방법 논문

양친매성 DNA 나노 구조의 합성 응축물 및 세포와 같은 구조

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DOI:

10.3791/66738

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2024년 5월 31일

 ,  , 
1Department of Chemical Engineering and Biotechnology, University of Cambridge, 2Department of Chemistry, Imperial College London, 3fabriCELL, Imperial College London

이 논문에서

요약

우리는 구성 DNA 올리고뉴클레오티드에서 시작하여 양친매성 DNA 나노스타로 구성된 합성 생체 분자 응축물을 제조하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 응축물은 단일 nanostar 구성 요소 또는 두 가지 구성 요소로 생성되며 내장된 DNA 템플릿에서 RNA의 시험관 내 전사를 유지하도록 변형됩니다.

초록

합성 액적과 응축물은 첨단 생체 모방 시스템 및 합성 세포의 점점 더 흔한 구성 요소가 되고 있으며, 여기서 구획화를 확립하고 실제와 같은 반응을 유지하는 데 사용할 수 있습니다. 합성 DNA 나노 구조는 프로그래밍 가능한 모양, 화학적 기능화 및 자체 조립 거동으로 인해 응축물 형성 빌딩 블록으로서 상당한 잠재력을 보여주었습니다. 우리는 최근에 소수성 부분으로 DNA 접합을 라벨링하여 얻은 양친매성 DNA "나노스타"가 특히 견고하고 다재다능한 솔루션을 구성한다는 것을 입증했습니다. 생성된 양친매성 DNA 응축물은 복잡한 다중 구획 내부 구조를 표시하고, 다양한 외부 자극에 구조적으로 반응하고, 거대분자를 합성하고, 페이로드를 포획 및 방출하고, 형태학적 변형을 겪고, 살아있는 세포와 상호 작용하도록 프로그래밍할 수 있습니다. 여기에서는 구성 DNA 올리고뉴클레오티드에서 시작하여 양친매성 DNA 응축물을 준비하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. (i) 균일한 응축물을 형성하는 단일 성분 시스템, (ii) 코어 쉘 응축물을 형성하는 2액형 시스템, (iii) RNA 나노 구조의 시험관 내 전사를 지원하기 위해 응축물이 변형되는 시스템에 대해 다룰 것입니다.

서론

합성 세포는 현존하는 생물학적 세포의 기능과 구조를 복제하기 위해 상향식으로 구성된 마이크로미터 규모(10-50 μm) 장치입니다 1,2. 합성 세포는 종종 지질 이중층 소포 3,4,5,6,7, 폴리머솜 8,9 또는 단백질 소체10,11로 구성된 막에 의해 결합되며, 이는 내부 구획화 (12,13)를 확립하는 데에도 사용될 수 있습니다. 살아있는 세포(14)에서 다양한 기능을 유지하는 것으로 알려진 막이 없는 세포소기관에서 영감을 받은 고분자 코아세르베이트, 생체 분자 응축물 및 하이드로겔과 같은 구조는 합성 세포에서 외부 및 내부 구획화를 모두 확립하기 위한 다재다능하고 강력한 대안으로 주목을 받고 있습니다 15,16,17,18.

DNA 나노 기술19의 다재다능한 툴킷을 활용하여 크기, 모양, 기능, 원자가 및 상호 작용을 정밀하게 프로그래밍할 수 있는 인공 DNA 나노 구조의 자체 조립에서 합성 액적 및 응축물을 엔지니어링하기 위해 여러 솔루션이 개발되었습니다20. DNA 방울 또는 응축물은 생체 적합성을 가지며 합성 세포와 세포 기관 모두의 골격 역할을 할 수 있으며, 화학 및 생체 분자 반응21을 호스팅하고, 정보를22,23 계산하며, 화물을 포획 및 방출하고(24,25) 구조적 반응을26 유지할 수 있습니다.

응축물 형성 DNA 나노 구조의 다양한 설계 중에서 C-star라고 불리는 양친매성 DNA 나노별은 견고하고 다재다능한 것으로 입증되었습니다27. C-star는 고정된 DNA 접합부(일반적으로 4방향)로 구성된 단순한 분지 모티프이며, 이로부터 이중 가닥(ds)DNA 팔이 출현합니다28. 그런 다음 팔은 일반적으로 콜레스테롤인 소수성 부분으로 기울어져 나노 구조를 양친매성으로 만들고 간단한 한 냄비 어닐링에 따라 응축을 유도합니다. C-star 응축물은 다중 구획 아키텍처(29,30)를 구축하고, DNA 및 양이온 트리거(31)에 구조적으로 반응하고, 거대분자(29)를 합성하고, 페이로드(32)를 포획 및 방출하고, 활세포(33)와 상호 작용할 가능성을 포함하여 정밀한 구조적 및 기능적 프로그래밍 기능을 제공합니다. 아래에서는 구성 성분인 올리고뉴클레오티드에서 시작하여 C-star 응축물을 생산하기 위한 프로토콜에 대해 설명하고 논의합니다.

이 프로토콜은 단항(1성분) 및 이원(2성분) 응축수의 준비를 요약하며, 세 가지 다른 C-star 설계(그림 1)인 "무반응", "TMSD-반응" 및 "RNA-템플릿"을 활용합니다. "무반응" C-star(패널 A)는 4방향 접합을 형성하는 뚜렷한 시퀀스를 가진 4개의 "코어 가닥"으로 구성됩니다. 4개의 동일한 콜레스테롤 변형 올리고뉴클레오티드가 접합부에 연결되어 각 팔의 끝에 콜레스테롤 분자가 존재하도록 합니다. 반응하지 않는 C-star는 단항 및 이진 응축물에 대한 단순하고 불활성인 스캐폴드를 구성합니다. "TMSD 반응성" C-star(패널 B)에서 콜레스테롤화된 가닥과 접합부 사이의 연결은 매달려 있는 단일 가닥(ss)DNA "toehold" 도메인을 특징으로 하는 "Toeholding bridge" 가닥에 의해 보장됩니다. 상보적인 토홀드 도메인을 갖는 침입자 DNA 가닥의 존재 하에서, 토홀드-매개 가닥 변위 반응(34)이 유발될 수 있으며, 이에 의해 침입자는 토홀딩 브리지를 변위시키고, 접합부와 소수성 부분 사이의 연결을 끊고 DNA 네트워크(32)의 분해를 트리거한다. 마지막으로, "RNA 템플릿" C-star(패널 C)에는 "Bridge" 가닥을 보완하는 "Base" 변형이 포함되어 있으며, 후자는 Broccoli aptamer29에 대한 전사 가능한 ssDNA 템플릿을 연결합니다. 여기에 언급된 세 가지 유형의 C-star 디자인에 대한 구성 올리고뉴클레오티드의 서열 세부사항은 보충 표 1 및 이전 연구 29,30,32에서 찾을 수 있습니다.

