다. [68Ga]Ga-FAPI-46의 준비는 다른 발전기의 68Ga를 사용하여 다양한 상업용 신디사이저에서 개발되었습니다26,27,28,29,30,31,32,33 또는 cyclotron 생산 68Ga34. 이러한 자동화된 방법의 세부사항은 보충 표 S1(보충 파일 1)에 요약되어 있습니다. 다른 68Ga- 및 177Lu 표지 FAP 억제제에 대한 자동 합성 방법도 최근 몇 년 동안 발표되었습니다35,36.

Sir Charles Gairdner Hospital RAPID Centre에서는 iPHASE MultiSyn synthesizer (이하 MS synthesizer라고 함)에서 [68Ga] Ga-FAPI-46의 준비를 개발하고 검증했습니다. 이 합성기는 68Ga, 177Lu 및 89Zr 표지 방사성 의약품의 준비를 위해 호주의 다른 생산 시설뿐만 아니라 우리 실험실에서도 일상적으로 사용됩니다 37,38,39. MS 신시사이저는 엑셀 시퀀스 단계 목록을 내부 메모리에 다운로드하여 작동됩니다. 이 시퀀스 단계 목록은 사용자 친화적이며 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한 신디사이저는 단계 반복, 이전 단계로 돌아가기, 단계 건너뛰기, 필요한 경우 생산 일시 중지와 같은 중간 제작 개입을 허용합니다. 전략적인 위치에 배치된 방사선 검출기가 장착되어 있어 사용자가 생산 공정을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. MS 합성기는 모든 상용 68Ga발생기와 호환되며 단일 또는 이중 발생기 용리가 가능합니다. 이 작업에 설명된 절차는 하나 또는 두 개의 68G/68Ga발생기에서 68Ga를 사용하며 68Ga의 사전 정제와 최종 제품의 사후 정제를 모두 포함합니다. 최적의 반응 시간과 세 가지 다른 유형의 정제 후 고체상 추출(SPE) 카트리지와 공급업체의 카세트에 제공된 카트리지의 성능 비교도 이 연구의 일부로 평가되었습니다.

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프로토콜

주의: 본 프로토콜은 방사성 물질의 취급을 포함합니다. 이 작업을 수행하는 모든 인원은 밀봉되지 않은 방사성 동위원소 취급에 대해 적절한 교육을 받아야 하며, 소속 기관의 방사선 안전 관리자의 승인을 받아야 합니다. 자동 합성기는 전용 차폐 핫셀(hot cell) 내에 배치해야 합니다. 수동 실험은 차폐 핫셀 내에서 또는 방사선 차폐막 뒤에서 수행해야 합니다. 반응 시간 최적화 및 다양한 SPE 카트리지 테스트를 위한 예비 실험은 보충 섹션 1(보충 파일 1)에 설명되어 있습니다.

1. MS 합성기 준비

  1. 핫셀 압축 공기, 질소 가스 공급 장치, 환기 시스템, 조명, 그리고 노트북과 프로그래머블 로직 컨트롤러(PLC)의 전원을 켭니다. 모듈 폐액병의 액위(level)를 확인하십시오. 병의 ¾이 차면 빈 병으로 교체하십시오.
  2. 컴퓨터를 켜고 합성기 소프트웨어에 로그인합니다. 사용자 이름과 비밀번호를 입력하십시오.
  3. 합성기 소프트웨어에서 Download recipe를 누르고, [68Ga]Ga-FAPI-46 생산을 위한 Excel sequence file을 선택한 후 Open을 누릅니다. 시퀀스 다운로드가 성공적으로 완료되면 OK를 누릅니다.
  4. Start를 누르고, 팝업 창에 배치 번호, 시약 키트 로트 번호를 입력하고 비고 사항이 있으면 작성한 후 OK를 누릅니다.
    참고: 이 시점부터 사용자 인터페이스에는 단계별 작업 내용이 표시되거나 작업자의 개입을 요청하는 메시지가 나타납니다.
  5. 사용자 인터페이스의 단계별 메시지 안내에 따라 기존 하드웨어 키트를 제거합니다. 사용자 인터페이스에서 NEXT를 누릅니다.
  6. 사용자 인터페이스의 단계별 메시지 안내에 따라, 주사기 드라이버 슬롯에서 주사기의 엄지 받침대를 당겨 빼고 제너레이터 유입 라인에서 주사기를 돌려 분리하여 제너레이터 용출 주사기(HCl Syringe 1)를 합성기에서 제거합니다. 사용자 인터페이스에서 NEXT를 누릅니다.

