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방법 논문

Wharton's Jelly 중간엽 줄기 세포 및 그 파생 엑소좀/작은 세포외 소포의 분리

1.5K 조회수

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DOI:

10.3791/66778

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2025년 11월 11일

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1Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy, Ain Shams University, 2School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire Hosted by Global Academic Foundation, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Ain Shams University, 4Department of Pharmacology and Biochemistry, Faculty of Pharmacy, The British University in Egypt, 5Health Research Center of Excellence, Drug Research and Development Group (DRD-G), The British University in Egypt

이 논문에서

요약

탯줄 조직은 풍부하고 쉽게 구할 수 있는 비침습적 중간엽 줄기 세포(MSC) 공급원입니다. 이 프로토콜에서는 인간 와튼 젤리 중간엽 줄기세포(WJ-MSC)의 분리 및 특성화를 위한 자세한 단계가 제공되며, 이어서 파생된 엑소좀 또는 작은 세포외 소포를 분리하기 위한 간단한 짧은 프로토콜이 제공됩니다.

초록

재생의학 분야에서는 중간엽줄기세포(MSC)가 특히 주목을 받고 있다. 와튼 젤리라고 불리는 탯줄(UC) 조직의 중간엽 줄기세포는 특히 다양한 응용 분야에서 잘 확립되어 있습니다. 다른 MSC 공급원과 비교하여 Wharton의 젤리 중간엽 줄기세포(WJ-MSC)는 여러 가지 이점을 제공하며 일반적으로 의료 폐기물로 폐기되는 UC로부터 분리됩니다. 따라서 WJ-MSC는 배아 줄기 세포와 관련된 것과 유사한 윤리적 문제를 제기하지 않습니다. 단순하고 재현 가능한 외식편 기술을 사용하여 UC 조직에서 WJ-MSC를 분리했습니다. 분리 후 5일에서 10일 이내에 WJ-MSC는 섬유아세포 모양의 부착 세포로 나타납니다. 분리된 후 세포는 14-18일 안에 약 80% 합류에 도달합니다. 그 후, 3계대에서 분리된 WJ-MSC는 지방 형성, 골형성 및 연골 형성 중간엽 계통을 따라 분화하도록 유도하여 완전히 특성화되었습니다. 또한 CD34, CD14 및 HLA-DR을 포함한 음성 분화 클러스터(CD) 표면 마커와 CD105, CD90, CD73 및 CD44와 같은 독특한 MSC 표면 마커에 대한 면역 표현형을 테스트했습니다. 또한, 침전 시약은 이러한 WJ-MSC의 조절된 배지에서 엑소좀/작은 세포외 소포(sEV)를 분리하기 위한 간단한 접근 방식으로 사용되었습니다. 분리 후 엑소좀/sEV를 투과 전자현미경으로 관찰하고 입자 크기 분석을 사용하여 평균 크기를 계산했습니다. 요약하면, WJ-MSC는 엑소좀/sEV를 생산하기 위한 공장으로 사용될 수 있는 쉽게 사용할 수 있고 비침습적이며 재생 가능한 줄기 세포 공급을 제공합니다. 이러한 WJ-MSC 및 파생 엑소좀/sEV는 광범위한 치료 및 다운스트림 연구 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

서론

불과 몇 년 전만 해도 줄기세포는 의학 분야에서 선두를 차지하는 것으로 생각되었습니다 1,2. 그러나 배아 줄기 세포(ESC)가 제기하는 윤리적 우려는 이 분야의 급속한 발전을 방해하는 큰 장애물이었습니다3. 이것은 줄기 세포, 특히 탯줄(UC)4에서 출생 후 분리할 수 있는 줄기 세포에 대한 대체 재생 가능 공급원을 탐색하는 데 많은 관심을 불러일으켰습니다. UC는 임산한 산모 내부의 태반과 태아와 자연적으로 결합합니다. UC의 타고난 역할은 혈관을 통한 지속적이고 충분한 혈액 공급으로 성장하는 태아에게 영양을 공급하고 운동 중 태아의 비틀림, 압박 또는 꼬임을 방지하여 이러한 혈관을 보호하는 것입니다5. 해부학적으로 인간 UC는 점액양 결합 조직 내에 매립되고 양막 상피의 외부 층 내에 둘러싸인 두 개의 동맥과 정맥으로 구성됩니다6. UC 기질 또는 세 개의 제대 혈관을 둘러싸고 있는 점액성 결합 조직은 "와튼 젤리"(WJ)로 알려져 있으며 주로 프로테오글리칸과 콜라겐7로 구성됩니다.

