광시트 현미경을 사용하여 온전한 융모막 내에서 초기 제브라피시 배아를 이미징하기 위한 샘플 준비 전략이 설명되어 있습니다. 70% epiboly 및 bud 단계에서 배아가 융모막 내에서 획득하는 다양한 방향을 분석하고 광시트 시스템을 사용하여 배아 전체에서 세포 규모의 해상도를 얻기 위한 이미징 전략을 자세히 설명합니다.
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방법 논문
Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
광시트 현미경은 광독성을 최소화하면서 장기간에 걸쳐 제브라피시 배아의 실시간 이미징을 위해 선택되는 방법론이 되었습니다. 특히, 샘플 회전이 가능한 멀티뷰 시스템을 통해 다양한 각도에서 전체 배아를 이미징할 수 있습니다. 그러나 멀티뷰 시스템을 사용하는 대부분의 이미징 세션에서는 샘플이 일반적으로 폴리머 튜브에서 준비되기 때문에 샘플 장착은 번거로운 과정입니다. 이 과정을 돕기 위해 이 프로토콜은 70% 에피볼리 단계와 초기 소마이트 단계 사이의 초기 제브라피시 발달을 이미징하기 위한 기본 장착 전략을 설명합니다. 특히, 이 연구는 융모막 내 70%의 에피볼리(epiboly) 및 새싹 단계에서 배아가 기본적으로 위치하는 다양한 위치에 대한 통계를 제공합니다. 또한, 발달 초기 단계에서 전체 제브라피시 배아를 이미징하는 데 필요한 최적의 각도 수와 각도 사이의 간격에 대해 논의하여 서로 다른 관점을 융합하여 세포 규모의 정보를 추출할 수 있습니다. 마지막으로, 배아는 세포 규모의 해상도를 얻는 데 필요한 카메라의 전체 시야를 커버하기 때문에 이 프로토콜은 다양한 보기의 정합을 위해 배아 위 또는 아래의 비드 정보를 사용하는 과정을 자세히 설명합니다.
서론
광독성을 최소화하는 것은 살아있는 배아를 장기간 높은 시공간 해상도로 이미징하기 위한 주요 요구 사항입니다. 지난 10년 동안 광시트 현미경은 이 요구 사항 1,2,3,4,5,6,7을 충족하기 위해 선택되는 방법론이 되었습니다. 간단히 말해서, 발달 과정8을 포착하기 위해 2004년에 처음 사용된 이 기술에서는 두 개의 정렬된 얇은 레이저 시트가 반대쪽 끝에서 배아를 통과하여 관심 평면만 비춥니다. 검출 대물렌즈를 직각으로 배치한 다음 샘플의 모든 조명 지점에서 방출된 형광을 동시에 수집합니다. 그런 다음 정적 광 시트를 통해 배아를 순차적으로 이동하여 3D 이미지를 얻습니다.
또한, 멀티뷰 광시트 현미경이라고 하는 이 방법론의 ....
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프로토콜
이 연구에 사용된 제브라피시 유지 관리 및 실험 절차는 기관 동물 윤리 위원회(참조 TIFR/IAEC/2023-1 및 TIFR/IAEC/2023-5)의 승인을 받았습니다. Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)19를 발현하는 이형접합 어류를 교배하여 얻은 배아에 단세포 단계에서 H2A-mCherry mRNA(30pg)를 주입했습니다. H2A-mCherry mRNA는 pCS2+ H2A-mCherry 플라스미드(Oates lab, EPFL에서 선물)를 사용하여 in vitro transcription으로 합성되었습니다. 프로토콜의 나머지 부분에서 각각 Utr-GFP 및 H2A-mCherry라고 하는 두 마커를 모두 발현하는 배아는 70% 에피볼리 및 새싹 단계에서 이미지화되었습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 멀티뷰 이미징을 위한 시료 전처리
- FEP/PTFE 튜브의 준비
- 이전에 설명한 절차에 따라 FEP/PTFE 튜브 청소14.....
