Isolation, Purification, and Identification of Bacitracin-producing Bacillus licheniformis from Fresh Baces of Healthy Pigs(건강한 돼지의 신선한 배설물에서 바시트라신 생산 Bacillus licheniformis 의 분리, 정제 및 식별)

요약

이 프로토콜은 건강한 돼지 배설물에서 바시트라신을 생산하는 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis )의 분리, 정제 및 식별을 위한 세부 프로세스에 대한 완전하고 포괄적인 설명을 제공합니다.

초록

바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis )와 바시트라신(bacitracin)은 의학, 화학, 양식업, 농업 및 부업 제품 분야에서 거대한 응용 시장과 가치를 가지고 있습니다. 따라서 바시트라신 생산량이 많은 B. licheniformis 를 선택하는 것이 매우 중요합니다. 이 실험 프로토콜에서는 바시트라신의 수율이 높은 바실러스 를 건강한 돼지의 신선한 배설물에서 분리, 정제 및 식별했습니다. 황체소구 균에 대한 2차 대사산물 바시트라신의 억제 효과도 시험되었습니다. 박층 크로마토그래피와 고성능 액체 크로마토그래피는 바시트라신의 정성적 및 정량적 검출을 위해 사용되었습니다. B. licheniformis 의 생리학적, 생화학적 특성은 관련 키트에 의해 결정되었습니다. B. licheniformis 의 계통발생학적 관계는 유전자 염기서열 검출을 사용하여 결정되고 구성되었습니다. 이 프로토콜은 다양한 관점에서 동물의 신선한 배설물에서 B. licheniformis 의 표준 분리, 정제 및 식별 프로세스를 설명하고 소개하여 공장에서 B. licheniformis 및 bacitracin을 대규모로 활용할 수 있는 방법을 제공합니다.

서론

바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)는 피르미쿠테스(Firmicutes)과에 속하는 바실러스(Bacillus)의 일종으로 물, 토양, 동물의 내장 등 다양한 환경에 널리 분포한다¹. B. licheniformis는 짧고 튼튼한 막대 모양의 구조를 가지고 있으며 개별적으로 움직입니다². 군체는 거의 둥글고 둔하며 중앙이 부풀어 오르고 가장자리가 회백색으로 깔끔합니다³. 생장능력과 번식능력이 강하며 단당류, 다당류, 케토스, 유기산 등 다양한 탄소원의 영양소를 흡수하고 활용할 수 있다⁴. 성장과 발달의 후기 단계에서 B. licheniformis는 휴면 포자 형태로 존재할 수 있으며 bacitracin, lichenysin 및 surfactin과 같은 항균 물질을 생산할 수 있습니다. 또한 영양 결핍 및 극한의 외부 환경에 저항할 수 있습니다⁵. 명백한 코돈 선호는 없으며 효율적인 분비 시스템은 B. licheniformis의 이종 단백질 분비를 결정하며, 이는 Bacillus subtilis⁶의 두 배입니다. 프로테아제, 아밀라아제 및 셀룰라아제와 같은 효소 제제를 생산하는 데 자주 사용됩니다⁷. 내인성 독소가 없기 때문에 식품 안전 균주로 인증되었으며 EFSA⁸에 의해 QPS에 등재되었습니다. 따라서 생물 활성 화합물 생산을 포함하여 양식업, 농업, 식품, 생물 의학 및 제약 산업에서 광범위하게 응용되는 몇 가지 잠재적인 용도가 있습니다. 또한 B. licheniformis는 동물 장내 세균총의 중요한 구성 요소로, 동물의 생산 성능을 향상시키고 장내 세균총 균형을 개선하며 질병을 예방할 수 있습니다. 2004년에 B. licheniformis ATCC14580의 전체 게놈을 분석하였으며, 전사 번역, 단백질 접힘, 분비 메커니즘에 대한 배경 정보가 점차 이해되고 있다⁹. 이 유전 정보는 분자 수준에서 유전자 변형에 도움이 되어 B. licheniformis의 대규모 생산을 촉진하는 데 기여합니다.

바시트라신(Bacitracin)은 B. subtilis와 B. licheniformis의 2차 대사에 의해 비리보솜 펩타이드 합성효소에 의해 생산되는 도데카사이클릭 펩타이드 항생제입니다. 바시트라신은 바시트라신 A, B, C와 같은 다양한 성분으로 구성된 혼합물로, 각 성분 간에 하나 또는 두 개의 아미노산이 다릅니다. 이 중 바시트라신 A는 가장 강력한 생물학적 활성을 가지고 있다¹⁰. 바시트라신은 세포벽 형성을 억제하고 막 결합 단백질과 상호 작용하여 황색포도상구균 및 마이크로코커스 루테우스 와 같은 그람 양성 박테리아와 일부 그람 음성 박테리아를 억제할 수 있습니다¹¹. 한편, 바시트라신은 안전하고 안정적이며 약물 내성을 일으키기 쉽지 않으며 다른 항균제와 호환될 수 있습니다¹². 따라서 바시트라신은 의료 및 수의학 실습에 사용됩니다. 또한 제거율이 빠르고 흡수율이 낮기 때문에 동물 사료¹³의 첨가제로도 사용할 수 있습니다.