2. 시약 준비

참고: [68Ga]Ga-FAPI-46의 자동 생산에 필요한 시약(표 1 참조)은 생산 직전에 클린룸 환경에서 준비되었습니다.

  1. 시약 키트 및 부속품 세트를 준비하십시오. 여기에는 금속 성분이 미량 포함된 물이 최소 5 mL 들어 있는 50 mL 원심분리 튜브, 0.1 M HCl 백, 아스코르브산 7 mg 바이알(바이알 A), 아스코르브산 나트륨 바이알(5 mg)(바이알 B), 라텍스, PVC 및 실리콘 오일이 포함되지 않은 5 mL 폴리프로필렌(PP)/폴리에틸렌(PE) 주사기 2개(이중 제너레이터 용출 사용 시 3개) 및 다음 항목이 포함됩니다. 50 µg FAPI-46 유리 바이알 (바이알 C; 참조 보충 그림 S1A,B-보충 파일 1).
  2. 50 mL 튜브 캡에 물 약 2 mL를 붓습니다. 5 mL 주사기(주사기 A로 표시)로 물 1 mL를 흡입합니다. 바늘로 캡을 씌웁니다. 피펫으로 400 µL 물을 취해 7 mg의 아스코르브산 바이알(바이알 A)에 넣고, 부드럽게 흔들어 용해시킵니다.
  3. 제공된 0.25 M 아세트산 나트륨 완충액 바이알(시약 키트 포함)을 열고 50 µg FAPI-46 유리 바이알. 완충액 0.9 mL를 피펫으로 취하여 다음의 용기에 첨가한다. 50 µg FAPI-46 유리 바이알(바이알 B); 부드럽게 혼합하십시오.
  4. Vial A와 Vial B의 내용물을 Syringe A로 흡입합니다. 가볍게 혼합합니다.
  5. 보조 도구 세트에 제공된 5 mL 주사기에 '주사기 B'라고 표시합니다. 주사기 B를 사용하여 0.1 M HCl 백에서 0.1 M HCl 5 mL를 취한 후, 제공된 디스펜싱 핀으로 캡을 씌웁니다.
    참고: 이중 제너레이터 용출을 이용한 생산에는 0.1 M HCl 5 mL 주사기 2개가 필요합니다.
  6. 부속품 세트에 제공된 3 mL 주사기에 '주사기 C'라고 표시하십시오. 산성화된 5 M 염화나트륨 용액 바이알(시약 키트에 포함됨)을 열고 1 mL를 피펫으로 취해 주사기 C에 옮긴 후, 제공된 디스펜싱 핀으로 캡을 씌우십시오.
  7. 0.9% 식염수 1 mL를 5 mL 주사기(주사기 D)로 취해 바이알 C에 넣고, 주사기 D는 비운 상태로 유지하십시오.

