방법 논문

인간 장 오가노이드를 사용하여 단세포 전사 수준에서 소장 상피를 이해합니다.

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DOI:

10.3791/66749

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2024년 6월 28일

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1Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 인간 장 오가노이드 기술과 단일 세포 전사체 분석을 결합하여 이전에 탐구되지 않은 장 생물학에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

초록

단일 세포 전사체학은 인체의 세포 생물학에 대한 우리의 이해에 혁명을 일으켰습니다. 최첨단 인간 소장 오가노이드 배양은 동물 모델과 임상 연구 간의 격차를 해소하는 체외 모델 시스템을 제공합니다. 인간 장 오가노이드(HIO) 모델에 단세포 전사체학을 적용하면 이전에는 알려지지 않았던 위장관의 세포 생물학, 생화학 및 생리학이 밝혀지고 있습니다. 고급 단일 세포 전사체학 플랫폼은 미세유체 분할 및 바코드를 사용하여 cDNA 라이브러리를 생성합니다. 이러한 바코드 cDNA는 차세대 염기서열분석 플랫폼에서 쉽게 염기서열 분석을 수행할 수 있으며 다양한 시각화 도구에서 맵을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 다양한 형식의 인간 소장 HIO를 배양하고 분화하는 방법과 단일 세포 전사 프로파일링 플랫폼에 사용하기에 적합한 이러한 형식에서 생존 가능한 세포를 분리하는 절차에 대해 설명합니다. 이러한 프로토콜과 절차는 소장 HIO의 사용을 용이하게 하여 다양한 환경의 맥락에서 전사 수준에서 인간 장 상피의 세포 반응에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

서론

소장 상피는 장 줄기 세포(ISC)를 수용하는 소낭(crypt)과 분비 및 흡수 계통의 분화된 세포로 구성된 융모(villus)의 두 가지 뚜렷한 영역을 가지고 있습니다. 이러한 복잡성을 더하는 것은 소장의 영역 간에 고유한 기능적 특성을 제공하는 상피의 지역적 특이성입니다. 선구적인 연구는 수술 조직 또는 조직 생검에서 인간 소장 분뇨관(human small intestinal crypt)과 융모 영역(villus zone)을 모두 생체 외(ex vivo )로 생성할 수 있는 배양 조건을 확립했다1. 이러한 배양은 동물 연구와 임상 시험 사이의 격차를 해소하고 있으며 이전에는 알려지지 않은 세포 생물학, 생화학 및 위장관의 생리학을 밝히고 있습니다. HIO는 줄기 세포 생존력과 세포 외 지지 매트릭스를 촉진하는 성장 인자가 있는 배지를 사용하여 3D 구형 구조로 증식됩니다. 이러한 조건으로 인해 대부분 전구 세포와 줄기 세포로 구성된 crypt와 같은 HIO 모델이 생성됩니다. 성장 인자를 제거하면 ISC 분화(융모 유사 모델) 및 세포 증식 및 분화, 분극, 장벽 무결성, 국소적 특이적 특징 및 적절한 생리적 반응과 함께 적절한 비율로 성숙한 장 상피 세포(잔, 장내분비, 터프트, 장세포)의 생산을 촉진합니다2. HIO 배양은 유전적으로 안정적이며 크립트와 같은 상태로 무기한으로 증식될 수 있습니다. 이러한 배양물의 정점 표면에 쉽게 접근할 수 있는 것은 단층 형식으로 성장할 수 있는 배양 조건에 의해 제공된다3. HIO는 또한 유전학, 연령, 성별, 인종 및 질병 상태와 같은 숙주의 개별 다양성에 대한 고려 사항을 생물학적 분석에 포함할 수 있도록 합니다. 분석 및 기능 평가 도구는 형질전환된 세포주에 중점을 둔 접근법에 사용되는 도구와 동일하며 유세포 분석, 현미경, 전사체학, 단백질체학 및 대사체학과 같은 다양한 분자 기술을 포함합니다.

단일 세포 전사체학은 생물학적 과정에 대한 각 세포 유형의 개별 기여도에 대한 통찰력을 제공함으로써 소장의 생물학 및 생리학에 대한 우리의 이해에 혁명을 일으키고 있습니다. 이 기술을 사용한 선구적인 연구는 인간 내장 4,5,6에 존재하는 세포 유형의 풍경을 제공했습니다. 단일 세포 전사 프로파일링 플랫폼을 사용하면 개별 세포의 전사 환경을 탐색할 수 있으므로 세포 이질성이 과학적 탐구의 최전선에 서게 됩니다. 일부 단일 세포 전사 프로파일링 플랫폼에서는 미세유체 분할 및 바코드를 사용하여 샘플당 최대 10,000개의 세포에서 얻은 세포 폴리아데닐화 mRNA에서 cDNA 라이브러리를 생성합니다. 이 플랫폼에서 단일 세포, 바코드화된 올리고뉴클레오티드, 역전사 시약 및 오일을 포함하는 액적은 반응 소포를 형성하여 단일 세포의 모든 cDNA가 동일한 바코드를 갖게 합니다. 그런 다음 바코드화된 cDNA를 차세대 염기서열분석을 사용하여 효율적으로 염기서열분석할 수 있습니다. 생성된 데이터는 소프트웨어 및 시각화 도구를 통해 처리할 수 있으며, 바코드 처리된 시퀀스를 시각화 맵 및 단일 세포 전사 프로필로 변환합니다. 세포 집단은 인간 소장 상피 4,5,6의 공개적으로 사용 가능한 데이터베이스를 사용하여 식별할 수 있습니다. 많은 연구에서 이 플랫폼을 사용하여 단일 세포 수준에서 쥐 장 오가노이드를 조사했지만 HIO의 단일 세포 전사 반응 분석은 7,8,9,10,11,12보다 뒤처져 있습니다.