B. licheniformis는 장에 서식하고 위장 미세환경을 개선할 수 있습니다. 다른 동물의 위장관에서 다른 근원에서 Bacillus의 접착 및 번식 능력 및 관련 생리적 기능은 다릅니다. 돼지 유래 B. licheniformis 는 돼지 및 기타 가축의 장에서 집락화에 더 도움이 됩니다. 장내 프로바이오틱스의 상대적 풍부함과 숙주¹⁴의 건강 상태 사이에는 밀접한 관계가 있습니다. 젖을 뗀 새끼 돼지에 B. licheniformis mix를 첨가한 식이 보충제는 미생물군 구성과 대사 활성을 변화시켜 장 생태계를 개선하고 장 점막에도 영향을 미친다¹⁵. 동물의 배설물은 동물의 장내 세균총의 종류와 양을 반영할 수 있습니다. 이 프로토콜은 건강한 돼지 배설물에서 바시트라신을 생산하는 Bacillus spp.를 분리하고 정제하는 방법을 설명합니다. 배설물은 복합 사료를 먹지 않고 돼지 농장에서 우수한 생산 성능을 보이는 Taihu 모돈에서 파생됩니다. 분리물은 형태학적 특성, 물리화학적 특성 및 생화학적 식별에 따라 B. licheniformis 로 확인되었습니다.

프로토콜

모든 실험 절차는 난징 공과 대학 윤리 위원회에 의해 문서화되고 승인되었습니다. 배설물은 약 2년 된 태호모돈( 재료 표 참조)에서 추출한 것으로, 전문적이고 표준적인 돼지 농장에서 자랐습니다.

1. 미디어 준비

1. Luria-Bertani(LB) 액체 배지: 원뿔형 병에 NaCl 10g, 효모 추출물 분말 5g, 트립톤 10g을 넣고 증류수를 1L에 넣고 저어주고 유리 막대로 녹입니다. 100mL의 배지를 500mL 원뿔형 병으로 옮기고 통기성 밀봉 필름으로 단단히 묶습니다. 121°C에서 오토클레이브에서 20분 동안 멸균합니다( 재료표 참조).
2. LB 고체 매체: 원뿔형 병에 NaCl 10g, 효모 추출물 분말 5g, 트립톤 10g, 한천 분말 20g을 넣고 증류수를 1L에 넣고 유리 막대로 녹이고 통기성 밀봉 필름으로 단단히 묶습니다. 121°C에서 오토클레이브에서 20분 동안 살균합니다. 매체가 50 ° C로 냉각되면 배지 20mL를 페트리 접시에 붓고 식 힌 다음 거꾸로 보관하십시오.
3. 바시트라신 발효 배지: 500mL 원뿔형 병에 대두박 8g, 수용성 전분 4g, 0.1g(NH₄)₂SO₄, CaCO 3 0.6g_, 증류수 100mL를 넣고 유리 막대로 저어 완전히 녹인 다음 통기성 밀봉 필름으로 단단히 묶습니다. 121°C에서 오토클레이브에서 20분 동안 멸균합니다( 재료표 참조).
4. M. luteus 현탁액: M. luteus 의 고리를 선택하고 1.2단계에서 준비한 LB 배양 플레이트에 접종합니다( 재료 표 참조). 37°C의 항온 인큐베이터에서 16시간 동안 배양합니다( 재료 표 참조). 플레이트에 생리식염수 5mL를 넣고 부드럽게 흔들어 집락을 용리시킵니다. OD600을 측정하고 용액을 시험관에 희석하여 OD600이 0.3-0.7인 현탁액을 얻습니다. 나중에 사용할 수 있도록 M. luteus 의 현탁액을 4 °C에서 보관하십시오.
5. 항균 활성 분석 배지: 1.4단계에서 제조한 M. luteus 현탁액 1mL를 1.2단계에서 제조된 액체 LB 고체 배지 100mL에 첨가하고 약간 흔듭니다. 즉시 M. luteus 가 함유된 이 용액 5mL를 LB 배양 플레이트에 골고루 펴 바릅니다.