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그림 1. 양친매성 DNA 나노별(C-stars)의 세 가지 다른 디자인의 개략도. 여기에 설명된 C-star의 다양한 예에 대한 올리고뉴클레오티드 서열은 보충 표 1에서 확인할 수 있습니다. (A) 구성 요소 올리고뉴클레오티드 가닥 "코어 1", "코어 2", "코어 3", "코어 4"(분홍색 음영) 및 "말단 콜레스테롤"(파란색)과 함께 무반응 응축물을 형성하도록 설계된 C-star의 개략도. 각각의 고유한 색상은 고유한 서열의 올리고뉴클레오티드 가닥을 나타냅니다. "코어 1"과 "코어 3"은 각각 "코어 2"와 "코어 4"를 부분적으로 보완하지만 서로 보완하지는 않습니다. (B) 이전 작업32에서 설명한 바와 같이 toehold-mediated strand displacement를 통해 침입 가닥이 추가되면 분해되도록 설계된 C-star의 개략도. 이 C-star는 "코어" 및 "말단 콜레스테롤" 가닥(회색으로 표시)과 "말단 보체"(주황색으로 표시) 및 "발가락 잡는 다리" 가닥(짙은 청록색으로 표시)으로 구성됩니다. 후자는 적절하게 설계된 침입자 가닥이 "Toeholding bridge" 가닥을 결합하고 연속적으로 완전히 변위시킬 수 있는 6-뉴클레오티드 돌출부를 포함하며, 이는 "말단 보체" 및 "말단 콜레스테롤" 가닥으로 구성된 듀플렉스에서 중앙 나노스타 접합("코어 1, 2, 3 및 4"로 구성)의 해리를 유발합니다. (C) RNA 압타머용 DNA 템플릿으로 기능화된 C-star의 개략도. 이것 역시 "말단 콜레스테롤" 가닥과 "코어 2, 3, 4"(모두 회색으로 표시)와 "코어 1" 가닥(분홍색으로 표시), "베이스" 가닥(갈색), "브리지" 가닥(노란색) 및 "Aptamer 템플릿"(녹색)의 확장 버전으로 구성됩니다. 후자의 두 가닥으로 구성된 DNA 듀플렉스는 전사 시작 부위를 표시하는 T7 중합효소 프로모터 영역을 형성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

C-star 응축물은 구성 올리고뉴클레오티드의 열 어닐링 시 형성되며, 여기에 제시된 프로토콜에서는 종횡비가 높은 직사각형 단면을 가진 밀봉된 유리 모세관 내에서 수행됩니다. 이러한 용기는 여러 가지 주요 이점을 제공합니다: i) 밀봉은 (때로는 느린) 어닐링 단계에서 증발이 완전히 방지되도록 합니다. ii) 모세관의 광학 품질의 평평한 바닥은 일시적인 자기 조립(또는 분해)의 이미징을 가능하게 합니다. iii) 모세관의 높은 종횡비는 무거운 응축수가 넓고 평평한 영역에 가라앉도록 하여 쐐기 모양의 용기(예: 마이크로 원심분리기 튜브)에서 발생할 수 있는 자체 조립 과도 현상의 후반 단계에서 유착 및 응집 가능성을 줄이고 상대적으로 단분산 응축수 집단을 생성합니다. iv) 길쭉한 유리 모세관에서 어닐링을 수행하면 양친매성 콜레스테롤화 올리고뉴클레오티드를 모집하여 자체 조립을 방해하는 것으로 관찰된 소수성 계면(공기, 플라스틱 또는 오일)에 대한 샘플의 노출을 최소화합니다. 조립 프로토콜이 완료되면 추가 시약을 포함하는 추가 실험을 위해 유리 모세관에서 응축수를 추출할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 프로토콜은 세 개의 섹션으로 나뉩니다. 섹션 1에서는 DNA 올리고뉴클레오티드 및 유리 모세관의 준비를 포함한 사전 요구 사항 단계를 설명합니다. 섹션 2에서는 1액형 및 2액형 설계를 포함한 다양한 설계의 C-star 응축수를 준비하고 유리 모세관에서 추출하는 방법에 대해 설명합니다. 섹션 3에서는 RNA 압타머의 합성을 위해 C-star 응축물을 템플릿화하는 단일 성분 RNA의 사용에 대해 설명합니다. 사용자는 전체적으로 우수한 실험실 관행을 따르고, 필요한 모든 위험 평가 및 완화 조치가 마련되어 있는지 확인하고, 장갑, 보안경 및 실험실 가운을 포함한 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 유리 모세관의 청소는 먼저 계면 활성제 용액으로, 두 번째로 이소프로판올 또는 에탄올로 초음파 처리가 필요합니다. 모세관에서 C-star 응축수를 추출하려면 다이아몬드 스크라이빙 펜을 사용하여 유리에 점수를 매기고 스냅해야 하며, 이와 관련된 유리 파편으로 인한 부상 위험이 있습니다. 사용된 주요 재료, 장비 및 시약은 재료 표에 나열되어 있습니다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 정제와 함께 주문되는 "extended Core 1" 및 "Aptamer template" 가닥을 제외하고, 대부분의 비기능성 올리고뉴클레오티드는 공급업체가 표준 탈염을 사용하여 정제합니다. 콜레스테롤 변형 올리고뉴클레오티드는 공급업체가 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 정제합니다.

1. 사전 요구 사항

참고: 다음 용액은 초순수(Type I) 물로 준비하고 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 여과해야 합니다: pH ~8.0에서 10mM Tris, 1mM EDTA로 구성된 Tris-EDTA(TE) 완충액; 2M NaCl이 보충된 TE 완충액; 및 0.3M NaCl로 보충된 TE 완충액. 완충 용액은 준비 후 2주 이내에 사용해야 하며 사용하지 않을 때는 4°C에서 보관해야 합니다. 또한 초순수에 1vol% 용량의 알칼리 광학 세제 용액을 사용하여 유리 모세관을 청소합니다.

