방법 논문

single-cell RNA sequencing을 위한 인간 및 생쥐 종양 조직 샘플의 해리

DOI:

10.3791/66766

⸱

2024년 8월 16일

 ,  ,  ,  , 
1Krantz Family Center for Cancer Research, Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Medicine, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 위해 인간 및 마우스 종양 샘플을 빠르게 해리하는 절차를 간략하게 설명합니다.

초록

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인간 종양 샘플은 미세환경과 면역 레퍼토리에 대한 많은 정보를 보유하고 있습니다. 인체 조직 샘플을 생존 가능한 세포 현탁액으로 효과적으로 해리하는 것은 단일 세포 RNA 염기서열분석(scRNAseq) 파이프라인에 필요한 입력입니다. 벌크 RNA 염기서열분석 접근법과 달리 scRNAseq를 사용하면 단일 세포 수준에서 종양 검체의 전사 이질성을 추론할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 이 접근법을 통합함으로써 면역 및 종양 세포 상태를 식별하고 면역 요법 및 기타 유형의 치료에 대한 임상 반응과 관련된 프로그램과 같은 많은 발견으로 이어졌습니다. 또한, 해리된 조직에 적용되는 단일 세포 기술은 DNA 바코드 항체(CITEseq)를 사용하여 접근 가능한 염색질 영역, T 및 B 세포 수용체 레퍼토리, 단백질 발현을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

해리된 샘플의 생존율과 품질은 단일 세포와 주변 RNA의 교차 오염, 데이터 품질 및 해석에 큰 영향을 미칠 수 있기 때문에 이러한 기술을 사용할 때 중요한 변수입니다. 또한, 긴 해리 프로토콜은 민감한 세포 집단을 제거하고 스트레스 반응 유전자 서명의 상향 조절로 이어질 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 여러 유형의 인간 및 쥐 종양에 대해 검증된 신속한 보편적 해리 프로토콜을 고안했습니다. 이 과정은 기계적 및 효소적 해리로 시작하여 여과, 적혈구 용해 및 살아있는 시체 농축으로 이어지며, 세포 투입이 적은 샘플(예: 바늘 코어 생검)에 적합합니다. 이 프로토콜은 Gel Bead-In Emulsion(GEM), 바코드 및 시퀀싱의 성공적인 생성에 가장 중요한 깨끗하고 실행 가능한 단일 세포 현탁액을 보장합니다.

서론

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암 연구의 많은 발전으로 면역 및 종양 세포에서 발현되는 억제 수용체를 표적으로 하는 관문 차단 억제제(checkpoint blockade inhibitors)가 개발되어 FDA의 승인을 받았지만, 치료 내성 및 환자 반응을 유도하는 메커니즘을 규명하는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다1. 분자 다양성에 대한 종양의 이질성과 종양 세포와 면역 미세환경 간의 복잡한 상호 작용을 특성화하는 복잡한 과제로 인해 이 복잡한 생태계를 단일 세포 해상도로 해부하기 위한 새로운 접근 방식이 필요합니다. 종양과 종양의 미세환경 내의 분자 복잡성을 이해하는 것은 치료 전략을 발전시키고 암 진행의 기저에 있는 복잡한 생물학을 해독하는 데 중추적인 역할을 합니다2. 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)은 복잡한 종양 샘플 내 개별 세포에 대한 고분해능 분석을 제공하기 때문에 점점 더 대중화되고 있습니다 3,4.

유전적, 후성유전학적, 표현형의 다양성을 포괄하는 종양 이질성은 암 생물학의 복잡성을 밝히는 데 어려움을 제기한다5. 벌크 RNA 염기서열분석의 기존 방법은 종양 내에 존재하는 이질적인 세포 집단의 고유한 발현 프로파일과 표현형을 모호하게 하는 경향이 있는데, 이는 이러한 방법이 전체 세포 집단에서 신호를 평균화하기 때문이다4. 대조적으로, scRNA-seq는 개별 세포 유형을 해부할 수 있어 다양한 유전자 발현, 억제 패턴 및 세포 상태를 밝혀낼 수 있습니다 4,6. scRNA-seq의 전제는 개별 세포의 유전 및 분자 서명을 해독할 수 있는 능력에 있으며, 이는 새로운 암 치료제를 발견하는 데 엄청난 가능성을 가지고 있습니다7.