2. 건강한 돼지의 신선한 배설물에서 간균의 분리 및 정화

1. 생리식염수 9mL와 신선한 돼지 배설물 1.0g을 150mL 삼각 플라스크에 넣습니다. 자석 교반기( 재료 표 참조)로 실온에서 60rpm/min으로 15분 동안 저어줍니다.
2. 배설물 추출물을 80°C 온도 조절기 수조( 재료 표 참조)에 20분 동안 넣어 포자를 생성하지 않는 박테리아를 죽입니다.
3. 250mL 삼각 플라스크에 있는 LB 액체 배지 100mL에 현탁액을 추가하고 37°C에서 8시간 동안 180rpm/분으로 셰이커( 재료 표 참조)에서 배양합니다.
4. 배양된 세균 용액을 ^{10-1에서 10-8}까지 생리식염수로 연속 희석합니다. ^10-6, ^10-7 및 ^10-8 박테리아 희석액 0.1mL를 개별 LB 배양 플레이트에 바르고 건조시킵니다. 10분 후 37°C의 항온 인큐베이터에 48시간 동안 플레이트를 거꾸로 놓습니다.
5. 접종 링을 사용하여 B. licheniformis (크림색, 부드러운 일관성, 점액질 모양, 볼록하고 평평한 고도, 불규칙한 모양)16와 유사하게 보이는 집락을 선택하고 ^1.5단계에서 준비한 항균 활성 분석 배지에서 지그재그 패턴을 사용하여 줄무늬를 만듭니다( 그림 1 참조).
6. 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 인큐베이터에 넣고 집락 주변에 억제 구역이 있는지 관찰합니다.

3. M. luteus 활성의 억제를 위한 스크리닝

1. 억제 영역을 생성한 단일 콜로니를 선택하고 100mL의 LB 액체 배지에 추가하고 12시간 동안 37°C 및 180rpm/분의 셰이커에서 배양합니다.
2. 1.3단계에서 제조한 바시트라신 발효 배지에 배양 배지 5mL를 접종하고 37°C에서 48시간 동안 배양합니다.
3. 원심분리기 튜브와 13,400 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리한 후 0.22μm 미세다공성 필터 멤브레인을 사용하여 여과합니다( 재료 표 참조).
4. 새로운 항균 활성 분석 매체 플레이트에 옥스포드 컵을 추가한 다음 옥스포드 컵에 50μL의 여과액(발효 상층액)을 추가합니다( 재료 표 참조). 인큐베이터에서 37°C에서 12시간 동안 배양합니다. 배양 후, 버니어 캘리퍼스로 억제 영역의 직경을 측정합니다( 재료 표 참조).
5. 후속 실험을 위해 억제 영역 직경이 15mm보다 큰 균주와 해당 발효 상등액을 선택합니다.

4. 박층 크로마토그래피에 의한 바시트라신의 식별

1. 60mg의 바시트라신 표준물질을 첨가하고 10mL 용량 병에 1% EDTA-2Na( 재료 표 참조)에 용해시켜 6.0mg/mL 바시트라신 용액을 만듭니다.
2. 발효 상등액 1mL를 10mL로 1% EDTA-2Na로 희석합니다. 활성 실리카겔 박막 플레이트에 5 μL의 샘플과 5 μL의 바시트라신 표준물질 용액을 찾아냅니다( 재료 표 참조).
3. 크로마토그래피 탱크에 n-부탄올-아세트산-물-피리딘-에탄올(60:15:10:6:5) 100mL를 추가합니다( 재료 표 참조). 실리카겔의 박막판을 크로마토그래피 탱크에 놓습니다. 뚜껑을 덮고 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오.
4. 실리카겔 박층판을 꺼내 닌히드린 1%가 함유된 부탄올-피리딘 용액(99:1)을 분무하고(재료 표 참조) 갈색을 띤 붉은 반점이 나타날 때까지 105°C에서 5분 동안 가열합니다. 다음 공식에 따라 표준물질 및 표본에 대한 Rf(Retention Factor Value)를 계산합니다.
   R_f = 스폿 이동 거리/용매 이동 거리.

