완전한 재관류를 위한 Longa Middle Cerebral Artery Occlusion 방법의 최적화

요약

이 프로토콜은 연구자가 수정된 Longa 외부 경동맥 방법을 사용하여 마우스에서 중뇌동맥 폐색 절차를 수행할 수 있는 단계별 가이드를 제공합니다. 이 기사에 제시된 수정 사항은 중뇌동맥 폐색의 정확도를 높이고 완전한 재관류를 보장하는 것을 목표로 합니다.

초록

중뇌동맥 폐색 모델은 허혈성 뇌졸중을 연구하기 위한 주요 동물 모델입니다. 30년 넘게 연구에 사용되어 왔음에도 불구하고 표준화는 여전히 불충분하다. 주로 쥐와 생쥐를 대상으로 실시되는 이 시술은 생쥐의 더 작고 연약한 특성으로 인해 어려움을 겪습니다. Koizumi 총경동맥법과 달리 Longa 외부 경동맥은 허혈 후 완전한 재관류를 보장하는 유일한 내강 내 필라멘트 스트로크 모델입니다. 이 측면은 재관류 현상을 조사하는 연구에서 매우 중요합니다. 이 기사에서 설명한 외과적 수정은 허혈기 전체와 재관류 시작 후에도 총경동맥에서 지속적인 혈류를 보장합니다. 이러한 수정의 목표는 허혈 기간 동안 중뇌 동맥에 근접한 가지에서 관류를 중단하지 않고 유지하여 중뇌동맥을 선택적으로 폐색하는 것입니다. 또한, 재관류의 시작은 갑작스럽고 정밀하게 제어할 수 있으므로 인간 의학에서 혈관 내 혈전제거술을 보다 정확하게 모델링할 수 있습니다. 이 포괄적인 비디오 기사를 제공하는 우리의 목표는 새로운 외과 의사의 교육을 용이하게 하고 과학계 내에서 수술 절차의 표준화를 촉진하는 것입니다.

서론

뇌졸중은 사망 원인 2위, 사망 및 장애를 합친 3차 주요 사망 원인¹. 뇌졸중은 그 원인에 따라 허혈성 또는 출혈성일 수 있으며, 허혈성 뇌졸중은 임상에서 훨씬 더 흔합니다. 허혈성 뇌졸중은 뇌 조직에 혈액을 공급하는 동맥이 막혀 허혈, 세포 사멸 및 염증을 유발합니다. 혈전용해술과 기계적 혈전제거술과 같은 재관류 요법이 등장한 이래로 뇌졸중 치료에 큰 진전이 이루어졌습니다. 그러나 모든 재관류 요법은 흔히 재관류 손상(reperfusion injury)이라고 하는 것을 일으켜 환자의 상태를 악화시킬 위험이 있다². 재관류 손상의 정확한 메커니즘은 아직 불분명하며, 잠재적인 원인과 예방 조치를 식별하는 것은 전임상 연구에 달려 있습니다. 이를 위해 허혈성 뇌졸중 후 재관류 손상에 대한 적절한 동물 모델을 개발하는 것이 중요합니다.

중뇌동맥폐색(MCAO)은 허혈성 뇌졸중을 연구하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 동물 모델입니다. 그것은 주로 설치류에서 수행되며 지금까지 과학 문헌에 설명 된 많은 다른 변이체를 가지고 있습니다 ^3,4. 총경동맥(CCA) 및 외경동맥(ECA) 변형으로 알려진 두 가지 주요 유형인 Koizumi와 Longa는 필라멘트 삽입을 위한 동맥 절제술 부위에 따라 기술적으로 다릅니다 ^5,6. 최근 논문에서 혈관 관류의 생체 내 모니터링을 통해 Longa 방법만이 진정으로 뇌 허혈/재관류 모델로 간주될 수 있음을 보여주었습니다⁷. 이 시술은 필라멘트를 ECA에 삽입하고, ICA를 통해 진행하고, 뇌 조직 허혈을 유발하기 위해 중뇌동맥(MCA)의 분기점에 고정하는 것을 포함합니다. 미리 결정된 허혈 기간이 지난 후 필라멘트를 빼면 재관류가 허용되어 일시적인 뇌 허혈을 시뮬레이션합니다. 뇌졸중 발병 후 연구에 사용되는 주요 결과 변수는 대부분 경색 병변의 부피이며, 이는 생체 외 조직학 또는 생체 내 뇌 스캔을 사용하여 측정할 수 있습니다. MCAO 모델의 과제는 변이체 간(inter-variant), 작업자 간(inter-operator), 피험자 간(inter-subject) 차이로 인한 낮은 재현성이며, 후자는 전임상 뇌졸중 연구에서 상당한 제한을 제기한다⁴.

