RGD 기능성 Avidin-Biotin 테더를 사용한 혈소판 이동을 연구하기 위한 In vitro 분석

요약

조정 가능한 밀도를 가진 RGD 기능화된 avidin-biotin tethers를 사용하여 단일 이동 혈소판을 이미징하기 위한 자세한 프로토콜이 제공되어 혈소판이 avidin-biotin 결합을 파열하기에 충분한 힘을 생성한다는 것을 밝혔습니다.

초록

혈소판은 핵이 없는 세포 조각임에도 불구하고 이제 다방면의 능력으로 널리 인정받고 있습니다. 부상 후 출혈을 방지하기 위해 혈전을 형성할 뿐만 아니라 감염과 싸우고 염증성 질환 중에 혈관 무결성을 유지합니다. 지혈 플러그는 혈소판의 집단적 활성화와 응집을 필요로 하지만, 염증이 있는 혈관을 보호하는 역할은 단세포 수준에서 수행됩니다. 이러한 맥락에서 최근 데이터는 혈소판이 자율적으로 이동할 수 있으며, 이 과정은 접착 환경의 기계적 감지에 따라 달라지는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 폴리-L-라이신 그라프트 폴리(에틸렌 글리콜)(PLL-PEG)-비오틴 골격(1), 형광 아비딘 링커(2) 및 비오틴 고리형 Arg-Gly-Asp(cRGD)(3)로 구성된 3층 코팅 시스템을 혈소판 인테그린 결합 모티프로 활용하여 단일 혈소판 이동을 이미징하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 환원주의적 접근법은 기질 접착 특성을 정밀하게 제어할 수 있게 해주며 혈소판 이동의 기저에 있는 메커니즘을 연구하기 위한 간단하고 표준화된 체외 분석 역할을 합니다. 결과는 cRGD에 결합하는 이동하는 혈소판이 아비딘-비오틴 결합을 파괴할 수 있는 힘을 가한다는 것을 나타냅니다. 또한, 비오틴-cRGD의 밀도는 혈소판 확산과 이동 모두에 큰 영향을 미칩니다.

서론

혈소판은 골수에 있는 거핵세포에서 유래한 작은 핵 세포 조각입니다. 활성화된 혈소판은 생리학적 지혈에서 혈관 병변을 봉합하거나 병리학적 혈전증에서 병든 혈관을 막기 위해 혈전의 기초를 형성하는 응집체로 뭉칩니다¹. 그러나 최근 수십 년 동안 혈소판이 염증, 감염 및 악성 종양의 병태생리학에서도 중심적인 역할을 한다는 사실이 명백해졌으며, 면역 세포, 암세포 및 침입 병원체와의 다면적인 상호 작용이 숙주 면역 반응을 형성하는 데 매우 중요합니다 ^2,3. 최근 데이터에 따르면 혈소판은 자율적으로 이동할 수 있는 능력이 있는 것으로 나타났습니다⁴. 전신 세균혈증에 대한 반응으로 혈소판은 간 정현파로 모집되어 부착하고 이동합니다. 이동을 통해 혈소판은 박테리아를 포획하고 결합할 수 있으며, 이는 다시 백혈구 활성화를 지원합니다. 특히 혈소판은 이 과정에서 혈관내에 남아 있으며 내피하 조직으로 이동하지 않는다⁴. 또한 혈소판은 혈관 염증의 파수꾼으로, 염증이 있는 혈관에서^{면역 세포의} 외부로 인한 미세 손상을 스캔하고5 염증이 있는 혈관을 보호하기 위해 이동을 사용합니다 ^6,7. 여기서 혈소판은 인테그린을 사용하여 염증이 있는 내피에 침착된 피브리노겐과 결합합니다. 그런 다음 혈소판은 주변의 접착 특성을 스캔할 수 있는 층상구 돌출부를 형성합니다. 그런 다음 혈소판은 분극화되어 더 높은 밀도의 섬유소물질로 이동하는데, 이는 합당택시(haptotaxis)로 알려진 과정입니다. 유도된 혈소판 이동은 궁극적으로 근육과 폐를 포함한 염증 조직의 출혈을 방지하는 내피 미세병변에 위치를 정하는 것을 지원합니다.