종양 세포와 주변 기질 및 면역 세포의 유전자 발현 프로파일을 해독함으로써 연구자들은 새로운 치료 표적을 식별하고 개별 환자에 맞는 정밀 유전 의학 전략을 개발할 수 있습니다6. 또한, 종양 미세환경 내에서 면역 레퍼토리를 해부하면 종양 세포와 면역 효과기 간의 상호 작용에 대한 중요한 통찰력을 제공하여 면역 치료 개입을 위한 길을 닦을 수 있습니다3. 임상 샘플에 scRNAseq를 사용하는 기술의 발전에도 불구하고 처리 단계 중 몇 가지 문제가 발생하면 세포의 RNA 무결성, 생존력 및 생성된 데이터의 품질에 해를 끼칠 수 있습니다. 더욱이, 세포 생존율이 낮은 조직을 처리하면 개별 세포의 캡슐화 중에 생성된 액적의 주변 RNA 수준이 증가하여 세포 유형의 교차 오염 및 잘못된 주석이 발생할 수 있으며, 37°C에서 수행되는 긴 해리 프로토콜은 여러 세포 유형에서 스트레스 반응 유전자 서명의 상향 조절로 이어질 수 있습니다 8,9, 10.

이 프로토콜에 요약된 단계적 절차(그림 1A)는 종양의 신속한 기계적 및 효소적 해리로 시작하여 각 종양 샘플의 생존력에 따라 여과 및 죽은 세포 제거로 이어집니다. 현재 이 시술은 흑색종11, 결장직장12, 두경부 편평세포암13, 췌장 및 폐(미공개 데이터) 종양 샘플에서 검증되었습니다. 이러한 기술은 다운스트림 분석에 중요한 고품질의 생존 가능한 세포 현탁액의 생성을 보장합니다14. 특히, 합성된 RNA가 없는 적혈구를 제거하는 것은 샘플을 정제하기 위해 필수적입니다15. 세포 수의 후속 평가와 죽은 세포의 제거는 성공적인 10x Genomics Gel bead-in Emulsion(GEM) 생성, 바코드 및 민감한 집단(예: 호중구 및 상피 세포)의 배제를 위태롭게 하지 않으면서 전사체 및 염기서열 세포의 회수율을 높이기 위한 전제 조건입니다16. 이러한 단계는 종양 샘플9,10 내에서 단일 세포 분해능 분석의 잠재력을 발휘하고, 혁신적인 치료 개입을 추진하는 데 필요한 새로운 유전자 발현 프로필 및 면역 서명을 발견하고, 새로운 종양 취약성을 식별하는 데 필수적입니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 인체 조직 샘플링에 관한 모든 기관 지침을 준수했습니다. 환자로부터 정보에 입각한 동의를 받았으며 식별 가능한 샘플 데이터는 익명으로 처리되었습니다. 검체는 수술실에서 채취하여 RPMI, 식염수 또는 PBS 용액에 넣고 연구에 사용하기 전에 병리학 부서를 통해 암으로 확인합니다. 표시된 경우를 제외한 모든 단계는 4 °C 또는 얼음 위에서 수행해야 합니다. 인체 조직을 처리할 때 생물 안전 후드 내부에서 작업하십시오. 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 시약 및 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 샘플 얻기

  1. 배지 튜브에서 고형 종양 샘플을 얻어 얼음 위에 놓습니다.
    1. 검체 탈수를 방지하기 위해 조직을 완전히 담글 수 있도록 충분한 RPMI, 식염수 또는 PBS가 포함된 튜브에 검체를 운반하도록 수술실 직원에게 지시합니다.
      참고: 샘플이 건조되지 않았는지 확인하는 것이 중요한데, 이는 생존력을 감소시키기 때문입니다.
  2. 모든 원심분리기를 4°C로 냉각하고 열 혼합기를 37°C로 낮춥니다.
  3. 준비된 인간 또는 생쥐 종양 해리 효소(재료 표)를 꺼내 37°C 열 믹서에서 해동하고 해동된 후 얼음으로 이동합니다.
  4. RPMI의 20mL 부분 표본을 검색합니다.
  5. 관련 검체 정보(예: 환자 ID, 비식별자, 검체 유형)를 기록합니다.
  6. 튜브를 여러 번 뒤집어 샘플을 60mm 조직 배양 접시(얼음 위에 놓음)로 옮기고 내용물을 접시에 부어 모든 샘플 물질이 옮겨지도록 합니다. 샘플이 도착 시 미디어로 배송되지 않은 경우 새 RPMI 미디어를 접시에 추가합니다.
    1. 샘플이 단편화된 경우 샘플이 들어 있는 튜브를 450× g, 4°C에서 5분 동안 회전시키고 상층액을 버리고 샘플을 420μL의 RPMI에 재현탁시킨 다음 섹션 2로 이동합니다.