더욱이, 설치류에서 MCAO를 따르는 경색 영역은 설치류의 뇌 크기에 비해 방대합니다. 또한, 뇌의 해마 후방 영역은 MCA가 아닌 후뇌동맥(PCA)의 혈류에 주로 의존함에도 불구하고 종종 경색 용적에 모집된다⁸. 문헌에 기술된 Koizumi 및 Longa 방법에서와 같이, CCA는 마우스에서 Willis 서클의 불완전한 개통성으로 인해 허혈 기간 동안 결찰 상태로 유지되어 의도한 것보다 훨씬 더 넓은 영역에서 허혈 유도를 유도합니다 ^5,6,9. 허혈 기간 후에 CCA를 다시 열거나 수리하는 방법에서도, 통상적인 30-60분의 허혈은 비-MCA 영역에서 돌이킬 수 없는 조직 손상을 초래한다(¹⁰). 또한, 예상과 달리 이전 연구에서는 필라멘트의 실리콘 코팅 길이가 병변 크기¹¹에 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었습니다. 그러나 필라멘트의 실리콘 코팅 길이 선택은 교합 기간 동안 결찰된 CCA가 있는 모델에서만 다루어졌습니다.

이 방법의 목표는 마우스에서 Longa MCAO 방법을 수정하여 허혈 기간 동안 CCA에서 중단 없는 혈류를 가능하게 하여 MCAO의 선택성을 높이고 시술 후 경색 부위의 완전한 재관류를 보장하는 것이었습니다. 이러한 수정은 사망률을 낮추고 피험자 간 분산을 줄임으로써 마우스의 허혈 재관류 손상을 연구하는 종단 연구에 큰 도움이 될 것입니다.

프로토콜

모든 동물 취급 및 절차는 자그레브 대학교 의과대학의 윤리 허가 위원회와 크로아티아 공화국 농업부의 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호를 위한 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 실험 절차는 크로아티아 동물보호법(NN 102/17, 32/19), 동물보호법 개정안(NN 37/13) 및 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 지침(NN 55/13)에 따라 수행되었으며, 이는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 유럽 지침(지침 2010/63/EU)에 부합합니다.

1. 동물 및 수술 부위의 준비

1. 동물을 녹아웃 상자에 넣고 산소/질소 혼합물(1:2 비율)에 5% 부피의 이소플루란을 사용하여 마취를 유도합니다.
2. 동물의 의식 상태와 호흡 빈도를 육안으로 검사한 후 실험실 저울로 가져와 무게를 잰다.
3. 적절한 마취 깊이를 보장하기 위해 하지의 디지털 간 피부를 꼬집어 반사를 확인합니다.
4. 동물을 가열된 수술대에 놓고 코를 마취 마스크 안으로 가져옵니다. 초기 수술대 온도를 36°C로 설정하고 동물의 체온을 37°C로 유지하도록 조정합니다(이후 단계에서 도입된 직장 프로브를 통해 측정). 모든 추가 단계에서 이소플루란의 부피 분율을 조정하여 동물의 호흡수를 100회/분으로 유지합니다.
   알림: 동물과 직접 접촉하는 모든 표면과 재료는 절차 전에 철저히 소독해야 합니다.
5. 동물의 눈에 눈 연고를 바르면 탈수와 이소플루란 가스로부터 동물을 보호할 수 있습니다.
6. 동물을 뒤로 돌리고 그 아래에 수술용 테이프로 만든 작은 베개를 놓아 목을 뻗습니다.
7. 수술용 테이프를 사용하여 동물의 팔다리를 제자리에 고정합니다. 실수로 어깨 관절 탈구를 일으키지 않도록 앞다리를 너무 많이 펴지 않도록 주의하십시오.
8. 하얀 석유 젤리를 사용하여 직장 프로브에 윤활유를 바르고 직장에 삽입하여 지속적인 체온 측정을 합니다. 수술용 테이프를 사용하여 꼬리와 함께 프로브를 제자리에 고정합니다.
9. 수술 전에 식염수와 부프레노르핀(0.5mg/kg)을 복강내 주사하여 시술 중 동물에게 수분을 충분히 공급하고 진통을 유지합니다.
10. 무선 동물 이발기를 사용하여 동물의 목 부분을 면도하십시오. 수술용 테이프를 사용하여 면도한 털을 모두 모으십시오. 또한 면도기로 해당 부위를 면도하여 털이 완전히 없도록 하십시오.
11. 측정된 동물의 체중 및/또는 나이에 따라 MCAO 필라멘트를 선택하십시오. 용기에서 꺼내 눈에 잘 띄는 곳에 페트리 접시에 넣으십시오. 필라멘트의 실리콘 부분에 식염수를 한 방울 떨어뜨려 깨끗하고 먼지가 없는 상태로 유지하십시오.
    알림: 필라멘트의 실리콘 코팅 두께는 12-16주 된 마우스의 경우 제조업체의 공식 권장 사항에 따라 선택해야 합니다. 또한 실리콘 코팅의 길이는 폐색할 관개 영역의 크기에 따라 사전에 신중하게 계획해야 합니다( 토론 참조).
12. 수술대 위에 깨끗한 수술용 드레이프를 놓습니다.
13. 동물의 면도한 피부에 베타딘 한 방울을 바릅니다. 면봉을 사용하여 소독제를 안쪽에서 바깥쪽으로 원을 그리며 피부에 문지릅니다. 그런 다음 에탄올에 적신 면봉으로 동일한 작업을 수행합니다. 각 반복에 대해 새 멸균 면봉으로 이 단계를 3번 반복합니다.
14. 국소 상처 진통제를 위해 향후 절개 부위의 소독 부위에 리도카인 젤을 살짝 바릅니다.