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결과
정확한 방식으로 샘플의 방향을 지정하는 것은 현미경 설정을 효율적으로 사용하는 데 있어 중요한 부분입니다. 그러나 튜브에서 샘플을 준비해야 하는 요구 사항을 감안할 때 멀티뷰 라이트 시트 시스템을 사용할 때 샘플의 방향을 수동으로 지정하는 것이 불가능한 경우가 많습니다. 따라서 배아가 융모막 내에서 차지하는 정형화된 위치가 있는지 확인하기 위해 제브라피시 배아를 70% 에피볼리(수정 후 약 7시간)로 이미징했는데, 이는 위축에서 초기 소마이트 단계까지의 타임랩스 이미징이 이 연구의 초점이었기 때문입니다. 70% epiboly에서 이미징하기 직전에 샘플을 준비했을 때, 배아는 샘플에서 자주 관찰되는 특정 방향이 나타나지 않았습니다. 이는 종종 바람직하지 않기 때문에 샘플은 위형성 훨씬 전에 준비하고 이미징이 시작될 때까지 적절한 온도의 미세 원심분리기 튜브에 보관했습니다. 이러한 조건 하에서, 70%의 에피볼리(epiboly)에서(N=3; n=87 배아), 배아 배향은 (1) 배아의 동물-식물(AV) 축이 고분자 튜브의 장축에 직.......
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토론
관심 영역을 이미지화하기 위해 배아를 올바른 방향으로 배치하는 것은 종종 사용자의 현미경 세션 실패를 초래하는 속도 제한 단계 중 하나입니다. 이는 샘플이 튜브 내에 내장되어 있기 때문에 방향을 수동으로 조작하기 어려운 멀티뷰 광시트 현미경에서 더욱 그렇습니다. 이 과정을 돕기 위해 이 연구는 배아가 있는 고분자 튜브가 미세 원심분리기 튜브에 똑바로 세워져 있을 때 제브라피시 배아가 융모막 내에서 70%의 에피볼리(epiboly) 단계와 초기 소마이트(somite) 단계 사이에서 차지하는 다양한 위치에 대한 통계를 보고합니다.
70%의 epiboly, 수직 또는 수평 배아는 전체 배아에 걸쳐 이벤트에 대한 보완 정보를 제공합니다. 수평 방향은 식물 극에서 볼 때 epiboly를 겪는 세포의 역학뿐만 아니라 동물 극의 세포 역학을 시각화 할 수 있지만, 수직 방향은 배쪽 조직자의 세포 역학, 위산 중 세포의 내부화 및 수.......
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공개 사항
저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
우리는 물고기 시설의 유지 보수를 위해 Kalidas Kohale 박사와 그의 팀을, 그리고 광시트 현미경의 유지 보수를 위해 KV Boby에게 감사를 표합니다. SRN은 인도 정부 원자력부(DAE)의 재정 지원을 인정합니다(프로젝트 식별 번호). RTI4003, DAE OM no. 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 2020년 2월 11일자), 막스 플랑크 소사이어티 파트너 그룹 프로그램(M.PG. A MOZG0010) 및 과학 및 공학 연구 위원회 창업 연구 보조금(SRG/2023/001716).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아가로스, 저겔화 온도 | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| 염화칼슘 이수화물 | Sigma-Aldrich | 12022 | |
| FIJI | 버전: ImageJ 1.54f | ||
| 라텍스 비드, 카르복실레이트 변성 폴리스티렌, 형광 적색, 0.5 μ m mean particle size, aqueous suspension | Sigma-Aldrich | L3280 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit | ThermoFischer Scientific | AM1340 | For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid |
| Potassium Chhloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| PTFE 슬리브 AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm 벽 +/-0.05 | Adtech, 불소수지 | STW15 | PTFE 튜브 |
| , 염화나트륨 | 시그마-알드리치 | S3014 | |
| 인산나트륨, 이염기성 | 시그마-알드리치 | 71640 | |
| 초음파 세척기 | Labman, | LMUC3 | 초음파기 |
| , Zeiss, LightSheet 7, 시스템 | , Zeiss |
참고문헌
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of....
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재인쇄 및 허가