여기에서는 단일 세포 전사 프로파일링 플랫폼에서 처리하기 위해 소장 HIO에서 생존 가능한 세포를 분리하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제공합니다(그림 1). 당사는 상피 분화에 최적화된 배지 구성 요소와 함께 배양 및 분화 지침을 제공합니다. 세 가지 다른 배양 형식, 즉 플라스틱 또는 막 세포 배양 삽입물에서 3차원(3D) 및 단층 배양에 대한 세포 회수 방법을 간략하게 설명합니다. 각 클러스터에서 차등적으로 발현된 유전자를 도출하기 위해 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 얻은 샘플 클러스터링 데이터를 제공합니다.

프로토콜

여기에 사용된 오가노이드 라인은 Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core에서 얻은 것입니다. 간단히 말해서, 초기에 오가노이드 라인을 확립하기 위해 기증자 조직 샘플을 세척하고 효소로 분해하여 장 퇴적물을 방출했습니다. 크립트는 기저막에 매립되어 배지에서 배양되었습니다. Baylor College of Medicine의 Institutional Review Board는 오가노이드 라인이 설정된 조직 샘플을 얻기 위한 연구 프로토콜을 승인했으며, 기증된 조직에서 오가노이드 라인을 구축하기 위해 모든 기증자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다.

1. 차별화를 위한 3D HIO의 Passaging 확장

  1. P1000 피펫을 사용하여 24웰 플레이트(단단한 기저막 주변)에서 성장한 오가노이드 웰에서 배지를 제거하고 폐기합니다. 웰에 300μL의 0.05% 트립신-EDTA를 추가하고 P1000 피펫으로 위아래로 5회 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 분해합니다.
  2. 플레이트를 37°C에서 4분 동안 배양합니다. 성장 인자가 없는 완전한 배지 500μL(CMGF-배지)와 10% FBS를 각 웰에 추가합니다(표 1). P1000 피펫 및 피펫 CMGF 배지 및 HIO 혼합물을 웰에서 앞뒤로 10번 사용합니다. 전체 부피를 15mL 튜브에 옮깁니다. 여러 웰의 통로를 동일한 15mL 튜브에 결합합니다. 튜브당 10개 이상의 웰을 결합하지 마십시오.
  3. 4°C에서 100 x g 의 스윙 로터 원심분리기를 사용하여 5분 동안 세포를 스핀다운합니다. 펠릿을 튜브 바닥에 유지하면서 모든 매체를 제거합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
  4. 도금된 HIO 수에 필요한 기저막의 양을 계산하고 냉간 P200 피펫 팁을 사용하여 HIO 펠릿을 기저막의 30μL/웰에 재현탁시킵니다. 차가운 P24 피펫 팁을 사용하여 HIO 기저막 혼합물을 200웰 플레이트 중앙에 액적처럼 피펫팅합니다.
  5. 플레이트를 37°C 인큐베이터로 옮깁니다. 기저막을 5-10분 동안 응고시킨 다음 WNT, R-spondin, noggin, EGF 및 ROCK 억제제(WRNE+Y; 표 1) 37 °C 인큐베이터에서 각 웰과 배양. 7일 동안 격일로 WRNE+Y로 문화권을 새로 고칩니다.
    참고: 건강한 HIO는 반짝이는 싹이 트는 상피를 가진 낭포성 모양입니다(그림 2). 낭종 중간에 있는 세포는 시각화할 수 없습니다. 건강하지 않은 HIO는 둔해 보이고 중간이 단단한 두꺼운 상피를 가지고 있습니다. 가장 중요한 특징은 반짝이는 외관입니다.