5. HPLC에 의한 바시트라신의 검출

1. 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 0.3mL의 발효 상등액과 1.2mL의 50% 에탄올을 넣고 손으로 5분 동안 흔든 다음 4°C에서 12시간 동안 그대로 둡니다.
2. 13,400 x g 에서 15분 동안 원심분리기를 가열하고 0.22μm 미세다공성 필터 멤브레인이 있는 S1 라벨이 붙은 샘플 병에 여과합니다( 재료 표 참조).
3. 바시트라신 모용액 준비: 100mL 부피 플라스크에 0.4g 바시트라신 표준물질(60 U/mg, 재료표 참조), 40g/L EDTA-2Na 100mL( 재료표 참조)를 추가하여 240 U/mL 바시트라신 모용액을 준비합니다.
4. 바시트라신 마더 용액 3mL와 초순수 21, 9, 3, 1, 0mL를 각각 A1, B1, C1, D1, E1이라고 표시된 시험관에 추가합니다. 0.22μm 미세 다공성 필터 멤브레인으로 여과한 후 여과액을 A2, B2, C2, D2 및 E2로 표시된 샘플 병에 넣습니다.
   참고: 바시트라신 표준 용액의 농도는 30, 60, 120, 180 및 240U/mL입니다.
5. A2, B2, C2, D2, E2 및 S1을 HPLC 기기의 테스트 트레이에 넣습니다. 1000mL의 50m/L 포름산모늄 암모늄과 1000mL의 아세토니트릴을 이동상 트레이에 넣고 각각 이동상 A와 B로 설정합니다.
   알림: 포름산암모늄의 pH는 포름산을 사용하여 4.0으로 조정해야 합니다.
6. C18(5μm, 4.6mm x 250mm) HPLC 컬럼을 컬럼에 표시된 방향으로 설치합니다( 재료 표 참조).
7. 이동상 매개변수를 0분, 77% A 및 23% B로 설정합니다. 30분, 70% A 및 30% B; 40분, 60% A 및 40% B; 50분, 60% A 및 40% B; 51분, 77% A 및 23% B; 58분, 77% A 및 23% B. 샘플 크기를 100μL로 설정합니다. 유속, 1.0mL/분; 컬럼 온도, 30 °C.
8. 실행 버튼을 클릭하여 프로그램을 실행합니다.

6. 형태학적 식별

1. LB 배양 플레이트에 가장 높은 바시트라신 역가로 균주를 희석하고 코팅하고 37°C의 인큐베이터에서 48시간 동안 배양합니다. 염색하고 아래에 설명된 대로 군체 형태를 관찰합니다.
2. 슬라이드에 멸균 정제수 한 방울을 추가하고 소량의 콜로니를 집어 들고 물방울에 추가합니다. 고르게 바르고 슬라이드를 자연 건조시킨 다음 화염 위에 고정합니다.
3. 크리스탈 바이올렛을 1분 동안 첨가하여 샘플을 염색한 다음 수돗물로 헹굽니다. 요오드를 1분 동안 첨가하여 샘플을 염색한 다음 증류수로 헹굽니다.
4. 95% 알코올을 넣고 슬라이드를 흔들어 1분 동안 탈색한 후 증류수로 헹굽니다.
5. 사프란을 1분 동안 첨가하여 샘플을 염색한 다음 증류수로 헹굽니다. 슬라이드를 자연적으로 건조시키고 오일 침지로 현미경으로 집락 형태를 관찰합니다( 재료 표 참조).

7. 생리학적이고 생화확적인 ID

1. 시험관에 멸균 식염수 2mL를 추가하고 접종 링을 사용하여 플레이트의 단일 콜로니를 멸균 식염수에 접종하여 박테리아 현탁액을 얻습니다.
2. Bacillus 생화학 식별 스트립에서 V-P, 구연산염, 젤라틴, 7% 염화나트륨, pH 5.7, 질산염 환원 및 전분 가수분해를 측정하기 위해 각 구멍에 100μL의 박테리아 현탁액을 추가합니다(재료 표 참조).
3. 접종 링을 사용하여 다른 단일 콜로니를 선택하고 Bacillus 생화학 식별 스트립의 혐기성 성장 생화학 튜브에 지그재그 패턴으로 줄무늬를 만듭니다.
4. 접종 링을 사용하여 다른 콜로니를 선택하고 공극에 수직으로 구멍을 뚫어 Bacillus 생화학 식별 스트립에서 프로피오네이트, D-자일로스, L-아라비노스 및 D-만니톨 식별을 수행합니다.