  1. 동결건조된 상태로부터의 DNA 올리고뉴클레오티드의 제조
    1. 동결건조된 DNA 올리고뉴클레오티드의 튜브를 간단히 원심분리기(10-30초 동안 2000 x g )하여 동결건조된 DNA의 펠릿이 바닥에 수집되도록 합니다.
      참고: 원심분리는 실온(RT)에서 10-30초 동안 수행됩니다. 여기에 사용된 미니 원심분리기는 기본적으로 2000 x g (6000rpm)입니다.
    2. 적절한 양의 TE 완충액을 추가하여 100μM에서 각 올리고뉴클레오티드를 재구성합니다. 소용돌이가 완전히 용해되도록 철저히 세척한 다음 튜브를 회전시켜 1.1.1단계에 따라 모든 액체를 수집합니다.
    3. 각 원액에 대해 260nm에서 흡광도를 측정하고 테스트 중인 올리고뉴클레오티드 서열의 흡광 계수를 사용하여 최종 농도를 계산합니다.
      주의: 주어진 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 흡광 계수는 일반적으로 공급업체의 데이터 시트에서 찾을 수 있지만, 최근접 이웃 모델(35 ) 또는 개별 뉴클레오티드(36)의 흡광 계수의 표화된 값을 사용하여 온라인 도구로 계산할 수도 있습니다.
    4. 재수화된 올리고뉴클레오티드를 4°C에서 단기간(최대 1주일) 보관하거나 -20°C에서 장기간 보관(최대 6개월) 보관합니다.
  2. 유리 모세관 세척
    1. 탈이온수의 광학 부품에 대한 1% 알칼리성 광학 세제로 초음파 처리합니다.
      1. 세척할 유리 모세관을 모아 모세관이 용기 바닥에 평평하게 놓이지 않도록 길고 좁은 용기(예: 비커 또는 15/50mL 원심분리기 튜브)에 넣습니다.
      2. 용기에 세제를 넣고 모세관 바로 위에 채우십시오. 모세관 내부에 갇힌 기포가 없는지 확인하고 필요한 경우 탭하여 제거합니다. 용기를 느슨하게 덮습니다(예: 은박지 또는 원심분리기 튜브 뚜껑을 사용하여 단단히 밀봉되지 않았는지 확인).
      3. 초음파 처리 수조를 40 ° C로 설정하고 덮개가있는 용기를 욕조에 똑바로 놓고 30 분 동안 초음파 처리합니다. 호일을 사용하는 경우 초음파 처리 수조의 물과 접촉하지 않도록 하십시오.
        참고 :이 연구에 사용 된 초음파 처리 수조는 기본적으로 60Hz의 초음파 처리 주파수와 150W의 초음파 처리 전력으로 설정됩니다.
        주의: 달리는 동안 초음파 수조에서 항목을 추가하거나 제거하지 마십시오. 항상 먼저 프로토콜을 일시 중지하십시오.
      4. 초음파 처리가 완료되면 초음파 처리 수조의 발열체를 끈 다음 용기의 모세 혈관을 탈 이온수 또는 초 순수로 철저히 헹구고 매번 헹굼수를 버립니다.
  3. 이소프로판올 또는 에탄올에 초음파 처리합니다.
    1. 세척 용기의 유리 모세관에 이소프로판올 또는 에탄올(최소 70%)을 추가하여 모세관 바로 위까지 채웁니다. 1.2.1.2단계에서와 같이 모세관에 갇힌 기포가 없는지 확인하고 용기를 느슨하게 덮습니다.
    2. 용기를 초음파 처리 수조에 똑바로 놓고 15-30분 동안 초음파 처리합니다.
      주의: 이소프로판올과 에탄올은 가연성이며 인화점이 RT 미만입니다. 적절한 크기의 용기를 선택하여 세척 중에 사용되는 용제의 양을 최소화하고, 용기가 느슨하게 덮여 있는지 확인하고, 이 단계에서 초음파 처리 수조를 방치하지 마십시오.
    3. 초음파 검사가 완료되면 이소프로판올 또는 에탄올을 적절하게 폐기하고 모세 혈관을 질소 아래에서 건조시켜 보푸라기가없는 조직으로 취급하십시오.

2. C-star 응축수의 준비 및 추출(그림 2)

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그림 2: C-star 혼합물을 로딩하고 유리 모세관에서 응축수를 추출하는 과정. 모든 패널에서 C-star 혼합물은 가시성을 높이기 위해 25mM 칼세인 수용액으로 대체되었습니다. (A-E) 프로토콜 섹션 2.1 및 2.2에 해당하는 어닐링 전에 수행해야 하는 주요 단계. (F-J) 의정서 단면도 2.3에 해당하는 어닐링 후에 취해야 할 주요 단계. 추출 중(패널(I-J)) 미세 원심분리기 튜브가 수직으로 보관되어 있는 한 DNA 응축물이 모세관에서 완충 저장소로 침전됩니다. 응축수는 육안으로 볼 수 없습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

