방법 논문

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

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DOI:

10.3791/66752

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2024년 4월 26일

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1Department of Urology, South China Hospital, Medical School, Shenzhen University, 2Guangdong Key Laboratory for Biomedical Measurements and Ultrasound Imaging, National-Regional Key Technology Engineering Laboratory for Medical Ultrasound, School of Biomedical Engineering, Shenzhen University Medical School, 3Cancer Center, Daping Hospital & Army Medical Center of PLA, Third Military Medical University, 4Guangdong Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 5Institute of Immunology, Third Military Medical University, 6Dermatology Hospital, Southern Medical University, 7Institute of Immunological Innovation and Translation, Chongqing Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

현재 연구는 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

초록

Follicular Helper T (TFH) cell은 동족 B 세포가 친화성이 높은 항체를 생성하여 장기적인 체액성 면역을 형성하는 데 도움을 주는 독립적인 CD4+ T 세포 계통으로 인식됩니다. 급성 바이러스 감염 시 바이러스 특이적 TFH 세포의 운명 결정은 초기 감염 단계에서 결정되며, 조기 분화된 TFH 세포에 대한 연구는 T 세포 의존성 체액성 면역을 이해하고 백신 설계를 최적화하는 데 중요합니다. 이 연구에서는 급성 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV) 감염 마우스 모델과 LCMV 당단백질 에피토프 I-AbGP66-77을 특이적으로 인식하는 CD4+ T 세포를 가진 TCR-transgenic SMARTA(SM) 마우스를 사용하여 유세포 염색을 기반으로 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신에 접근하는 절차를 설명했습니다. 또한, SM CD4+ T 세포의 레트로바이러스 transduction을 이용하여 조기 분화된 바이러스 특이적 TFH 세포에서 유전자 발현을 조작하는 방법도 제공합니다. 따라서 이러한 방법은 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 투여의 기저에 있는 메커니즘을 탐색하는 연구에 도움이 될 것입니다.

서론

다양한 병원체나 위협에 직면했을 때, 미성숙 CD4+ T 세포는 특화된 기능을 가진 다양한 보조 T(TH) 세포 subset으로 분화하여 면역 반응을 조정합니다1. 급성 바이러스 감염 시나리오에서 naive CD4+ T 세포의 상당 부분은 B 세포 2,3에 도움을 제공하는 여포 도우미 T(TFH) 세포로 분화합니다. 다른 CD4+ TH 세포 subset(예를 들어, TH1, TH2, TH9 및 TH17 세포)와 구별되듯이, TFH 세포는 상당한 수준의 CXCR5를 발현하는데, 이는 B 세포 귀환 chemokine CXCL13에 대한 chemokine 수용체로서, TFH 세포가 B 세포 소낭선으로 이동할 수 있게 한다. B 세포 난포에서 TFH 세포는 생식 중심 반응을 시작하고 유지하는 데 있어 B 세포를 동족 형성을 지원하여 빠른 고친화성 항체 생산과 장기 체액성 기억을 가능하게 합니다 2,3.

급성 바이러스 감염 시, 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 결정은 72 h 4,5 이내에 발생하며, TFH 세포 운명 결정을 관장하는 "마스터 조절자" 역할을 하는 전사 억제 인자 B 세포 림프종-6(Bcl-6)5,6,7,8에 의해 조절됩니다. Bcl-6의 결핍은 TFH 세포 분화를 심각하게 둔화시키는 반면, 이소성 Bcl-6 발현은 TFH 세포 운명 헌신을 실질적으로 촉진합니다. Bcl-6 외에도 여러 분자가 초기 TFH 세포 운명 헌신을 지시하는 데 관여합니다. 전사 인자 TCF-1 및 LEF-1은 Bcl-6 9,10,11의 유도를 통해 TFH 세포 분화를 시작합니다. Bcl-6 및 TCF-1 모두에 의한 Blimp1의 억제는 초기 TFH 세포 운명 헌신11,12에 필요합니다. STAT1 및 STAT3는 초기 TFH 세포 분화에도 필요합니다13. 게다가, 히스톤 메틸전이효소 EZH214,15 및 m6A 메틸전이효소 METTL316에 의한 후성유전학적 변형은 TFH 세포 전사 프로그램(특히 Bcl6 및 Tcf7)을 안정화하는 데 도움이 되므로 초기 TFH 세포 운명 헌신을 촉진합니다. 앞서 언급한 분자 및 다른 분자를 포함한 발전이 다른 곳에서 요약된3, 초기 TFH 세포 운명 헌신의 전사 및 후성유전학적 규칙을 이해하는 데 이루어졌지만, 이전에 알려지지 않은 분자는 학습되어야 할 과제로 남아 있습니다.

급성 림프구성 맥락막염 바이러스(LCMV) 감염의 마우스 모델에서, LCMV 당단백질 에피토프 I-AbGP66-77을 특이적으로 인식하는 입양 전달 동종성 TCR-형질전환 SMARTA(SM) CD4+ T 세포는 바이러스 감염 중에 TFH 또는 TH1 세포 분화를 겪습니다. 이 TFH/TH1 분기 분화 패턴은 바이러스 특이적 TFH 세포의 생물학을 연구하는 데 있어 SM/급성 LCMV 감염 모델의 발전을 지원합니다. 실제로, SM/급성 LCMV 감염 모델은 TFH 세포 연구 분야에서 널리 사용되어 왔으며 TFH 세포 생물학의 이정표적 발견에 중요한 역할을 했습니다. 여기에는 TFH 세포 5,6의 계통 정의 전사 인자로서의 전술한 Bcl-6의 식별뿐만 아니라 T FH 세포분화를 안내하는 다른 중요한 전사 인자(예: Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 및 Itch19)가 포함되며, TFH 세포 분화, 전사 후 규정( 예를 들어, TFH 세포 분화, TFH 세포 기억 및 가소성21,22, 및 TFH 세포를 표적으로 하는 합리적인 백신 접종 전략(예: 셀레늄23)의 METTL316 및 miR-17~9220)을 포함할 수 있다.