3. 합성 카세트 준비 및 카세트 설치

  1. 전용 멸균 [68Ga]Ga 카세트를 준비합니다.
  2. 다음 단계에 따라 카세트를 조립합니다:
    1. 카세트 봉투를 풀고 손상 여부를 확인한 후, 각 Luer 연결부를 조입니다. 카세트의 각 스톱콕(stopcock)을 회전시켜 정렬함으로써 고정되지 않았는지, 모듈에 적합하게 장착되는지 확인합니다. 모든 스파이크 캡을 제거합니다.
    2. 강양이온 교환 전정제 SPE 카트리지를 다음과 같이 컨디셔닝합니다:
      1. 매니폴드 3(M3) 밸브 7에 위치한 카트리지를 카세트에서 분리합니다.
      2. 개방된 전용 유리 폐액병을 벤치 위에 놓습니다.
      3. 3 M HCl 2 mL가 담긴 시린지(시약 키트에 포함됨)를 SPE 카트리지에 연결하고, SPE 카트리지를 유리 폐액병으로 천천히 한 방울씩 용출시킵니다. 시린지를 제거하고 공기 5 mL를 흡입한 후, SPE를 공기 5 mL로 플러싱합니다.
        주의: 단계 3.2.2.3에서는 강산(3 M 염산)을 취급합니다. 적절한 보호 장구(장갑, 보안경, 실험복)를 착용하십시오.
      4. 물 5 mL가 담긴 시린지(시약 키트에 포함됨)를 SPE에 연결하고, SPE를 유리 폐액병으로 천천히 한 방울씩 용출시킵니다. 시린지를 제거하고 공기 5 mL를 흡입한 후, SPE를 공기 5 mL로 플러싱합니다.
      5. SPE를 매니폴드의 M3 밸브 7 위치에 다시 장착합니다.
    3. 사용자 인터페이스에서 NEXT를 누릅니다.
    4. 시약 없이 사용자 인터페이스에 표시된 대로 새 카세트를 조립 및 설치하며(그림 1A,B; 이중 용출 사용 시 참조), 그림 1C에 설명된 연결 방식에 따릅니다.
      1. 10 mL 시린지(보조 도구 세트에 포함됨)를 M2 밸브 6에 연결합니다.
      2. 4개의 매니폴드를 설치하고 합성기의 마그네틱 락을 사용하여 카세트를 고정합니다.
      3. 리액터를 오븐에 넣습니다.
      4. 튜빙을 G1, W2, W1, R 및 G2 포트에 연결합니다.
      5. M1 밸브 3 우측 튜빙을 M3 밸브 7의 양이온 교환 카트리지에 연결합니다.
      6. M2 밸브 4에 SPE 후정제 카트리지를 설치합니다.
        참고: 합성을 위한 최종 설정 사진은 부록 그림 S1C(부록 파일 1)에 나와 있습니다.
  3. 사용자 인터페이스에서 NEXT를 눌러 아래 나열된 순서대로 다음 테스트를 시작합니다:
    1. M4로 연결되는 불활성 가스 연결부의 압력 테스트.
    2. M3와 M4 사이 연결부의 압력 테스트.
    3. 리액터의 압력 테스트.
    4. M3로 연결되는 폐액 연결부의 압력 테스트.
    5. M3와 M2 사이의 후정제 SPE 카트리지 압력 테스트.
    6. M2 밸브 6의 시린지 연결부 압력 테스트.
    7. M2로 연결되는 폐액 연결부의 압력 테스트.
    8. M1로 연결되는 불활성 가스 연결부의 압력 테스트.
    9. M1과 M3 사이의 전정제 SPE 카트리지 압력 테스트.
    10. 불활성 가스로 밸브 10, 11, 12의 스파이크 플러싱.
    11. 불활성 가스로 M3 및 M4 플러싱.
    12. 불활성 가스로 전정제 및 후정제 SPE 카트리지를 모두 플러싱.