  1. 단일 성분 응축수를 위한 C-star 혼합물 준비
    참고: 단일 구성 요소의 다양한 설계에 대한 시퀀스 세부 정보는 보충 표 1 및 이전 작업 29,30,32에서 찾을 수 있습니다. 단계 2.1.9 및 2.2.2에서 정의된 느린 어닐링 프로토콜은 nanostar 네트워크(37)의 강하게 온도에 의존하는 유변학적 특성을 감안할 때 nanostar 네트워크를 컴팩트한 형태로 이완시키기 위해 개발되었습니다.
    1. 올리고뉴클레오티드 및 완충액 성분은 원하는 C-star 설계에 따라 달라집니다. 무반응 4군 C-star, TMSD 반응성 C-star 또는 RNA 템플릿 C-star에 대해 5μM 농도의 단일 성분 C-star 응축수 60μL 혼합물을 준비합니다.
    2. 각 설계에 대해 보충 표 2 에 나열된 해당 구성 요소를 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 피펫팅을 통해 완전히 혼합합니다.
      참고: 모든 올리고뉴클레오티드 원액은 TE에서 100μM 농도로 가정합니다.
    3. 그림 2A와 같이 C-star 용액 60μL 전체와 피펫을 조심스럽게 빼내어 기포가 유입되지 않도록 주의하면서 세척되고 건조한 유리 모세관에 혼합물을 주입합니다.
    4. 피펫을 사용하여 약 9-12μL의 미네랄 오일을 모세관의 양쪽 끝에 주입하고 C-star 용액과 공기 사이에 자유 인터페이스가 없도록 샘플을 캡핑합니다( 그림 2B 참조). 그런 다음 티슈 페이퍼로 모세관을 조심스럽게 건조시켜 외부에 오일이 없는지 확인하고(그림 2C) 모세관에서 미네랄 오일이나 C-star 용액을 흡수하지 않도록 주의합니다. 최종 결과는 그림 2D에 나와 있습니다.
    5. 모세관의 각 끝을 평평한 면이 아래로 향하게 하여 유리 덮개 슬립에 부착하기 위해 소량의 두 부분으로 구성된 에폭시 접착제를 준비합니다. 튜브의 개구부가 접착제로 완전히 덮여 그림 2E와 같이 연속 밀봉을 형성하는지 확인합니다.
    6. 최소 3시간 동안 경화되도록 따로 보관하지만 가급적이면 하룻밤 동안 보관하십시오.
    7. ~30분의 경화 후 기포로 인한 씰에 틈이 있는지 접착제 층을 검사합니다. 이러한 항목이 있는 경우 소량의 접착제를 사용하여 밀봉하십시오.
    8. 커버슬립에 접착된 모세관을 은박지로 감싸고 호일이 유리 커버 슬립의 아래쪽에서 평평하게 유지되도록 합니다. 호일은 동일한 것과 열 순환기의 발열체 사이의 양호한 열 접촉을 보장합니다(다음 단계 참조).
    9. 포장된 샘플을 열 순환기에 넣고 다음 프로토콜을 사용하여 어닐링합니다: 95°C에서 30분 동안 유지한 다음 85°C에서 -0.04°C·min-1에서 50°C로 냉각한 다음 50°C에서 -0.5°C·min-1에서 RT로 냉각합니다.
      1. 열 어닐링이 시료를 효과적으로 멸균하고 뉴클레아제를 변성시키므로 모세관이 밀봉된 상태로 유지되는 한 어닐링된 C-star 응축수를 4°C 또는 RT에서 장기간(수개월) 보관하십시오. 보관 및 취급 중에는 모세관을 평평하게 유지하여 응축수가 한쪽 끝으로 침전되어 응집되는 것을 방지하십시오.
  2. 이원 응축수를 위한 C-star 혼합물 준비
    참고: 쌍성계에 대한 C-star 개체군의 선택에 대한 정보를 제공하려면 Malouf et al.의 연구를 참조하여, 이 연구는 쌍성 C-star 응축물(30)의 설계 규칙 및 예상 위상 거동을 설명합니다.
    1. 이원 응축수를 준비하려면 위의 2.1단계에서 설명한 C-star 혼합물 30μL 부피를 총 부피 60μL로 결합하고 철저히 혼합한 다음 모세관에 로드한 다음 2.1.4-2.1.8단계를 따릅니다.
    2. 포장된 샘플을 열 순환기에 넣고 다음 프로토콜을 사용하여 어닐링합니다: 95°C에서 30분 동안 유지한 다음 85°C에서 -0.01°C·min-1에서 40°C로 냉각한 다음 40°C에서 -0.1°C·min-1에서 RT로 냉각합니다.
  3. 모세관에서 C-star 응축수 추출.
    1. TE 버퍼에 60μL의 0.3M NaCl이 들어 있는 대형(1.5mL 또는 2.0mL) 미세 원심분리기 튜브를 준비합니다.
    2. 모세관 샘플의 포장을 풀고 다이아몬드 스크라이빙 펜을 사용하여 접착 영역의 각 안쪽 끝에서 커버슬립의 아래쪽에 점수를 매깁니다(그림 2F). 이 부분의 커버슬립을 떼어내고 적절하게 폐기하십시오.
    3. 모세관을 에탄올로 철저히 청소하고 건조시킵니다.
    4. 다이아몬드 스크라이빙 펜으로 모세관의 각 끝을 먼저 밑면(그림 2G)으로 채점한 다음 튜브를 뒤집어 "오른쪽이 위로" 점수를 매깁니다.
      1. 점수 선이 오일-물 인터페이스와 겹치지 않도록 하십시오. 추출된 샘플에 오일이 남아 있는 것을 방지하기 위해 수성 영역 내에 있어야 합니다.
    5. 모세관의 끝 부분을 떼어내고(그림 2H) 튜브의 중앙 부분을 유지하고 나머지는 버립니다. 절단된 모세관을 2.3.1단계에서 준비한 미세 원심분리기 튜브에 넣고 모세관의 바닥이 완충 용액과 접촉하도록 합니다(그림 2I).
    6. 응축수는 중력을 통해 튜브에서 완충 저장소로 침전됩니다. 이 작업이 최소 10분 동안 수행되도록 합니다(그림 2J). 절단된 모세관을 제거하고 적절하게 폐기하십시오. 이 부드러운 추출 방식은 응축수 응집의 위험을 제한합니다.

3. RNA 템플릿 C-star 응축물에서 RNA 압타머의 전사

참고: 브로콜리 RNA 압타머 생산을 위해서는 디플루오로-4-하이드록시벤질리덴 이미다졸리디논(DFHBI) 용액이 필요합니다 - DFHBI 분말은 먼저 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 10mM의 원액으로 준비한 다음 RNase 및 DNase가 없는 물에서 600μM로 희석합니다.

  1. RNA 템플릿 C-star 응축수 세척
    참고: RNA-템플릿 C-star 응축물은 결합되지 않은 템플릿 올리고뉴클레오티드가 제거되도록 세 번 세척합니다.
    1. 추출된 응축수 용액을 최소 5분 동안 가라앉힌 다음 상층액 부피의 약 절반을 제거합니다.
      1. 60 μL 부피의 추출된 응축수의 경우 25-30 μL의 상층액을 제거합니다.
      2. 이 단계에서 제거되는 응축수의 수를 최소화하기 위해 액체 레벨 상단에서 피펫팅합니다.
    2. TE에 동일한 부피의 0.3M NaCl을 추가하여 제거된 상층액을 교체하고 피펫팅으로 혼합합니다.
    3. 총 3주기 동안 이전 두 단계를 반복합니다.
  2. T7 전사 혼합물의 제조
    참고: T7 전사 혼합물은 CellScript T7-FlashScribe 전사 키트를 사용하여 준비됩니다. 3.2.2단계는 제조업체 프로토콜의 수정이며, 이는 여기에서 찾을 수 있습니다38. 여기에서는 결합 시 DFHBI에서 형광을 유도하는 Broccoli RNA aptamer의 전사에 대해 설명합니다. 다른 라이트업 압타머의 경우 3.2.2단계에서 설명한 DFHBI의 부피를 적절한 플루오로겐으로 교체합니다. 다른 대본의 경우 이 구성 요소를 완전히 제거합니다.
    1. DMSO에서 10mM DFHBI의 원액을 준비한 다음 RNase 및 DNase가 없는 물을 사용하여 부분 표본을 600μM의 최종 농도로 희석합니다.
    2. 전사 키트 구성 요소를 얼음으로 해동한 다음 멸균 피펫 팁을 사용하여 실온에서 다음을 오토클레이브 마이크로 원심분리기 튜브에 피펫팅합니다: 10x T7-전사 완충액 2μL(전사 키트에 제공), 100mM ATP 1.8μL, 100mM CTP 1.8μL, 100mM UTP 1.8μL, 100mM GTP 1.8μL, 100mM DTT 2μL, 600μM DFHBI 2μL, RNase inhibitor 0.5μL, T7 효소 용액 2μL(전사 키트에 제공).
    3. 피펫팅으로 용액을 부드럽게 혼합합니다.
    4. 준비 직후 3.3단계(RNA 전사체 합성)에 전사 혼합물을 사용합니다.
  3. RNA transcript의 합성
    1. 현미경 이미징에 적합한 챔버에 RNA 템플릿 C-star에서 준비된 세척된 응축수 3.3μL를 피펫팅하고 이전에 준비된 전사 혼합물의 총 부피를 추가합니다.
    2. 18시간 동안 현미경 이미지를 획득하며, 전사 혼합물을 응축수에 첨가한 직후부터 시작합니다.
      참고: 현미경 검사는 준비된 시스템에 따라 다릅니다. 샘플의 모든 형광단에 대해 적절한 excitation 및 emission 설정이 사용되었는지 확인하고, transcription이 진행됨에 따라 포화로 이어지지 않는 노출 시간을 보장해야 합니다. 모든 타임랩스의 경우, 양호한 신호를 얻기 위해 충분히 높은 레이저 또는 LED 출력 사이에서 절충점을 찾는 동시에 광퇴색의 위험을 최소화해야 합니다. 장기간에 걸친 광퇴색은 레이저 기반 시스템에 비해 LED 기반 시스템에서 최소화됩니다. 제안된 이미징 간격: 처음 2시간 동안 20분, 이후 30분.