8. 균주 유전자 염기서열의 결정

1. 박테리아 DNA 추출 키트를 사용하여 균주의 DNA를 추출합니다( 재료 표 참조): 5mL 마이크로 원심분리 튜브에 2mL의 시드 액체를 넣고 11,500 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버리고 110μL의 완충액(20mM Tris, pH8.0, 2mM Na_2-EDTA 및 1.2% Triton 포함)과 70μL의 50mg/mL 라이소자임 용액을 펠렛에 첨가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
2. 100 mg/mL RNase A 4 μL를 15초 동안 첨가하고 실온에서 5분 동안 그대로 둡니다. proteinase K 용액 20 μL를 넣고 잘 섞습니다.
3. 220μL의 버퍼 GB를 추가하고, 펠릿이 현탁될 때까지 15초 동안 흔들고, 용액이 투명해지도록 70°C에서 10분 동안 배치한 다음 짧은 회전을 수행하여 튜브 벽의 물 구슬을 제거합니다.
4. 220μL의 무수 에탄올을 넣고 15초 동안 완전히 충격을 가한 후 짧은 간격으로 합니다. 용액과 응집 침전물을 수집 튜브의 흡착 컬럼 CB3로 옮기고 13,400 x g 에서 30초 동안 원심분리한 다음 상등액을 버립니다.
5. 흡착 컬럼에 500μL의 완충액 GD를 추가하고 13,400 x g에서 30초 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 컬럼에 PW 600μL를 첨가하고 13,400 x g에서 30초 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
6. 흡착 컬럼을 회수 튜브에 다시 넣고 13,400 x g에서 2분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다.
7. 흡착 컬럼을 실온에 놓고 10분 동안 건조시킵니다. 컬럼을 원심분리 튜브로 옮기고 흡착막 중간에 100μL의 용리 완충액 TE를 추가합니다.
8. 실온에서 5분 동안 그대로 두어 원심분리기 튜브와 원심분리기로 흐름을 모으고 13,400 x g에서 2분 동안 원심분리합니다.
9. 2x 마스터 믹스 25μL( 재료 표 참조), 8.8단계에서 얻은 DNA 샘플 2.5μL, 27F 정방향 프라이머 2μL, 1492R 역방향 프라이머 2μL 및 이중 증류 H_2O18.5μL를 0.1mL PCR 튜브에 추가합니다.
   참고: 프라이머의 유전자 서열은 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 및 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'입니다.
10. 다음 조건에서 PCR 튜브를 PCR 기계( 재료 표 참조)에 넣습니다: 95°C에서 10분 동안 사전 변성, 95°C에서 30초 동안 변성, 55°C에서 30초 동안 어닐링, 72°C에서 90초 동안 연장, 72°C에서 7분 동안 연장. 변성, 어닐링 및 확장 3단계 사이클을 32x에 대해 실행합니다.
11. 제품 5μL를 취하고 120V에서 30분 동안 1% 아가로스 겔로 전기영동을 수행합니다.
    1. 500mg 아가로스를 1x TAE 완충액 50mL에 용해시킵니다. 아가로스가 완전히 녹을 때까지 전자레인지에서 용액을 1-2분 동안 가열합니다. DNA 염색 염료 5μL를 첨가한 후 겔 트레이에 붓고 오리피스 플레이트를 삽입합니다. 굳을 때까지 30분 동안 실온에 두십시오. 겔을 전기영동 탱크에 넣고 1x TAE 버퍼를 추가하여 겔을 담급니다. 첫 번째 웰에 2 μL의 2 kb DNA ladder(10 mg/μL)를 추가하고 1 μL의 로딩 염료와 혼합된 5 μL PCR 산물을 겔의 나머지 웰에 추가합니다.
12. 젤 이미징 시스템에 젤을 놓고 사진을 찍습니다. 자외선 아래에서 DNA 스트립을 빠르게 자르고 무게를 잰다.
13. 마이크로 원심분리기 튜브에 스트립을 추가하고 동일한 부피의 PN 용액을 추가합니다. 젤이 완전히 녹을 때까지 튜브를 50°C의 수조에 보관하십시오.
14. 500μL의 평형 액체 BL을 흡착 컬럼 CA2에 추가하고 13,400 x g 에서 1분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
15. 용해된 겔 용액을 흡착 컬럼 CA2에 넣고 실온에 2분 동안 놓고 13,400 x g 에서 30초 동안 원심분리한 후 상등액을 버립니다.
16. 흡착 컬럼 CA2에 PW 600μL를 첨가하고 13,400 x g 에서 1분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 1회를 반복합니다.
17. 흡착 컬럼 CA2를 수집 튜브에 넣고 13,400 x g 에서 2분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
18. 흡착 컬럼 CA2를 실온에서 10분 동안 놓고 완전히 건조시킨 다음 깨끗한 원심분리기 튜브에 넣습니다.
19. 상온에서 2분간 현탁한 흡착막에 50μL의 용출 완충액 EB를 첨가하고 13,400 x g 에서 2분간 원심분리하여 DNA 용액을 채취합니다.
    참고: 위에서 언급한 용액 또는 시약은 정제 키트에 포함되어 있습니다( 재료 표 참조).
    1. 수집된 DNA 용액을 염기서열분석을 위해 전문 염기서열분석 회사( 재료 표 참조)에 보냅니다. NCBI의 GenBank 데이터베이스에서 Blast의 염기서열분석 결과를 비교합니다. 염기서열 상동성에 따라 다른 균주를 선택하고 MEGA-X의 최대우도법(Maximum Likelihood method)으로 계통발생 나무를 구성하여 균주의 종 관계를 결정합니다.

결과

이 실험에서는 1001에서 1048까지 번호가 매겨진 건강한 돼지의 신선한 배설물에서 48개의 바실러스 균주를 분리했습니다. 그 중 15 종은 M. luteus에 대해 항균 활성을 가졌습니다. 15개 균주에서 바시트라신의 역가는 표 1과 같이 고성능 액체 크로마토그래피로 측정되었습니다. 그 중 B. licheniformis No. 1026이 21.75 U/mL± 456.35로 가장 높은 바시트라신 역가를 보였기 때문에 후속 실험에서 No. 1026을 선택하였다.