혈소판 이동은 접착 기질의 기계적 특성에 크게 의존합니다 ^4,8. 환경의 기계적 특성을 감지하고 전달하는 작업은 주로 인테그린 수용체(integrin receptor)에 의해 매개되며, 이는 세포외 기질의 리간드에 결합하는 α 및 β 서브유닛으로 구성된 막관통 이질이량체 단백질이며, 세포 외 도메인은 어댑터 단백질을 통해 액틴 세포골격에 결합합니다 ^9,10. 가장 풍부한 혈소판 인테그린은 α_{IIbβ 3이며,} 주요 리간드는 피브린(ogen)¹¹입니다. 인테그린-리간드 결합은 부착 혈소판⁷의 선두 가장자리를 형성하는 Arp2/3 유도 층상쇄(lamellipodium)의 형성으로 절정에 이르는 신호 전달 이벤트를 트리거합니다. 접착성 혈소판은 접착 환경을 잡아당겨 기계적 특성을 즉시 조사합니다⁴. 미오신 IIa에 의존하는 당기는 힘이 세포외 기질(예: 피브린(ogen)))의 기계적 안정성을 극복할 때, 혈소판은 약화된 리간드를 기계적으로 파열시키고 층상구 돌출부를 사용하여 미세환경에서 접착 리간드를 스캔하고, 새로운 기질 결합을 설정하고, 리간드가 고갈된 환경에서 멀어집니다⁶. 비단백질 분해, 기계적 리간드 고갈에 의해 주도되는 세포 이동은 접착 매트릭스를 기계적으로 리모델링할 수 있는 세포에서 관찰되는 일반적인 현상으로 보이기 때문에 혈소판 기능을 넘어서는 역할을 할 가능성이 높습니다⁸. 리간드 고갈 속도는 이동 속도를 결정하고 리간드 안정성과 기질의 리간드 밀도 모두에 따라 달라집니다⁸. 낮은 리간드 밀도의 혈소판은 약 160 피코네톤(pN)12,13,14,15의 비오틴-아비딘 테더가 있는 유리 커버슬립^{에 결합된 엔지니어링}된 인테그린 리간드(cyclic Arg-Gly-Asp(cRGD⁾⁾를 기계적으로 파괴할 수 있습니다.

여기에서 이러한 관찰은 리간드가 불안정한 접착 표면을 생성하기 위한 간단한 체외 프로토콜을 개발하여 혈소판 이동 메커니즘에 대한 연구를 촉진하는 데 활용됩니다. 이 프로토콜에 요약된 접착 코팅은 (1) PLL-PEG-비오틴 골격 및 (2) (3) 비오틴-cRGD(접착성 리간드)와 PLL-PEG-비오틴 골격에 대한 (접착 리간드)의 결합을 용이하게 하는 뉴트라비딘-플루오레세인 이소티오시아네이트(NA-FITC) 링커의 세 가지 필수 요소로 구성됩니다( 그림 1B 참조). 이 구축물의 안정성은 비오틴-아비딘 결합의 강도에 따라 달라지며, 이는 (A) PLL-PEG-비오틴-NA-FITC 또는 (B) FITC-NA-비오틴-cRGD 계면에서 끊어질 수 있습니다. 또한 접착 리간드의 밀도는 맨 아래 층에서 PLL-PEG에 대한 PLL-PEG-비오틴의 비율을 조정하여 조정할 수 있습니다. 결합(A)이 중단되면 코팅에서 FITC가 방출되어 이동하는 혈소판 아래의 형광 신호가 감소합니다. 따라서 이 프로토콜에 설명된 코팅은 기계적 및 접착 기질 특성을 정밀하게 조정할 수 있게 하고 혈소판 이동을 형광 기반으로 쉽게 판독할 수 있도록 합니다.