본 연구는 (1) 조기 분화된 TFH 세포에 접근하는 데 적합한 급성 LCMV 감염 SM 키메라 마우스 모델 확립, (2) 조기 분화 TFH 세포와 관련된 분자의 유세포 분석 염색 수행, (3) SM CD4+에서 레트로바이러스 벡터 기반 유전자 조작 수행을 포함하여 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신에 접근하기 위한 재현 가능한 방법을 설명합니다 T 세포. 이러한 방법은 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 조사하는 연구에 유용할 것입니다.

프로토콜

모든 동물실험은 제3군사의과대학의 동물관리이용위원회(Institutional Animal Care and Use Committees)가 승인한 절차에 따라 실시하였다. 본 연구에서는 다음과 같은 마우스 균주가 사용되었다 : C57BL / 6J (B6) 마우스 (남녀 모두), 6-8 주령, 체중 25-30g; CD45.1+SM TCR 형질전환 마우스(B6 CD45.1 × SM TCR 형질전환), 남녀 모두, 생후 6-8주, 체중 25-30g; 및 CXCR5-GFP CD45.1 + SM TCR 형질 전환 마우스 (B6 CD45.1 × SM TCR 형질 전환 × CXCR5-GFP 녹인), 남녀 모두, 6-8 주, 무게 25-30g. 형질전환 종은 이전에 발표된 보고서24에 따라 생성되었다. 연구에 사용된 시약, 완충액 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 입양 전달을 위한 CD45.1+ SM CD4+ T 세포 채취

  1. (제도적으로 승인된 프로토콜에 따라) 6-8주 된 CD45.1+ TCR-형질전환 SM 마우스의 필요한 수를 안락사시킨다24. 외과 용 가위로 안락사 된 쥐의 복막 벽 왼쪽에 1 인치를 절개하고, 복막에서 비장을 절개하고, 비장 뒤의 결합 조직을 찢습니다25,26.
  2. 페트리 접시(60mm × 15mm) 내의 70μm 세포 여과기에 각 비장을 넣고 1mL 주사기 플런저를 사용하여 3mL의 적혈구(RBC) 용해 완충액으로 비장을 갈아줍니다.
    알림: 주사기 플런저의 둥근 면을 사용하여 결합 조직만 남을 때까지 비장을 갈아줍니다.
  3. 각 접시에 6mL의 RPMI + 2% FBS(RPMI 2%)를 추가하여 3mL의 RBC 용해 완충액을 희석합니다. 세포 현탁액을 접시에서 15mL 원뿔형 튜브로 피펫팅합니다. 2% RPMI 3mL를 추가로 헹구고 동일한 원추형 튜브로 옮깁니다.
  4. 셀 현탁액을 800× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 디캔테이션으로 상층액을 버립니다. 분리 완충액으로 세포를 재현탁시키고 세포 밀도를 mL당 ~1 × 108 세포로 조정합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  5. CD4+ T 세포의 농축을 위해 CD8a, CD19, NK1.1, F4/80, CD11c 및 Ter119에 대한 1x 비오틴화 항체 칵테일을 분리 완충액에서 준비합니다.
    참고: 재료 표에 언급된 대로 표시된 희석에서 비오틴화된 항체를 분리 완충액에 추가합니다. 항체 칵테일의 부피를 단계 1.4의 분리 완충액의 부피와 동일하게 유지하십시오.
  6. 셀 현탁액을 800× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 디캔테이션으로 상층액을 버립니다.
  7. 원뿔형 튜브에 표시된 1x 비오틴화 항체 칵테일이 있는 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
  8. 원뿔형 튜브를 셰이커에 넣고 얼음 위에 놓고 45rpm에서 30분 동안 기다립니다.
  9. 비오틴화 항체로 배양하는 동안 제조업체의 지침에 따라 필요한 부피의 스트렙타비딘 코팅 비드를 준비합니다.
    참고: 순진한 마우스 한 마리의 총 비장 세포에는 200μL의 스트렙타비딘 코팅 비드가 필요합니다.
  10. 800 x g 에서 8-10 mL의 분리 완충액으로 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 세척하고 상층액을 버립니다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다.
  11. 준비된 스트렙타비딘 코팅 비드로 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
  12. 45rpm에서 40분 동안 셰이커에 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  13. 그런 다음 모든 비드가 자석 쪽에 조립될 때까지 튜브를 자기 스탠드에 3-4분 동안 놓습니다.
  14. 상층액을 조심스럽게 채취하여 새로운 15mL 코니컬 튜브에 옮깁니다.
  15. 셀 현탁액을 800× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 디캔테이션으로 상층액을 버립니다.
    참고: 1.5-1.15단계에서 설명한 CD4+ T 세포 농축 절차의 대체품으로 사용할 수 있는 CD4+ T 세포 농축에 사용할 수 있는 다른 상용 키트가 있습니다.
  16. 세포 펠릿을 2-3mL의 2% RPMI로 재현탁시킵니다. CD4+ T 세포 농축(CD4 및 Vα2) 및 세포 생존율의 효율성에 대한 유세포 분석을 위해 50μL의 세포 현탁액을 흡인합니다.
  17. 셀 현탁액을 800× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 디캔테이션으로 상층액을 버립니다. RPMI로 세포 펠릿을 재현탁시키고 세포 밀도를 mL당 1 × 107 CD4+Vα2+ SM 세포로 조정합니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 다음 단계에서 입양 세포 이식으로 진행합니다.