4. 시약, 발생기 라인 및 최종 생성물 바이알 설치 (이중 발생기 용출을 사용하는 경우 그림 1A,C 및 그림 1B,C 참조)

  1. 시약 키트에서 에탄올(100%), 식염수 및 주사용수 바이알을 준비하고, 캡을 제거한 후 각 격막(septum)을 알코올 스왑으로 닦습니다.
  2. 합성 장비의 안내에 따라 M4 valve 10, M4 valve 11, M4 valve 12 위치에 바이알을 설치하고, 사용자 인터페이스에서 NEXT를 클릭합니다.
  3. Syringe A에서 바늘을 제거하고 플런저를 5 mL까지 당깁니다.
  4. 반응기 중간 포트(reactor middle port)로 연결된 라인을 분리하고, Syringe A의 내용물을 반응기 중간 포트를 통해 반응기 바이알로 옮깁니다.
  5. 반응기 중간 포트에 라인을 다시 연결하고, 사용자 인터페이스에서 NEXT를 클릭합니다.
  6. 카세트의 M1 valve 2 위치(이중 제너레이터 용출 시 M1 valve 1 포함)에 제너레이터 배출 라인을 설치하고, 사용자 인터페이스에서 NEXT를 클릭합니다.
  7. Syringe C에서 분주 바늘을 제거하여 M1 valve 3 위치에 설치하고, 사용자 인터페이스에서 NEXT를 클릭합니다.
  8. Syringe B에서 분주 바늘을 제거하고, Syringe B의 루어 락(luer lock)을 제너레이터 유입 라인 피팅에 연결한 후, 플런저의 엄지 받침대가 시린지 드라이버 슬롯에 들어갈 때까지 Syringe B를 밀어 넣습니다. 그 다음 사용자 인터페이스에서 NEXT를 클릭합니다.
  9. 2등급 생물안전작업대(Class II Biological safety cabinet) 또는 그에 준하는 시설에서 다음 단계에 따라 최종 생성물 바이알을 준비합니다.
    1. 라벨이 부착된 25 mL 멸균 바이알을 텅스텐 팟(또는 적절히 차폐된 팟)에 넣습니다.
    2. 바이알의 격막을 알코올 스왑으로 닦고, 팟에 뚜껑을 덮은 후 필터가 달린 벤트 바늘을 삽입합니다.
    3. 단백질 결합력이 낮은 멸균 0.22 µm 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 벤트 필터의 배출구를 멸균 20 G 피하 주사 바늘에 연결합니다. 필터에 제품 배치 번호를 기재합니다.
    4. 바늘을 벤트가 처리된 25 mL 최종 생성물 바이알에 삽입합니다.
    5. Vial C(Table 1)의 내용물을 빈 Syringe D(단계 2.7 참조)로 흡입하고 공기 4 mL를 추가합니다.
    6. Syringe D를 0.22 µm 벤트 필터의 유입구에 연결합니다. 시린지의 내용물을 0.22 µm 필터와 바늘을 통해 최종 생성물 바이알로 밀어 넣습니다.
    7. 필터를 공기 5 mL로 2회 플러싱합니다. 0.22 µm 벤트 필터에서 시린지를 제거합니다.
      참고: 필터 막의 파손을 방지하기 위해 플러싱은 천천히 수행해야 합니다.
  10. 최종 생성물 바이알이 담긴 팟을 핫셀(hot cell)로 옮기고, M2 valve 5 위치의 말단 튜브를 생성물 바이알 필터에 연결한 후 사용자 인터페이스에서 NEXT를 클릭합니다.

5. 방사성 표지 전 합성기의 예비 단계

  1. 합성기가 다음의 예비 단계를 수행할 때까지 기다리십시오: 에탄올 바이알 가압(M4, 밸브 10), 식염수 바이알 가압(M4, 밸브 11), 증류수 바이알 가압(M4, 밸브 12), 산성화된 염화나트륨 주사기 가압(M1, 밸브 3), 에탄올을 이용한 정제 후 SPE 카트리지 컨디셔닝, 증류수를 이용한 정제 후 SPE 컨디셔닝, 증류수 바이알 재가압(M4, 밸브 12).
  2. 누르십시오 다음 합성기가 요청할 때 사용자 인터페이스에서 생산을 시작하십시오. 용출 준비 완료 68Ga 발생기.