TLC에 의한 식별 결과는 그림 2A에 나와 있습니다. 균주 No. 1026과 bacitracin 표준 용액의 발효 배액에서 주요 반점의 위치는 동일했으며 Rf 값은 0.61이었다. HPLC 분석에서 바시트라신의 표준 곡선 방정식은 y = 50.287x - 250.55이고 상관 계수 R² = 0.9968입니다(그림 2B). 발효 상등액의 피크 시간은 바시트라신 표준물질(그림 2C)과 일치했기 때문에 정균 물질은 바시트라신으로 확인되었으며 바시트라신의 역가는 456.35 ± 21.75 U/mL였습니다.

균주 No. 1026의 콜로니는 도 3A에 도시된 바와 같이 12시간 동안 LB 배지에서 배양하였다. 군체는 둥글고 투명한 물방울 모양이었으며, 돌출부는 꽉 찼고 가장자리는 깔끔했다. 12 시간에서 24 시간 사이에 박테리아는 성장의 후반 단계에 들어갔습니다. 그림 3B에서 볼 수 있듯이 군체는 자두 모양으로 퍼져 있고 중심은 접혀 형성되며 색은 점차 유백색으로 짙어졌습니다. 이는 B. licheniformis¹⁶의 군체 형태에 대한 설명과 일치합니다. 가장자리에는 투명한 점액이 있었다. 그람 염색 후, 변형주 No. 1026을 그림 3C와 같이 현미경으로 관찰했습니다. 세포는 자주색 막대였는데, 이는 그람 양성 박테리아를 나타냅니다.

표 2에서 볼 수 있듯이, 균주 1026번은 혐기성 환경에서 성장할 수 있다. 이 균주는 V-P 검사, 구연산염 활용, 질산염 환원 및 전분 가수분해에 대해 양성 반응을 보였습니다. 이 균주는 대부분의 탄소원을 분해하여 활용할 수 있었습니다. 그것은 B. licheniformis와 동일한 생리학적, 생화학적 특성을 가졌습니다.

균주 No. 1026의 16S rDNA 단편 크기는 약 1400bp 크기였습니다(그림 4A). 균주 No. 1026의 염기서열분석 결과는 GenBank의 B. licheniformis DSM 13과 99.58% 유사성을 보였다. 그런 다음 계통발생 나무(phylogenetic tree)를 그림 4B에 나타낸 바와 같이 구성하였다. B. licheniformis DSM 13의 진화 가지 길이는 0.000으로 B. licheniformis임을 나타냅니다.

균주 No. 1026의 형태학적, 생리학적, 생화학적 특성과 16S rDNA 유전자 염기서열의 상동성 분석을 바탕으로 균주 No. 1026을 B. licheniformis로 확인하였다.

그림 1: 균주 접종의 개략도. 접종 링은 집락을 선택하고 항균 활성 분석 배지에 지그재그 패턴으로 표시하는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 정균 물질의 식별. (A) 박층 크로마토그래피. (B) 바시트라신의 HPLC 표준 곡선. (C) HPLC 크로마토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 변형주 No. 1026의 형태학적 특성 및 그람 염색. (A) 12시간 및 (B) 24시간에서의 집락 형태 (C) 그람 염색. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 균주 No. 1026의 분자생물학적 식별. (A) 균주 NO. 1026 16S rDNA의 유전자 증폭. (B) 균주 No. 1026의 계통발생수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

아니요.	바시트라신 역가(U/mL)	아니요.	바시트라신 역가(U/mL)
1003	423.57±18.62	1021	317.46±13.46
1004	325.82±13.23	1026	456.35±21.75
1009	326.26±14.52	1027	435.57±19.18
1011	376.65±16.11	1030	382.48±17.64
1015	325.27±12.37	1031	215.37±11.73
1016	256.56±15.37	1039	353.67±16.16
1017	352.47±16.47	1041	342.36±14.36
1018	328.73±16.12

표 1: 항균 활성 균주의 바시트라신 역가.

항목	결과	항목	결과
혐기성 성장 테스트	+	D-만니톨 테스트	+
V.P 분석	+	젤라틴 검사	+
구연산염 활용 테스트	+	7%NaCl 테스트	+
프로피오네이트 시험	+	pH5.7 검사	+
D-자일로스 테스트	+	질산염 환원 시험	+
L-아라비노스	+	전분 가수분해 시험	+

표 2: 균주 번호 1026의 생리학적 및 생화학적 식별.