결과

어닐링 후 C-star 응축수는 모세관에서 직접 이미징하거나 추출 후에 형성을 확인할 수 있습니다. 모든 C-star 설계 변형에 대해 직경이 약 10-50 μm인 뚜렷한 구형 또는 다면체 응축수를 관찰해야 하며, 후자는 결정화가 발생할 때 형성됩니다28,32. 단일 성분 응축수의 경우 응축수는 불연속적이고 외관이 균일해야 하며 사용된 C-star 설계에 따라 다면체(그림 3A) 또는 구형(그림 3B,C)으로 나타날 수 있습니다. 이원 응축물의 형태는 이전에 설명한 바와 같이 사용된 C-star 개체군의 특성에 따라 달라집니다30. 그림 3D는 명시야 이미징에서 관찰할 수 있는 상 분리가 예상되는 이진 응축수를 보여줍니다. 모세관에 기포가 있으면 응축수의 자체 조립을 방해할 수도 있으며, 이로 인해 공기 인터페이스 근처에 응집이 발생하는 경우가 많습니다(그림 4A, B). 올리고뉴클레오티드 성분이 결핍된 혼합물 또는 불균형한 화학량론으로 제조된 혼합물과 같이 잘못 제조된 혼합물은 응축물이 전혀 형성되지 않거나 그림 4C와 같이 비구형 연결 네트워크 또는 응집체를 형성할 수 있습니다. 마찬가지로, 잘못 준비된 이원 응축물은 응집과 네트워크를 나타낼 수 있으며, 그림 4D와 같이 관찰 가능한 상 분리를 나타내지 않을 수도 있습니다.

RNA 라이트업 압타머의 전사를 위해 현미경(그림 5) 또는 분광광도법 등을 통해 시간 경과에 따른 형광의 증가를 모니터링하여 성공적인 결과를 관찰할 수 있습니다.