6. [68Ga]Ga-FAPI-46 생산을 위한 자동 방사성 표지법

참고: 자동 합성은 단계 5.2를 수행함으로써 시작됩니다. 그림 1D는 [68Ga]Ga-FAPI-46를 생산하기 위한 방사성 표지 반응을 설명합니다. 합성기 인터페이스의 대표적인 스크린샷과 전형적인 방사능 프로파일이 각각 그림 1A,B 및 그림 2에 나타나 있습니다. 이중 제너레이터 용출을 이용한 생산의 경우, 첫 번째 제너레이터의 용출 후 합성기가 사용자에게 비어 있는 Syringe B를 제거하고 두 번째 제너레이터의 용출을 위해 5 mL HCl 0.1 M이 들어 있는 다른 시린지를 시린지 드라이버에 장착하도록 안내합니다.

  1. 합성 종료(EOS) 시, 합성기에 표시되는 synthesis complete 메시지를 확인하십시오. 최종 생성물 바이알에서 멸균된 0.22 µm 통기성 필터와 필터링된 통기 바늘을 제거하고 핫셀에서 텅스텐 포트를 꺼냅니다.

표 1: [68Ga]Ga-FAPI-46 생산을 위한 시약 준비. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

매니폴드 설정 및 반응 과정이 포함된 방사성 표지 다이어그램; 크로마토그래피 단계 포함.
그림 1: 합성기 사용자 인터페이스의 모식도; [68Ga]Ga-FAPI-46의 자동 방사성 합성을 위한 카세트 및 시약 설정. (A) 단일 제너레이터 생산 설정. (B) 듀얼 제너레이터 생산 설정. (C) MS 방사성 합성기를 이용한 [68Ga]Ga-FAPI-46 자동 생산을 위한 시약 위치. (D) [68Ga]Ga-FAPI-46 방사성 표지 체계. 약어: FAPI = fibroblast activation protein inhibitor; Mn = 매니폴드 n; Wn = 폐액 배출구 n; Vn = 밸브 n; R = 반응기 진공; Gn = 가스 주입구 n. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

방사성 표지 과정 그래프: [68Ga]Ga3+ 용출, SPE 트래핑, 방사능 대 시간 분석.
그림 2: [68Ga]Ga-FAPI-46의 자동 합성에 대한 합성기의 전형적인 방사능 프로파일.약어: FAPI = 섬유아세포 활성화 단백질 억제제; SPE = 고체상 추출. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.

7. 품질 관리 및 배송을 위한 [68Ga]Ga-FAPI-46 분주

  1. 제품 바이알을 적절히 차폐된 분주 시스템으로 옮기고 바이알을 뒤집어 제품을 균질화합니다.
  2. 무균 조작법 및 방사선 방호 기술을 사용하여 제품 바이알에서 1 mL 샘플을 취한 뒤 다음과 같이 수행합니다:
    1. 출하 전 품질 관리 시험 및 잔류 용매 분석을 위해 단백질 결합력이 낮은 1.5 mL 튜브(튜브 1)에 150 µL를 분주합니다.
    2. 엔도톡신 시험을 위해 단백질 결합력이 낮은 1.5 mL 튜브(튜브 2)에 50 µL를 분주합니다.
    3. 무균 시험을 위해 10 mL 멸균 진공 유리 바이알에 300 µL를 분주합니다 (샘플이 허용 수준[10 반감기]으로 붕괴된 후 외부 수탁 기관으로 보냅니다).
    4. 보관용으로 10 mL 멸균 진공 유리 바이알에 500 µL를 분주합니다.
    5. 나머지 제품을 환자 투여용 바이알(~10 mL)에 분주합니다.

8. [68Ga]Ga-FAPI-46의 품질 관리

참고: 아래에 설명된 품질 관리 시험은 유럽 약전40에 기술된 절차에 따라 수행되었습니다.