2. 기계적 및 효소적 소화

  1. 60mm 시료 접시에서 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 420μL의 매체를 피펫팅합니다. 미디어에 현탁된 샘플 조각을 포함하려고 시도합니다.
  2. 핀셋을 사용하여 60mm 접시의 샘플 조직을 배지가 들어 있는 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 튜브 내부의 깨끗한 가위로 샘플을 잘라 조각의 직경이 최대 2-3mm가 되도록 합니다.
  3. 제조업체 사양(재료 표)에 따라 준비된 분해 효소를 인간 샘플의 경우 42μL의 효소 H(비특이적 프로테아제), 쥐 샘플의 경우 효소 D(비특이적 프로테아제), 21μL의 효소 R(비특이적 프로테아제) 및 5μL의 효소 A(뉴클레아제)의 샘플에 추가합니다.
  4. 접시에서 420μL의 배지를 추가하거나 튜브의 최대 1mL 표시까지 추가합니다. 420μL의 매체를 초과하지 마십시오.
  5. 튜브를 5초 동안 소용돌이치고 측면에 수직으로 위치한 열 믹서에 넣습니다(그림 1B). 37 °C, 450 rpm에서 15분 동안 배양합니다.
    참고: 배양 중에는 실온과 평형을 이루는 데 10분이 필요하므로 GEM 생성에 필요한 30x Genomics 물질을 모두 꺼내십시오.

3. 샘플 필터링

  1. 새 15mL 원뿔형 튜브 위에 50μm 셀 필터를 놓고 1mL의 새 RPMI 매체를 튜브에 통과시켜 필터를 프라이밍합니다.
  2. 분해 후 1,000 μL의 저잔류 와이드 피펫 팁을 사용하여 샘플을 15 mL 튜브로 옮깁니다. 1.5mL 튜브를 1mL의 새 배지로 세척하고 배지를 필터로 옮겨 모든 샘플 물질이 필터를 통과하도록 합니다.
  3. 1mL 플라스틱 주사기를 구하여 플런저만 꺼냅니다(나머지 주사기는 폐기). 주사기 플런저의 뒷면을 사용하여 비틀기 동작으로 필터에 샘플을 갈아서 밀어 넣습니다.
  4. 5mL의 배지와 샘플이 들어 있는 접시의 남은 배지(섹션 1)로 필터를 세척하여 조직에서 분리되었을 수 있는 세포를 수집합니다.
  5. 새 15mL 코니컬 튜브 위에 30μm 셀 필터를 놓고 필터에 1mL의 매체를 프라이밍한 다음 필터를 통해 해리된 샘플이 들어 있는 튜브의 내용물을 옮깁니다.
    참고: 이 단계는 10x Genomics 미세유체 칩을 사용하여 샘플을 실행할 때 막히거나 습윤 실패를 일으킬 수 있는 큰 파편을 제거합니다.

4. 적혈구 용해

  1. 샘플을 450× g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 매체를 흡입하십시오.
  2. 적혈구(RBC)를 제거하고 사용된 부피를 기록하기 위해 ACK 용해 완충액에 재현탁합니다. 부피는 펠릿 크기와 펠릿 내 RBC의 정도에 따라 달라집니다.
    참고: 재부유된 ACK 샘플 용액은 충분한 ACK Lysis 완충액이 추가되었을 때 무색이어야 하며, 이는 샘플에서 적혈구를 제거하기 때문입니다.
  3. 시료 튜브를 450× g, 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡입합니다.
  4. 원심분리 후 샘플 펠릿에 눈에 띄는 빨간색이 없을 때까지 필요에 따라 4.2-4.3단계를 반복합니다(그림 2). 이 단계에서 사용된 ACK Lysis 버퍼의 추가 볼륨을 기록합니다.
  5. 계수를 준비하기 위해 샘플 펠릿을 새 매체에 재현탁합니다.