최근에는 중간엽 줄기 세포(MSC)가 광범위한 재생 의학 응용을 위한 효과적인 새로운 치료 양식으로 많은 주목을 받고 있습니다 7,8,9,10,11,12. MSC에서 가장 흥미로운 점은 분리가 용이하고 면역 조절 활성과 다능성이 입증되었다는 것입니다 13,14,15. 일반적으로 MSC와 특히 WJ에서 파생된 MSC의 다른 우수한 장점은 ESC와 달리 이식 시 기형종이 나타나지 않는다는 점과 여러 세포 계대 후에도 줄기 특성을 유지한다는 사실입니다16,17. 따라서 이제 MSC는 실제로 다양한 질병에 대한 혁신적인 치료 개입을 제공할 수 있다고 믿어집니다 8,18,19. 2006년에 ISCT(International Society for Cell and Gene Therapy)가 MSC의 적절한 특성화를 위한 특정 최소 기준을 정의했다는 점을 지적하는 것이 중요합니다20. 첫째, 표준 배양 조건에서 성장/배양할 때 MSC는 플라스틱 부착성이어야 합니다. 둘째, 중간엽 줄기세포는 CD90, CD105 및 CD73과 같은 일부 특징적인 분화 클러스터(CD) 표면 마커를 발현해야 하며 CD14, CD34 및 CD45와 같은 다른 마커의 발현을 나타내지 않아야 합니다. 셋째, 중간엽 줄기세포는 시험관 내에서 골형성, 지방형성 및 연골형성 계통으로 분화되어야 합니다 20. 오늘날까지 MSC는 골수(BM), 지방 조직과 같은 성인 조직21 및 태반, UC 혈액(UCB) 및 UC 매트릭스22,23과 같은 태아/주산기 공급원을 포함한 여러 출처에서 분리되었습니다. 여기서 주목할 만한 점은 중간엽 줄기세포 수확 성공률을 비교할 때 UCB24,25에서 약 100%에 불과한 것에 비해 WJ 조직에서 거의 6%에 도달하는 것으로 보고되었다는 것입니다. 따라서 UCB는 실제로 조혈모세포의 풍부한 공급원이지만 중간엽 줄기세포의 좋은 공급원으로도 간주되지만 WJ26,27,28보다 현저히 낮습니다.

WJ-MSC는 다른 유형의 중간엽 줄기세포와 비교할 때 예외적인데, 이는 성체 중간엽 줄기세포와 유사한 특성을 갖는 선의(전형적인) 중간엽 줄기세포이지만 다양한 다능성/ESC 마커의 발현도 가지고 있기 때문입니다17,29. 따라서, WJ-MSC는 성체 줄기 세포와 배아 줄기 세포 사이 어딘가에 있는 것으로 여겨진다17. 흥미롭게도, WJ-MSC는 인간 MSC와 ESC 마커를 모두 발현하는 것으로 밝혀졌으며 여러 계대 동안 줄기를 유지할 수 있습니다16. 다행히도 이식 시 기형종을 형성하지 않습니다17. 이것은 ESC 및 다른 MSC와 비교하여 고유한 전사체 프로파일에 의해 설명될 수 있습니다29,30. WJ-MSC는 성인 MSC에 비해 다양한 이점을 나타내며, 일반적으로 다른 유형의 줄기 세포에 비해 다양한 이점을 나타냅니다. 그들의 격리 수단은 출생 시 일상적으로 폐기되는 UC를 통해 쉽게 사용할 수 있으므로 의료 폐기물로 간주됩니다. 따라서 ESC와 달리 WJ-MSC는 윤리적 문제가 없으며 BM-MSC와 달리 침습적 기술을 통해 분리됩니다31. 또한, 다른 MSC 유형과 마찬가지로, WJ-MSC는 인간 백혈구 항원-D 관련(HLA-DR)의 발현이 부족하며, 특히 인간 백혈구 항원-G(HLA-G)를 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 이들에게 추가적인 면역-특권을 제공한다32. 이것은 WJ-MSC가 생체 내 태아-산모 인터페이스에서 일반적으로 발생하는 것을 시뮬레이션하는 면역억제 역할을 나타낸다는 것을 시사합니다 33,34,35. 마지막으로, UCB에서 분리된 유사체와 마찬가지로 WJ-MSC는 뱅킹36에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이러한 모든 장점을 감안할 때 WJ-MSC는 MSC 기반 치료법의 새로운 황금 표준이 되도록 옹호됩니다30.