2. 허혈유도 수술

1. 메스를 사용하여 소독된 피부를 처음 절개합니다. 수술 상처가 더 쉽게 치유될 수 있도록 피부 절개 스트로크 횟수를 최소한으로 유지하십시오.
   알림: 모든 기기는 이전에 멸균 처리되어야 합니다. 독자는 멸균 또는 수술용 장갑 사용에 대한 기관 지침을 참조해야 합니다.
2. 7형 및 5형 겸자를 사용하여 표재성 근막을 떼어내고 기저 조직에서 타액선을 분리합니다.
   알림: 항상 집게를 닫은 상태에서 전진하고 조직을 밀어내기 위해 멀어지면서 확장하십시오. 이렇게 하면 조직 외상을 최소화하면서 해부학적 공간을 횡단할 수 있습니다.
3. 침샘이 후속 단계를 방해하지 않도록 하면서 와이어 견인기를 초기 위치에 놓습니다.
4. Type 7 겸자를 사용하여 깊은 목 근막을 제거하고 경동맥 영역에서 흉쇄유돌근을 분리하여 견인기의 위치를 변경합니다.
5. 경동맥 영역에 접근할 수 있도록 흉쇄유돌근 아래에 도달하도록 견인기의 위치를 변경합니다.
6. 경동맥 부위에 명확하고 시각적으로 쉽게 접근할 수 있도록 오모설근을 절제합니다.
7. 경동맥 근막에 함께 붙어있는 경동맥 정맥과 미주 신경에서 경동맥과 그 가지를 풀어줍니다.
   알림: 이 근막은 미주 신경을 손상시키거나 심각한 출혈을 일으키지 않도록 조심스럽게 제거해야 합니다.
   1. 경동맥 트라이어드의 측면에 있는 경동맥 근막을 꼬집고 부드럽게 옆으로 당겨 동맥, 신경, 정맥 및 주변의 모든 혈관 가지를 시각적으로 식별합니다.
   2. Type 5 겸자를 사용하여 근막을 측면으로 당기면서 CCA를 인접 신경 및 정맥에서 분기점과 CCA를 가로지르는 상갑선 정맥까지 분리합니다.
   3. 곡선형 Type 7 겸자를 사용하여 CCA의 하부를 기저 조직과 근막에서 완전히 분리하고 향후 단계에서 클램핑할 준비가 되었는지 확인합니다.
   4. CCA 분지 지점 위의 영역에서 두개골로 진행하면서 두 개의 겸자를 사용하여 경동맥 근막을 찢습니다.
   5. 마찬가지로 경동맥 근막의 느슨한 끝을 내측 및 측면으로 당겨 ECA와 내부 경동맥(ICA)을 근막과 주변 조직에서 각각 정확하게 분리합니다.
   6. 구부러진 Type 7 겸자를 사용하여 ECA 및 ICA를 기본 조직에서 자유롭게 설정합니다.
8. 두 개의 각각의 가지로 조심스럽게 준비된 CCA를 사용하여 곡선형 7형 집게를 사용하여 ECA를 올리고 N0형 자동 폐쇄 집게로 고정합니다.
9. 수술대에서 N0형 자동 폐쇄 겸자를 조심스럽게 내립니다.
   알림: ECA의 클램핑 포인트를 재배치하려면 그립을 약간 풀고 ECA 브랜치 포인트를 옆으로 밀어야 하는 경우가 있습니다. 이 시점에서 ECA 클램핑과 브랜치 포인트 사이에 1mm 이상의 ECA가 남아 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
10. ECA를 고정하고 N0 핀셋으로 단단히 고정한 상태에서 ECA 뒤에 두 개의 꼰 실크 실을 삽입합니다.
    알림: 두개골 나사산은 결찰 매듭을 만들며 클램핑 위치에서 두개골 방향으로 배치해야 합니다.
11. 두개골 실은 영구적이므로 완전히 묶고 여분의 실은 가위로 잘라냅니다.
12. 꼬리 실을 느슨한 고정 매듭으로 묶습니다.
    알림: MCAO 필라멘트가 통과할 수 있도록 ECA 분기 지점에 가깝게 놓고 느슨하게 유지해야 합니다.
13. 혈관 마이크로클립을 사용하여 clamp 동맥 절제술 후 출혈을 방지하기 위해 CCA와 ICA를 닫습니다.
    알림: CCA는 맥동하는 고처리량 동맥이므로 CCA에 적용된 마이크로클립이 충분히 강한 그립을 갖도록 하는 것이 중요하며, 그렇게 하지 않으면 이후 단계에서 동물의 과다 출혈과 사망을 초래할 수 있습니다.
14. 마이크로 스프링 가위를 사용하여 ECA 클램핑 부위 바로 아래에 작은 동맥 절개술을 만듭니다.
    알림: 동맥 절개술은 필라멘트의 실리콘 부분이 들어갈 수 있을 만큼 충분히 커야 하지만 N0형 집게에 의해 유지되는 장력을 손상시키지 않기 위해 ECA 둘레의 절반보다 크지 않아야 합니다.
15. ECA와 일치하는 각도로 필라멘트를 CCA에 근접한 방향으로 동맥 절개 부위에 삽입하고 ECA의 분기 부위에 있는 느슨한 고정 매듭을 통과하여 필라멘트로 CCA의 루멘에 붙습니다.
16. 필라멘트의 실리콘 부분 주위의 고정 매듭을 조입니다.
    알림: 필라멘트가 마지막 조작의 중간에 ECA에서 미끄러지는 경향이 있고 그 시점에서 다시 넣는 것은 매우 어렵기 때문에 이 시점에서 세심한 주의가 필요합니다.
17. ICA 마이크로 클립을 조심스럽게 열고 제거합니다.
18. 필라멘트를 ECA에 부분적으로 삽입하고 고정한 상태에서 완전한 동맥 절개술을 만들어 MCAO 필라멘트가 내부에 있는 ECA 그루터기를 느슨하게 합니다. 이 시점에서 N0 유형 자동 폐쇄 집게를 풀고 제거하십시오.
19. 5형 핀셋 한 세트로 ECA 그루터기를 단단히 잡고 약간 올립니다. 다른 집게로 부분적으로 삽입된 필라멘트를 잡고 ECA 그루터기를 내리고 부드럽게 당겨 필라멘트의 안쪽 끝이 ICA 쪽으로 향하도록 합니다. 필라멘트의 실리콘 부분을 끼지 마십시오.
20. 집게가 필라멘트를 잡고 ICA를 통해 필라멘트를 Wills 원 쪽으로 천천히 전진시킵니다.
    참고: ICA의 첫 번째 분기점은 작업자가 원하는 MCA 분기점을 놓칠 수 있는 유일한 분기점이기도 합니다. 따라서 필라멘트를 MCA 분기점으로 안내하기 위해 약간의 측면 전진 각도가 필요합니다. 약간의 측면 전진 각도로 필라멘트는 익상편 동맥(PPA)에서 멀어지고 전진 끝이 Willis 원에 들어갈 가능성이 더 높아집니다(그림 1).