2. 조기 분화된 SM T FH 세포에 접근하기 위한 급성 LCMV 감염 SM 키메라 마우스 모델 확립

  1. 6주에서 8주 된 C57BL/6 수혜 마우스를 적외선 램프로 데우고 정맥 주사를 위해 꼬리 정맥을 확장합니다.
  2. 1.17단계에서 준비한 1 ×10 6 SM 세포를 포함하는 100μL의 세포 현탁액을 인슐린 주사기로 흡인합니다.
    참고: 주입량은 각 연구자에 의해 수정되어야 하며 기관 및 지역 법률에서 허용하는 최대 주입량을 초과해서는 안 됩니다.
  3. 마우스 고정 장치로 쥐를 제자리에 고정하고 꼬리를 곧게 펴고 면봉을 사용하여 75% 에탄올로 꼬리를 닦아 꼬리 정맥이 보이도록 합니다.
  4. 인슐린 주사기 바늘을 꼬리 정맥에 삽입하고 세포 현탁액을 부드럽고 천천히 주입합니다. 그런 다음 수혜 쥐를 밤새 쉬게 하십시오.
  5. 다음 날, LCMV 암스트롱 바이러스 스톡을 RPMI 배지로 희석하여 최종 농도가 1 × 107 플라크 형성 단위/mL가 되도록 합니다.
  6. 100μL의 희석된 LCMV 암스트롱 용액(1 × 106 개의 플라크 형성 단위 포함)을 수용 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다.
    참고: 각 연구자는 권장되는 전염성 역가가 기관 및 지역 법률에 의해 허용되는지 여부에 대해 신중해야 합니다.

3. 조기 분화된 SM TFH 세포의 유세포 분석 염색

  1. 감염 후 3일째에 2.6단계의 마우스(기관에서 승인된 프로토콜에 따름)를 희생하고 1단계에서 설명한 대로 비장에서 림프구를 처리합니다. 세포 밀도를 mL당 약 2 × 107 세포로 조정합니다.
  2. 50 μL의 세포 현탁액(~1 × 106 세포)을 둥근 바닥 96웰 플레이트에 로드하고 웰당 150 μL의 염색 완충액을 보충합니다. 접시를 얼음 위에 두십시오.
  3. 정제된 랫트 항마우스 CXCR5 항체 칵테일(즉, CXCR5 1차 항체)을 튜브의 각 샘플에 대해 50μL의 TFH 세포 염색 완충액에 1:50 희석하여 준비합니다. 튜브를 완전히 소용돌이치고 15,000× g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리하여 입자를 응집합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
  4. 96웰 플레이트를 800× g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하고, 디캔테이션으로 상층액을 버리고, 플레이트를 잠시 소용돌이치고, 웰당 200μL의 염색 완충액을 추가합니다.
  5. 3.4 단계를 반복하고 웰 당 CXCR5 1 차 항체 50 μL로 세포를 재현탁시킵니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞고 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.
  6. 새 튜브의 각 샘플에 대해 50μL의 TFH 세포 염색 완충액에 1:200으로 희석하여 비오틴화 염소 항쥐 항체 칵테일(즉, CXCR5 2차 항체)을 준비합니다. 튜브를 소용돌이치게 하고 15,000× g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리하여 입자를 응집합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
  7. 800× g 에서 4°C에서 1분 동안 플레이트를 원심분리하고, 디캔테이션으로 상층액을 버리고, 플레이트를 잠시 소용돌이치고, 웰당 200μL의 염색 완충액을 추가합니다.
  8. 3.7단계를 두 번 반복하고 접시를 얼음 위에 둡니다.
  9. 웰당 50μL의 CXCR5 2차 항체를 플레이트에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
  10. 각 샘플에 대해 50μL의 TFH 세포 염색 완충액에 1:200으로 희석하여 형광 접합 스트렙타비딘(즉, CXCR5 3차 항체)을 준비합니다. 한편, 표면 마커(예: CD45.1, CD4, PD-1, CD25 및 기타 관심 있는 분자)에 대한 다른 항체를 CXCR5 3차 항체와 함께 데드 셀 염색을 추가합니다.
  11. 튜브를 소용돌이치게 하고 15,000× g 에서 4°C에서 3분 동안 원심분리하여 입자를 응집합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
  12. 800× g 에서 4°C에서 1분 동안 플레이트를 원심분리하고, 디캔테이션으로 상층액을 버리고, 플레이트를 잠시 소용돌이치고, 웰당 200μL의 염색 완충액을 추가합니다.
  13. 3.12단계를 두 번 반복하고 접시를 얼음 위에 둡니다.
  14. 웰당 50μL의 CXCR5 3차 항체 칵테일을 플레이트에 추가합니다. 위아래로 피펫팅하여 잘 섞고 어두운 곳에서 30분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
  15. 제조업체의 지침에 따라 각 웰에 대해 200μL의 고정/투과화 버퍼를 준비합니다.
  16. 800× g 에서 4°C에서 1분 동안 플레이트를 원심분리하고, 디캔테이션으로 상층액을 버리고, 플레이트를 잠시 소용돌이치고, 웰당 200μL의 염색 완충액을 추가합니다.
  17. 3.16단계를 두 번 반복하고 어두운 곳에서 접시를 얼음 위에 두십시오.
  18. 각 웰에 200μL의 고정/투과화 버퍼를 추가합니다. 위아래로 피펫팅하고 실온에서 30분(어두운 곳에서) 배양하여 잘 섞습니다.
    알림: 제조업체의 지침에 따라 투과화 완충액(1x)을 준비합니다.
  19. Bcl-6, TCF-1, T-bet 및 기타 관심 있는 분자를 포함한 전사 인자에 대한 항체 칵테일을 새 튜브의 각 웰에 대해 50μL의 투과화 완충액(1x)에서 준비합니다.
  20. 튜브와 원심분리기를 15,000 x g 에서 4°C에서 3분 동안 소용돌이쳐 입자를 응집합니다.
  21. 800× g 에서 4°C에서 1분 동안 플레이트를 원심분리하고, 디캔테이션으로 상층액을 버리고, 플레이트를 잠시 소용돌이치고, 웰당 50μL의 전사 인자 항체 칵테일을 추가합니다. 잘 섞고 어두운 곳에서 30분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
  22. 800 × g 에서 4 °C에서 1 분 동안 플레이트를 원심 분리하고, 상층액을 버리고, 디캔테이션으로 플레이트를 잠시 소용돌이 치고, 웰 당 200 μL의 투과화 완충액 (1x)을 추가합니다.
  23. 3.22단계를 반복합니다.
  24. 각 웰에 200μL의 염색 완충액을 추가하고, 4°C에서 1분 동안 800× g 으로 플레이트를 원심분리하고, 디캔테이션으로 상층액을 버리고, 플레이트를 잠시 소용돌이칩니다.
  25. 200 μL의 염색 완충액으로 세포 펠릿을 각 웰에 재현탁시키고 세포를 유세포 분석 튜브로 옮겨 즉각적인 유세포 분석기 분석을 가능하게 합니다.
    참고: 또는 각 튜브에 200μl의 2% PFA를 추가하고 어두운 곳에서 4°C에서 보관하는 조건에서 샘플을 3일 이내에 검출할 수 있습니다.