  1. 육안 검사로 외관을 평가한다.
  2. 지시약 시험지로 pH를 평가한다.
  3. 전리함(ionization chamber)을 사용하여 50 µL 시료의 방사능을 3회 측정하여 방사성 핵종의 반감기를 결정한다.
  4. 다채널 분석기(MCA) 기반의 NaI(Tl) 감마 분광계를 사용하여 방사성 핵종의 정체성 및 방사성 핵종 순도를 평가한다.
  5. 분석용 radio-HPLC를 통해 [68Ga]Ga-FAPI-46 시료와 비방사성 [natGa]Ga-FAPI-46 표준품의 머무름 시간(retention time)이 유사한지 확인하여 방사화학적 정체성을 평가한다 (방사능 검출기와 UV 검출기 사이의 작은 지연 부피를 고려한다).
  6. 식 (1)을 이용한 분석용 radio-HPLC로 방사화학적 % 순도를 정량한다.
    방사화학적 순도 계산; 식; 방사선 검출 크로마토그램 내 방사성 피크의 AUC. 
  7. 식 (2)를 이용한 분석용 radio-TLC로 방사화학적 % 순도를 정량한다.
    방사화학적 순도 공식; 크로마토그램 방법; [68Ga]Ga-FAPI-46 피크의 AUC; 용매 전선. 
    참고: 단계 8.8, 8.9 및 8.10은 지역 규제 요건에 따라 출하 전 또는 후에 수행할 수 있다. 단계 8.11 및 8.12는 출하 후에 수행할 수 있다. 모든 출하 후 시험은 시료의 방사성 붕괴 후 가능한 한 빨리 수행해야 한다.
  8. 가스 크로마토그래피를 사용하여 제형의 잔류 용매(에탄올) 함량을 정량한다.
  9. 카트리지 기반 엔도톡신 시험 시스템(속도론적 발색 리무루스 아메보사이트 라이세이트 [LAL]법)을 사용하여 박테리아 엔도톡신 수치를 평가한다.
  10. 버블 테스트를 수행하여 0.22 µm 필터의 무결성을 평가한다.
  11. 감마 분광계 또는 감마 카운터를 사용하여 방사성 핵종 순도(germanium-68 breakthrough)를 평가한다. gallium-68이 불순물을 검출할 수 있는 수준으로 붕괴될 때까지 검사할 용액을 최소 48 h 동안 보관한다.
  12. 제품의 무균성을 평가한다.

9. 안정성 테스트

  1. 안정성 분석을 위해, 합성 종료(EOS) 직후 최종 제품 바이알에서 50 µL의 [68Ga]Ga-FAPI-46를 취하고, 이후 EOS 후 3시간까지 1시간 간격으로 다시 취합니다.
  2. 각 시점마다 radio-HPLC를 통해 방사화학적 % 순도를 정량합니다.
  3. 각 시점마다 radio-TLC를 통해 방사화학적 % 순도를 정량합니다.

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결과

95 °C에서 5분에서 20분 사이의 반응 시간에 따라 평가한 방사성 표지 효율은 표 2에 보고되어 있습니다. 정제 후 사용한 SPE 카트리지인 HLB 30 mg, Strata X 60 mg 및 Sep-Pak C18 Plus Short 360 mg은 매우 유사한 회수율(붕괴 보정[DC] 후 94.3 ± 0.5%)을 보였습니다(표 3). 본 실험 결과, HLB 225 mg의 회수율은 훨씬 낮았습니다(63.8 ± 3.5% DC).

표 2: 반응 시간 5, 10, 15, 20분에 대해 TLC로 측정한 조반응물의 방사화학적 전환율 요약 (n = 3).약어: TLC = 박층 크로마토그래피; Exp. = 실험.