프로토콜

본 연구에서 수행된 동물실험은 생쥐를 대상으로 한 연구에 대한 모든 관련 윤리 규정을 준수하여 수행되었으며 동물 보호에 관한 현지 법률(Regierung von Oberbayern, Munich, 190-15, 2015)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 생후 8-10주(체중 20-25g)의 암컷 및 수컷 C57BL/6마리의 마우스를 사용하였다. 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 비오틴-뉴트라비딘-비오틴 cRGD 코팅

1. 20 % HNO₃ 내에서 1 분 동안 유리 커버 슬립 (24 mm x 24 mm, # 1.5)을 초음파 처리 한 다음 이소프로판올, 에탄올 및 H₂O 내에서 1 분 동안 초음파 처리합니다. 각 초음파 처리 후 커버 슬립을 증류수 (ddH₂O)로 광범위하게 헹구고 마지막으로 인큐베이터에서 건조시킵니다.
2. 플라즈마 클리너에서 O₂ 플라즈마로 사전 세척된 커버슬립을 2분 동안 처리한 다음 앞서 설명한 대로 끈적한 슬라이드로 조립합니다¹⁶. 끈적한 슬라이드와 유리 커버슬립은 그들 사이에 채널을 형성합니다( 그림 1A 참조).
   참고: 효율적인 플라즈마 치료가 중요합니다. O₂ 를 플라즈마 소스로 사용하십시오.
3. 97.5μL의 PLL-PEG(1mg/mL)에 희석된 2.5μL의 PLL-PEG-비오틴(1mg/mL)으로 채널을 채우고 실온(RT)에서 30분 동안 배양한 다음 PBS로 3회 세척합니다. PLL-PEG-비오틴은 다음 단계에서 뉴트라비딘과 결합하고, PLL-PEG 골격은 단백질과 혈소판의 비특이적 결합을 방지하는 불활성 기질을 형성합니다.
   참고: 코팅 용액 내 PLL-PEG-비오틴의 농도는 cRGD 리간드의 최종 밀도를 정의합니다.
4. 100 μL의 Neutravidin-FITC (25 μg/mL)를 넣고 RT에서 30분 동안 암흑 속에서 배양한 다음 PBS로 3회 세척합니다.
   참고: Neutravidin-FITC 농도를 PLL-PEG-비오틴 농도로 조정합니다. 더 높은 PLL-PEG-비오틴 밀도가 코팅된 경우 Neutravidin-FITC 농도를 증가시킵니다.
5. cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys (Biotin-PEG-PEG)] (cRGD-biotin) (0.1-1 μM) 100 μL를 첨가하고 RT에서 30 분 동안 배양 한 다음 PBS로 3 회 세척합니다. 커버슬립을 사용할 준비가 되었습니다. 코팅의 개략도는 그림 1B에 나와 있습니다.

2. 혈액에서 마우스 혈소판 분리

1. 136.9mM의 NaCl, 12.1mM의 NaHCO₃, 2.6mM의 KCl, 5.5mM의 포도당, 10mM의 HEPES를 포함하는 변형된 Tyrode 완충액을 준비하고 pH를 7.4 및 6.5로 조정합니다.
2. 0.5mg/kg 펜타닐, 5mg/kg 미다졸람 및 0.05mg/kg 메데토미딘의 복강내 주사로 마우스(제도적으로 승인된 프로토콜에 따름)를 마취합니다. 발가락 꼬집기로 마취 깊이를 확인한 후 가위로 흉부 피부를 제거합니다.
3. 항응고제로 150μL ACD(Acid-Citrate-Dextrose)가 함유된 2mL 주사기(26G 바늘)를 준비합니다. 흉골 왼쪽의 두 번째와 세 번째 갈비뼈 사이에 바늘을 삽입하여 심장에서 혈액을 뽑습니다. 그 후, 경추 탈구로 마우스를 안락사시킵니다.
   참고: (1) ACD 완충액 조성: 포도당 111mM에 구연산나트륨 삼염기성 탈수물 85mM 및 구연산 일수화물 65mM. (2) 혈액 채취는 혈전 형성을 방지하기 위해 원활하게 이루어져야 합니다. 8-10주 된 생쥐에서 약 1mL의 혈액을 얻을 수 있습니다.
4. 5mL FACS(폴리스티렌 둥근 바닥) 튜브에 혈액을 1mL Tyrode's buffer(pH 6.5)와 혼합하고 브레이크를 끈 상태에서 상온에서 20분 동안 70 x g 으로 원심분리합니다.
5. 원심분리 후 혈소판 풍부 혈장(PRP)이 함유된 상부(약 1mL)를 취합니다. Tyrode의 완충액 3mL(pH 6.5)와 혼합하고 100ng/mL 프로스타사이클린(PGI₂)을 첨가하여 혈소판 활성화를 방지합니다.
6. RT에서 5분 동안 1200 x g 에서 원심분리기를 하고, 상층액을 버리고, 펠릿을 Tyrode의 완충액 500μL(pH 6.5)에 재현탁하고, 혈구계를 사용하여 혈소판 수를 측정합니다.