흥미롭게도 많은 연구에서 중간엽 줄기세포가 주로 측분비 신호 전달을 통해 치료 효과를 나타낸다는 사실이 밝혀졌습니다. 많은 경우, 이러한 효과는 중간엽 줄기세포에 의해 분비되는 엑소좀/작은 세포외 소포(sEV)에 반응하여 발생하는 것으로 보고되었습니다37. 엑소좀/sEV는 세포의 내막 시스템에서 획득되는 나노 크기의 생리 활성 소포로 알려져 있습니다. 이들은 단백질, mRNA 및 마이크로RNA 및 긴 비코딩 RNA(LncRNA)와 같은 비코딩 RNA를 병 안의 메시지로 전달하는 셔틀 역할을 한다(38). 결과적으로, 그들은 수용 세포를 재프로그래밍할 수 있으며 필수 세포 기능을 조작하는 "신호체"로 표시됩니다39. MSC 유래 엑소좀/sEV는 가능한 무세포 대안이라는 점에서 MSC 치료법보다 우월함을 입증했습니다. 모 MSC와 유사하게 엑소좀/sEV는 여러 질병에서 치료 효과와 세포 재생을 유도하는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나 모세포와 달리 생물학적 장벽을 더 쉽게 통과할 수 있습니다. 또한 중요한 안전 문제가 없습니다. 면역 거부 반응이나 장기적인 종양 형성의 위험을 부여하지 않습니다40. 또한, 엑소좀/sEV는 유전 정보를 전달하기 위해 자연스럽게 갖추어진 약물 전달 시스템의 수단으로서 유전자 치료 응용에 사용될 수 있습니다41. 따라서 엑소좀/sEV는 실제로 다양한 질병의 새로운 치료 개입을 위한 흥미롭고 새로운 길을 열었습니다 42,43,44.

이 프로토콜에서는 UC 조직에서 WJ-MSC의 분리 및 특성화를 위한 철저한 단계적 외식편 기반 프로토콜이 제시됩니다. 그 다음에는 이러한 WJ-MSC의 조건화된 배지에서 엑소좀/sEV를 분리하기 위한 간결한 프로토콜이 뒤따를 것입니다.

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프로토콜

모든 실험 및 절차는 승인된 지침에 따라 수행되었으며 이집트 카이로에 있는 Ain Shams University 약학부(ACUC-FP-ASU RHDIRB2020110301 REC# 220)와 이집트 카이로에 있는 이집트 영국 대학교 약학부(CL-2309). UC는 부모(들)로부터 서명된 정보에 입각한 동의를 얻은 후 획득되었습니다.