2. HIO 차별화 : 3D 형식

  1. 배양 후 1주일 후에 3D 분화된 HIO 3웰 3개에 대해 3D HIO 1웰을 사용합니다.
  2. 웰에서 미디어를 제거합니다. P1000 피펫을 사용하여 기저막과 HIO를 분산시키고 웰당 500μL의 CMGF-를 콜드하고 피펫을 위아래로 5배 이상 추가합니다. 4 x g 에서 스윙 로터 원심분리기를 사용하여 5분 동안 100 °C에서 HIO를 스핀다운합니다. 펠릿을 튜브 바닥에 고정하는 모든 매체를 제거합니다.
  3. 도금되는 HIO의 웰당 30μL의 기저막을 추가합니다. HIO가 있는 기저막의 30μL 방울을 24웰 플레이트의 웰에 피펫팅합니다. 37°C에서 10분 동안 배양합니다. 500μL의 WRNE+Y/Diff(50/50) 매체를 추가합니다.
  4. 24시간 후 배지를 분화 배지로 전환하고 추가로 3일 동안 이틀에 한 번씩 배지를 새로 고칩니다. 기술적 변동성을 줄이기 위해 샘플당 3개의 웰을 준비하여 풀링합니다.

3. HIO 차별화 : 단층 형식

  1. 96웰 플레이트의 멤브레인 세포 배양 삽입물 또는 웰을 차가운 H2O(1:30)에 희석한 인간 태반 콜라겐 IV(100mM 아세트산에서 1mg/ml)의 100μL/웰로 코팅합니다. 37°C에서 최소 1.5시간 또는 최대 하룻밤 동안 배양합니다. 멤브레인 세포 배양 삽입물의 경우 플레이트 공간에 멸균 H2O를 추가하여 플레이트를 가습합니다. 96웰 플레이트의 경우 사용하지 않는 웰에 멸균 H2O를 추가합니다.
  2. 배지를 제거하고 500μL/웰의 차가운 0.5mM EDTA(멸균 PBS에서 1:1000으로 희석된 0.5M EDTA)를 추가하여 기저막과 세포를 회수하여 WRNE에서 7일 동안 배양한 3D HIO를 수집합니다. P1000 피펫을 사용하여 오가노이드와 용액을 위아래로 5배 피펫하고 15mL 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브당 10웰 이상의 오가노이드를 모으지 마십시오. 4 °C의 스윙 버켓 로터에서 300 x g 으로 5분 동안 원심분리기.
    알림: 3웰 플레이트에 96웰을 준비하려면 3D HIO 1웰을 사용하십시오. 1개의 멤브레인 세포 배양 삽입물을 준비하려면 1웰의 3D HIO를 사용합니다(단일 셀의 파종 밀도는 96웰 플레이트의 경우 약 1-2 x 105 셀/웰, 멤브레인 세포 배양 삽입물의 경우 2.5-3 x 105 셀/웰).
  3. 펠릿을 튜브 바닥에 남겨두고 500μL의 매체를 제거합니다. 500μL의 0.05% 트립신/0.5mM EDTA를 첨가하고 37°C에서 4-5분 동안 배양하여 HIO를 해리합니다. P1000을 사용하여 ~50배 동안 위아래로 세게 피펫팅합니다. 튜브 측면에 피펫팅하여 기포를 만들지 마십시오.
  4. 10% FBS를 함유한 CMGF 1mL를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 10% FBS가 함유된 CMGF-1mL로 40μm 세포 여과기를 적시고 세포를 세포 여과기 상단에 추가하여 소화되지 않은 큰 세포 덩어리를 걸러냅니다. 중력을 사용하여 세포가 여과기를 통과할 수 있도록 하고 세포 덩어리가 포함된 세포 여과기를 버립니다.
  5. 실온에서 스윙 버킷 로터에서 400 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.
  6. 콜라겐 코팅된 멤브레인 세포 배양 삽입물 또는 96웰 플레이트에서 액체를 제거합니다. 10 μM Y-27632를 함유한 WRNE 100 μL/웰에 HIO 펠릿을 재현탁시킨 다음 막 세포 배양 삽입물의 상부 구획 또는 96웰 플레이트에 피펫팅합니다. 멤브레인 세포 배양 삽입물의 경우 10μM Y-27632를 포함하는 600μL의 WRNE를 웰의 하단 구획에 추가합니다.
  7. 멤브레인 세포 배양 삽입물의 상부 및 하부 또는 96웰 플레이트에서 24시간 후 배지를 제거하고 5일 동안 분화 배지로 교체합니다. 기술적 변동성을 줄이기 위해 샘플당 3개의 웰을 준비하여 풀링합니다.