4. 레트로바이러스 생산

  1. 10cm 배양 접시에서 DMEM 10% 배지를 사용하여 293-3 passages 동안 293T 세포(10개 미만 passage)를 배양합니다.
  2. 세포가 90% 밀도에 도달하면 기존 배지를 버리고 PBS로 세포를 두 번 부드럽게 세척한 다음 실온에서 1분 동안 0.25% Trypsin-EDTA 1mL를 사용하여 293T 세포를 짧게 트립신화합니다.
  3. 2mL의 사전 예열된 10% DMEM 배지에 세포를 재현탁시키고 15mL 코니컬 튜브로 옮긴 다음 200× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 분해 과정을 중지합니다.
  4. 상층액을 버리고 사전 예열된 10% DMEM 배지 2mL로 배양 배지를 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
  5. 6-웰 플레이트의 웰당 2.5mL 10% DMEM 배지에서 세포 수를 정량화하고 5 × 105 개의 세포를 플레이트합니다.
    알림: 293T 셀이 접시 전체에 고르게 퍼질 수 있도록 접시를 부드럽게 휘젓습니다.
  6. 293T 세포 합류도가 80%를 초과하면 4.7 - 4.9단계에 설명된 대로 transfection 시약을 준비합니다.
  7. 6-웰 플레이트의 각 웰에 대해 250μL의 사전 예열된 Opti-MEM 배지를 멸균된 1.5mL 튜브에 추가합니다. 그런 다음 3μg의 플라스미드 DNA(2μg의 레트로바이러스 벡터 및 1μg의 pCL-Eco 포함)를 Opti-MEM 배지에 첨가한 다음 완전한 혼합을 보장하기 위해 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
    참고: 이 연구에서 예시로 사용된 레트로바이러스 벡터는 IRES-GFP(MigR1-Bcl6)의 상류에서 Bcl6 CDS 영역을 갖는 MigR1 및 변형된 MigR1 벡터입니다.
  8. 다음으로, 7.5μL의 사전 예열된 transfection 시약(상업적으로 획득)을 혼합물에 추가하고 완전히 혼합되도록 위아래로 부드럽게 피펫팅합니다.
  9. 혼합물을 실온에서 20분 동안 배양합니다.
  10. 혼합물을 293T 세포 배양 웰의 뚜렷한 영역에 적하 방향으로 분주한 다음 혼합물이 고르게 분포되도록 배양 용기를 앞뒤로 좌우로 부드럽게 흔듭니다.
  11. 293T 세포를 5 % CO2 가 포함 된 37 ° C 인큐베이터에서 72 시간 동안 배양합니다.
  12. 형광 현미경 또는 유세포 분석을 사용하여 transfection된 293T 세포에서 transfection 효능에 대한 대리물로서 레트로바이러스 벡터의 태그를 검출합니다.
    참고: 예를 들어, MigR1 벡터 transfection된 293T 세포의 상당 부분에서 GFP 형광 신호를 확인했으며, 이는 고품질 transfection을 시사합니다.
  13. 세포 배양 배지와 원심분리기를 2,500× g 에서 4°C에서 10분 동안 수집하여 세포 파편을 제거합니다. 생성된 상층액은 -80°C에서 장기 보존하거나 4°C에서 임시로 보관하기 위해 조심스럽게 수집하여 보관해야 합니다.

