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방법 논문

Naegleria gruberi rDNA의 분자 클론을 N. gruberi Trophozoites로 transfection

1.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66726

⸱

2024년 6월 21일

 ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, Creighton University School of Medicine, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center, 3Department of Biology, Washburn University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 시험관 내 영양 영양 환자를 통과시키는 동안뿐만 아니라 encystment 및 excystment를 통해 유지되는 구조로 Naegleria gruberi trophozoites를 transfection하는 방법론을 설명합니다.

초록

Naegleria trophozoites의 모든 리보솜 유전자는 닫힌 원형 염색체 외 리보솜 DNA(rDNA) 함유 요소(CERE)에서 유지됩니다. CERE에 대해 알려진 바는 거의 없지만, 세 가지 Naegleria 종에 대한 완전한 게놈 염기서열 분석은 핵 게놈에 rDNA cistron이 없다는 것을 명확하게 보여줍니다. 또한, 복제의 단일 DNA 기원이 N. gruberi CERE에 매핑되어 CERE가 핵 게놈과 독립적으로 복제한다는 가설을 뒷받침합니다. 이러한 CERE 특성은 공학적 CERE를 사용하여 외래 단백질을 Naegleria trophozoites에 도입하는 것이 가능할 수 있음을 시사합니다. Naegleria에서 CERE를 벡터로 사용하는 방법을 탐색하는 첫 번째 단계로, pGEM7zf+(pGRUB)로 클로닝된 N. 그루베리 CERE의 분자 클론과 N. 그루베리를 transfection하는 프로토콜을 개발했습니다. transfection 후, pGRUB는 N. gruberi trophozoites에서 최소 7개의 구절에 대해 그리고 encystment 및 excystment를 통해 쉽게 검출되었습니다. 대조군으로, trophozoites는 N. gruberi sequences (pGEM) 없이 backbone vector, pGEM7zf+로 transfection되었습니다. pGEM은 N. gruberi로 transfection한 후 첫 번째 통과 후에는 검출되지 않았으며, 이는 진핵생물에서 복제할 수 없음을 나타냅니다. 이러한 연구는 Naegleria trophozoites에 대한 transfection 프로토콜을 설명하고 pGRUB의 박테리아 플라스미드 염기서열이 transfection된 CERE 클론의 성공적인 transfection 및 복제를 억제하지 않음을 보여줍니다. 또한, 이 transfection 프로토콜은 영양체에서 복제를 주도하는 CERE의 최소 염기서열을 이해하고 비리보솜 염기서열(NRS)에서 조절 영역을 식별하는 데 중요합니다.

서론

Naegleria 속에는 45 종이 넘는 종이 포함되어 있지만 종의 모든 구성원이 확인되었을 가능성은 거의 없습니다1. Naegleria는 trophozoites (amoebae), 편모 또는 자원이 심각하게 제한된 경우 낭종 1,2,3,4로 다양한 형태로 존재할 수 있습니다. Naegleria 속은 거의 보편적으로 치명적인 원발성 아메바성 수막뇌염의 원인인 '뇌 먹는 아메바'(1,2,3,4,5,6,7에서 검토됨)로 알려진 특히 위험한 종인 Naegleria fowleri로 알려져 있습니다.

Naegleria는 핵소체에 위치한 CERE에서 rDNA를 암호화합니다. 세 가지 Naegleria 종의 게놈에 대한 완전한 시퀀싱은 핵 게놈 8,9,10,11에 rDNA가 없음을 확인합니다. 제한된 전체 길이 CERE 시퀀스를 기반으로 CERE의 길이는 약 10kbp에서 18kbp 사이입니다. Naegleria의 각 종의 CERE는 세포 당 대략 4,000 CERE 12,13,14의 각각에 단 하나 rDNA cistron (5.8, 18, 및 28S 리보솜 DNA 포함)를 나른다. rDNA 외에도 각 CERE는 큰 non-rDNA 염기서열(NRS)을 가지고 있습니다. CERE 크기는 종에 따라 다릅니다. rDNA 염기서열은 1,15,16,17,18,19,20 속에 걸쳐 매우 보존되어 있기 때문에 이러한 차이는 주로 NRS의 다양한 길이에 기인합니다. N. gruberi CERE NRS21 내에서 DNA 복제의 단일 기원에 대한 매핑은 Naegleria CERE가 핵 게놈과 독립적으로 복제한다는 가설을 강력하게 뒷받침합니다.