1. 인간 탯줄에서 WJ-MSC의 분리

  1. 분만 직후 탯줄(UC)(길이 약 15cm)을 채취하기 위해 약 30-40mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 용기(밀봉된 수집 백)에 넣습니다. 수집된 UC를 얼음 위에 유지하고 수집 후 최대 4-5시간 이내에 처리합니다.
    참고: 샘플은 4-5시간 후에 처리할 수 없으며, 이는 MSC 수율을 크게 감소시키기 때문입니다. PBS와 용기가 멸균되어 있는지 확인하십시오.
  2. 10% 태아 소 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 0.25 μg/mL 암포테리신 B로 보완된 저포도당 둘베코의 변형 독수리 배지(LG-DMEM)로 구성된 WJ-MSC용 완전한 배양 배지를 준비합니다.
  3. 웰당 3mL의 완전 배지를 6웰 플레이트에 넣은 다음 배지가 있는 6웰 플레이트를 37°C 및 5%CO2로 설정된 CO2 인큐베이터에 넣어 데우고 준비합니다.
  4. 생물 안전 캐비닛에서 8개의 10cm 세포 배양 접시를 준비하고 각 접시에는 멸균 PBS 10mL를 채웁니다.
  5. 멸균된 겸자를 사용하여 밀봉된 비닐 봉지에서 PBS가 들어 있는 첫 번째 페트리 접시로 UC를 조심스럽게 옮겨 혈액을 씻어냅니다(샘플에서 모든 혈액이 씻겨 나올 때까지 이 단계를 반복합니다).
  6. 멸균 면봉에 70% 에탄올을 뿌리고 이를 사용하여 30초 동안 UC를 닦습니다.
  7. UC를 멸균 PBS로 채워진 새 페트리 접시로 옮겨 잔류 에탄올을 제거합니다.
  8. UC를 멸균 PBS로 미리 채워진 다른 페트리 접시로 옮기고 멸균 가위를 사용하여 UC를 더 작은 조각(각각 약 3cm)으로 자릅니다. 그런 다음 절단 과정에서 혈액이 방출되는 것을 방지하기 위해 3cm 길이의 조각을 신선한 멸균 PBS가 있는 다른 페트리 접시로 옮깁니다.
    알림: 이 시점부터 UC 조각은 모든 후속 처리 단계와 마찬가지로 얼음 위에 유지되어야 합니다. 이것은 젤라틴 물질의 방출을 방지하고 UC 조직에서 WJ-MSC의 분리 절차의 성공을 보장하는 데 매우 중요합니다. 수집된 UC를 최대 4-5시간 이내에 처리하는 것은 분리 프로세스의 성공에 매우 중요합니다. 이전에는 UC가 수집 후 더 오랜 기간 내에 처리되었는데, 안타깝게도 시술 결과 성공하지 못했습니다(데이터는 표시되지 않음).
  9. 멸균 PBS로 채워진 페트리 접시에서 UC 조각을 하나씩(얼음 위에서) 처리하기 시작합니다. 멸균 가위와 겸자를 사용하여 혈관을 잘라내고 와튼 젤리(WJ) 조직을 분리합니다. 그런 다음 투명한 WJ 조각을 얼음 위의 멸균 PBS로 채워진 다른 페트리 접시에 넣습니다.
    참고: UC 조각에서 WJ 조직을 분리하는 동안 혈관을 절단하지 않도록 혈관에서 멀리 떨어진 UC 조각의 투명한 면에서 첫 번째 절개를 수행합니다. 그 후 혈관을 고정하고 절단하고 당겨냅니다.
  10. 혈관이 없는 투명한 WJ 조직을 얻기 위해 모든 UC 조각에 대해 이전 단계를 반복합니다.
    참고: WJ 조직 분리 중에 PBS 용액이 피가 섞이거나 불분명해지면 UC 조각을 처리하고 혈관을 제거하는 동안 필요한 경우 PBS 페트리 접시를 교체하십시오.
  11. 수집된 WJ 조각을 멸균 PBS로 채워진 신선한 10cm 세포 배양 접시로 옮겨 PBS로 세척합니다.
  12. 멸균되고 날카로운 메스와 겸자를 사용하여 수집된 WJ 조직을 10mm 길이의 작은 조각으로 자릅니다.
  13. WJ 조각을 1.3단계에서 이전에 준비된 6웰 플레이트로 옮깁니다. 웰당 5-6개의 WJ 조각을 배치한 다음 WJ 조직 외식편을 포함하는 6웰 플레이트를 CO2 인큐베이터에서 37°C에서 5% CO2가 함유된 가습 분위기에서 배양하고 3일 동안 방해받지 않고 방치합니다.
  14. WJ 조직 외식편을 배치한 후 4일 째에 외식편을 방해하지 않도록 주의하면서 웰당 1mL의 배지를 조심스럽게 추가합니다.
    알림: WJ 조각이 부착된 플레이트 바닥을 만지거나 긁지 마십시오.