5. SM CD4+ T 세포의 In vivo activation, retrovirus transduction 및 adoptive transfer

  1. CD45.1+ SM 마우스 1개(6-8주령)에 100μL의 RPMI 배지 부피에 200μg의 LCMV GP61-77 펩타이드11,14를 정맥 주사합니다.
    참고: 주입량은 각 연구자가 수정해야 하며 기관 및 현지 법률에서 허용하는 최대 주입량을 초과해서는 안 됩니다.
  2. 펩타이드 주입 후 16-18 시간에 SM 마우스를 안락사시킵니다 (기관에서 승인 된 프로토콜에 따름). 1단계에서 앞서 언급한 절차에 따라 비장 세포를 획득합니다.
    참고: 대안적으로, in vitro anti-CD3/anti-CD28 자극 방법27,28을 사용하여 5.1 및 5.2단계에서 설명한 in vivo 펩타이드 자극 대신 SM CD4+ T 세포를 활성화할 수 있습니다.
  3. 2% RPMI로 비장 세포를 현탁시키고 세포 밀도를 15mL 원추형 튜브에서 mL당 약 1 × 108 세포로 조정합니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
  4. 50μL의 세포 현탁액을 둥근 바닥 96웰 플레이트에 분주하고 웰당 150μL의 염색 완충액을 보충합니다.
  5. 96웰 플레이트를 800× g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 디캔테이션으로 상층액을 조심스럽게 제거하고, 플레이트를 잠시 소용돌이치고, 웰당 200μL의 염색 완충액을 추가합니다.
  6. 5.5단계를 반복하고 CD4, CD25 및 CD69를 포함한 50μL의 표면 항체 칵테일로 세포를 재현탁시켜 SM CD4+ T 세포의 활성화 상태를 검출합니다. 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합하고 어두운 곳에서 30분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
  7. 각 웰에 염색 완충액을 200μL까지 충전한 다음 800× g 에서 4°C에서 1분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 디캔팅으로 상층액을 버리고 플레이트를 잠시 소용돌이칩니다.
  8. 5.7단계를 두 번 반복합니다.
  9. 200 μL의 염색 완충액에 세포를 재현탁시키고 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.
  10. 유세포 분석으로 형광 접합 항체 염색 세포를 분석하여 SM CD4+ T 세포의 활성화 상태를 평가합니다.
    참고: 활성화된 SM CD4+ T 세포는 naive 세포에 비해 풍부한 CD25 및 CD69 발현을 나타내어 후속 transduction 절차를 가능하게 했습니다.
  11. 웰당 1 × 106 SM CD4+ T 세포(단계 5.3에서)를 24웰 플레이트에 추가합니다. 800 × g 에서 4 °C에서 3 분 동안 세포를 스핀 다운 한 다음 디캔테이션으로 매체를 조심스럽게 제거합니다.
  12. 단계 4.13에 설명된 대로 레트로바이러스 배지 1mL와 폴리브렌 8μg을 각 웰에 추가합니다.
  13. 37°C에서 2시간 동안 800× g 에서 세포를 스핀-트랜스듀싱합니다.
  14. 피펫팅을 통해 레트로바이러스 배지를 조심스럽게 폐기하고 10ng/mL 재조합 쥐 IL-2가 보충된 사전 예열된 10% RPMI 1mL를 각 웰에 추가합니다.
  15. 5 % CO 2 가 포함 된 37 ° C 인큐베이터에서 48 시간 동안 세포를 배양합니다.
  16. 세포 현탁액을 15mL 코니컬 튜브에 옮기고 4°C에서 6분 동안 800× g 의 세포를 스핀다운합니다.
  17. 디캔테이션으로 상층액을 제거하고 2% RPMI의 적절한 부피로 세포를 재현탁시켜 15mL 원추형 튜브에서 mL당 1 × 108 세포의 세포 밀도를 만듭니다. 튜브를 얼음 위에 두십시오.
  18. 50μL의 세포 현탁액을 둥근 바닥 96웰 플레이트에 분주하고 웰당 150μL의 염색 완충액을 보충합니다.
  19. 96웰 플레이트를 800× g 에서 4°C에서 1분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화하고, 디캔테이션으로 상층액을 조심스럽게 제거하고, 플레이트를 잠시 소용돌이치고, 웰당 200μL의 염색 완충액을 추가합니다.
  20. 5.19단계를 반복하고 CD4, Vα2 및 벡터 태그 관련 항체를 포함한 50μL의 표면 항체 칵테일로 세포를 재현탁시킵니다. 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합하고 어두운 곳에서 30분 동안 얼음 위에서 배양합니다.
  21. 각 웰에 염색 완충액을 200μL까지 충전한 다음 800× g 에서 1분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 디캔팅으로 상층액을 버리고 플레이트를 잠시 소용돌이칩니다.
  22. 5.21단계를 두 번 반복합니다.
  23. 200 μL의 염색 완충액에 세포를 재현탁시키고 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.
  24. 유세포 분석으로 형광 접합 항체 염색 세포를 분석하여 SM CD4+ T 세포의 transduction 효율을 평가합니다.
    참고: 이 연구에서 효율적으로 transduction된 SM CD4+ T 세포는 GFP와 같은 레트로바이러스 태그의 높은 발현을 보였습니다.
  25. 단계 5.17의 셀 현탁액을 800× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 디캔테이션으로 상층액을 버립니다. RPMI로 세포 펠릿을 재현탁시키고 세포 밀도를 1 × 107 CD4+Vα2+ SM cells/mL로 조정합니다.
  26. 단계 5.25에서 세포 현탁액 100μL의 정맥 주사를 통해 총 1 × 106 CD45.1+ SM CD4+ T 세포를 각 C57BL/6 수용 마우스(6-8주령)에 입양적으로 전달합니다.
  27. 다음 날, C57BL/6 수혜 마우스를 정맥 주사를 통해 1 × 106 플라크 형성 단위 LCMV Armstrong으로 감염시킵니다.

6. 초기 급성 LCMV 감염 단계에서 레트로바이러스 transduced SM TFH 세포의 유세포 분석

  1. 감염 후 3일째에 5.25단계에서 C57BL/6 마우스에서 비장 세포를 획득합니다.
  2. 3단계에서 설명한 대로 비장 세포에서 CD4, CD45.1, CXCR5, CD25 및 기타 관심 있는 분자를 포함한 표면 마커의 유세포 분석을 수행합니다.
  3. 형광 단백질로 태그된 레트로바이러스로 transductioned SM CD4+ T 세포에서 전사 인자를 검출하기 위해 각 웰에 200μL의 2% PFA를 추가하고 어두운 곳에서 20분 동안 실온에서 배양합니다.
  4. 3단계에서 설명한 대로 고정/투과화, 관심 있는 transcriptional factor의 유세포 분석 염색을 수행하고 유세포 분석을 수행합니다.