4. 단일 세포 전사체학을 위한 분화된 3D HIO에서 단일 세포 현탁액 제조

  1. 효소 세포 분해 시약을 37°C에서 CO2 인큐베이터에 넣어 3D HIO 분해를 시작하기 30분 전에 해동하고 따뜻하게 합니다. 세포 건강을 보장하기 위해 10x에서 명시야 현미경을 사용하여 HIO를 확인합니다.
  2. 웰에서 매체를 제거하고 500μL의 콜드 셀 회수 용액을 웰에 추가합니다. P1000 피펫과 표준 피펫 팁을 사용하여 기저막에서 세포를 분리하기 위해 몇 번 위아래로 피펫팅합니다. 세포 현탁액을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
    참고: 복제 웰을 사용하면 적절한 세포 수를 보장하고 웰 간 변동을 줄일 수 있습니다. 아래 4.7단계 전에 웰을 결합하지 마십시오.
  3. 세포의 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 배양하고 5분마다 위아래로 피펫팅합니다. 4°C에서 400 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.
  4. 세포 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 튜브에서 액체를 제거합니다. 500 μL의 사전 예열된 효소 세포 분해 시약에 세포를 재현탁시킵니다. P1000으로 최소 10회 위아래로 피펫팅합니다.
  5. CO2 인큐베이터에서 37°C에서 30분 동안 HIO를 배양합니다. 10분마다 P1000 피펫을 사용하여 전체 부피를 10배 피펫팅하여 세포를 해리합니다. 셀 현탁액에 기포가 유입되지 않도록 하십시오.
  6. 4 ° C에서 400 x g 에서 3 분 동안 세포를 펠릿합니다. 상층액을 제거하고, 세포를 1mL의 분화 배지에 재현탁시킨 다음 얼음 위에 보관합니다.
    알림: 이 시점부터 HIO는 항상 얼음 위에 있어야 합니다.
  7. P1000을 사용하여 셀을 50배 빠르게 위아래로 피펫팅하여 HIO가 단일 셀로 해리되도록 합니다. 이 단계에서 기포가 유입되면 세포 손실이 발생하므로 주의하십시오.
  8. P1000 피펫 팁을 사용하여 70μm 팁 스트레이너를 통해 전체 부피를 여과합니다. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 사용하여 용리액을 수집합니다.
    알림: 소화 시간이 충분하면 필터 팁이 막히지 않습니다. 필터가 막힌 경우 여러 필터 팁을 사용하십시오. 필터를 통해 볼륨을 강제로 통과시키지 마십시오.
  9. 40μm 팁 스트레이너로 4.8단계를 반복합니다. 샘플을 얼음에 보관하십시오.
  10. 5μL의 세포 현탁액에 0.4% 트리판 블루 5μL를 추가하여 트리판 블루 배제를 사용하여 세포 계수 챔버에서 생존 가능한 단일 세포를 계수합니다. 필요에 따라 샘플을 1000 cells/μL로 희석합니다. 세포 밀도가 1000 cells/μL 미만인 경우 4°C에서 400 x g 에서 2분 동안 세포를 펠릿하고 원래 배지를 제거하고 세포 배양 배지에 재현탁합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 5 x 105-1 x 106 셀을 생성합니다.
    참고: 고품질 현탁액(90% 생존 가능 및 90% 단일 세포)의 준비는 고품질 단일 세포 데이터에 필수적입니다. 그러나 경험에 따르면 감염 또는 저분자 적용과 같은 치료가 생존력에 영향을 미치는 경우 75%의 낮은 생존율이 허용될 수 있습니다.
  11. 제조업체의 프로토콜에 따라 단일 세포 전사 프로파일링 플랫폼을 위한 DNA 라이브러리를 준비합니다. scRNAseq 데이터 분석을 위한 모범 사례 프로토콜에 따라 데이터를 처리합니다13,14.