  15. WJ 조직 외식편을 배치한 후 6일째 에 이전 단계를 반복합니다.
  16. WJ 조직 외식편을 배치한 후 8일째(즉, 외식편 배치 후 거의 1주일)에 외식편 배치 후12-14일까지 격일로 웰당 배지의 절반을 교체하기 시작합니다. 모든 웰에서 약 2.5mL를 제거하고 신선한 2.5mL의 완전 따뜻한 배지(37°C)를 추가하여 각 웰에서 배양 배지의 절반을 교체합니다.
    알림: 웰 표면에서 매체를 빼내고 WJ 조각이 부착된 플레이트 바닥을 만지거나 긁지 마십시오. WJ-MSC는 일반적으로 외식편을 배치한 후 5-10일 이내에 WJ 조직 외식편 아래와 주변에 나타납니다.
  17. 도립 현미경(10배 배율)에서 6웰 플레이트를 일상적으로 관찰하고, 방출된 세포가 증식하고 융합성이 증가하여 50-60%에 도달하면 다음 단계로 진행합니다. 그렇지 않은 경우 1.16단계를 반복합니다. 다시. WJ 조각은 시간이 지남에 따라 크기가 크게 줄어듭니다.
  18. 웰 바닥에 부착된 WJ 외식편을 부드럽게 제거하고 모든 배지를 제거합니다. WJ 외식편 조각 제거는 일반적으로 처음 배치한 후12-14일째에 수행됩니다.
    참고: 미디어를 제거하는 동안 플레이트를 45° 각도로 약간 기울여 모든 미디어가 제거되었는지 확인합니다.
  19. PBS 2mL로 각 웰을 세척하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이친 다음 PBS를 버립니다. 이 세탁 단계를 두 번 반복합니다.
    참고: PBS를 웰 벽에 부드럽게 추가하고 웰 바닥을 만지지 않도록 하여 세포가 전혀 방해받지 않도록 합니다.
  20. 웰당 2mL의 따뜻한 완전 배지(단계 1.2에 설명된 것과 같은 정확한 조성을 가진 배지)를 부드럽게 추가하고 37°C에서 5%CO2 와 함께 가습된 조건에서 6웰 플레이트를 배양합니다.
  21. 세포가 약 80% 컨플루션에 도달할 때까지 격일로 배지를 완전히 교체합니다(웰당 완전 배지 2mL).
  22. 세포가 약 80% 컨플루션에 도달하면 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 T25 세포 배양 플라스크로 계대시킵니다(하나의 6-웰 플레이트에서 얻은 총 세포는 하나의 T25 배양 플라스크로 계대될 수 있습니다. T25 플라스크당 8-9mL의 완전 배지 사용). 이러한 WJ-MSC는 P1 세포로 표시됩니다.
    참고: 독성 효과를 피하기 위해 트립신-EDTA와 함께 세포를 너무 오래 방치하지 마십시오. 일반적으로 세포 분리에는 3분이면 충분합니다. 다양한 공급업체가 다양한 효능의 트립신-EDTA를 제공할 수 있습니다. 따라서 배양 시간을 지정할 때 이를 고려해야 합니다.
  23. 격일로 미디어를 교체하십시오. 세포가 약 80% 합류에 도달하면, 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 T75 세포 배양 플라스크로 계대시킵니다(하나의 T25 배양 플라스크에서 얻은 총 세포는 하나의 T75 배양 플라스크로 계대될 수 있습니다. T75 플라스크당 15-18mL의 완전 배지를 사용함); 이러한 WJ-MSC는 P2 세포로 표시됩니다.
  24. 격일로 미디어를 교체하십시오. 세포가 약 80% 컨플루언트에 도달하면 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 분리한 다음 T75 플라스크당 약 0.75 x 106-1 x 106 세포의 밀도로 WJ-MSC를 시드합니다. 이러한 WJ-MSC는 P3 세포로 표시됩니다.
    참고: 이 프로토콜에 설명된 향후 실험을 위해 P3-P5 사이의 세포를 사용하십시오.
  25. 80% FBS, 10% 완전 배지(1.2단계에 설명된 대로) 및 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)로 구성된 냉동보존 배지를 사용하여 분리된 WJ-MSC를 액체 질소에 냉동 보존합니다.
    참고: WJ-MSC 분리를 위한 전체 단계의 개략적인 표현은 그림 1에 나와 있습니다.