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토론

이 연구는 임상 적용을 위한 MS 합성기에서 [68Ga]Ga-FAPI-46의 신뢰할 수 있고 고수율 생산을 설명합니다. 이 프로토콜의 예비 정밀 검사는 동일한 일련의 실험에서 [68Ga]Ga-FAPI-46의 합성을 위한 다양한 반응 시간과 최종 제품의 정제를 위한 4개의 서로 다른 SPE 카트리지를 테스트했습니다. (i) 작업자에 대한 방사선량을 줄이고 (ii) [68Ga]Ga-FAPI-46의 일상적인 생산이 개발될 조건을 재현하기 위해 이러한 예비 실험도 가능한 경우 MS 합성기를 사용하여 수행되었습니다. [68Ga]Ga-PSMA-11 및 [68 Ga]Ga-DOTA-TATE의 생산에 사용된 유사한 매개변수를 사용하여 [68Ga]Ga-FAPI-46 서열이 생성되었습니다. 시퀀스는 Excel 스프레드시트의 간단한 단계별 프로그래밍을 기반으로 하며 쉽게 편집할 수 있습니다. 키트와 시약은 [68G...

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공개 사항

저자는 공개할 이 작업과 관련하여 실제 또는 인지된 이해 상충을 초래할 수 있는 상업적 파트너십이나 자금 출처가 없습니다.