3. 비오틴-뉴트라비딘-비오틴 cRGD 코팅에 의한 마우스 혈소판 이동

1. 변형된 Tyrode의 완충액(pH 7.4)에 10 x 10³/μL 마우스 혈소판, 1mM의 CaCl₂, 2μM의 U46619 및 4μM의 아데노신 5'-이인산나트륨염(ADP)을 보충하고 1단계에서 준비한 채널에 총 부피 240μL를 피펫팅합니다.
2. 스테이지 인큐베이터가 장착된 도립 현미경을 사용하여 실시간 혈소판 이동을 기록합니다. 또는 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 채널을 배양합니다.
3. RT에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 샘플을 고정하고 PBS로 5회 세척합니다.
4. Triton-X(PBS의 경우 0.2%)로 혈소판을 5분 동안 투과하고 PBS로 5회 세척합니다.
5. 2.5μL의 Alexa Fluor 594 팔로이딘(40x 메탄올 스톡)을 100μL의 PBS에 희석합니다. 어두워질 때 30분 동안 혈소판으로 배양한 다음 PBS로 5번 세척합니다.
6. 형광 현미경으로 슬라이드를 이미지화합니다.

4. 정량화

참고: filopodia(손가락 모양의 돌기) 또는 lamellipodia(시트와 같은 돌기)를 형성하는 혈소판은 부착 혈소판으로 계산되었습니다⁴. 이동 거리가 직경의 하나 이상인 혈소판은 이동 혈소판으로 정의되었습니다.

1. Fraction of moving platelets(이동하는 혈소판의 비율): 피지에서 Multi Point 도구를 사용하여 혈소판 부착 또는 이동 수를 계산합니다. 도구 모음에서 Point Tool 의 드롭다운 메뉴를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 Multi-point 도구를 선택합니다. 이동하는 혈소판의 수를 접착 혈소판의 수로 나누어 이동하는 혈소판의 비율을 계산합니다.
2. Mean distance of migration: Free Hand Line Tool을 사용하여 neutravidin-FITC-coating에 "각인된" 이동 경로의 길이를 측정하여 고정된 샘플로부터의 이동 거리를 추출합니다. 도구 모음에서 Straight Line 의 드롭다운 메뉴를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 Free Hand Line 도구를 선택합니다.
3. 혈소판 모양 설명자: Threshold 기능을 사용하여 형광 혈소판(Alexa594-Phalloidin)을 분할하여 이진 마스크를 생성합니다. 도구 모음에서 이미지 > Adjust > Threshold(임계값 조정 )를 선택합니다.
4. 영역, 둘레, 원형도 및 종횡비와 같은 형상 설명자는 입자 분석에서 얻을 수 있습니다. 분석 > 측정 설정에서 형상 설명자를 선택한 다음 분석에서 결과 표시 > 입자 분석을 선택합니다.

결과

활성화된 혈소판은 PLL-PEG-비오틴-뉴트라비딘-FITC-비오틴-cRGD 코팅된 슬라이드(그림 1C 및 그림 2A, 0분 및 5분)에 쉽게 부착 및 확산된 후 앞쪽 가장자리에 층상쇄를 형성하여 분극화됩니다(그림 2A, 10분). 이 과정에서 가성핵(pseudonucleus, 혈소판 중앙의 어두운 영역)이 혈소판 중앙에서 뒤쪽으로 이동했습니다(그림 2A). 그런 다음 분극된 혈소판은 뚜렷한 방향성 없이 이동하기 시작합니다(그림 2A, 15분 및 20분 및 그림 2B). PLL-PEG-비오틴-뉴트라비딘-FITC-비오틴-cRGD 코팅으로 이동하는 혈소판이 뉴트라비딘-FITC-비오틴-PLL-PEG 결합을 끊을 수 있음을 관찰했으며, 이는 이동 경로를 따라 형광 강도가 감소하는 것으로 입증되었습니다(그림 1C 및 그림 2A,B). 또한, 파괴된 뉴트라비딘-FITC-비오틴-cRGD 복합체는 혈소판 표면에 축적됩니다(그림 2A,B). 이 현상은 이동하는 혈소판이 기질에서 피브리노겐을 제거하고 개방 이관 시스템(OCS) 내에 축적된 이전 발견과 유사합니다⁴.