2. 다양한 CD 표면 마커에 대한 유세포 분석을 사용한 면역 표현형에 의한 분리된 WJ-MSC의 특성화

  1. 계대 4에서 트립신-EDTA를 사용하여 세포를 분리합니다. PBS로 세포를 두 번 세척하고 혈구계를 사용하여 세포수를 계산합니다.
    참고: 트립신화 중 최소 배양 시간(3분 동안)은 손상을 입히지 않고 세포를 성공적으로 분리하는 데 중요합니다. 트립신-EDTA와 장기간 배양하면 세포 표면 마커가 손상되고 면역 표현형 분석 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
  2. 다음과 같이 피코에리트린(PE) 또는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 인간 단클론 항체와 함께 약 100,000개의 세포(어두운 조건에서)를 4°C에서 20분 동안 배양하고, 항-CD90 PE, 항-CD73 PE, 항-CD105 FITC, 항-CD44 PE, 항-CD34 PE, 항-CD14 PE 및 항-HLA-DR FITC, 염색되지 않은 세포를 대조군으로 사용합니다.
  3. PBS로 세포를 헹구고 나중에 500μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 유세포 분석법45를 사용하여 분석합니다.

3. 다양한 중간엽 계통에 대한 분리된 WJ-MSC의 분화 가능성 평가

  1. 지방 생성 분화
    1. 세포를 완전 증식 배지에 재현탁합니다(단계 1.2에 설명된 대로). 그 후, 24웰 조직 배양 플레이트에서 3.7 x 104 세포/웰(0.5 mL 배지/웰)의 밀도로 세포를 배양합니다. 그런 다음 37°C에서 5% CO2 의 가습 조건에서 배양합니다. 다음으로, 다음으로 격일로 세포가 거의 100% 합류에 도달할 때까지 매체를 교체합니다. 일반적으로 약 3-4일이 소요됩니다.
    2. 증식 배지를 제거하고 지방 생성 배지로 교체하여 지방 생성을 유도합니다. 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 U/mL 페니실린, 0.25 μg/mL 암포테리신 B 및 중간엽 줄기 세포 기능 식별 키트에 제공된 지방 생성 보충제로 LG-DMEM 배지를 보완합니다. 그 후, 3일마다 배지를 부드럽게(0.5mL/웰) 교체하고 지질 액포가 파괴되지 않도록 합니다.
    3. 약 21일 후 현미경 검사를 사용하여 지질 액포를 오일 레드로 염색하여 지방 생성 분화를 평가합니다.
    4. 오일 레드의 신선한 원액을 준비하십시오. 오일 레드 염색 30mg을 이소프로판올 10mL에 녹이고 실온에서 최소 30분 동안 휴지시킨다. 다음으로, 이중 증류수(ddH2O) 2부와 원액 3부를 혼합하고 잘 혼합한 후 실온에서 10분 동안 휴지시켜 작업 용액을 준비합니다. 그런 다음 0.22 또는 0.45μm 필터를 사용하여 필터링합니다.
      참고: 최상의 염색 결과를 얻으려면 오일 레드 염색을 새로 준비하십시오.
    5. 성공적인 지방 생성 분화 문서화를 위해 PBS로 세포를 두 번 세척하고 중성 완충 10% 포르말린(0.75mL/웰)으로 15분 동안 고정합니다. 그 후, 1mL/웰을 사용하여 PBS로 세포를 두 번 세척합니다(각 세척 후 PBS를 폐기하기 전에 약 5분 동안 세포를 배양합니다).
      참고: 증식 배지(단계 1.2에 설명됨)에서 유지된 세포는 대조군, 유도되지 않은 세포로 사용됩니다. 세포 손상을 방지하기 위해 중성 완충 포르말린을 세포에 직접 첨가하지 않고 벽에 천천히 첨가하십시오. PBS로 최종 세척한 후 비효율적인 염색을 방지하기 위해 오일 레드 염색 작업 용액을 추가하기 전에 PBS를 완전히 흡인하는 것이 중요합니다.
    6. 최종 세척 후, 세포(1mL/웰)를 오일 레드 작업 용액으로 염색하고 37°C에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 염색액을 빼내고 버리고 PBS로 세포를 부드럽게 두 번 헹굽니다. 그런 다음 현미경으로 염색된 지질 방울을 관찰합니다.
  2. 골형성 분화