N. gruberi는 Naegleria 생물학을 연구하는 데 자주 사용되는 비병원성 아메바입니다. 우리는 Naegleria amoebae가 trophozoites 내에서 CERE를 견디고 독립적으로 복제한다는 가설을 테스트하기 위해 N. gruberi trophozoites를 동일한 종의 CERE 클론으로 변형시키는 방법론을 개발했습니다. 이것은 N. gruberi CERE의 전장 클론으로 N. gruberi를 영양류로 변형시키고 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 기증자 CERE 클론의 운명을 따름으로써 달성되었습니다. 프로토콜의 일반적인 개요는 그림 1에 요약되어 있습니다. 본 명세서에 제시된 데이터는 공여체 클론이 조직 배양에서 적어도 7개의 통로를 통해 검출될 수 있을 뿐만 아니라 엔시스트먼트(encystment) 및 엑시스트먼트(excystment)를 통해 유지될 수 있음을 보여준다. 이러한 연구는 CERE가 복제하는 방법을 해부하고 Naegleria를 transfection하는 벡터로서의 사용을 탐구하는 수단의 기초를 형성합니다.

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프로토콜

이 연구에 사용된 종, 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다. 17,004 염기쌍 pGRUB 구문의 시퀀스는 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.

1. trophozoites 배양

  1. 얼린 N. gruberi trophozoites를 37°C에서 3분 동안 해동합니다.
  2. 변형 펩톤/효모 추출물/핵산/엽산/헤민의 T25 플라스크에 10% 태아 송아지 혈청(PYNFH) 배지와 2% 완충액(인산이나트륨, 인산이수소칼륨)을 접종합니다.
  3. 25 ° C에서 ~ 80 %가 합류 할 때까지 trophozoites를 배양하면 아메바이드 형태가 나타납니다 (그림 2A).
    참고: 처음 동결 상태에서 영양류 배양을 되살릴 때 T25가 합류하는 데 최대 5-7일이 걸릴 수 있습니다. 3-4일마다 디캔팅 미디어를 교체하고 새 미디어로 교체하십시오.
  4. 합류 플라스크를 얼음 위에 5-10분 동안 올려 플라스틱에서 부착된 영양류를 제거합니다. 플라스크를 부드럽게 휘저어 남아 있는 부착 세포를 제거합니다. trophozoites는 이제 '반올림된' 형태를 가지고 있습니다(그림 2B).
  5. 배양액을 1:2에서 1:4로 분할하여 새로운 조직 배양 플라스크로 만듭니다.
  6. PYNFH를 제거하고 멸균 배지(120mM 염화나트륨, 0.03mM 염화마그네슘, 1mM 인산이나트륨, 1mM 인산이수소칼륨, 0.03mM 염화칼슘, 0.02mM 염화철, pH 6.8)22 로 교체하여 N. gruberi를 감염시킵니다.
    참고: 대부분의 trophozoites는 72시간이 지나면 상태가 됩니다(그림 2C). 배설은 72시간 이내에 완료해야 합니다.
  7. 플라스크에서 낭종을 제거하고 20°C에서 10분 동안 600 x g 으로 원심분리한 다음 10% 태아 송아지 혈청으로 PYNFH 배지의 낭종을 재현탁시켜 세포를 배설합니다. trophozoites가 나오기 시작할 때까지 25 °C에서 24 시간 동안 배양합니다.

2. trophozoites 형질주입

  1. 영양영양생물을 6웰 편평한 바닥 조직 배양 플레이트(1 x 106 trophozoites/mL 1mL)에 패팅하고 25°C에서 배양합니다.
  2. 세포가 70%-80% confluent(6웰 클러스터에서 ~10.4 x 104 cells/cm2 )에 도달하면 세포를 transfection합니다. 사용하기 전에 transfection 시약을 실온으로 데우십시오.
  3. FBS 없이 200 μL의 PYNFH 배지에 75 ng의 plasmid DNA와 0.225 μL의 transfection 시약을 넣고 plasmid-transfection 시약 혼합물을 준비합니다. transfection을 중복으로 수행할 수 있는 충분한 plasmid-transfection 시약 혼합물을 준비합니다.
    참고: 이 연구에서는 N. gruberi CERE(pGRUB)의 전장 클론을 포함하는 박테리아 플라스미드를 사용했습니다. 빈 플라스미드(pGEM)를 음성 대조군으로 사용했습니다(그림 3).
  4. plasmid-transfection 시약 혼합물을 실온에서 10분 동안 배양합니다.
  5. transfection 직전에 trophozoite 단층에서 ~800 μL의 배지를 제거합니다.
  6. plasmid-transfection 시약 혼합물을 trophozoites에 넣습니다.
  7. 미디어가 플레이트 가장자리에 뭉치는 것을 방지하기 위해 15분마다 플레이트를 부드럽게 소용돌이칩니다.
  8. 25°C에서 1시간 배양 후 2mL의 성장 배지로 단층을 한 번 세척합니다.
  9. 37°C에서 15분 동안 10x DNase 완충액 1mL에 단층을 10U DNase로 처리하여 잔류 플라스미드 DNA를 제거하고 성장 배지로 한 번 세척한 다음 2mL의 새 배지를 추가하고 25°C에 둡니다. 플레이트를 24-36 시간 동안 배양하십시오.
  10. 접시를 얼음 위에 10분 동안 올려 세포를 방출합니다.
  11. 하나의 웰(1:2)을 두 개의 새 웰로 나눕니다.
  12. 실험 목적으로 남은 우물에서 영양류를 수집하십시오.
    참고: 모든 문화권은 중복으로 수행됩니다. 각 조건에 대해 1개의 웰은 통과에 사용되고 1은 CERE 절연에 사용됩니다.