5. 세포 계수

  1. 1.5mL 튜브에 트리판 블루 10μL를 넣습니다. 해리된 세포를 부드럽게 혼합하고 10μL의 샘플을 채취한 다음 트리판 블루와 혼합(1:1)합니다. 혈구측정기의 양쪽에 10μL를 로드하고 세포를 계수합니다.
  2. 세포 농도, 총 살아있는 세포 수, 생존율 백분율 및 계수 후 최종 배지 부피를 기록합니다.
  3. 최적의 10x 유전체학 실행을 위해 세포 수가 700 - 1,200 cells/μL(7 × 10 5-1.2 × 106/mL) 사이인지 확인합니다.
    1. 샘플이 너무 농축되어 있으면 미디어로 희석하고 다시 계산하십시오.
    2. 샘플이 너무 희석된 경우 샘플을 450× g, 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 더 적은 양의 매체에 재현탁합니다.
    3. 세포 생존율이 80% 미만인 경우 죽은 세포를 제거하기 위해 살아있는 죽은 절차를 수행합니다.
    4. 셀이 100만 개 미만인 경우 섹션 6을 참조하십시오.
    5. 세포가 100만 개 이상이고 생존율이 10%> 경우 섹션 6을 참조하십시오.
    6. 세포가 100만 개 이상이고 생존율이 10%< 경우 섹션 7을 참조하십시오.
    7. 세포 생존율이 80% 이상인 경우 처리된 세포를 얼음 위에 유지하고 제조업체의 지침에 따라 즉시 GEM 생성을 진행합니다.

6. 데드 셀 제거 - 키트 1

알림: 죽은 세포 제거 시약을 사용할 때는 쉽게 오염될 수 있으므로 생물 안전 후드 내부에서 작업하십시오.

  1. 샘플을 450× g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  2. 15mL 원뿔형 튜브에 분리 매체를 준비하고 실온에서 보관합니다: PBS 9.8mL, CaCl2 10μL 및 열 비활성화 FCS 200μL(생물 안전 후드에 추가).
  3. 원심분리 후 펠릿에서 배지를 흡입하고 분리 매체 1mL에 재현탁합니다.
  4. 튜브를 450× g, 4°C에서 5분 동안 다시 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 펠릿을 100μL의 분리 매체에 재현탁시킵니다.
  5. 분리 매체에 있는 100μL의 시료를 0.2mL PCR 스트립 튜브의 웰 1개로 옮깁니다.
  6. 생물 안전 후드에서 10 μL의 Annexin V Cocktail과 10 μL의 Biotin Selection Cocktail을 100 μL의 샘플이 포함된 웰에 추가합니다. 피펫은 용액을 혼합하고 실온에서 4분 동안 그대로 둡니다.
  7. 4분 후 덱스트란 코팅된 자성 입자를 30초 동안 소용돌이칩니다. 20 μL의 비드와 60 μL의 분리 매체를 샘플에 추가합니다(총 부피 200 μL). 생존율이 40% 미만인 경우 분리 매체의 부피(최대 40μL)를 조정하면서 비드의 양을 최대 40μL까지 스케일링하여 총 부피를 200μL로 유지합니다. 피펫을 혼합하고 용액을 실온에서 3분 동안 그대로 둡니다.
  8. 스트립 튜브를 실온에서 5분 동안 10x Genomics Magnetic Separator(높은 설정)에 놓습니다.
  9. 비드를 방해하지 않고 스트립 튜브의 액체를 새로운 1.5mL 로우 바인드 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 자석에서 스트립 튜브를 제거하지 마십시오.
  10. 시료가 들어 있는 1.5mL 튜브를 450× g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 섹션 5에 설명된 대로 상층액을 흡입하고 펠릿 크기 및 계수 셀에 따라 적절한 양의 RPMI 매체에 펠릿을 재현탁시킵니다. 생존율이 80% 미만으로 유지되는 경우 죽은 세포 제거 절차를 반복합니다(그림 3 및 그림 4).
    참고: 염화칼슘은 캡슐화 과정과 역전사(RT) 단계를 방해하므로 다운스트림 GEM 생성을 위해 분리 매체에 세포를 재현탁시키지 마십시오.
  11. 세포 생존율이 80% 이상인 경우 처리된 세포를 얼음 위에 유지하고 제조업체의 지침에 따라 즉시 GEM 생성을 진행합니다.

7. 데드 셀 제거 - 키트 2

알림: 키트 시약을 사용할 때는 생물 안전 후드 내부에서 작업하십시오.