그림 1: 익상편구개 동맥 분기점을 지나는 중뇌동맥 폐색 필라멘트 전진의 그림. 적절한 필라멘트 전진(왼쪽)은 MCAO 필라멘트가 ICA의 측벽에 대해 뒤로 물러나고 PPA 분기 지점에서 멀어지도록 구부러지는 방식으로 방향을 지정함으로써 달성됩니다. 그렇게 하지 않으면(오른쪽) 필라멘트가 PPA에 들어가 뇌졸중을 일으키지 않을 수 있습니다. 후자의 경우 필라멘트는 필요한 만큼 전진할 수 없으며 외과의는 필라멘트의 끝이 ICA 분기점에서 보일 때까지 필라멘트를 빼내고 필라멘트를 다시 전진시키기 시작해야 합니다. 녹색의 동맥은 후방 소통 동맥(PcomA)을 나타내며, 대부분 마우스에서 특허가 없습니다. BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

21. 저항의 급격한 증가가 느껴질 때까지 Willis 원을 통해 MCAO 필라멘트를 천천히 전진시킵니다.
    알림: 이 시점에서 필라멘트의 남은 길이를 관찰하는 것이 중요합니다. 필라멘트는 성인 마우스의 ICA 분기 지점에서 최소 7mm 이상 쉽게 진행되어야 합니다.
22. 허혈 중에 필라멘트가 변위되지 않도록 고정 매듭을 조입니다.
23. CCA 클립을 제거하고 시간을 기록해 둡니다.
    참고: 이것은 허혈 발병의 시작을 나타냅니다.
24. MCAO 필라멘트의 느슨한 끝을 경동맥 삼각형과 동측 흉쇄유돌근 사이의 홈에 밀어 넣어 수술 상처 밖으로 튀어나오지 않도록 합니다.
25. 와이어 견인기를 제거하고 수술 상처의 가장자리를 서로 더 가깝게 가져옵니다. 조직이 해부학적 위치로 돌아갈 수 있도록 수술 부위를 몇 초 동안 가라앉히십시오.
26. 허혈 기간 후 상처가 더 빨리 다시 열릴 수 있도록 테이프 상처 봉합을 사용하여 수술 상처를 봉합합니다.
    참고: 연구자가 허혈 기간 동안 동물을 깨우고 싶다면 상처가 적시에 다시 열리는 것을 방지하기 위해 상처를 봉합하는 것이 좋습니다.