    1. 세포를 완전 증식 배지에 재현탁합니다(단계 1.2에 설명된 대로). 그 후, 24웰 조직 배양 플레이트에서 7.4 x103 세포/웰을 시드하고(0.5mL 배지/웰 추가) 습한 조건에서 3일 동안 37°C에서 5% CO2 배양하여 거의 70% 컨플루션에 도달합니다.
    2. 약 70% 합류에서 증식 배지를 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민 및 0.25 μg/mL 암포테리신 B와 함께 10% FBS로 보완된 LG-DMEM 배지에 골형성 보충제(중간엽 줄기 세포 기능 식별 키트에 제공됨)를 포함하는 분화 유도 배지로 교체합니다.
    3. 3일에 한 번씩 분화 배지를 교체하고 약 21일 동안 골형성 유도를 계속합니다.
    4. Alizarin Red S 염색의 작업 용액을 준비하십시오. 9mL의 ddH2O를 가져오고 200mg의 알리자린 레드 S 염색을 녹인 다음 수산화암모늄과 HCl을 사용하여 pH를 4.1-4.3으로 조절합니다. 다음으로, ddH2O로 부피를 10mL로 완성한 후 필터(0.22 또는 0.45μm)를 사용하여 용액을 여과하여 침전물을 제거합니다.
    5. 유도 기간이 끝나면 PBS로 세포를 두 번 헹구고 중성 완충 10% 포르말린(0.75mL/웰)을 사용하여 고정하고 15분 동안 휴지시킨다. 그 후, PBS(1mL/웰)를 사용하여 세포를 두 번 헹구고 헹굼할 때마다 세포를 5분 동안 배양합니다.
      참고: 증식 배지(단계 1.2에 설명됨)에서 유지된 세포는 대조군, 유도되지 않은 세포로 사용됩니다.
    6. 3.2.4단계에서 제조한 2% 알리자린-레드 S 작업 용액을 이전 단계의 고정 세포에 첨가하고 실온에서 약 45-60분 동안 어두운 곳에서 배양합니다.
    7. 그 후, 염색액을 버리고 세포를 ddH2O로 두 번 헹구고 PBS로 한 번 헹구고 염색된 칼슘이 풍부한 세포외 기질을 관찰하여 현미경으로 성공적인 골형성 분화를 평가합니다.
  3. 연골 형성 분화
    1. 세포를 완전 증식 배지에 재현탁합니다(단계 1.2에 설명된 대로). 그 후, 24웰 조직 배양 플레이트에서 7.4 x 103 세포/웰을 시드하고(0.5mL의 배지/웰 추가) 습한 조건에서 37°C에서 5% CO2 의 습한 조건에서 3일 동안 배양하여 거의 90% 컨플루션에 도달합니다.
    2. 약 90% 합류에서 인슐린-트랜스페린 셀레늄(ITS)이 보충된 무혈청 DMEM/F12 및 연골 형성 보충제(중간엽 줄기 세포 기능 식별 키트와 함께 제공됨)를 사용하여 연골 형성 분화 유도를 시작하여 0.25μg/mL 암포테리신 B, 100 U/mL 페니실린, 2 mM L-글루타민 및 100 μg/mL 스트렙토마이신46.
      참고: 완전한 연골 형성 분화 유도 배지는 2-8°C에서 어둠 속에 보관됩니다.
    3. 약 21일 동안 연골 형성 분화 유도를 계속합니다. 한편, 3일마다 미디어를 교체하십시오.
    4. 다음과 같이 Alcian Blue 염색 작업 용액을 준비합니다. 먼저 ddH2O에 3% 빙초산을 준비합니다(빙초산 3mL를 첨가하고 ddH2O로 최대 100mL를 채웁니다). 그런 다음 20mg을 20mL의 3% 빙산 용액에 첨가하고 약 30분 동안 방치한 다음 0.22μm 또는 0.45μm 필터를 사용하여 여과하여 침전물을 제거하여 Alcian Blue 염색 작업 용액을 준비합니다.
    5. 유도 기간이 끝나면 PBS로 세포를 두 번 헹구고 10% 중성 완충 포르말린(0.75mL/웰)을 사용하여 고정하고 15분 동안 휴지시킨다. 그 후, PBS(1mL/well)를 사용하여 세포를 두 번 세척합니다. 매번 5분 동안 세포를 배양해야 합니다.
      참고: 증식 배지(단계 1.2에 설명된 대로)에 유지된 세포는 대조군, 유도되지 않은 세포로 사용됩니다.
    6. 고정 세포를 0.1% 알시안 블루 준비된 작업 용액에서 37°C에서 약 60분 동안 배양합니다. 세포를 ddH2O로 두 번, PBS로 한 번 헹구어 잔류 염색을 제거합니다. 그런 다음 현미경 검사를 사용하여 염색된 황산화 프로테오글리칸을 관찰합니다.