3. Cer를 Naegleria에서 분리

  1. trypan blue exclusion staining 및 hemocytometer23에 의해 CERE 분리에 사용되는 각 웰의 trophozoites 수를 계산합니다.
  2. trophozoites를 2.0mL 튜브에 넣습니다.
  3. 원심분리(600 x g, 10분, 4°C)를 통해 100mM 염화나트륨(pH 7.5)에 트로포조이트를 한 번 세척합니다.
    알림: 염화나트륨은 영양류가 튜브 측면에 부착되는 것을 방지합니다.
  4. 상층액을 제거하고 100mM EDTA(pH 7.5) 100μL에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
  5. 튜브를 98°C에서 15분 동안 열 블록에 넣어 세포를 용해하고 영양류석의 효소를 비활성화합니다.
    참고: 이 단계는 Naegleria trophozoites에 풍부한 DNase를 비활성화합니다. DNase는 4단계에서 native CERE 및 분자 클론을 검출하는 기능을 방해할 수 있습니다. 3.4단계에서 3~106 개 이상의 세포를 사용하면 DNA 수율이 감소합니다.
  6. 4°C에서 최고 속도(16,000 x g)로 튜브를 10분 동안 원심분리하여 파편을 펠릿화합니다.
  7. 상층액을 새 튜브로 옮깁니다.
  8. 에탄올은 0.5 부피의 7.5M 암모늄 아세테이트(pH 7.5), 3 부피의 절대 에탄올 및 1 μL의 10mg/mL 글리코겐을 담체로 사용하여 상층액을 침전시킵니다.
  9. 튜브를 여러 번 뒤집고 튜브를 -80°C에서 최소 1시간 또는 밤새 두십시오.
  10. 샘플을 실온으로 데우십시오.
  11. 튜브를 실온에서 16,000 x g에서 10분 동안 원심분리합니다.
  12. 상층액을 제거하고 펠릿을 70% 에탄올로 원심분리하여 16,000 x g (실온에서)에서 5분 동안 세척합니다.
  13. 에탄올을 제거하고 펠릿을 5분 동안 자연 건조합니다.
  14. 건조된 펠릿을 멸균 탈이온수(DI)에 재현탁시킵니다. 부피를 μL당 10,000 trophozoites로 정규화합니다.
  15. PCR에 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.

4. 형질전환된 trophozoites의 PCR 검출

  1. 20,000 cell equivalent of DNA, 600 nM primer (Table 1) 및 Taq polymerase를 사용하여 PCR24를 수행합니다.
    참고: 원시 CERE와 복제된 CERE를 구별하는 프라이머는 PCR 조건과 마찬가지로 표 1에 나열되어 있습니다. 그림 3 은 구조체에서 프라이머의 위치를 보여줍니다. PCR은 사용된 프라이머와 사용된 특정 PCR 혼합물에 따라 최적화가 필요합니다.
  2. 아가로스가 용해될 때까지 0.8x Tris 염기, 아세트산 및 EDTA(TAE) 완충액에 1% 아가로스를 전자레인지에 넣습니다.
  3. 아가로스를 실온에서 ~50°C로 냉각시킵니다.
  4. 우물을 형성하기 위해 빗이 들어있는 젤 주조 트레이에 용액을 붓습니다.
  5. 겔이 응고될 때까지 실온에 두십시오.
  6. 겔을 전기영동 장치에 넣는다.
  7. 겔이 덮일 때까지 1x TAE를 전기영동 챔버에 디캔트합니다.
  8. 빗을 제거하십시오.
  9. 6x 로딩 염료(0.25% 브롬페놀 블루, 0.25% 자일렌 시아놀, 30% 글리세롤)를 샘플에 추가하고 겔을 로드합니다. DNA ladder를 사용하여 PCR 산물의 크기를 측정합니다.
  10. 전극을 부착하고 전원 공급 장치를 켠 다음 겔을 80V에서 ~1.5-2시간 동안 실행합니다.
  11. 전원을 끄고 젤을 제거하십시오.
  12. DNA 염료(예: 10mg/mL 에티듐 브로마이드 10μL)를 탈이새 물 100mL에 10분 동안 염색합니다.
  13. 탈이온수에서 20분 동안 젤을 탈색합니다.
  14. 자외선(UV) 시스템에서 겔을 시각화하고 결과를 문서화합니다.