  1. 마이크로비즈와 20x Binding Buffer 스톡 용액을 생물안전 후드 안에 넣습니다.
  2. 시료 현탁액을 450× g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  3. 19mL의 DNAse, RNAse가 없는 증류수에 피펫팅된 20x Binding Buffer 스톡 용액 1mL를 사용하여 멸균 조건에서 1x 완충 용액을 준비합니다.
  4. 원심분리가 완료되면 상층액을 흡인하고, 마이크로비즈를 첨가하고, 샘플을 부드럽게 혼합하고, 실온에서 15분 동안 배양합니다.
    1. 세포 수가 107 이하인 경우 100 μL의 마이크로비즈를 추가합니다.
    2. 총 세포 수가 107 개 이상인 경우 107 개의 살아있는 세포 당 100 μL의 최종 농도로 마이크로 비즈를 조정합니다.
  5. 배양 중에는 하나의 MACS 양성 선택 컬럼, MACS 멀티스탠드 및 해당 자기 분리기를 얻습니다. 분리기가 멀티스탠드에서 수평을 이루고 자기력이 강력하고 데드 셀 제거 효율성에 영향을 줄 수 있으므로 스탠드 근처에 다른 금속이나 자성 물체가 없는지 확인하십시오. 날개가 바깥쪽을 향하도록 컬럼을 분리 홀더에 꼭 맞게 놓습니다.
  6. 시료 배양 후 총 재현탁 부피가 500 μL 미만인 경우 총 부피가 500 μL가 될 때까지 1x Binding Buffer를 추가합니다.
  7. 컬럼 아래에 15mL 원뿔형 튜브를 놓고 3mL의 1x 결합 완충액으로 컬럼을 프라이밍합니다.
  8. 세포 시료 채취를 위해 원추형 튜브를 새로운 15mL 원추형 튜브로 교체하고 시료를 컬럼에 추가하여 컬럼을 통해 완전히 흐르도록 합니다.
  9. 1x Binding Buffer 4 x 3 mL의 컬럼을 세척하고 이전 세척이 컬럼을 완전히 통과한 후 한 번에 한 번만 세척을 추가합니다.
  10. 네 번째 세척 후 분리된 세포가 들어 있는 원추형 튜브를 450× g, 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 컬럼과 나머지 1x 바인딩 버퍼를 폐기합니다.
  11. 펠릿 크기에 따라 적절한 양의 RPMI 매체에 샘플 용액을 재현탁하고 섹션 5(그림 3 및 그림 5)에 설명된 방법을 사용하여 분리된 세포를 계산합니다.
    1. 생존율이 80% 미만으로 유지되고 총 세포 수가 106 이하인 경우 섹션 6을 반복합니다.
    2. 세포 생존율이 80% 이상인 경우 처리된 세포를 얼음 위에 유지하고 제조업체의 지침에 따라 즉시 GEM 생성을 진행합니다.

결과

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RPMI에 현탁된 흑색종 생검을 얻어 즉시 얼음 위에 놓았습니다. 샘플을 420μL의 RPMI와 분해 효소가 들어 있는 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 가위를 사용하여 작은 조각으로 다진 다음 37°C의 수직으로 배치된 열 믹서에서 15분 동안 후속 효소 분해를 거쳤습니다(그림 1). 분해 후 50μm 멸균 일회용 필터를 통해 샘플을 여과하고 필터를 새 RPMI로 세척하여 세포 수율을 높였습니다(그림 1). 세척 후 남은 조직의 나머지 부분은 원치 않는 생물학적 물질(예: 지방 조직)이므로 폐기되었습니다.

생성된 세포 펠릿의 색상에 따라 적혈구를 제거하기 위해 15mL의 ACK 용해 완충액이 필요했습니다(그림 2). RPMI 배지 3mL에 재현탁 후 총 세포 수는 1 × 106/mL였으며 생존율은 <80%였습니다(그림 3A). 이는 10x Genomics 로딩을 진행하기 전에 Kit 1(프로토콜 섹션 6)을 사용한 한 주기의 라이브 셀 농축이 필요함을 나타냅니다(그림 4). 이 샘플에 100만 개 이상의 세포가 있고 생존율이 10% 미만인 경우 Dead Cell removal - Kit 2가 대신 사용되었을 것입니다(그림 5). 샘플을 분리 매체로 세척하고 10μL의 Annexin V 및 비오틴 선택 칵테일을 첨가한 다음 프로토콜 섹션 6(그림 4)에 설명된 대로 20μL의 마그네틱 비드와 60μL의 분리 매체를 첨가했습니다. 이 절차 후, 샘플을 500 μL의 매체에 재현탁시키고 다시 계수하였다. 살아있는 세포 수는 4.9 × 105/mL였으며 생존율은 90% 이상이었고(그림 3B), 샘플은 제조업체의 지침에 따라 즉시 GEM 생성으로 진행되었습니다.