리간드 밀도가 혈소판 이동에 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위해 첫 번째 코팅층에서 PLL-PEG-비오틴과 PLL-PEG의 비율을 변경하여 cRGD 밀도를 조정했습니다. 이러한 데이터는 마우스 혈소판이 2.5% 농도의 PLL-PEG-비오틴에서 최적의 이동을 달성한다는 것을 보여줍니다. 이동은 PLL-PEG-비오틴의 농도가 낮은(1%) 및 높은(10%) 농도 모두에서 감소합니다(그림 3A, B). 이러한 기질 의존적 이동 행동의 변화는 혈소판 형태의 변화를 동반합니다(그림 3C). 낮은 리간드 밀도(1%)에서는 혈소판이 적절하게 퍼지지 않으며, 이는 돌출된 혈소판 면적과 둘레가 낮다는 것이 입증됩니다(그림 3C). 이는 불충분한 인테그린 활성화와 아웃사이드-인 신호전달⁷을 시사한다. 결과적으로, 혈소판은 cRGD 리간드에 힘을 가할 수 없고, 기질을 리모델링하지 못하며, 이동하지 않습니다(그림 3A,B).

중간 리간드 밀도(2.5%)에서는 혈소판 면적과 둘레가 크게 증가합니다(그림 3C). 혈소판은 효과적으로 퍼져 불안정한 cRGD 리간드를 기계적으로 파괴하고 이동합니다(그림 3A, B). 그러나 높은 리간드 밀도(10%)에서는 확산이 증가하더라도 혈소판이 분극화되지 않으며, 이는 종횡비의 감소로 나타납니다(그림 3C). 이러한 조건에서 혈소판은 끈적끈적한 기질에 부착된 상태로 유지되며 불안정한 cRGD 리간드를 파괴할 수 없기 때문에 이동하지 않습니다(그림 3A, B).

이러한 결과는 혈소판 이동이 기질의 접착 특성에 크게 의존한다는 것을 보여줍니다. 혈소판은 접착 리간드와 충분히 결합하고 동시에 접착 기질의 인장 내성을 극복할 수 있을 만큼 충분히 강한 견인력을 생성할 때만 이동할 수 있습니다 ^4,6,7,8.