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그림 3: 어닐링된 C-star 응축수를 보여주는 대표적인 현미경 사진. (A) 암 길이가 28 염기쌍인 무반응 C-star로 형성된 응축수를 보여주는 명시야 현미경 사진 및 삽입물. 여기서 우리는 더 작은 C-별(32)의 결정 순서를 반영하는 다면체 형태에 주목한다. (B) 암 길이가 50 염기쌍인 TMSD 반응 C-star로 형성된 응축수를 보여주는 명시야 현미경 사진 및 삽입물. 이들 응축물은 대체로 구형이지만, 많은 응축물이 여러 개의 응축수가 합쳐지는 것을 나타내는 더 불규칙한 형태를 보여주는데, 이는 더 유동적인 경향이 있는 더 큰 C-별에서 예상되는 것처럼보인다(32). (C) 암 길이가 35 염기쌍인 무반응 C-star로 형성된 응축수를 보여주는 명시야 현미경 사진 및 삽입물. 이러한 응축물은 구형으로 보이지만, 이전 연구의 작은 각도의 X선 산란 데이터는 그들의 미세 구조가 결정질32임을 보여줍니다. (D) 패널 (B) 및 (C)에서도 사용되는 C-star 개체군의 조합으로 형성된 이원 응축물을 보여주는 명시야 현미경 사진 및 삽입물. 이 두 집단의 결합은 형광 라벨링 없이 볼 수 있는 뚜렷한 상 분리를 가진 응축물을 형성합니다. 다른 조합은 선행 작업(30)에서 설명한 바와 같이 상 분리를 나타내지 않을 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 잘못 준비된 응축수에서 발생하는 일반적인 문제를 보여주는 현미경 사진. (A) 모세관에 기포가 있는 상태에서 암 길이가 28 염기쌍( 그림 3A에서 성공적으로 형성됨)의 암 길이를 가진 무반응 C-star로 형성된 응축수를 보여주는 명시야 현미경 사진. 이 패널은 빨간색 점선으로 스티칭된 두 개의 현미경 사진으로 구성되며 공기 인터페이스 근처의 응축수 응집을 보여줍니다. (B) 모세관에 기포가 있는 상태에서 암 길이 50 염기쌍( 그림 3B에서 성공적으로 형성됨)의 TMSD 반응성 C-star로 형성된 응축수를 보여주는 명시야 현미경 사진. 여기서, 응축물들은 더 큰 C-스타 모티프(32)로 구성된 응축수의 보다 유동적인 성질로 인해 연속적인 상호 연결된 네트워크를 형성하기 위해 병합되었다. (C) 암 길이가 35 염기쌍인 무반응 C-star에서 형성된 응축수를 보여주는 명시야 현미경 사진( 그림 3C에서 성공적으로 형성됨). 형태는 불규칙하고 각이 져 있어 준비 오류, 불균형한 화학량론을 나타낼 수 있습니다. (D) Fig. 3D에서와 같이 C-star 개체군의 조합으로 형성된 이진 응축물의 명시야 현미경 사진. 이러한 응축수는 패널 (C)에서와 같이 고도로 연결되어 있으며 예상되는 상 분리( 그림 3D 참조)를 나타내지 않아 준비 시 오류가 있음을 나타냅니다. 오류의 정확한 원인을 찾아내기는 어렵지만, 잘못된 화학량론 또는 잘못된 올리고뉴클레오티드 서열의 사용이 잠재적인 원인일 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: RNA 압타머에 대한 임베디드 DNA 템플릿의 전사에서 얻은 대표적인 결과. 그림 1C에 설명된 C-star 모티브로 만든 응축물에 내장된 DNA 템플릿의 전사를 통한 브로콜리 라이트업 압타머의 합성을 보여주는 타임랩스. 압타머는 전사 혼합물에 존재하는 DFHBI에 결합하여 시간이 지남에 따라 형광을 증가시킵니다. 여기서 주목할 만한 것은 시간이 지남에 따라 응축수의 형태가 변화한다는 것인데, 이는 코어-쉘 구조를 형성하는 것으로 보입니다. 이 현상은 RNA 압타머의 국소 생산과 관련된 일시적인 삼투압 불균형으로 인한 응축수의 외부 층의 팽창 때문일 수 있습니다. 압타머 생산은 압타머 템플릿 스트랜드가 이 영역(30)에 축적되는 보고된 경향으로 인해 응축물의 외층에서 우선적으로 발생할 수 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 단일 구성 요소의 다양한 설계에 대한 시퀀스 세부 정보. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 2: 각 설계에 대한 구성 요소의 부피. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 설명된 프로토콜은 양친매성 DNA 나노별에서 1개 또는 2개 성분의 응축물을 제조하기 위한 접근 방식을 제공하며, 응축물에 다양한 반응을 도입하기 위한 설계 변형을 제공합니다. 주어진 프로토콜은 TE에서 0.3M NaCl의 완충 용액에서 응축수를 생성하지만 위에 나열된 부피를 적절하게 수정하여 완충 조건을 수정할 수 있습니다. 이전 연구에서는 TE의 0.2M NaCl 및 TE의 0.1M NaCl 및 인산염 완충 식염수(PBS)32에서 C-star 응축수의 형성을 연구했습니다. C-star 응축물은 5μM의 말단 농도에서 생성되지만, 이 농도 역시 위 프로토콜에 추가된 올리고뉴클레오티드 농도 및/또는 부피를 적절하게 수정하여 변경할 수 있습니다. 원하는 변형에 따라, 프로토콜의 실제 측면은 동일하게 유지되지만, 섹션 1에 설명된 프로토콜과 비교하여 다른 농도와 다른 완충액으로 올리고뉴클레오티드 스톡 용액을 준비해야 할 수도 있습니다. C-star 디자인은 이전 작업32에서 자세히 설명한 바와 같이 다른 기능이나 응답을 도입하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다. 디자인 변형에는 pH 변화(32), 칼륨 이온(31) 또는 올리고뉴클레오티드 서열(30,32)에 반응하는 모티프의 도입이 포함됩니다. 새로운 디자인이 필요한 경우, 먼저 어셈블리를 계산적으로 테스트하고(NUPACK39와 같은 도구를 사용하여) 아가로스 겔 전기영동(32,40)을 사용하여 등가물, 비콜레스테롤화된 나노스타의 형성을 테스트하는 것이 좋습니다. 이원 응축물에서 상 분리의 정도는 이전 작업30에서 설명한 바와 같이 사용된 C-star 집단의 조합에 따라 달라집니다. 응축수 형성을 위해 지정된 어닐링 프로토콜은 개별 C-star와 유사한 작은 DNA 나노 구조를 접는 데 일반적인 것보다 훨씬 더 긴 시간 척도를 필요로 합니다. 느린 어닐링은 실제로 응축수의 더 큰 길이 스케일에 걸쳐 평형을 가능하게 하기 위해 필요합니다. 단일 성분 응축수의 경우 제안된 프로토콜의 지속 시간은 17시간이며, 이원 응축수의 경우 열역학적 평형에 접근하기 위해 훨씬 더 긴 어닐링 프로토콜(~3일)이 사용됩니다. 우리는 이러한 프로토콜이 현재까지 사용된 모든 다른 C-star 집단에서 재현 가능한 결과를 산출한다는 것을 발견했지만, 연구자가 샘플 처리량을 개선하고자 하는 경우 테스트 중인 시스템에 대해 원하는 형태를 달성할 수 있는 가능한 가장 짧은 프로토콜을 찾기 위해 어닐링 속도를 조절하는 체계적인 연구를 권장합니다. 95°C에서 30분 동안 유지되는 것은 수정하지 않은 상태로 두는 것이 좋은데, 이 단계는 시료를 효과적으로 멸균하고 모세관에 장기간 보관할 수 있기 때문입니다.

C-star 응축수가 생성되는 챔버는 성공적인 응축수의 형성에 매우 중요합니다. 챔버는 유리 또는 석영으로 만들어야합니다. 마이크로 원심분리기 튜브의 일반적인 재료인 폴리프로필렌과 같은 플라스틱 용기를 사용하면 플라스틱과 콜레스테롤 부분 사이의 소수성 상호 작용으로 인해 자체 조립이 중단됩니다. 어닐링 용기의 종횡비와 C-star 혼합물의 농도도 응축수의 특성, 특히 응집물의 크기와 응집력에 영향을 미칩니다. 특히, 높이에 비해 바닥의 표면적이 작은 "더 높은" 용기를 사용하는 경우 C-star 응축수는 표면 밀도가 높은 바닥에 침전되어 응축수 간의 접점 형성에 유리합니다. 온도가 상대적으로 낮고 응축수가 점성이 높은 액체 또는 고체로 작용할 때 열 어닐링 공정 후반에 이러한 현상이 발생하는 경우, 응축수를 만지면 응축수가 구형으로 이완되지 않고 부분적으로 합쳐진 구성의 불규칙한 응집체를 형성합니다. C-star 혼합물을 모세관에 피펫팅할 때 기포가 유입되지 않도록 주의해야 합니다 - 큰 응집체는 공기/물 계면에서 형성되는 경향이 있으므로 추출된 응축수는 이상적이지 않은 크기와 형태를 가질 수 있습니다. C-star 혼합물 또는 미네랄 오일을 주입한 후 모세관 끝부분을 건조시키면 접착력이 향상됩니다. 선택한 접착제는 모세관 개구부를 튜브 내부로 완전히 코팅할 수 있을 만큼 점성이 있어야 하고, 미네랄 오일에 불활성이어야 하며, 유리와 호환되고, 사용된 어닐링 온도에서 안정적이어야 합니다. 우리는 두 부분으로 구성된 Araldite Rapid 에폭시 접착제가 80 °C의 온도에만 등급이 매겨졌음에도 불구하고 우리의 목적에 적합하다는 것을 발견했습니다. 접착제의 기포나 틈은 불완전하게 밀봉된 모세관으로 이어져 어닐링 중에 누출되는 경향이 있습니다. 접착제가 경화된 후 샘플을 알루미늄 호일로 감싸면 누출을 방지하고 샘플과 열 순환기 사이의 열 접촉을 개선하는 이중 이점이 있습니다. 호일은 어닐링 중에 모세관이 수평을 유지할 수 있도록 가능한 한 매끄럽고 평평하게 유지해야 합니다. 모세관의 어닐링된 응축수는 실온에서 장기간 보관할 수 있으며 필요한 경우 다시 어닐링할 수 있습니다. 샘플은 조심스럽게 다루어야 합니다 - 응축수가 접촉할 때 합쳐질 가능성이 있으므로 모세관은 평평하게 보관해야 합니다. 최적의 현미경 이미징을 위해 모세관을 그대로 유지하면서 커버슬립을 점수를 매기고 제거할 수 있습니다. 응축수는 직경이 5μm보다 큰 경향이 있으며 이미징29,30 중에 중요한 브라운 운동이 관찰되지 않았습니다.