3. 허혈 기간

1. MRI 또는 다른 정량적 관류 측정 방법을 사용하여 수술의 성공을 확인합니다.
   참고: MRI 스캔을 수행하는 경우 관류 가중 영상(PWI)은 넓은 MCA 영역에서 심각한 허혈을 보여야 하며 확산 가중 영상(DWI)은 세포 부종으로 인해 겉보기 확산 계수(ADC)가 감소한 부위를 설명해야 합니다.
2. 허혈 기간이 끝날 때까지 동물을 깨끗한 케이지에 넣으십시오.

4. 필라멘트 철수 수술

1. 할당된 허혈 시간이 끝나기 약 5분 전에 동물을 위치에 놓고 다시 수술대에 고정합니다.
2. 테이프 상처 봉합을 제거하고 와이어 리트랙터로 수술 상처를 다시 엽니다.
3. MCAO 필라멘트의 느슨한 끝 부분을 주변 조직과 고정 매듭 나사의 끝에서 분리합니다.
4. N0형 겸자를 사용하여 ECA 그루터기의 가장자리를 복부로 꼬집고 당겨 장력을 가합니다. 첫 번째 수술 절차와 유사하게 끼는 집게를 조심스럽게 내립니다.
   알림: 작업자는 고정 매듭을 끼면 매듭을 풀 수 없게 되므로 고정 매듭을 끼지 않아야 합니다.
5. Clamp 미세혈관 클립으로 CCA를 다시 클릭합니다.
6. 유형 5 집게를 사용하여 필라멘트 인출을 가능하게 하는 고정 매듭을 풉니다.
   알림: 매듭을 풀기 시작하는 가장 좋은 방법은 개별 부분으로 분리될 때까지 계속 꼬집은 다음 실 끝을 매듭 쪽으로 밀어내는 것입니다.
7. 실리콘 부분이 ECA 그루터기에서 튀어나오기 시작할 때까지 MCAO 필라멘트를 천천히 빼냅니다. 필라멘트가 완전히 빠질 수 있도록 고정 매듭을 약간 조입니다.
8. 필라멘트의 실리콘 끝에 가까워지면 고정 매듭을 조여 MCAO 필라멘트를 밀어내고 ECA 그루터기를 한 번에 닫습니다. 필라멘트가 빠진 후 매듭을 완전히 조입니다.
9. CCA 클립과 함께 끼는 집게를 열고 제거합니다.
   알림: 이것은 허혈 기간의 끝과 재관류 과정의 시작을 표시합니다.
10. 와이어 견인기를 제거하고 수술 상처의 가장자리를 다시 모읍니다.
11. 수술 상처 주변부에서 시작하여 봉합하여 기저 조직이 보이지 않도록 상처를 완전히 봉합합니다.
    참고: 필요한 봉합사 수는 수술 상처의 크기에 따라 다릅니다.
12. 소독용 알코올 물티슈를 사용하여 수술 부위를 청소하고 소독합니다.

5. 수술 후 관리

1. 동물을 깨끗한 우리에 넣고 마취에서 자발적으로 깨어나도록 합니다.
2. 더 쉽게 접근할 수 있도록 펠릿 식품을 케이지 바닥에 놓습니다. 식수를 사용하여 식품 펠릿을 부드럽게하십시오. 작은 페트리 접시에 식수를 채우고 케이지 바닥으로 가져옵니다.
3. 다음 48시간 동안 복강내로 24시간마다 0.25mL 식염수와 부프레노르핀(0.5mg/kg)을 주사합니다.

결과

수술 중 또는 수술 후 MRI 스캔, 특히 관류 가중 영상(PWI) 및/또는 확산 가중 영상(DWI) 스캔(그림 2)은 성공적인 시술의 결정적인 증거를 제공할 수 있습니다. 수술 중 PWI는 동측 MCA 영역에서 심각한 허혈을 보여 필라멘트 배치가 완전한 폐색을 초래했음을 확인합니다. 성공적인 시술의 수술 후 PWI는 병변 중심부에서 과관류를 표시하고 MCA 영역 경계에서 어느 정도의 재관류를 표시합니다. 수술 중 DWI 병변은 수술 중 PWI에서 관찰된 허혈 영역에 해당합니다. 수술 후 DWI 병변은 허혈성 병변의 중심부로 수축을 나타내며 병변의 겉보기 확산 계수가 현저히 감소하여 수술 중 DWI 병변 및 주변의 재관류된 뇌 조직보다 더 어둡게 만듭니다. 표준 T2 해부학적 스캔은 수술 중 및 수술 후 모두에서 필라멘트로 인한 출혈이 발생하지 않는 한 일반적으로 주목할 만한 것을 보여주지 않습니다

(그림 3). 이러한 경우 PWI 및 DWI 스캔은 불완전하거나 허혈이 없는 것으로 나타납니다.