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그림 1: 종양 시료 처리 개요. (A) 조직 해리 프로토콜의 단계별 과정에 대한 그림. (B) 수직으로 배치된 열 혼합기를 사용하여 시료를 분해합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 경미한 색소가 침착된 흑색종 샘플의 Pre-ACK 및 Post-ACK 처리. (A) 이미지는 ACK를 사용하여 적혈구(RBC) 용해 전 분해 단계 후 여과 및 펠릿화된 흑색종 샘플을 보여줍니다. (B) 이미지는 ACK 완충액을 사용하여 적혈구를 제거한 후 동일한 흑색종 샘플을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 200x 배율로 확대된 trypan blue 아래의 혈구분석기에서 본 세포 보기. (A) 살아있는 세포 농축 전의 청색 세포의 모습을 보여주는 이미지로, 생존율이 80% 미만인 죽은 세포를 나타냅니다. (B) Kit 1 프로토콜(프로토콜 단계 6)을 사용하여 라이브 셀 농축 후 샘플을 보여주는 이미지로, 90% 이상의 생존력 증가를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: Kit 1을 사용한 살아있는 시체 세포 분리 개요. 이 단계는 세포 계수 후 생존율>10%)가 있는 100만 개 미만 또는 100만 개 이상의 세포가 검출될 때 수행됩니다(프로토콜 단계 5). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: Kit 2의 죽은 세포 제거 마이크로비드를 사용한 살아있는 죽은 세포 분리의 개요. 이 단계는 세포가 100만 개 이상이고 생존율이 <10%일 때 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: Kit 1의 수정된 프로토콜을 사용한 1주기 생세포 농축 후 조작되지 않은 샘플의 단일 세포 분석 검증. 상단 부분은 살아있는 세포 농축 전후의 세포 그룹 및 유형의 일관성을 보여주는 UMAP 분석을 보여줍니다. 하단 부분은 Cell Ranger에 의해 생성된 시퀀싱 출력을 요약합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 10x Genomics 미세유체 시스템을 사용하여 scRNA 염기서열분석을 위해 인간 또는 쥐 종양 샘플을 단일 세포 현탁액으로 해리하는 방법을 설명합니다. 종종 희귀 암에서 유래하거나 쥐 종양에 대한 진행 중인 임상 시험 또는 장기 실험의 일부인 조직을 처리할 때 샘플은 모든 단계 사이에 최적으로 신중하게 보존되어야 합니다. 모든 단계는 실온에서 장기간 작업하면 전사체 품질에 영향을 미치므로 천연 세포 RNA 프로필을 유지하고 분해를 방지하기 위해 얼음 또는 4°C에서 빠르게 수행해야 합니다17,18.

시술 전반에 걸쳐 세포의 손실을 최소화하기 위해 몇 가지 단계를 취해야 하며, 특히 작은 바늘 코어 생검을 처리할 때 더욱 그러하다17. 종양 샘플의 모든 단편이 분해에 포함되도록 하면 샘플에서 더 많은 세포를 추출할 수 있으므로 향후 10x Genomics 캡슐화 및 염기서열 분석과 분석을 위해 회수된 총 세포 및 전사체 수가 향상되므로 가장 성공적인 결과를 얻을 수 있습니다. 샘플이 도착한 튜브에 박히면 매체를 추가하고 튜브를 뒤집어 처리를 위해 접시로 옮길 수 있습니다. 초기 샘플이 단편화되거나 용액이 탁하여 현탁 상태에 있는 세포가 있음을 나타내는 경우, 도착한 용액으로 샘플을 원심분리하고 분해를 위해 배지 부피에 다시 현탁시켜 효소 분해를 위해 모든 샘플을 수집하도록 합니다(프로토콜 섹션 1).

흡입할 때 절차 내내 펠릿이 방해받지 않도록 하십시오. 흡입 시 P200 피펫으로 제거할 수 있는 여분의 부피를 남겨 두십시오. 펠릿이 방해를 받으면 부피를 튜브로 다시 분주하고 다시 원심분리할 수 있습니다. ACK Lysis 후 또는 살아있는 사체 제거 후 샘플의 부피는 25μL만큼 낮을 수 있습니다. 따라서 세포를 포함하는 상층액을 잃지 않는 것이 중요합니다. 적절한 기계적 소화는 관심 세포가 효소 분해에 노출되도록 하는 데 필수적입니다. 더 큰 시료 크기 9,19,20의 경우 적절한 효소와 열 혼합기를 사용한 더 긴 효소 분해가 필요할 수 있습니다. 특정 효소 이름은 독점적이지만 제조업체는 효소 A를 뉴클레아제로, 효소 H, D 및 R을 비특이적 프로테아제로 표기합니다. 가능한 한 많은 종양 샘플을 필터를 통과시키는 것은 가능한 최고의 세포 수율을 보장하는 데 매우 중요합니다. 성공적으로 필터링하면 필터에 눈에 보이는 샘플이 전혀 없거나 아주 작은 샘플만 끼워집니다. 샘플의 일부 조각은 지방 또는 결합 조직의 양이 많은 경우 필터링되지 않을 수 있습니다. 필터 상단에 샘플의 조각이 보이는 경우 주사기 플런저 뒷면을 계속 사용하여 비틀림 동작을 사용하여 모든 샘플을 연마하고 밀어내는 동시에 필터 상단을 더 많은 매체로 세척합니다.