토론

B. licheniformis는 간단한 배양 조건과 빠른 설탕 소비로 빠르게 성장하며 성숙한 발효 기술은 산업 생산 비용을 절약하는 데 도움이됩니다¹³. B. licheniformis와 그 분비물인 bacitracin의 광범위한 적용은 유망한 시장 가치를 결정했습니다. 농업에서 B. licheniformis는 토양 비옥도를 높이고 뿌리 발달을 촉진하며 유기물의 분해를 지원함으로써 식물 성장과 영양 흡수를 개선하기 위한 생물 비료로 사용됩니다¹⁵. 산업용 효소 생산을 위해 B. licheniformis는 프로테아제, 아밀라아제, 셀룰라아제 및 리파아제와 같은 다양한 효소를 생산하며, 이는 식품 가공, 세제 제조, 가죽 가공 및 섬유 산업에서 대체할 수 없는 시장 가치를 결정합니다¹⁶. B. licheniformis와 bacitracin의 우수한 항균 약리 활성을 고려하여 박테리아 및 곰팡이에 의해 유발되는 다양한 감염병을 치료하기 위해 의료 분야에서 사용되어 왔습니다¹. 한편, 초본 식물의 성장과 식물의 약리학 활성 성분 축적을 고려할 때 B. licheniformis는 식물 성장의 잠재적 인 향상제이며 Rhodiola 유래 salidroside^{17, 18}과 같은 화합물의 생산에 유용합니다. B. licheniformis와 bacitracin의 위와 같은 장점으로 인해 산업, 농업, 양식업, 생명 공학 및 의료 산업에서 널리 유용합니다. 그러므로, 높은 수율의 바시트라신을 함유한 B. licheniformis의 분리 및 정제는 이후의 대규모 생산 및 적용을 보장하는 데 결정적인 요소입니다.

바시트라신은 화학 합성으로 제조할 수 있지만 단계가 번거롭고 부산물이 많습니다. 산업에서 바시트라신은 주로 B. licheniformis에 의해 발효된 옥수수 가루와 콩가루의 2차 대사 과정에 의해 생산됩니다. 바시트라신의 현대 산업 생산에서 높은 비용과 낮은 수율은 추가 적용을 방해합니다¹⁰. 따라서 고수율 바시트라신 균주를 스크리닝하고 원료의 활용률을 개선하는 것이 바시트라신 생산을 개선하는 열쇠입니다.

현재 고수율 바시트라신 균주의 육종은 주로 토양 및 기타 환경에서의 자연 육종, 기존 바시트라신 생산 균주를 사용한 돌연변이 육종 또는 유전 공학 기반 육종을 통해 이루어집니다. 자연 사육 작업이 간단하고 선별된 균주는 안정적인 생산 능력을 가지고 있지만 공정에 시간이 오래 걸리고 작업량이 많습니다. 돌연변이 번식은 돌연변이 비율이 높고 번식 시간이 단축되지만, 돌연변이가 다음 세대에 안정적으로 유전되지 않을 수 있다¹⁶. 유전 공학 기반 육종은 고수율 균주¹⁰을 얻기 위한 목표이지만, 외인성 유전자의 도입으로 인한 안전성 문제가 있다. 건강한 성인 동물의 배설물에는 세균총의 균형을 유지할 수 있는 풍부한 프로바이오틱스 자원이 포함되어 있습니다.

본 논문에서는 극한 환경에서 휴면 포자를 생산하는 B. licheniformis 의 특성¹⁹을 바탕으로 건강한 돼지 배설물을 고온 환경에 희석하여 내열성 무포자 생성 박테리아 및 곰팡이를 사멸시켰습니다. M. luteus 는 성장 후기 단계에서 B. licheniformis 에 의한 정균 펩타이드 생성에 민감하고 관찰이 용이한 노란색 색소를 생성하기 때문에 억제 영역 평가를 기반으로 항균 활성을 스크리닝하는 데 사용됩니다. B. licheniformis의 형태와 유사한 집락 형태에 따르면, 세포 형태는 B. licheniformis의 짧은 막대 모양, 그람 양성, 생리학적, 생화학적 특성이며, 16 s RNA는 B. licheniformis와 밀접한 관련이 있으므로 균주 번호 1026이 B. licheniformis임을 확인할 수 있습니다. 정균 물질은 TLC와 HPLC에 의해 바시트라신으로 확인되었습니다. 따라서, 바시트라신을 생산하는 B. licheniformis 를 얻었다. 이 방법은 또한 심사 과정에 시간이 오래 걸리고 약간의 경험이 필요한 작업과 같은 단점이 있습니다.