재관류 과정은 다음 48시간 동안 이어지며 시술 후 2일째에 수행된 MRI 스캔에서 발생한 것으로 확인되었습니다(그림 2, 2일째 CBF). PWI 스캔은 병변 부위에서 완전한 재관류와 병변 코어에서 약간의 과관류를 보여줍니다. DWI 스캔은 뇌 부종 형성으로 인해 낮아진 겉보기 확산 계수의 여러 영역을 보여줍니다. T2 해부학적 스캔은 해마와 같은 비 MCA 영역의 침범 없이 MCA 영역을 둘러싸고 있는 부종의 고강도 영역을 나타냅니다.

깨어났을 때, 동물은 급성 뇌졸중의 명백한 징후를 보인다. 일반적인 행동 증상으로는 병변 쪽의 근육 긴장도가 증가하여 동물이 그 방향으로 몸통을 구부리게 되는 것이 포함됩니다. 동측 방향으로 빙글빙글 돌고 회전하는 것도 급성 뇌졸중의 명백한 징후입니다. 보행 운동 실조증은 종종 허혈성 병변 부피에 해마가 관여한다는 것을 시사합니다. 그러나 이 증상은 이소플루란 마취 부작용으로 인해 초급성기에는 특이성이 부족할 수 있습니다. 그 후 며칠 동안 동물은 앞다리 굴곡이 동측으로 발생하고 수염 반사의 부재를 동반하여 자세 상태가 악화되어야 합니다. 사망률은 뇌부종으로 인해 시술 후 약 3일 후에 최고조에 달합니다. 만성 단계는 뇌 부종이 해소되기 시작한 후에 시작됩니다. 이 기간 동안 동물은 소변 저류를 나타낼 수 있습니다. 이러한 이유로 동물의 방광 뻣뻣함과 요도 출구의 단단한 뚜껑을 검사하는 것이 중요합니다. 대부분의 경우 이 문제는 배뇨를 용이하게 하기 위해 방광을 부드럽게 마사지하여 해결할 수 있습니다. 체중 회복 징후는 일반적으로 뇌졸중 발병 후 초기 7일 이내에 나타납니다.

그림 2: MRI 스캔으로 완전 재관류가 확인된 성공적인 MCAO의 대표적인 예. CBF, ADC 및 T2w는 각각 대뇌 혈류 맵, 겉보기 확산 계수 맵 및 T2 가중 해부학적 스캔을 나타냅니다. IntraOP, postop 및 D02는 각각 허혈 발병 후, 재관류 발병 후, MCAO 후 2일째에 3개의 다른 이미징 시점을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: MCAO 절차 중 필라멘트 유발 출혈의 대표적인 MRI 스캔. CBF, ADC 및 T2w는 각각 대뇌 혈류 맵, 겉보기 확산 계수 맵 및 T2 가중 해부학적 스캔을 나타냅니다. IntraOP, postOP 및 D02는 각각 허혈 발병 후, 재관류 발병 후, MCAO 후 2일째의 3가지 다른 이미징 시점을 의미합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 중뇌동맥 분지에서의 적절한 필라멘트 배치에 대한 그림. 대부분의 경우 필라멘트의 실리콘 부분(흰색)은 MCA 분기점보다 약 2mm 더 먼 전방 대뇌 동맥(ACA)의 근위 부분에 박힙니다. 일반적으로 ACA 뇌 영역은 ACA가 반대쪽 뇌 영역과 결합하여 단일 azygos ACA로 결합하기 때문에 마우스에서 영향을 받지 않습니다. 영향을 받는 동맥은 회색으로 표시됩니다. 왼쪽의 CCA는 허혈 기간 동안 특허를 남겨두어 필라멘트의 실리콘 부분으로 막힌 MCA까지 모든 ICA 가지에 혈액을 공급합니다. 오른쪽에는 CCA ligation이 허혈 기간 동안 유지되는 것을 제외하고는 필라멘트가 동일하게 배치되어 있습니다. 대부분의 경우 PcomA(녹색)가 특허를 받지 않기 때문에 CCA 결찰이 유지되면 스트로크는 MCA, AchA, VTA, HTA 및 PCA를 통해 동측 반구의 대부분을 비선택적으로 둘러쌉니다. 이러한 경우 PPA 차단으로 인해 눈의 급성 경색(백혈구 및 이뇨증)의 징후도 관찰될 수 있습니다. BioRender.com 로 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

MCAO는 작업자에게 매우 까다로운 절차이며 동물에게는 쇠약해지는 절차입니다. 이러한 이유로, 연구자들은 뇌졸중의 중증도를 최소화하고, 절차적 실패를 줄이며, 시술 후 동물의 복지를 개선하는 표준 수술 절차를 갖추는 것이 가장 중요합니다. 이 MCAO 프로토콜은 마우스에서 이 절차를 수행할 때 고려해야 할 몇 가지 주요 측면을 강조합니다.