결과

급성 LCMV 감염 중 조기 분화 바이러스 특이적 TFH 세포의 특성
바이러스 특이적 TFH 세포의 초기 운명 헌신을 조사하기 위해, LCMV GP 에피토프 I-AbGP66-77을 특이적으로 인식하는 naive congenic SM CD4+ T 세포를 CD45.2+ C57BL/6 수용자에게 입양 전달했습니다. 다음 날, 이 수혜자들은 급성 분해된 LCMV Armstrong의 고용량으로 정맥 주사로 감염되었습니다(그림 1A). 감염 후 3일째에 C57BL/6 수용자의 비장 세포를 유세포 분석으로 분석한 결과, 대량의 CD4.1+ SM CD4+ T 세포(전체 CD4+ T 세포의 ~10%)가 확인되었으며(그림 1B), 이는 추가 조사를 위한 충분한 수의 바이러스 특이적 CD4+ T 세포를 제공했습니다. 전이된 SM CD4+ T 세포에 대한 추가 분석은 CXCR5 및 Bcl-6/TCF-1의 동시 발현과 CXCR5 및 CD25/T-bet의 상호 발현을 보여주었으며, 이에 따라 TFH(CXCR5+Bcl-6+ 또는 CXCR5+TCF-1+) 및 TH1(CXCR5-CD25+ 또는 CXCR5-T-bet+) 계통을 정의했습니다(그림 1C). 연구에서 제시된 CXCR5 항체 염색의 특이성 및 민감도를 평가하기 위해 앞서 언급한 CD45.1+ SM 마우스 라인과 CXCR5-GFP knock-in 마우스 라인을 추가로 교차시켰으며, 이는 Cxcr529의 열린 판독 프레임 이후에 IRES-GFP 구조를 삽입하여 생성되었습니다. 그런 다음, CD45.1+ CXCR5-GFP 리포터 SM 세포를 C57BL/6 수용자로 옮겼다. 이 수혜자들은 LCMV 암스트롱에 감염되었으며, 감염 후 3일째에 그들의 비장 세포를 분석했습니다. 실제로, 연구에서 CXCR5 항체 염색법에 의한 형광 신호는 감염 후 3일차에 전달된 CXCR5-GFP 리포터29개의 SM CD4+ T 세포의 GFP 신호와 미세하게 겹쳤으며(그림 1D), 이는 3단계 CXCR5 항체 염색 방법의 높은 특이성을 나타냅니다.

SM CD4+ T 세포에서 레트로바이러스 기반 Bcl-6 과발현
Bcl-6는 TFH 세포 분화 6,7,8을 촉진하는 가장 중요한 분자 중 하나입니다. 조기 분화된 TFH 세포에 접근하는 데 있어 현재 프로토콜의 신뢰성을 확인하기 위해 CD45.1+ SM CD4+ T 세포를 생체 내에서 활성화하고 MigR1 플라스미드 또는 MigR1-Bcl6 과발현 플라스미드 형질주입된 293T 세포의 레트로바이러스 상등액으로 transduction했습니다(그림 2 및 그림 3A). 레트로바이러스-형질도입된 SM CD4+ T 세포는 다음으로 C57BL/6 수용자에게 입양 전달되었고, 그 후 LCMV Armstrong에 감염되었습니다(그림 3B). 감염 후 3일째에는 MigR1-SM CD4+ T 세포에서 TFH와 TH1 세포의 균형 잡힌 분기가 관찰되었으며, MigR1-Bcl6-SM CD4+ T 세포에서는 TFH 세포 유도 분화가 우세했습니다(그림 3C). 일관되게 Bcl-6 발현 수준은 MigR1-SM CD4+ T 세포에 비해 MigR1-Bcl6-SM CD4+ T 세포에서 향상되었습니다(그림 3D). 따라서, 이소성 Bcl-6 발현 주도 TFH 세포 분화(6)라는 표현형은 본 프로토콜에 따라 정교하게 재현되었다.