C-star 응축수의 여러 개의 독립적인 배치를 준비하여 샘플 간에 관찰될 수 있는 차이가 잠재적인 실험 오류로 인한 차이가 아니라 조성 또는 어닐링 조건의 차이를 반영하도록 하는 것이 좋습니다.

작은 유리 입자는 추출 공정의 결과로 응축수 용액에 유입될 수 있습니다. 절단된 모세관을 완충 용액이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브에 넣기 전에 유리를 집어 올리는 데 매우 효과적인 깨끗한 파라필름 스트립으로 모세관의 절단된 끝을 조심스럽게 두드려 이러한 문제를 최소화할 수 있습니다. 추출하는 동안 절단된 모세관이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브를 잠시 회전시켜 추출되는 응축수의 수를 최대화할 수 있지만, 이렇게 하면 응축수가 합쳐져 이상적이지 않은 형태를 형성할 가능성이 높아집니다. 추출 후 응축수는 냉장고 온도(일반적으로 4°C)에서 보관해야 하며 생물학적 오염과 관련된 잠재적인 문제를 방지하기 위해 3일 이내에 사용해야 하며, 미세 원심분리기 튜브의 응축수는 일반적으로 둥글거나 뾰족한 모양으로 인해 시간이 지남에 따라 응집되고 합쳐지기 때문입니다. 추출된 응축수의 매우 격렬한 피펫팅은 과도한 전단 흐름으로 인해 손상될 수 있으므로 피해야 합니다.

RNA 압타머의 전사를 위해서는 각 개별 반응에서 응축물의 수와 크기(따라서 주형의 농도)를 정확하게 제어할 수 없기 때문에 사용되는 전사 혼합물의 부피를 수정해야 할 수 있습니다. 섹션 3에 설명된 실험에서는 이론적 템플릿 농도에 비해 과도한 전사 혼합물이 사용됩니다. 세 가지 세척 단계(섹션 3.1)의 상층액을 유지하고 전사 반응을 수행하는 데 사용하는 것이 좋습니다. 이 실험은 용액에 존재하는 결합되지 않은 압타머 템플릿의 양을 나타냅니다.

C-star 플랫폼의 주요 장점 중 하나는 유연성과 모듈성입니다. 위에서 설명한 바와 및 이전 연구에서 설명한 바와 같이, 응축수는 토홀드 매개 가닥 변위 및 RNA 압타머 전사와 같은 다양한 입력에 개별적으로 또는 순차적으로 반응하도록 설계할 수 있습니다. DNA 구성 요소의 고유한 프로그래밍 가능성과 결합된 양친매성 DNA 나노스타는 합성 세포의 설계 및 준비를 위한 강력하고 다재다능한 솔루션을 제공합니다.

공개 사항

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

LM, LDM 및 DT는 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(ERC-STG No 851667 - NANOCELL)에 따른 유럽 연구 위원회(ERC)의 지원을 인정합니다. LDM은 Royal Society Research Grant for Research Fellows(RGF/R1/180043)와 Royal Society University Research Fellowship(UF160152, URF/R/221009)의 지원을 인정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 &무; m 주사기 필터Sigma-AldrichSLGVR33RB
24 x 60 mm #1.5 직사각형 커버 안경, Menzel Gl ä serVWR631-0853
2-프로판올Sigma-Aldrich34683
6L 초음파 세척기, 디지털 타이머 및 가열 기능, 230VACCole-ParmerWZ-08895-11
Araldite Rapid Adhesive 2액형 에폭시 접착제RSARA-400005
Bio-Rad C1000 열 순환기Bio-Rad1851197
브랜드 마이크로 원심분리기 튜브 2 잠금 뚜껑이 있는 mLFisher Scientific15338665C-star 응축수 추출용 2 mL 마이크로 원심분리기 튜브
다이아몬드 스크라이빙 펜RS394-217
디플루오로-4-하이드록시벤질리덴 이미다졸리디논(DFHBI)시그마-알드리치SML1627
디메틸 설폭사이드(DMSO)시그마-알드리치472301
Eppendorf PCR Clean Colorless Safe-Lock 원심분리기 튜브Fisher Scientific0030123301C-star 혼합물 준비를 위한 0.5mL 마이크로 원심분리기 튜브
에탄올 절대 99.8+%Fisher Scientific1043734170% 에탄올은 세척 목적으로 충분합니다
Fisherbrand ZX4 IR Vortex MixerFisherbrand13284769
Hellmanex IIIHellma9-307-011-4-507
중공 직사각형 모세 모세 나무 ID 0.40 x 4.00 mm, 길이 50 mmCM Scientific2540-50
미네랄 오일Sigma-Aldrich69794
미니 원심 분리기, 230 VPRISM(TM)
NaClSigma-AldrichS3014
NanoDrop One 분광 광도계Thermo Fisher ScientificND-ONE-W농도 계산을 위해 올리고뉴클레오티드의 흡광도를 측정하는 데 사용되는
올리고뉴클레오티드통합 DNA 기술맞춤형올리고뉴클레오티드 염기서열은 필요한 C-star 설계에 고유합니다.
ScriptGuard RNase 억제제CELLSCRIPTC-SRI6310KRNase 억제제
T7-FlashScribe 전사 키트CambioC-ASF3507
Tris-EDTA 완충액, 100x 원액Sigma-Aldrich574793
UltraPure DNase/RNase-Free 증류수Invitrogen10977035
VWR Spec-Wipe 3 와이퍼VWR21914-758
Z763128