MCAO 필라멘트의 선택은 유도된 뇌졸중 병변의 크기와 위치에 영향을 미치므로 이 절차에서 중요한 단계입니다¹¹. Doccol이 개척한 것과 같은 실리콘 코팅 필라멘트는 필라멘트로 인한 출혈의 발생률을 낮추는 데 큰 도약을 이루었습니다¹². 그러나 실리콘 코팅 필라멘트는 크기와 길이가 매우 다양하기 때문에 새로운 연구자가 실험 동물의 MCAO에 적합한 필라멘트를 선택하는 데 어려움이 있습니다. 필라멘트 제조업체는 일반적으로 주어진 동물 무게에 적합한 필라멘트 직경을 선택하기 위한 지침을 제공하지만, 실리콘 코팅의 길이는 작업자의 개인 취향으로 간주되며 작업자의 기술에 기반해서만 선택해야 합니다. 이 연구에서 우리는 유도 뇌졸중 병변이 MCA 관개 영역만 포함하도록 실리콘 길이를 최소화하여 재현성을 향상시키는 것을 옹호합니다. 그림 4 는 첫 번째 두개내 ICA 분지인 후대뇌동맥(PCA)이 해마의 일부를 포함하여 뇌의 후방 영역에 혈액을 공급한다는 것을 보여줍니다. 마우스에 대한 최근의 micro-CT 연구는 MCA¹³의 분기점 이전에 ICA에서 발생하는 3개의 더 작은 가지를 추가로 확인했다. 섬세하고 가변적인 시상하부 동맥(HTA), 복측피개동맥(ventral tegmental artery, VTA), 전맥락막동맥(anterior choroid artery, AChA)은 분지 순서에 따라 변이체 내 및 피험자 내 변동성에 유의하게 기여한다⁸. 또한, micro-CT 연구에 따르면 마우스에서 MCA 및 PCA 분기점까지의 평균 거리는 약 1.7mm로 측정되며, 이는 대부분의 제조된 필라멘트의 실리콘 코팅 길이보다 상당히 짧습니다¹⁴. 필라멘트를 전진시킬 때 작업자가 받는 유일한 피드백은 필라멘트가 MCA 분기점에 도달할 때 저항이 갑자기 증가하는 것이므로, 필라멘트의 실리콘 코팅의 트레일링 길이는 MCA에 허혈을 유발하고, 실리콘 코팅의 길이에 따라 AChA, VTA, HTA 및 PCA에도 허혈을 유발합니다. 의도한 MCAO 모델에 반하는 변동성을 도입합니다. 따라서 재현성과 수술 후 동물의 웰빙을 유지하기 위해서는 MCA 교합이 목표여야 합니다. Doccol은 1-2mm 범위의 실리콘 코팅이 된 MCAO 필라멘트를 제공하지만, 우리의 경험에 따르면 1-2mm 코팅을 사용하면 뇌졸중을 일으키지 않고 가짜 수술을 받는 경우가 많습니다. 수술 중 MRI 스캔에 따르면 필라멘트는 MCA 분기점을 넘어 전뇌동맥(ACA)으로 최대 2mm 전진한 후 작업자에게 중요한 저항 피드백을 제공하는 것으로 나타났습니다. 이러한 이유로, MCAO 필라멘트의 긴 실리콘 코팅에 비해 뇌졸중 병변에서 해마의 침범을 줄이는 2-3mm 길이의 실리콘 코팅을 사용하는 것이 좋습니다.

이 절차의 두 번째 중요한 단계는 MCA의 완전한 폐색을 달성하기 위해 MCAO 필라멘트를 올바르게 배치하는 것입니다. MCAO 필라멘트가 발전하는 동안 잘못된 방향을 잡았다는 피드백이 거의 없기 때문에 첫 번째 ICA 분기인 PPA(익상편 구개 동맥)에 실수로 들어가는 것은 운영자에게 일반적인 문제입니다. 이러한 이유로 필라멘트의 실리콘 코팅된 팁이 PPA의 분기점에서 구부러져 ICA의 두개내 부분에 들어갈 가능성을 높일 수 있도록 약간의 측면 전진 각도를 권장합니다. (그림 1) 프로토콜 섹션에 명시된 바와 같이 필라멘트의 배치가 적절한지 결론을 내리기 위해 후행 필라멘트의 길이를 관찰하는 것이 중요합니다. ICA 분기점에서 최소 7mm 이상 필라멘트를 삽입할 수 없는 경우 작업자는 필라멘트를 집어넣고 반복해야 합니다. 필라멘트 삽입 중에 불필요한 힘이 가해지면 출혈이 발생하고 시술이 실패할 수 있습니다. 이 문제에 대해 연속 레이저 도플러 관류 측정을 사용하여 올바른 필라멘트 배치를 확인할 수 있습니다.