그림 1: 코팅 절차 및 혈소판-기질 상호 작용의 라이브 이미징. (A) 조립된 챔버의 사진. (B) 프로토콜의 원칙. 왼쪽: 코팅의 개략도. 플라즈마 처리된 유리 커버슬립은 3개의 층으로 코팅되었습니다. 첫 번째 층은 PLL-PEG와 PLL-PEG-비오틴의 혼합물입니다(PLL-PEG 골격은 세포에 불활성이며 불특이적 결합을 방지합니다). 두 번째 층은 뉴트라비딘-FITC이고 세 번째 층은 비오틴-cRGD입니다. Neutravidin-FITC 는 PLL-PEG-비오틴과 비오틴-cRGD를 연결합니다. 혈소판은 원형질막의 인테그린(integrins)을 통해 비오틴-cRGD에 결합합니다. 오른쪽: 혈소판 인테그린에 의해 결합이 해제되는 비오틴-아비딘의 그림. 혈소판은 인테그린-cRGD 결합을 통해 기질에 힘을 가하고 상부 cRGD-비오틴 - 뉴트라비딘 - FITC - 결합 또는 하부 뉴트라비딘-FITC - PLL-PEG-비오틴 - 결합을 파열시킵니다. 뉴트라비딘-FITC(뉴트라비딘-FITC)와 비오틴-PLL-PEG 사이의 하부 결합이 파열되면 형광 신호가 감소하지만, 비오틴-cRGD와 뉴트라비딘-FITC(뉴트라비딘-FITC) 사이의 상부 결합이 파열되면 형광 신호가 감소하지 않습니다.(C) 혈소판 이동과 불안정한 cRGD-리간드의 고갈을 보여주는 시계열. 형광이 감소한 영역은 혈소판의 이동 경로를 나타내고( 그림 2A 참조), 형광이 증가한 영역은 이동하는 혈소판에 FTIC-neutravidin-biotin-cRGD 축적을 나타냅니다. 스케일 바: 5μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 리모델링된 기질에 의해 인코딩된 혈소판 이동의 면역형광 영상. (A) 단일 혈소판 이동의 대표적인 영화 시퀀스. 왼쪽: 이동하는 혈소판의 위상차 이미지. 혈소판은 앞쪽 가장자리에 층상족(lamellipodium)을 형성하여 편광되고 이후에 이동합니다. 오른쪽: Neutravidin-FITC가 기질에서 제거되어 혈소판 이동의 "발자국"이 남았습니다. 파열된 cRGD-비오틴-뉴트라비딘-FITC는 이동하는 혈소판의 중심에 축적됩니다. (B) 리간드 불안정 cRGD-비오틴-아비딘 코팅의 혈소판 이동의 대표적인 이미지. 상부: 팔로이딘(Alexa FluorTM 594)으로 염색된 혈소판은 큰 층상쇄 형성과 이동하는 혈소판을 연상시키는 편광 모양을 보였습니다. 이동하는 혈소판은 cRGD-비오틴-뉴트라비딘-FITC 결합을 파열시켜 감소된 FITC 신호로 표시된 기질에서 이동 경로를 생성합니다. 아래: 확대 배율이 크게 자른 이미지입니다. (C) 피지에서 이주 경로는 노란색 선으로 수동으로 그렸습니다. 스케일 바: 5μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: PLL-PEG-비오틴과 PLL-PEG의 비율은 혈소판 이동 및 모양을 결정합니다. (A) 1%, 2.5% 및 10% PLL-PEG-비오틴 코팅의 혈소판 대표 이미지, 스케일 바: 5μm. (B) 혈소판 부착, 이동 효율 및 이동 거리의 정량화, n = 4개의 독립적인 실험; 평균/SD; 편도 ANOVA/Tukey; **p < 0.01; 피 < 0.001; p < 0.0001, ns: 유의하지 않음 (C) 혈소판 모양 설명자(면적, 둘레, 진원도 및 종횡비)의 정량화, n = 4개의 독립적인 실험; 평균/최소-최대; 편도 ANOVA/Tukey; **p < 0.01; 피 < 0.001; p < 0.0001, ns: 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜에서는 (1) PLL-PEG-비오틴 골격과 (2) (3) 비오틴-cRGD(접착성 리간드)를 PLL-PEG-비오틴 골격( 그림 1B 참조)에 결합하는 것을 용이하게 하는 뉴트라비딘-FITC 링커로 구성된 3층 코팅 절차가 제시되며, 이는 PLL-PEG-비오틴과 PLL-PEG의 비율을 변화시켜 기계적 및 접착 기질 특성의 정확한 조정성을 허용하고 혈소판 이동에 대한 쉬운 형광 기반 판독을 제공합니다. 이 프로토콜은 FITC 복합 뉴트라비딘 및 Alexa Fluor 594 복합 팔로이딘을 사용하여 혈소판 이동 및 모양을 추적하지만 다른 형광단 접합 아비딘 및 팔로이딘을 사용할 수 있습니다. 혈소판 활성제뿐만 아니라 PLL-PEG, PLL-PEG-비오틴, 뉴트라비딘-FITC, cRGD-비오틴을 포함한 모든 코팅 시약이 시판되고 있기 때문에 이 실험은 많은 추가 노력 없이 수행할 수 있습니다. 비효율적인 플라즈마 처리는 PLL-PEG/PLL-PEG-비오틴이 기질에 부적절하게 결합되어 혈소판 접착 및 이동에 실패하기 때문에 중요한 단계는 혈장 처리입니다. 플라즈마 클리너의 성능이 중요합니다. 일반적으로 13.6MHz 발생기가 있는 플라즈마 클리너는 40KHz 또는 100KHz의 플라즈마 클리너보다 성능이 좋습니다. 또한 산소 플라즈마 소스가 주변 공기보다 더 적합합니다. 성공적인 플라즈마 처리 후 코팅 단계에서 오류가 거의 발생하지 않습니다.