참고문헌

  1. Buddingh', B. C., Hest, J. C. M. v Artificial cells: Synthetic compartments with life-like functionality and adaptivity. Acc Chem Res. 50 (4), 769-777 (2017).
  2. Fanalista, F., et al. Shape and size control of artificial cells for bottom-up biology. ACS Nano. 13 (5), 5439-5450 (2019).
  3. Dora Tang, T. -Y., et al. Fatty acid membrane assembly on coacervate microdroplets as a step towards a hybrid protocell model. Nat Chem. 6 (6), 527-533 (2014).
  4. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nat Commun. 10 (1), 1800(2019).
  5. Rubio-Sánchez, R., et al. Thermally driven membrane phase transitions enable content reshuffling in primitive cells. J Am Chem Soc. 143 (40), 16589-16598 (2021).
  6. Jahnke, K., Huth, V., Mersdorf, U., Liu, N., Göpfrich, K. Bottom-up assembly of synthetic cells with a DNA cytoskeleton. ACS Nano. 16 (5), 7233-7241 (2022).
  7. Tran, M. P., et al. A DNA segregation module for synthetic cells. Small. 19 (13), 2202711(2023).
  8. Mason, A. F., Buddingh', B. C., Williams, D. S., Hest, J. C. M. v Hierarchical self-assembly of a copolymer-stabilized coacervate protocell. J Am Chem Soc. 139 (48), 17309-17312 (2017).
  9. Gumz, H., et al. Toward functional synthetic cells: In-depth study of nanoparticle and enzyme diffusion through a cross-linked polymersome membrane. Adv Sci. 6 (7), 1801299(2019).
  10. Huang, X., Patil, A. J., Li, M., Mann, S. Design and construction of higher-order structure and function in proteinosome-based protocells. J Am Chem Soc. 136 (25), 9225-9234 (2014).
  11. Booth, R., Qiao, Y., Li, M., Mann, S. Spatial positioning and chemical coupling in coacervate-in-proteinosome protocells. Angew Chem Int Ed Engl. 58 (27), 9120-9124 (2019).
  12. Hindley, J. W., et al. Light-triggered enzymatic reactions in nested vesicle reactors. Nat Commun. 9 (1), 1093(2018).
  13. Zubaite, G., Hindley, J. W., Ces, O., Elani, Y. Dynamic reconfiguration of subcompartment architectures in artificial cells. ACS Nano. 16 (6), 9389-9400 (2022).
  14. Hirose, T., et al. A guide to membraneless organelles and their various roles in gene regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (4), 288-304 (2023).
  15. Guindani, C., Silva, L. C. d, Cao, S., Ivanov, T., Landfester, K. Synthetic cells: From Simple Bio-Inspired Modules to Sophisticated Integrated Systems. Angew Chem Int Ed Engl. 61 (16), e202110855(2022).
  16. Adamala, K. P., et al. Present and future of synthetic cell development. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (3), 162-167 (2023).
  17. Allen, M. E., et al. Biomimetic behaviors in hydrogel artificial cells through embedded organelles. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (35), e2307772120(2023).
  18. Cook, A. B., Novosedlik, S., Hest, J. C. M. v Complex coacervate materials as artificial cells. Acc Mater Res. 4 (3), 287-298 (2023).
  19. Seeman, N. C., Sleiman, H. F. DNA nanotechnology. Nat Rev Mater. 3, 17068(2018).
  20. Takinoue, M. DNA droplets for intelligent and dynamical artificial cells: from the viewpoint of computation and non-equilibrium systems. Interface Focus. 13 (5), 20230021(2023).
  21. Liu, W., Lupfer, C., Samanta, A., Sarkar, A., Walther, A. Switchable hydrophobic pockets in DNA protocells enhance chemical conversion. J Am Chem Soc. 145 (13), 7090-7094 (2023).
  22. Wilner, O. I., Willner, I. Functionalized DNA nanostructures. Chem Rev. 112 (4), 2528-2556 (2012).
  23. Gong, J., Tsumura, N., Sato, Y., Takinoue, M. Computational DNA droplets recognizing miRNA sequence inputs based on liquid-liquid phase separation. Adv Funct Mater. 32, 2202322(2022).
  24. Jeon, B. -J., Nguyen, D. T., Saleh, O. A. Sequence-controlled adhesion and microemulsification in a two-phase system of DNA liquid droplets. J Phys Chem. 124 (40), 8888-8895 (2020).
  25. Sato, Y., Sakamoto, T., Takinoue, M. Sequence-based engineering of dynamic functions of micrometer-sized DNA droplets. Sci Adv. 6 (23), 3471(2020).
  26. Saleh, O. A., et al. Vacuole dynamics and popping-based motility in liquid droplets of DNA. Nat Commun. 14 (1), 3574(2023).
  27. Rubio-Sánchez, R., Fabrini, G., Cicuta, P., Michele, L. D. Amphiphilic DNA nanostructures for bottom-up synthetic biology. Chem Commun. 57 (95), 12725-12740 (2021).
  28. Brady, R. A., Brooks, N. J., Cicuta, P., Di Michele, L. Crystallization of amphiphilic DNA C-Stars. Nano Lett. 17 (5), 3276-3281 (2017).
  29. Leathers, A., et al. Reaction-diffusion patterning of DNA-based artificial cells. J Am Chem Soc. 144 (38), 17468-17476 (2022).
  30. Malouf, L., et al. Sculpting DNA-based synthetic cells through phase separation and phase-targeted activity. Chem. 9 (11), 3347-3364 (2023).
  31. Fabrini, G., Minard, A., Brady, R. A., Antonio, M. D., Michele, L. D. Cation-responsive and photocleavable hydrogels from noncanonical amphiphilic DNA nanostructures. Nano Lett. 22 (2), 602-611 (2022).
  32. Brady, R. A., Brooks, N. J., Foderà, V., Cicuta, P., Di Michele, L. Amphiphilic-DNA platform for the design of crystalline frameworks with programmable structure and functionality. J Am Chem Soc. 140 (45), 15384-15392 (2018).
  33. Walczak, M., et al. Responsive core-shell DNA particles trigger lipid-membrane disruption and bacteria entrapment. Nat Commun. 12 (1), 4743(2021).
  34. Zhang, D. Y., Winfree, E. Control of DNA strand displacement kinetics using Toehold exchange. J Am Chem Soc. 131 (47), 17303-17314 (2009).
  35. Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/pages/products/custom-dna-rna/dna-oligos/custom-dna-oligos (2024).
  36. Cavaluzzi, M. J., Borer, P. N. Revised UV extinction coefficients for nucleoside-5'-monophosphates and unpaired DNA and RNA. Nucleic Acids Res. 32 (1), e13(2004).
  37. Lattuada, E., Caprara, D., Piazza, R., Sciortino, F. Spatially uniform dynamics in equilibrium colloidal gels. Sci Adv. 7 (49), (2021).
  38. T7-FlashScribeTM Transcription Kit. , Available from: https://www.cellscript.com/products/018pl0617CS.pdf (2017).
  39. Zadeh, J. N., et al. NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. J Comput Chem. 32 (1), 170-173 (2011).
  40. Walczak, M., Brady, R. A., Leathers, A., Kotar, J., Di Michele, L. Influence of hydrophobic moieties on the crystallization of amphiphilic DNA nanostructures. The Journal of Chemical Physics. 158 (8), 084501(2023).

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