허혈 기간 동안 CCA에서 방해받지 않는 혈류를 보장하는 것은 이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계입니다. 쥐에서 완전한 Willis circle을 묘사하는 대부분의 그림과 달리, 연구에 따르면 후방 통신 동맥(PcomA)은 마우스에서 양측으로 특허를 받지 않는 경우가 가장 많으며 CCA가 허혈 기간 동안 닫혀 있으면 Willis circle의 동측 쪽을 안정적으로 공급할 수 없습니다^15,16. 이러한 경우, 연구자가 필라멘트의 실리콘 코팅의 올바른 길이를 신중하게 선택하더라도 PcomA 개통성에 따라 스트로크가 반구 전체를 감싸거나 MCA 영역만 둘러싸게 되어 스트로크 크기의 설명할 수 없는 변동이 발생합니다. 이러한 이유로 작업자가 폐색 MCAO 필라멘트를 설정한 직후 CCA 클립을 제거하는 명령 단계를 포함하도록 절차를 수정했습니다. 이러한 수정은 수술의 정밀도와 재현성을 높이고 동시에 결과의 이질성을 줄일 수 있습니다. 방법의 표준화는 성공률과 비교 가능성뿐만 아니라 결과의 변환 잠재력을 더욱 향상시킬 것입니다¹⁷.

제안된 기술의 가장 큰 한계는 ECA가 시술 후에도 결찰된 상태로 유지된다는 사실이며, 이는 잠재적으로 회복 동안 동물의 상태를 악화시킬 수 있다⁽¹⁸). 지금까지 우리는 절차의 성공률을 충분히 높게 유지하면서 ECA를 수리하려는 노력에 성공하지 못했습니다. 이는 이 방법의 향후 개선을 위한 잠재적인 포인트로 남아 있습니다. 또한, CCA가 고정되어 있는 시간을 최소화하는 것은 어려운 일이지만, 뇌졸중에서 비MCA 영역이 모집되는 것을 방지하는 것이 필수적입니다. 이는 작업자 간 및 작업자 내 분산의 원인을 제공할 수 있으므로 CCA 클램핑 기간을 측정하는 것이 바람직하며, 이를 통해 연구원이 스트로크 크기에서 관찰된 총 분산의 일부라도 통계적으로 설명할 수 있습니다. 다른 한편으로는, 작업자의 기술과 경험은 CCA 합자 시간과 전체 절차 기간을 줄이는 데 중요한 역할을 한다¹¹.

제시된 방법은 연구자가 MCA를 선택적으로 폐색할 수 있도록 하여 재관류의 시작을 갑작스럽고 고도로 제어할 수 있게 하기 때문에 중요합니다. 이 방법은 현재 사용 가능한 방법보다 더 정확하게 혈관 내 혈전 절제술 및 그에 따른 재관류 손상을 모방하여 재현 가능하고 임상적으로 관련된 동물 허혈/재관류 손상 모델에 대한 세부 정보를 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Betadine 피부 용액 10g/100ml	알칼로이드 Skopje	N/A
꼰 실크 봉합	Fine Science Tools	18020-60
Dafilon 봉합사 5/0 DS16	B. Braun	C0936154
Dolokain 20 mg/g gel	Jadran-Galenski Laboratorij	N/A
Dumont #5 집게	Fine Science Tools	11251-20	2개
Dumont #7 집게	Fine Science Tools	11271-30
Dumont N0 자동 폐쇄 집게	Fine Science Tools	11480-11
Durapore 수술 테이프 1,25cm x 9,1m	3M	7100057169
Durapore 수술 테이프 2,5cm x 9,1m	3M	7100057168
외부 온도 조절기	Petnap	1012536
Halsey 바늘 홀더	Fine Science Tools	12500-12
핫 비드 살균기	Fine Science Tools	18000-50
Iris 가위	Fine Science Tools	14060-10
Isoflurane USP	Piramal critical care	N/A
레이저 도플러 모니터		Moor MOORVMS-LDF2
Metal Pet Heat Pad	Petnap
Micro Vannas 스프링 가위	Fine Science Tools	15000-00
Mini-colibri retractor	Fine Science Tools	17000-01
Recugel eye ointment	Bausch& 롬	N/A
S& T B-1 용기 마이크로 클램프	파인 사이언스 도구	00396-01	2 개
S & T 마이크로 클램프 적용	집게 Fine Science Tools	00071-14
Schwartz micro serrefines	Fine Science Tools	18052-01
Stemi DV4 Spot stereo microscope	Zeiss	000000-1018-453
Steri-Strip Reinforced adhesive Skin Closures 3 mm x 75 mm	3M	7100236545
Straight tissue Viewport	Science Tools	11023-10
SZX 스탠드 암	올림푸스	SZ2-STS
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