5. 막 세포 배양 삽입물에서 분화된 HIO의 단일 세포 현탁액 제조

  1. 효소 세포 분해 시약을 37°C의 CO2 인큐베이터에 넣어 HIO 멤브레인 세포 배양 삽입 분해를 시작하기 30분 전에 해동 및 따뜻하게 합니다. 사전 예열된 효소 세포 분해 시약을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 담긴 200μL 부분 표본(멤브레인 세포 배양 삽입물당 튜브 1개)으로 나눕니다. 사용할 준비가 될 때까지 튜브를 37°C 인큐베이터에 보관하십시오.
  2. PBS 5mL에 0.5M EDTA 5μL를 첨가하여 PBS-EDTA를 제조합니다. 500μL의 PBS-EDTA를 24웰 플레이트에 분취(멤브레인 세포 배양 삽입물당 1웰).
  3. PBS-EDTA로 세포 세척: 성장 배지가 포함된 웰에서 PBS-EDTA가 포함된 웰로 막 세포 배양 삽입물을 옮깁니다. 정점 쪽에서 세포 배양 배지를 제거하고 100μL의 PBS-EDTA로 교체합니다. 세포층을 건드리지 않도록 주의하십시오.
  4. 막 세포 배양 삽입물의 정점 쪽에 추가된 PBS-EDTA를 즉시 폐기합니다. 웰에서 멤브레인 세포 배양 삽입물을 제거하고 종이 타월의 가장자리를 부드럽게 터치하여 닦아낸 다음 벤치탑에서 뒤집습니다. 날카로운 메스 날을 사용하여 멤브레인의 내부 둘레 주위를 절단하여 인서트에서 멤브레인을 제거합니다. 건조를 방지하기 위해 신속하게 작업하십시오.
  5. 겸자를 사용하여 멤브레인을 효소 세포 분해 시약으로 채워진 사전 예열된 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 멤브레인이 완전히 잠겼는지 확인합니다. 모든 추가 멤브레인 세포 배양 삽입물에 대해 반복합니다.
    참고: 효소 세포 분해 시약의 부피를 500μL로 늘리면 조밀한 단층을 해리하는 데 도움이 될 수 있습니다.
  6. CO2 인큐베이터에서 37°C에서 멤브레인이 있는 튜브를 배양하여 세포를 분리합니다. 10분마다 200μL 피펫으로 전체 부피를 5배 부드럽게 피펫팅하여 총 30분 동안 혼합합니다. 생존력을 보존하기 위해 멤브레인의 기포와 흡입을 피하십시오.
  7. 10분마다 소량의 세포 부분 표본(1-2μL)을 유리 슬라이드에 옮겨 단일 세포의 비율을 정성적으로 평가하여 해리를 평가합니다. HIO 유형에 따라 50%-80% 단일 세포를 달성하기 위해 추가 피펫팅으로 최대 90분이 소요될 수 있습니다. 특히 세포를 해리하기 어려운 경우 해리를 촉진하기 위해 혼합 단계 중에 피펫 팁으로 멤브레인을 부드럽게 긁어내지만 긁는 것은 생존력에 영향을 미칠 수 있습니다.
  8. 단일 1.5mL 미세 원심분리기 튜브(총 600μL)에 조건당 3개의 복제 웰을 결합합니다. 400 μL의 세포 배양 배지(diff) + 10 μM ROCKi(총 부피 1 mL)를 추가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다.
    참고: 복제 웰을 사용하면 적절한 세포 수를 보장하고 웰 간 변동을 줄일 수 있습니다. 이 단계에서 웰을 모아야 합니다.
  9. 1mL 피펫 팁을 사용하여 70μm 팁 스트레이너를 통해 전체 부피를 여과합니다. 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 흐름을 수집합니다.
    알림: 소화 시간이 충분하면 필터 팁이 막히지 않습니다. 필터가 막힌 경우 여러 필터 팁을 사용하십시오. 볼륨을 억지로 통과시키지 마십시오.
  10. 40μm 팁 스트레이너로 5.9단계를 반복합니다. 샘플을 얼음에 보관하십시오.
  11. 5μL의 세포 현탁액에 0.4% 트리판 블루 5μL를 추가하여 트리판 블루 배제를 사용하여 세포 계수 챔버에서 생존 가능한 단일 세포를 계수합니다. 필요에 따라 샘플을 1000 cells/ μL로 희석합니다. 세포 밀도가 1000 cells/ μL 미만인 경우 4 °C에서 400 x g 에서 2 분 동안 회전시켜 세포를 펠릿화하고 원래 매체를 제거한 다음 원하는 세포 밀도에서 WRNE+Y로 재현탁합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 4 x 105 - 6 x 105 셀을 생성합니다.
    참고: 고품질 현탁액(90% 생존 가능 및 90% 단일 세포)의 준비는 고품질 단일 세포 데이터에 필수적입니다. 그러나 경험에 따르면 감염 또는 저분자 적용과 같은 치료가 생존력에 영향을 미치는 경우 75%의 낮은 생존율이 허용될 수 있습니다.
  12. 제조업체의 프로토콜에 따라 단일 세포 전사 프로파일링 플랫폼을 위한 DNA 라이브러리를 준비합니다. scRNAseq 데이터 분석을 위한 모범 사례 프로토콜에 따라 데이터를 처리합니다13,14.