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결과

pGRUB로 transfection된 trophozoites의 PCR은 transfection된 CERE가 trophozoites의 최소 7개 통로와 encystment 및 excystment를 통해 검출됨을 보여줍니다(그림 4). PCR에 사용된 프라이머는 pGEM 벡터와 CERE 서열 모두에 어닐링하여 PCR이 네이티브 CERE를 검출하지 않도록 합니다. pGEM을 영양류석에 transfection한 후 PCR은 pGEM이 음성임을 나타냈으며(그림 4), 이는 빈 플라스미드가 아메바에 의해 유지되지 않았음을 나타냅니다. 그림 4 는 pGEM이 첫 번째 구절에서 손실되었음을 보여주며, 후속 구절, encystment 및 excystment는 모두 음수였습니다.

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토론

본 명세서에 요약된 프로토콜은 매우 간단하지만, 모든 구축물은 구축물의 특성 및 사용된 Naegleria 종에 따라 특히 DNA-transfection 시약 비율의 어느 정도의 최적화가 필요할 수 있습니다. 당사는 이 프로토콜을 사용하여 상업적으로 이용 가능한 transfection 시약을 하나만 테스트했지만, 다른 여러 시약이 효과적일 수 있습니다. 복제의 기능적 기원을 포함하고 따라서 자율적으로 복제하는 CERE의 전체 길이 클론이 사용된다는 점을 감안할 때, 구조체는 필요한 모든 진핵 복제 기계를 소유합니다. 부분 클론이 pGEM 벡터에 삽입되는 경우, 빈 pGEM 벡터와 유사한 기능적 진핵 복제 기원을 포함하지 않는 경우 transfection된 클론은 transfection 직후 손실될 것으로 예측됩니다(그림 2B). 게다가, 이 자료는 prokaryotic DNA의 존재가 trophozoite에 의해 유지되는 분자 클론의 능력에 방해가 되지 않는다는...

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공개 사항

재정적 이해 상충은 선언되지 않았습니다.

감사의 글

이 연구는 크레이튼 대학(KMD)의 조지 F. 해딕스 기금(George F. Haddix Fund)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 그림 1 은 biorender.com 에서 생성되고 그림 3 은 benchling.com 에서 생성됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AgaroseBio Rad161-3102
암모늄 아세테이트Sigma AldrichA-7330
염화칼슘Sigma AldrichC-4901
분쇄 얼음
배양 플라스크, T-75Thermo Scientific130190
배양 플레이트, 6웰Corning3506
DNAseSigma AldrichD-4527
EDTA, 0.5 MAffymetrix15694
전기pheresis Gel ApparatusAmersham Biosciences80-6052-45
Eppendorf Tubes, 1.5 mLFisher Scientific05-408-129
Eppendorf Tubes, 2 mLFisher Scientific05-408-138
에탄올, 100%Decon Laboratories2716
에티듐 브로마이드시그마 AldrichE-8751
소 태아 혈청Gibco26140
엽산시그마 AldrichF7876-25G
GeneRuler 1kb Plus LadderThermo ScientificSM1331
빙하 아세트산Fisher ScientificUN2789
GoTaq Green PCR 마스터 믹스PromegaM7122
가열 블록Thermo Scientific88871001
혈구계Hausser Scientific1483
HeminSigma Aldrich51280
염화철Sigma Aldrich372870-256
LigaseNEBM2200S
Magneisum ChlorideFisher ScientificM33-500
마이크로퓨지Thermo ScientificMySpin 12
현미경NikonTMS
N. gruberiATCC30224
핵산Chem Impex Int' l#01625
펩톤Gibco211677
pGEMPromegaP2251
인산칼시그마 AldrichP0662-500G
PowerPac HC 전기위상 전원 공급 장치Bio Rad1645052
염화나트륨MCB 시약SX0420
인산나트륨, 이염기성Sigma AldrichS2554
탁상용 원심분리기Eppendorf5415R
Tris, 기본Sigma AldrichT1503-1KG
Trypan Blue, 0.4%Gibco15250-061
ViaFect 시약PromegaE4981
체중Denver InstrumentsAPX-60
효모 추출물기브코212750
륨 계

참고문헌

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