적혈구 용해 단계의 성공 여부는 계수 및 생존도를 위해 샘플이 혈구계에 로드되면 현미경 아래에서 샘플을 보는 것으로 결정됩니다15,21. 적혈구를 제거하기에 충분한 ACK가 샘플에 추가되면 펠릿에 적혈구나 눈에 띄는 적색이 없습니다. 검체에서 적혈구가 보이면 추가 ACK를 추가해야 하며 검체를 450×g, 4°C에서 5분 동안 다시 원심분리해야 합니다. 완료되면 상층액을 흡인해야 하며 세포의 펠릿을 시각화 및 계수를 위해 RPMI 매체에 재현탁할 수 있습니다.

최적의 10x 유전체학 실행을 보장하기 위해 세포 수는 700 - 1,200 cells/μL(7 × 105- 1.2 × 106/mL) 사이여야 합니다. 농도가 높으면 액적 형성 중에 이중항 속도(하나의 액적에 두 개의 세포)가 증가합니다. 계수가 너무 높으면 적절한 양의 매체를 샘플에 추가하고 재계수를 위해 혈구계에 다시 로드할 수 있습니다. 농도가 너무 낮으면 샘플을 450× g, 4°C에서 5분 동안 다시 원심분리할 수 있으며, 상층액을 흡입하여 더 적은 부피의 매체에 재현탁한 후 다시 계수할 수 있습니다. 살아있는 세포 생존율이 80% 이상인 경우 10x Genomics를 위해 샘플을 로드할 준비가 된 것입니다(그림 3).

샘플의 생존율이 80% 미만인 경우 10x Genomics loading16 전에 live-dead 절차가 필요합니다. 한 차례의 살아있는 사체 제거로 생존율이 80%를 넘지 않으면 총 1 × 105 세포 이상인 경우 다른 라운드를 수행해야 합니다. 생존율이 높을수록 후속 10x Genomics 프로토콜의 막힘을 방지하고 세포 회수율을 높이며 주변 RNA의 존재를 줄일 수 있습니다. Kit 1의 프로토콜은 더 적은 세포 수로 더 작은 조직 샘플을 빠르게 해리할 수 있도록 최적화되고 소형화되었습니다. 시약의 부피가 감소하고 배양 시간이 단축되어 세포 수율이 증가하고 다양한 세포에서 스트레스 반응 유전자 서명(FOS, JUN 및 JUNB)이 방지됩니다 9,22. 살아있는 세포를 농축하는 대체 방법에는 염색 및 분류가 포함됩니다. 그러나 이로 인해 세포 수율이 감소하고, 세포 상태에 영향을 미칠 수 있는 염색 배양이 길어지고(예: aCD3e 항체가 T 세포를 활성화함) 분류 중 세포에 가해지는 기계의 압력에 의해 유발되는 스트레스가 발생합니다 9,22. 그림 6의 예는 10X GEX(Genomics Gene Expression) 염기서열 분석 후 생성된 UMAP과 생성된 세포 바코드를 FASTQ 파일로 변환한 다음 CellRanger를 통해 연결 및 정렬하는 과정을 보여줍니다. 후속 염기서열 분석 결과와 살아있는 시체 제거 비교를 도표화하여 살아있는 시체 제거 전과 후의 샘플에서 세포 집단을 보여주고 염기서열 분석 품질을 개선했습니다. 그림 6에 표시된 폐 샘플은 판독 비율이 70% 미만이었기 때문에 판독률에 문제가 있음을 나타냅니다. 이 경고는 용해되거나 죽은 세포 집단에서 높은 대기 RNA로 인해 생성되었습니다. 그러나, 죽은 세포를 제거한 후에, 이 오류는 더 이상 존재하지 않았고, 그 결과 세포(23)에서 분획 판독의 비율이 더 높아졌다.