6. 96웰 단층으로 분화된 HIO로부터 단세포 현탁액의 제조

  1. 효소 세포 분해 시약을 37°C의 CO2 인큐베이터에 넣어 단층 HIO 분해를 시작하기 30분 전에 해동하고 따뜻하게 합니다.
  2. PBS 5mL에 0.5M EDTA 5μL를 첨가하여 PBS-EDTA를 제조합니다. 96웰 플레이트에서 세포 배양 배지를 버리고 100μL의 PBS-EDTA로 교체합니다. 세포층을 건드리지 않도록 주의하십시오.
  3. 세포 해리: PBS-EDTA를 버리고 각 웰에 100μL의 따뜻한 효소 세포 분해 시약을 추가합니다. 플레이트를 37°C의 5%CO2 인큐베이터에 놓고 20-30분 동안 10분마다 200μL 피펫 팁으로 전체 부피를 5배 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 생존 가능성을 보존하기 위해 거품을 피하십시오.
    참고: 효소 세포 분해 시약의 부피를 500μL로 늘리면 조밀한 단층을 해리하는 데 도움이 될 수 있습니다.
  4. 세포의 작은 부분 표본(1-2 μL)을 10분마다 유리 슬라이드에 옮겨 해리를 평가합니다. HIO 유형에 따라 50%-80% 단일 셀을 달성하는 데 최대 90분이 소요될 수 있습니다. 특히 세포를 해리하기 어려운 경우 해리를 촉진하기 위해 혼합 단계 중에 피펫 팁으로 플레이트를 부드럽게 긁어냅니다. 그러나 긁는 것은 생존 가능성에 영향을 미칠 수 있습니다.
  5. 단일 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브(총 300μL)에 조건당 3개의 복제 웰을 결합합니다. 700μL의 세포 배양 배지(diff) + 10uM ROCKi(총 부피 1mL)를 추가합니다. 피펫팅으로 부드럽게 섞습니다.
    참고: 복제 성장 웰을 사용하면 적절한 세포 수를 보장하고 웰-투-웰(well-to-well) 변동을 줄일 수 있습니다.
  6. 1mL 피펫 팁을 사용하여 70μm 팁 스트레이너를 통해 전체 부피를 여과합니다. 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 흐름을 수집합니다.
    알림: 효소 세포 분해 시약 분해 시간이 충분하면 필터 팁이 막히지 않습니다. 필터가 막힌 경우 여러 필터 팁을 사용하십시오. 볼륨을 억지로 통과시키지 마십시오.
  7. 40μm 팁 스트레이너로 6.6단계를 반복합니다. 샘플을 얼음에 보관하십시오.
  8. 5μL의 세포 현탁액에 0.4% 트리판 블루 5μL를 추가하여 트리판 블루 배제를 사용하여 세포 계수 챔버에서 생존 가능한 단일 세포를 계수합니다. 필요에 따라 1000 cells/μL로 희석합니다. 세포 밀도가 1000 cells/μL 미만인 경우 400 x g 4 °C에서 2분 동안 회전시켜 세포를 펠렛화하고 원래 배지를 제거한 다음 원하는 세포 밀도에서 세포 배양 배지 + ROCKi에 재현탁합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 2 x 105 - 6 x 105 셀을 생성합니다.
    참고: 고품질 현탁액(90% 생존 가능 및 90% 단일 세포)의 준비는 고품질 단일 세포 데이터에 필수적입니다. 그러나 경험에 따르면 감염 또는 저분자 적용과 같은 치료가 생존력에 영향을 미치는 경우 75%의 낮은 생존율이 허용될 수 있습니다.
  9. 단일 세포 전사 프로파일링 플랫폼 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 라이브러리를 준비합니다. scRNAseq 데이터 분석을 위한 모범 사례 프로토콜에 따라 데이터를 처리합니다13,14.

결과

단일 세포 현탁액은 충분한 세포 수율을 보장하고 well-to-well 변동을 줄이기 위해 2-3웰의 막 세포 배양 삽입물, 단층 및 3D HIO에서 통합되었습니다. 단일 세포 라이브러리는 단일 세포 전사 프로파일링 플랫폼에 특정한 시약을 사용하여 준비되었습니다. 차세대 염기서열분석 플랫폼에서 쌍을 이루는 말단 판독으로 염기서열 분석, 30,000회 읽기/세포. 판독은 단일 세포 유전체학을 위한 분석 도구를 사용하여 매핑, 계산 및 분석되었습니다. 미토콘드리아 판독률이 20% 이상이거나 계수된 유전자가 200개 미만인 저품질 세포는 분석에서 제외되었습니다. 세포의 품질을 평가하기 위해 유전자 수, UMI 및 세포당 미토콘드리아 판독 비율을 그래프로 표시했습니다(그림 3). 고품질 세포에는 약 3,500개의 유전자, 15,000개의 UMI 및 10%의 미토콘드리아 판독이 포함되어 있습니다. 필터링 후 HIO 성장 형식에 따라 4000에서 9500 개의 단일 세포를 얻었습니다. 비지도 클러스터링(unsupervised clustering) 및 UMAP 차원 축소(dimension reduction)는 흡수성 장세포(absorptive enterocytes) 및 분비 세포(secretory cell)를 포함하여 예상되는 세포 유형을 나타내는 별개의 클러스터를 식별했습니다(그림 4).

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그림 1: 프로토콜 단계 개요. 단일 셀 데이터 워크플로우에 다양한 형식의 HIO를 도금하는 주요 단계를 간략하게 설명하는 회로도. 이 이미지는 Biorender를 사용하여 생성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 명시야 이미지. 처리할 준비가 된 HIO는 5X 배율의 명시야 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다. 왼쪽, 3D 오가노이드; 중간, 96웰 플레이트; 맞아요, 트랜스웰. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 데이터 품질 관리. 96웰 플레이트에서 단층으로 성장한 jejunal HIO에서 분리된 분석된 단일 세포의 예시 메트릭. 바이올린 플롯은 세포당 유전자 수(nFeature_RNA), UMI(nCount_RNA) 및 미토콘드리아 판독 비율(percent.mt)을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 분석된 단일 세포의 UMAP. (A) 총 9952개의 단일 세포를 96웰 플레이트에서 성장한 분화된 jejunal HIO에서 분리했습니다. (B) 총 5623개의 단일 세포를 막 세포 배양 삽입물에서 성장한 분화된 jejunal HIO로부터 분리하였다. (C) 총 4402개의 단일 세포를 분화된 회장 3D HIO에서 분리했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