혈소판은 이전에 중간엽 이동 모드를 사용하는 것으로 나타났으며, 이는 기질 접착에 크게 의존합니다 ^4,17. 섬유아세포(fibroblast)와 유사하게, 낮은 리간드 밀도는 혈소판이 기질에 달라붙는 데 어려움을 겪을 때 이동을 방해하는 반면, 높은 리간드 밀도는 단단한 접착력의 이탈을 방지하여 이동을 방해합니다¹⁸(그림 3). 중간 밀도에서는 혈소판이 부착되지만 인테그린 결합당 미오신 IIA 의존적 당기는 힘은 여전히 유착을 끊기에 충분합니다. 인테그린 α_{IIbβ 3}과 리간드 피브린(ogen) 사이의 높은 친화력으로 인해 접착 리간드가 분리되는 것이 아니라 생체 내 내피 세포 또는 시험관 내 커버슬립과 같은 기본 기질로부터의 파열 또는 분리를 통해 접착력이 분해된다는 점은 주목할 만합니다 ^4,6. 기저 기질에서 피브리노겐을 분리하는 데 필요한 결합을 해제하는 힘은 종종 제어하기 어려운 물리적 및 (생체적) 화학적 특성의 영향을 크게 받으며, 이는 이동 효율성에 상당한 변동을 초래할 수 있습니다. 여기에 소개된 분석은 이 문제를 해결하기 위한 환원주의적 접근 방식을 제공합니다. 그러나 아비딘-비오틴 결합의 파괴력은 약 160pN으로 고정되어 있으므로 이중 가닥 DNA 테더를 기반으로 하는 것과 같은 보다 정교한 장력 센서를 사용하여 더 낮은 힘 체제에서 혈소판 접착을 연구해야 합니다¹⁹.

이전 연구에서는 혈소판 이동이 생체 내 박테리아 감염 및 혈관 염증에 관여한다는 것을 발견했습니다. 결과적으로, 손상된 미오신 수축성(myosin contractility), 액틴 중합화(actin polymerization) 또는 인테그린 아웃사이드-인(integrin outside-in) 신호전달과 같은 이동 결함이 있는 혈소판은 박테리아 제거 및 혈관 무결성 손상(damaged bacteria clearance and vascular integrity)을 보여줍니다 ^4,6,7. 여기에 제시된 분석법은 간단하고 안정적이므로 소분자 억제제와 혈소판 이동에 대한 저분자 억제제의 효과를 스크리닝하는 데 적합합니다. 염증 또는 혈전증의 치료 대상을 탐색할 수 있는 새로운 체외 도구를 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아데노신 5&프라임;-디포스페이트 나트륨 염 (ADP)	시그마-알드리치	A2754
알렉사 플루오르 594 팔로이딘	Thermofisher	A12381
혈액 카운터	Sysmex	XN-1000
바닥이 없는 6 채널 스티키 슬라이드	IBIDI, 스티키 슬라이드 VI0.4	80608
원심분리기	Eppendorf	5804
컨포칼 현미경	Zeiss	LSM880
cyclo [Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(Biotin-PEG-PEG)]	펩타이드 국제	PCI-3697-PI
FACS 튜브	Corning 브랜드
FITC 접합체 뉴트라비딘	써모피셔	A2662
포름알데히드	Thermofisher	28908
HEPES 용액	Sigma-Aldrich	H0887
위상차 및 에피 형광 현미경	Olympus	IX83
플라즈마 클리너	Diener	116531
PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-비오틴(50%)	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-비오틴(50%)
폴리(L-라이신)- 그라프트-폴리(에틸렌 글리콜) 공중합체	Susos	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)
프로스타글란딘 I2 나트륨 염(PGI2)	Abcam	ab120912
Sonicator	BANDELIN	SONNOREX RK514M
Ttriton X-100 20% v/v	Cayman Chemical
U46619	엔조 생명과학	BML-PG023-0001)