감사의 글

저자는 FAPI-46 화학 전구체 및 [natGa]Ga-FAPI-46 표준을 공급한 SOFIE Biosciences Inc., 재정 지원을 제공한 Charlies Foundation for Research, iPHASE Pty Ltd의 Stan Poniger, Sir Charles Gairdner Hospital의 의료 기술 및 물리학과의 방사성 의약품 생산 팀(RAPID)의 과학 및 기술 지원을 인정하고 감사를 표합니다. 저자들은 또한 NCRIS(National Collaborative Research Infrastructure Strategy) 기능을 통해 호주 연방 정부와 협력하여 서호주 주 정부의 인프라 자금으로 지원되는 WA National Imaging Facility Node의 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1 M 염산(HCl) 초순수ABX 고급 생화학 화합물(Radberg, 독일)HCl-103-G발생기 용출에 사용
세트산 암모늄Sigma Aldrich Pty Ltd(NSW, 호주)A1542-250GiTLC 이동상
C18 SepPak Plus 단락(360mg)WatersWAT020515정제 후 실리카 SPE
Chromolith Performance RP-18 엔드캡 100-4.6 모놀리식Merck Pty Ltd (Victoria (Australia)1021290001HPLC RP-18 엔드캡 컬럼, HPLC 품질 관리에 사용됨
용량 보정기CapintecCRC-15PET68Ga 활성을 보정하고 측정하는 데 사용됨
Dual scan-RAM LabLogic Limited (VA, USA)SR-1A분석하기 위한 Radio-TLC 스캐너
ABX 고급 생화학 화합물 (Radberg, Germany)3601.0000.050펩타이드 전구체
주입 용이성 멸균 진공 바이알 (10 mL)HUAYI 요오소토프SVV-10C멸균 및 보유 샘플에 사용
주입 용이성 멸균 진공 바이알 (25 mL)HUAYI 요오소토프SVV-25A제품
Ga68 펩타이드 방사성 라벨링에 사용되며, 발전기와 사전 정제iPHASE Technologies (Melbourne, Australia)MSR-120G-(RK-3296)시약 세트 
발전기 사전 정화를 사용한 Ga68 방사성 라벨링iPHASE Technologies (Melbourne, Australia)MSH-120하드웨어 카세트 + 보조 세트 
가스 크로마토그래피(GC) 시스템Agilent technologies(Vic, 호주)G2630A잔류 용매 측정에 사용
GS 표준 소스(Ba133)Global Medical Solutions Pty Ltd(호주)D-102-19감마 분광계
GS 표준 소스(Co60)Global Medical Solutions Pty Ltd(호주)1559-84감마 분광계
보정에 사용고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템Shimadzu Scientific Instruments (NSW, Australia)LC-20HPLC 장비
소수성 공기 환기 바늘Baldwin Medical (Victoria, australia)1088최종 제품 바이알과 함께 사용됩니다
  IGG100 에커트 & Ziegler 동위원소 제품  (독일 베를린)IGG100-65M-NT68Ge/68Ga 발생기
5 mL 주사기(Injekt luer lock solo syringe)B Braun (Melsungen, Germany)4606710V폴리프로필렌(PP)/폴리에틸렌(PE) 주사기, 라텍스, PVC 및 실리콘 오일이 없는 주사기 시약에 사용
iTLC-SG 종이Agilent technologies(Vic, Australia)SGI0001iTLC 분석에 사용
LabLogic 소프트웨어(LAURA)LabLogic Limited(VA, 미국)LAURA 소프트웨어 버전 6.1방사선 TLC 분석에 사용
L-Ascorbic acid Trace selectFluka Sigma05878-100G반응 혼합물에서 라디칼 제거제로 사용
Lichrosolv Acetonitrile (ACN)Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)1.00030.2500HPLC 유기 이동상을 만드는 데 사용
Lichrosolv WaterSigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)1.15333.2500HPLC 수성 이동상
메탄올(MeOH)Sigma Aldrich Pty Ltd(NSW, Australia)1060182500iTLC 이동상
Na+I- 검출기LabLogic Limited(VA, USA)1"NaI/PMTRadio-HPLC
Oasis HLB(30 mg)Waters(Milford, MA, USA)WAT094225Postpurification 공중합체 SPE
Oasis HLB Plus short (225 mg)Waters (Milford, MA, USA)186000132Postpurification copolymer SPE
pH stripThermo Fisher Scientific Australia Tty Ltd90424제품 pH PS
  검출기LabLogic Limited (VA, USA)PS 플라스틱/PMTRadiodetector 라디오-TLC
에 사용  Safe Lock tube (1.5 mL)Eppendorf0030 120.086품질 관리 시료에 사용
(+)-Sodium L-ascorbateMerck Pty Ltd (Victoria (Australia)11140-250G최종 제품의 안정제
염화나트륨 (NaCl) 용액 (식염수)PfizerPS1110.9%, 주사용 USP grade
Sterican 100 NeedlesB Braun (Melsungen, Germany)4667093사용 최종 제품
멸균 주사기 필터(0.22 &마이크로; m)Millipore Sigma (미국 매사추세츠주 벌링턴)SLGSV255FMillex-GV
Strata SCX (하드웨어 카세트 키트)iPHASE Technologies(호주 멜버른)의 Phenomenex 내부 하드웨어 키트MSH-120Prepurification silica SPE 내부 하드웨어 카세트
Strata X(하드웨어 카세트 키트)iPHASE Technologies(호주 멜버른)의 Phenomenex 내부 하드웨어 키트MSH-120정제 후 실리카 SPE 내부 하드웨어 카세트
트레이스 트레이스 트레이스 트레이스 트레이스 분석을 위한 물Honeywell Riedel-de-Haen95305-2.5L반응 혼합물 및 사전 정제 SPE 카트리지
트리플루오라세트산(TFA)Sigma Aldrich Pty Ltd (NSW, Australia)302031-10X1mLHPLC 수성 이동상
초미세 인슐린 주사기(0.5mL)BD326769품질 관리 샘플 디스펜싱에 사용
통풍 필터 Cathivex-GV 0.22 µ m, 저단백질 결합 Durapore PVDF 멤브레인Merk Millipore(아일랜드 코크)SLGV02505최종 제품을 필터링하는 데 사용됩니다.
아을 만드는 데 사용 iTLC 종이 FAPI-46 전구체 (GMP)를 최종 을 만드는 데 사용를 만드는 데 사용 에 사용

참고문헌

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