WRNE 성장 매체차별화 매체
구성 요소음량최종 집중L-WRN 컨디셔닝 매체, 니코틴아미드 및 SB202190이 없는 WRNE 매체
*Y-27632 (5 mM) 옵션200 마이크로리터10 마이크로미터
재질 보기 83-01 (500 μM)100 μL500 nM 수준
고급 DMEM/F1245mL
나272mL
EGF (50 μg/mL)100 μL50ng/mL
가스트린(10μM)100 μL10 nM의
글루타맥스 (100X)1mL
헤페스 1m1mL
L-WRN 콘 미디어50mL~50%
N21mL
N-아세틸시스테인(500mM)100 μL500 마이크로미터
니코틴아미드 1m1mL10 mM
SB202190 (10 mM)100 μL10 마이크로미터
총 볼륨100mL
CMGF- 중간
고급 DMEM/F12500mL
글루타맥스5mL100배
1M 헤페스5mL

표 1: 사용된 다양한 미디어의 구성.

토론

단일 세포 유전체학 플랫폼을 사용하면 장 상피를 모델링하는 조직 유래 HIO 배양과 같은 복잡한 생물학적 시스템을 분해하여 전체 생물학적 반응에 대한 개별 세포 기여도를 산출할 수 있습니다 4,5,6. 세포 이질성 및 희귀 세포 집단도 식별하고 조사할 수 있습니다. 단일 세포 전사체 기반 플랫폼을 사용하여 출력을 최대화하도록 세포 입력을 최적화해야 합니다. 여기에서는 다운스트림 고품질 전사체 데이터를 얻을 가능성을 높일 수 있는 매우 실행 가능하고 우수한 품질의 단일 세포 현탁액을 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 프로토콜에 익숙해지는 것이 가장 중요하며 라이브러리 준비를 진행하기 전에 여러 번의 연습을 수행하는 것이 좋습니다. 라이브러리 준비를 위해 세포를 사용하기 전에 실행 가능한 단일 세포 현탁액의 재현 가능한 달성이 제안됩니다. 프로토콜이 구현되는 속도는 실행 가능성 결과에 정비례하기 때문에 가장 중요합니다. 이를 바탕으로 한 번에 처리되는 샘플의 수를 제한하는 것이 좋습니다. 문제 해결에 대한 지원을 위해 이러한 프로토콜을 시작하기 전에 라이브러리를 준비할 엔터티와 상호 작용하는 것이 좋습니다.

HIO 생존력은 염기서열분석을 위해 보내진 DNA 라이브러리에 직접적인 영향을 미칩니다. HIO의 세포 생존율은 해리, 원심분리, 완충액, 피펫팅 및 계수 정확도를 포함한 단일 세포 현탁액 준비의 여러 단계에 따라 달라집니다. 플랫폼을 위한 HIO를 준비하는 목표는 세포 생존율 유지와 시료 품질의 균형을 맞추는 것입니다. 고품질 데이터를 얻기 위해 중요한 것은 세포 응집체, 죽은 세포, 비세포 핵산 및 역전사의 생화학적 억제제를 최소화하는 것입니다. 죽어가는 세포는 핵산 노이즈를 증가시키고 세포 응집에 기여하여 데이터 및 플랫폼 실패를 초래합니다 7,8,9,10,11,12. 적절한 필터 크기로 필터링하면 큰 집계를 제거하고 데이터 품질을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다.

단일 세포 현탁액을 준비할 때 HIO 세포 사멸을 최소화하기 위해 몇 가지 요소를 고려해야 합니다. 최소 80%의 생존 가능한 세포를 얻는 것이 필요하며, >90%의 생존율이 훨씬 더 바람직합니다. 생존할 수 없는 세포의 수가 많은 샘플은 컬럼 기반 마이크로비드와 같은 죽은 세포를 제거하는 전략을 사용하여 개선할 수 있지만, 이러한 샘플은 취급 중 손실로 인해 더 많은 초기 세포와 더 많은 샘플 부피가 필요합니다. HIO는 완충액에 특히 민감하며 특정 완충액에서 RT로 너무 오래 방치하면 세포 사멸을 겪게 됩니다. 오가노이드 배지는 세포 손실과 응집체 형성을 최소화합니다. 피펫팅은 해리 중 HIO 생존력에도 영향을 미칠 수 있습니다. 일반 보어 팁은 오가노이드를 전단하여 단일 세포 현탁액으로 해리하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 일반 보어 팁으로 너무 빠르게 피펫팅하면 전단력으로 인해 HIO 셀이 손상될 수 있습니다. 넓은 보어 팁을 사용한 느린 피펫팅은 HIO 세포에 대한 스트레스를 최소화하고 생존 가능한 세포 수 다운스트림을 크게 향상시킵니다. 원심분리, 세척 및 재현탁은 HIO 단일 셀 현탁액의 품질에 영향을 줄 수 있는 다른 요소입니다. 스윙 버킷 원심분리는 HIO 세포의 펠릿화를 더 부드럽게 만들어 세포 손실을 최소화하면서 죽은 세포의 수를 줄입니다. 마지막으로, 농도를 결정하기 위한 계수 정확도는 라이브러리 합성을 위한 플랫폼에 도달하는 최대 세포 수를 보장하는 데 필수적입니다. 이러한 세부 사항에 주의를 기울이면 분리 프로세스 중에 HIO 셀에 대한 스트레스가 최소화되고 처리 후 데이터 반환 가능성이 가장 높아집니다.