단세포 RNA 염기서열 분석은 비용이 많이 들고 불안정한 과정으로, 암 면역학 및 암 연구 분야를 극적으로 발전시켰습니다. 이를 통해 유전자, 세포 상태, 특정 세포 유형에서 발현되고 억압된 프로그램에 대한 추가 조사를 할 수 있어 암의 행동과 이질성에 대해 더 많은 것을 밝힐 수 있습니다. 최적화되지 않았거나 생존율이 낮은 조직은 종양 생물학의 현실을 벗어나게 하는 아티팩트를 생성할 수 있는 저품질 데이터를 생성할 가능성이 더 높으며, 이는 적절한 종양 해리 및 샘플 준비의 중요성을 강조합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.S-F. Bristol Myers-Squibb, Istari Oncology로부터 자금을 지원받았으며 Galvazine Therapeutics의 컨설턴트였습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 Adelson Medical Research Foundation(AMRF), Melanoma Research Alliance(MRA) 및 U54CA224068의 지원을 받았습니다. 그림 1, 그림 4 및 그림 5 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1x PBSCorning21-040-CV
10 mL 혈청학 피펫Corning357551
1000 μ L 저유지력 피펫 팁Rainin30389213
1000 μ L 저유지력 와이드 피펫 팁Rainin30389218
1000 μ L 피펫 팁Rainin30389212
10x 자기 분리기10x Genomics120250
15 mL 코니컬 튜브Corning430052
2 mL 흡입 피펫Corning357558
20 μ L 저유지력 피펫 팁Rainin30389226
20 μ L 파이펫 팁Rainin30389225
200 μ L 저잔류 피펫 팁Rainin30389240
200 μ L 피펫 팁Rainin30389239
50 mL 폴리프로필렌 원뿔형 튜브Falcon352098
60 x 15 mm 조직 배양 접시Falcon353004
ACK 용해 버퍼GibcoA10492-1
BD 1 mL 주사기Becton, Dickinson and Company3090659
Bright-Line HemocytometerHausser Scientific551660
칼슘 클로라이드 솔루션시그마 알드리치2115-100ML
셀 레인저 10x Genomicshttps://www.10xgenomics.com/support/software/cell-ranger/latest
세포 계수기 세포 계수기 슬라이드,Bio-Rad1450015
CellTrics 30μ m 멸균 일회용 필터Sysmex04-004-2326
CellTrics 50μ m 멸균 일회용 필터Sysmex04-004-2327
데드 셀 제거 키트 Miltenyi Biotec130-090-101-20 °에 저장; C; 키트 2
절제 겸자, Fine TipVWR82027-386
DNA LoBind 마이크로 원심분리기 튜브, 1.5 mLEppendorf22431021
EasySepTM 사체 제거
(Annexin V) 키트		STEMCELL Technologies178994 °에 보관; C; 키트 1
Eppendorf centrifuge, 5425REppendorf5406000640
Eppendorf centrifuge, 5910REppendorf2231000657
Eppendorf Easypet 3, 전자 피펫 컨트롤러EppendorfEP4430000018
Eppendorf Thermomixer F1.5, 모델 5384EppendorfEP5384000012
FBS,Gibco26140-0794 °에 저장; C, 생물학적 후드에 사용
독일 스테인리스 가위미세 과학 도구14568-12
Leica Dmi1 현미경Leica Microsystems454793
LS ColumnMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultistandMiltenyi Biotec130-042-303
Pipet-Lite LTS 피펫 L-1000XLS+Rainin17014382
Pipet-Lite LTS 피펫 L-200XLS+Rainin17014391
Pipet-Lite LTS 피펫 L-20XLS+Rainin17014392
Quadro MACS 자석Miltenyi Biotec130-091-051
RPMI Medium 1640 (1x)Gibco21870-0764 °에 보관; C
TempAssure 0.2 mL PCR 8-튜브 스트립USA Scientific1402-4700
Trypan blue stain 0.4%Thermo Fisher ScientificT10282
종양 해리 키트, HumanMiltenyi Biotec130-095-929-20 ° C, 키트 지침에 따라 효소를 준비합니다.
RPMI 1640
3mL의 동결건조 효소 H 바이알에 재구성 RPMI 1640
2.7mL의 RPMI 1640br/에 동결건조된 효소 A 바이알을
종양 해리 키트, 마우스Miltenyi Biotec130-096-730-20 °에 저장; C, 키트 지침에 따라 효소를 준비합니다.
RPMI 1640
3mL의 동결건조 효소 D 바이알을 재구성 RPMI 1640
2.7mL의 RPMI 1640br/ 키트와 함께 제공된 버퍼 A 1mL에 동결건조된 효소 A 바이알을 재구성합니다.
UltraPure 증류수Invitrogen10977-0154 °에 저장; 씨
: , , , , , , , , 재구성합니다.

참고문헌

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