figure-results-1
그림 1: LCMV 암스트롱 감염 중 SM TFH 세포의 초기 운명 헌신에 대한 유세포 분석 분석. (A) 실험 설계. CD45.1+ SM 마우스에서 비장 CD4+ T 세포를 수확한 후 C57BL/6 수용자(CD45.2+)에 입양 이식했습니다. 다음 날, 이 수혜자들은 LCMV 암스트롱에 감염되었습니다. 감염 후 3일째에 수혜자의 비장에서 전달된 CD45.1+ SM 세포를 유세포 분석으로 분석했습니다. (B) LCMV 암스트롱 감염 후 3일째에 수혜자의 비장에서 전달된 CD45.1+ SM CD4+ T 세포의 게이팅 전략을 보여주는 대표적인 유세포 분석 데이터. (C) LCMV 암스트롱 감염 후 3일째에 수혜자의 비장에서 전달된 CD45.1+ SM 세포에서 CXCR5 및 기타 TFH 세포 관련 분자(Bcl-6, TCF-1, CD25 및 T-bet)의 동시 염색을 보여주는 대표적인 유세포 분석 데이터. (D) LCMV 암스트롱 감염 후 3일째에 수혜자의 비장에서 전달된 CD45.1+ CXCR5-GFP 리포터 SM 세포에서 CXCR5 및 GFP 신호에 대한 형광 접합 항체의 동시 염색을 보여주는 대표적인 유세포 분석 데이터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: SM CD4+ T 세포의 레트로바이러스 transduction. (A) SM CD4+ T 세포의 레트로바이러스 생산 및 레트로바이러스 형질도입의 개략도. 레트로바이러스 생산을 위해 세포 밀도가 ≥80% confluence에 도달하면 6-well plate에 파종된 293T 세포를 타겟 DNA 플라스미드로 transfection했습니다. 그런 다음, 형질주입 후 72시간 후에 레트로바이러스를 함유하는 세포 배양 상층액을 채취하고 즉시 사용하거나 -80°C에서 보관하였다. SM CD4+ T 세포의 레트로바이러스 형질도입을 위해 CD45.1+ SM 마우스에 200μg의 LCMV GP61-77 펩타이드를 정맥 주사했습니다. 그런 다음 펩타이드 주입 후 16-18시간 후에 SM 마우스에서 비장을 절제하여 비장 CD4+ T 세포의 활성화 상태를 검출하였다. 활성화된 SM CD4+ T 세포를 레트로바이러스가 함유된 배양 상층액으로 transduction하고 transduction efficiency에 접근하기 전에 48시간 동안 in vitro에서 배양했습니다. (B) 플라스미드 DNA transfection된 293T 세포에서 GFP의 형광 현미경 이미징. 척도 막대: 400 μm. (C) naive: mouse(naive, 왼쪽) 또는 LCMV GP61-77 펩타이드 주입 SM mouse(활성화됨, 오른쪽)의 비장 미아 CD4+ T 세포에서 CD25 및 CD69 발현 수준의 유세포 분석. (D) 레트로바이러스 형질도입 SM CD4+ T 세포(형질주입, 왼쪽) 또는 레트로바이러스-비형질주입 SM CD4+ T 세포(비형질주입, 왼쪽)에서 GFP 발현의 유세포 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: SM TFH 세포 운명 헌신에서 Bcl-6 과발현의 효과. (A) IRES-GGP(MigR1-Bcl6)의 업스트림에서 Bcl6 CDS 영역이 있는 레트로바이러스 MigR1 백본(상단 패널) 및 수정된 MigR1 벡터의 선형 맵(하단 패널). (B) 실험 설계. MigR1-형질주입 또는 MigR1-Bcl6-형질주입된 SM CD4+ T 세포는 LCMV Armstrong보다 하루 전에 C57BL/6 수용자(CD45.2+)로 입양 전달되었습니다. 감염 후 3일째에 수혜자의 비장에서 전달된 CD45.1+ SM CD4+ T 세포를 유세포 분석으로 분석했습니다. (C) MigR1 형질주입 또는 MigR1-Bcl6-형질주입 GFP+, SM, CD4+, T 세포에서 CXCR5 및 CD25의 유세포 분석. 게이트에 인접한 숫자는 SM CD4+ T 셀에서 TFH 셀의 주파수를 나타냅니다. (D) MigR1-transduced 또는 MigR1-Bcl6-transduced SM CD4+ T 세포에서 Bcl-6 발현 수준의 유세포 분석. MFI, 평균 형광 강도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

TFH 세포 분야의 연구는 B 세포를 돕는 TFH 세포의 특화된 기능이 발견된 이후 주목을 받았습니다. 축적된 연구는 TFH 세포 분화가 다단계 및 다인자 과정(multistage and multifactorial process)이라는 것을 나타냈다(30), 여기서 TFH 세포 운명 헌신은 초기 단계(early stage5)에서 결정된다. 따라서 조기 분화된 TFH 세포의 기전을 더 잘 이해하는 것은 TFH 세포 생물학 및 합리적인 백신 설계에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 LCMV 암스트롱 바이러스 감염 모델, TCR-형질전환 SM 마우스 및 레트로바이러스 매개 형질도입을 활용하여 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신에 접근하고 조기 분화된 TFH 세포의 유전자 발현을 조작하는 방법을 제공하였다.

케모카인 수용체 CXCR5는 TFH 세포를 다른 CD4+ TH 세포 subset 6,7,8,31과 구별하는 중요한 표면 마커이므로 TFH 세포 연구에서 높은 특이성과 민감도를 가진 CXCR5 염색 방법이 필요합니다. 이 연구에서는 TFH 세포 subset을 식별하기 위해 3단계 streptavidin-biotin CXCR5 염색 방법을 선보였습니다(그림 1C). 특이성 손실은 고감도의 2-또는 3-strep 항체 염색 접근법에서 까다로운 문제 중 하나이지만, 감염 후 3일째에 CXCR5-GFP29 reporter SM CD4+ T 세포의 GFP 신호와 3단계 CXCR5 항체 염색에 의한 형광 신호가 거의 완전히 겹치는 것으로 나타났습니다(그림 1D), 3단계 CXCR5 항체 염색법에 의한 특이성과 민감도 모두의 달성을 시사합니다. 실제로, 이 3-strep CXCR5 염색 전략은 검증되고 신뢰할 수 있으며 연구자들이 TFH 세포 생물학 11,14,15,21 및 기타 CXCR5 발현 T 세포 유형29,32를 더 잘 조사하는 데 도움이 되었습니다.

감염 및 면역 시, TFH 세포의 운명 헌신은 일반적으로 naive CD4+ T 세포를 TFH 세포 또는 non-TFH effector TH 세포 2,3,30으로 분기하여 분화하는 방식으로 모델링됩니다. 이 연구는 전달된 SM CD4+ T 세포에서 TFH 및T H1 세포의 균형 잡힌 분기를 보여주었습니다. 더욱이, 이렇게 전달된 SM CD4+ T 세포는 감염 초기 단계에서 적절한 세포량을 가지고 있어 TFH 세포 분화 연구에 적합한 모델로 작용합니다. 확실히, 전달된 SM CD4+ T 세포에서 레트로바이러스 매개 이소성 Bcl-6 발현은 대조군 SM CD4+ T 세포(86.6% 대 53.8%)에 비해 TFH 세포 분화에 강하게 치우쳐 있었으며(그림 3C), 이는 이전 보고서6과 일치하며 연구에서 설명된 프로토콜의 정확성을 더욱 입증합니다. 대안적으로, 전술한 프로토콜은 또한 조기에 활성화된 SM CD4+ T 세포(11)에서 관심 유전자(예를 들어, bcl6, Tcf7)의 레트로바이러스-매개 knock-down에 적용될 수 있다(데이터는 도시되지 않음).