단일 세포 전사체학은 단일 세포 수준 4,5,6에서 생물학적 프로필과 반응을 해부할 수 있는 강력한 도구이지만, 인간 장 오가노이드 배양을 분석하기 위해 이 기술을 적용할 때 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 라이브러리 준비 및 염기서열분석 중에 도입된 기술적 다양성 또는 시료 전처리로 인한 배치 효과로 인해 상당한 전사 변동이 있을 수 있습니다. 또한 염기서열분석은 유전자 또는 세포 전반에 걸쳐 불균일한 염기서열분석 깊이가 있는 커버리지 편향을 초래할 수 있습니다. 이로 인해 발현량이 낮은 유전자를 검출하거나 희귀 세포 집단을 식별할 때 문제가 발생합니다. 둘째, 세포 유형의 식별은 오가노이드 배양의 세포 및 전사 이질성과 천연 장 상피와 비교할 때 덜 분화된 세포 프로필로 인해 어려울 수 있습니다. 전사 반응을 기능적 표현형에 결합하는 것도 어려운 일이며 다른 접근법이나 분석을 사용하여 추가 검증이 필요합니다. 셋째, 이 접근법에는 세포의 공간적 맥락이나 시간적 역동성에 대한 고려가 포함되지 않는다. 해리 절차는 전사 데이터에서 세포 간 상호 작용을 추론하는 기능을 제거합니다. 생물학적 연속체가 아닌 세포 상태의 시간에 대한 단일 스냅샷만 제공합니다. 마지막으로, 단일 세포 전사 접근법은 비용이 많이 들고 전문 계산 도구와 생물정보학 전문 지식이 필요할 수 있습니다. 그러나 이 접근법은 여전히 세포 이질성을 이해하고 새로운 세포 유형을 식별하기 위한 지배적인 최첨단 도구로 남아 있습니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 보조금 및 NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A를 인정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG914510 nM
0.05% 트립신-EDTAInvitrogen25300054
0.4% Trypan 블루Millipore-SigmaT8154
0.5 M EDTACorning46-034-CI
1x PBS Ca-Mg-Corning21-040-CM
24 mm TranswellCostar3412
24 웰 Nunclon 델타 표면 조직 배양 접시Thermo Scientific142475
40 &마이크로; m 세포 여과기Falcon352340
40 µ m Flowmi 팁 스트레이너SP Bel-Art LabwareH13680-0040
70 &마이크로; m Flowmi 팁 스트레이너SP Bel-Art LabwareH13680-0070
96 웰 플레이트Corning3595
A-83-01Tocris2939500 nM
AccutaseStemCell Technologies7920
Advanced DMEM/F12Invitrogen12634-028
B27 supplementInvitrogen17504-0441X
크롬 다음 GEM 단일 셀 3' GEM, 라이브러리 & 젤 비드 키트 v3.110x GenomicsPN-1000128
콜라겐 IV시그마-알드리치C5533-5MG33 &마이크로; g/mL
코닝 세포 회수 솔루션 VWR354253
DPBS (Mg2-, Ca2-)Invitrogen14190-1361X
GlutaMAX-IInvitrogen35050-0612 mM
HEPES 1MInvitrogen15630-08010 mM
L-WRN 컨디셔닝 매체ATCCCRL-3276
Matrigel, GFR, phenol freeCorning356231
mouse 재조합 EGFInvitrogenPMG804350ng/mL
N2 보충제Invitrogen17502-0481X
N-아세틸시스테인Sigma-AldrichA9165-5G500 µ M
니코틴아미드시그마-알드리치N063610 mM
SB202190시그마-알드리치S706710 &마이크로; M
트랜스웰코닝3413
Y27632줄기세포 기술7230810 &마이크로; 미디엄

참고문헌

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  2. Blutt, S. E., et al. Gastrointestinal microphysiological systems. Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).
  3. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  4. Elmentaite, R., et al. Cells of the human intestinal tract mapped across space and time. Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).
  5. Hickey, J. W., et al. Organization of the human intestine at single-cell resolution. Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).
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  8. Triana, S., et al. Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut. Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).
  9. Fujii, M., et al. Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).
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  11. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).
  12. Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).
  13. Luecken, M. D., Theis, F. J. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).
  14. Heumos, L., et al. Best practices for single-cell analysis across modalities. Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).

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