요약하면, 이 실험 프로토콜은 바시트라신을 생산하는 B. licheniformis의 획득 및 일상적인 실험실 식별 프로세스를 포괄적이고 상세하게 소개했으며, 이는 광범위한 응용 전망과 헤아릴 수 없는 시장 가치를 가지고 있습니다²⁰. 이러한 방법은 간단하고 실현 가능하며 구현하기 쉬우며, 의심할 여지 없이 B. licheniformis의 대규모 생산을 위한 효과적인 참고 자료가 될 것입니다. 이 논문은 또한 다른 항균 펩타이드에 대한 균주 생산에 대한 스크리닝 아이디어를 제공합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2 × Phanta Flash Master Mix	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, China	P252-01
2kb DNA 마커	Beijing Trans Biotechnology Co., Ltd., 베이징, 중국	BM121-01
Acetonitrile	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., 상하이, 중국	A104443
한천 분말	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., 상하이, 중국	A800730
Agarose	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	A104062
황산 암모늄 ((NH4)2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10002917
오토클레이브 살균기	Zealway Instrument Inc., Xiamen, China	GI36DWS
바실러스 생화학 식별 스트립	칭다오 Haibo Biotechnology Co., Ltd., 칭다오, 중국	HBIG14
Bacitracin	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., 상하이, 중국	B65740
박테리아 DNA 추출 키트	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., 베이징, 중국	DP209
통기성 밀봉 필름	Beijing Leiborun Biotechnology Co., Ltd.	BS-QM-01A
부탄올	상하이 Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., 상하이, 중국	B433378
C18 (5 μ m, 4.6 × 250 mm) HPLC 컬럼	Rizhao Kepuno New Material Co., Ltd., Rizhao, China	C1805-462510
탄산칼슘 (CaCO3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China	10005717
Centrifuge	New Brunswick Scientific Co., Inc., UK	5452
크로마토그래피 탱크	Nanjing Tenghui Experimental Technology Co., Ltd., Nanjing, China	P-1
원뿔형 병	Sichuan Shubo  Co., Ltd., Chengdu, China	18012
항온 인큐베이터	Taist Instrument Co., Ltd., Tianjin, China	GH4500
인산이칼륨 (K2HPO4)	Xilong Chemical Co., Ltd., Guangdong, China	XL0015
EDTA-2Na	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., 상하이, 중국	E397526
전자 저울	Mettler Toledo International Co., Ltd.	FA2104
에틸 알코올	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., 상하이, 중국	E130059
젤 미디 정제 키트	Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd., 베이징, 중국	DP302
유리 막대	Chengdu Yibang Kexi Instrument Co., Ltd.	1294
Glucose	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	D823520
Gram의 염색 용액 키트	Qingdao Haibo Biotechnology Co., Ltd., Qingdao, China	HB8278
고성능 액체 크로마토 그래프	Agilent Technologies, Inc., California, America	1260
수평 전기 영동 장치	Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., 베이징, 중국	DYCP-31DN BIOMATE
접종 링	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., 상하이, 중국	3171026
Magnetic stirrer	Wiggens GmbH Co., Ltd., Germany	WH220 PLUS
메틸 알코올	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	M116115
마이크로 원심 분리기 튜브	Shanghai Muchen Biotechnology Co., Ltd., 상하이, 중국	1351171
Micrococcus luteus	Bena Culture Collection, 쑤저우, 중국	BNCC102589
미세 다공성 필터 멤브레인	Nantong Suri Experimental Equipment Co., Ltd.	PES0.22
닌히드린	상하이 알라딘 생화학 기술 유한 회사, 상하이, 중국	N105629
광학 현미경	광학 기기 공장, 상하이, 중국	DYS-108
돼지 배설	난징 Quanfu 돼지 농장, 난징, 중국
중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭기	Suzhou Dongsheng Xingye Scientific Instrument Co., Ltd., 쑤저우, 중국	ETC811
전문 시퀀싱 회사	General Biology (Anhui) Co., Ltd., Anhui, China
Pyridine	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	P111516
Shaker	Taicang Qiangle Experimental Equipment Co., Ltd., Taicang, China	HYL-C
실리카겔 GF254 박층 플레이트	Yantai Huayang New Material Co., Ltd., 중국 옌타이	HPT-HSGF5025023
염화나트륨(NaCl)	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	S805275
구연산나트륨	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., 중국 상하이	C39197100001
가용성 전분	Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd., 중국 상하이	S817547
서모스탯 수조	Shanghai Heheng Instrument Equipment Co., Ltd., Shanghai, China	DK-8D
Tryptone	Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China	T139519
Ultra GelRed	Nanjing Vazyme Biotechnology Co., Ltd., Nanjing, China	GR501-01
초순수 기기	Merck KGaA Co., Ltd., Germany	Milli Direct-Q8
초음파 세척기	Jiangsu Huaguan Electric Appliance Group Co., Ltd., Jiangsu, China	SB-100DT
버니어 캘리퍼스;	Sanfeng Company, 일본	N20P
효모 추출물 분말	Vicbio Biotechnology Co., Ltd., 베이징, 중국	LP0021