프로토콜의 한 가지 제한 사항은 타이밍 문제(총 2시간 이상)와 3단계 CXCR5 염색 방법의 다단계 프로세스입니다. 대안적으로, 1단계18,33 또는 2단계 4,9,34 CXCR5 염색법도 T FH 세포 연구에 적용하였다. 이러한 CXCR5 염색 방법의 특이성/민감도에 대한 비교가 필요합니다.

요약하면, 본 연구는 초기에 분화된 바이러스 특이적 TFH 세포에 접근하고 잠재적으로 TFH 세포 분화를 조절하는 관심 유전자를 조사하기 위한 프로토콜을 제공했습니다. 이러한 프로토콜은 초기 TFH 세포 운명 약속에 대한 연구를 촉진할 것입니다.

공개 사항

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 32300785에서 X.C.까지), 중국 국가 혁신 인재 박사 후 과정 (No. BX20230449 to X.C.), 국가 과학 기술 전공 프로젝트(No. 2021YFC2300602 to L.Y.).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% 트립신-EDTA코닝25-052-CI
4% 파라포름알데히드 고정 용액, 4% PFA베요타임P0099-500mL
70 μ m 세포 여과기MerckCLS431751
Alexa Fluor 647 안티 마우스 TCR Vα 2 (클론 B20.1)Biolegend1278121:200 희석
Alexa Fluor 700 안티 마우스 CD45.1 (클론 A20)Biolegend1107241:200 희석
APC 안티 마우스 CD25 (클론 PC61)Biolegend1019101:200 희석
B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) 마우스The Jackson Laboratory002014
BeaverBeads StreptavidinBeaver22321-10
Biotin anti-mouse F4/80 항체 (clone BM8)Biolegend1231061:200 희석
Biotin Rat anti-mouse CD11c (클론 N418)Biolegend1173041:200 희석
Biotin Rat 안티 마우스 CD19 (클론 6D5)Biolegend1155041:200 희석
비오틴 쥐 안티 마우스 CD8a (클론 53-6.7)Biolegend1007041:200 희석
비오틴 쥐 안티 마우스 NK-1.1 (클론 PK136)Biolegend1087041:200 희석
비오틴 쥐 안티 마우스 TER-119 / 에리스로이드 세포 (클론 TER-119)Biolegend1162041:200 희석
소 혈청 알부민, BSA시그마A7906
브릴리언트 바이올렛 421 안티 T-벳 (클론 4B10)바이오레전드 6448161:100 희석
브릴리언트 바이올렛 605 안티 마우스 CD279 (PD-1) (클론 29F.1A12)바이오레전1352201:200 희석
C57BL/6J (B6) 마우스잭슨 연구소000664
CXCR5-GFP 넉인 리포터 마우스사내에서; CXCR5-GFP 넉인 마우스 라인은 Cxcr5의 개방형 판독 프레임 뒤에 IRES-GFP 구조를 삽입하여 생성되었습니다.
DMEM 10% 배지10% FBS DMEM
배지Gibco11885092
EDTASigmaE9884
FACSFortesaBD Biosciences
소 태아 혈청, FBSSigmaF8318
FlowJo (버전 10.4.0)BD Biosciences
Foxp3/Transcription Factor 염색 완충액 세트Invitrogen00-5523-00키트에는 3개의 시약이 포함되어 있습니다: a. 고정/투과화 농축액(4X); b. 고정/투과화 희석제; c. 투과화 완충액.
Goat Anti-Rat IgG 항체 (H+L), BiotinylatedVector laboratoriesBA-9400-1.51:200 dilution
Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging SystemThermoFisher Scientific
Isolation buffer0.5% BSA 및 2mM EDTA
LCMV GP61-77 펩타이드를 함유한 FACS 버퍼 (GLKGPDIYKGVYQFKSV)중국 펩타이드 회사
LIVE/DEAD 고정성 근적외선 데드 셀 염색 키트, 633 또는 635nm 여기용Life TechnologiesL101991:200 희석
MigR1애드겐#27490
NaN3시그마S2002
Opti-MEM 매체Gibco31985070
pCL-Eco애드겐#12371
PE 안티 마우스 CD69(클론 H1.2F3)Biolegend1045081:200 희석
PE 마우스 anti-Bcl-6 (클론 K112-91)BD Biosciences5615221:50 희석
인산염 완충 식염수, PBSGibco10010072
PolybreneSolarbioH8761
정제 쥐 안티 마우스 CXCR5 (클론 2G8)BD Biosciences5519611:50 희석
쥐 단클론 PerCP 안티 마우스 CD4 (클론 RM4-5)Biolegend1005381:200 희석
재조합 쥐 IL-2Gibco212-12-1MG
적혈구 용해 완충액BeyotimeC3702-500mL
RPMI 1640 배지SigmaR8758
RPMI 2%RPMI 1640 배지 2% 함유
FBS SMARTA (SM) TCR 형질전환 마우스저희 연구실의 SM TCR 형질전환 라인은 Rafi Ahmed 박사(에모리 대학교)의 선물입니다. 또한 이 마우스 라인은 The Jackson Laboratory(stain#: 030450)에서도 얻을 수 있습니다.
2% FBS 및 0.01% NaN3염색 완충액
eBioscience25-4317-821:200 희석
TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) 세포 신호 전달 기술6444S1:400 희석
TFH 세포 염색 완충액1% BSA 및 2% 마우스 혈청 함유 FACS 완충액
TransIT-293 시약Mirus BioMIRUMIR2700
드 Streptavidin PE-Cyanine7을 함유한 PBS

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급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근
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