4. WJ-MSC 컨디셔닝 배지에서 엑소좀/sEV 분리

  1. WJ-MSC를 완전 증식 배지(단계 1.2에 설명된 대로)에 재현탁하고 이러한 WJ-MSC로 6웰 조직 배양 플레이트를 150,000 세포/웰(2mL 배지/웰)의 밀도로 시드하고 5% CO2의 습한 조건에서 37°C에서 배양합니다.
  2. 다음과 같이 무혈청(SF) 엑소좀 수집 배지를 준비합니다: 2mM L-글루타민, 100U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 0.25μg/mL 암포테리신 B가 보충된 저포도당 Dulbecco's Modified Eagle 배지(LG-DMEM).
    참고: 엑소좀 수집 배지는 완전한 증식 배지(단계 1.2에 설명됨)와 동일한 조성을 갖지만 FBS는 없습니다.
  3. 6웰 플레이트(4.1단계에서 준비)를 따르고 증식 배지를 사용하여 격일로 배지를 교체합니다(1.2단계에서 설명된 대로). 세포가 약 75-80% 합류에 도달할 때까지 현미경으로 세포를 관찰합니다.
  4. 70% 컨플루언션에 도달하면, PBS(1mL/웰)로 세포를 두 번 세척한 후, 무혈청(SF) 엑소좀 수집 배지(1.5mL/웰)(단계 4.2에 설명됨)를 첨가하고, 5%CO2의 습한 조건에서 37°C에서 48시간 동안 배양한다.
  5. 48시간 후, 15mL 원심분리 수집 튜브에 이전 단계에서 배치된 6웰 조직 배양 플레이트에서 WJ-MSC 컨디셔닝 배지를 수집합니다. 그런 다음, 수집된 컨디셔닝된 배지(47)를 제거하기 위해 다음과 같은 순차적 원심분리 및 여과 단계를 수행한다.
    참고: 트리판 블루 배제 염료를 사용한 후 혈구계를 사용하여 세포를 계산한 후 수집된 컨디셔닝 배지를 도출하는 데 처음 사용된 세포의 생존율을 평가합니다. 생존 세포는 이상적으로는 90% 이상이어야 합니다. 그 후, 향후 조사에 필요할 경우를 대비하여 수집된 세포 펠릿을 -80°C에 보관합니다.
    1. 수집된 컨디셔닝 배지를 4°C에서 10분 동안 300 x g 으로 원심분리하여 부유 세포를 제거합니다. 그런 다음 상청액을 수집하고 이 수집된 상청액(컨디셔닝 배지)에 대해 다음 원심분리 단계를 수행합니다.
    2. 4.5.1단계에서 얻은 컨디셔닝된 배지를 3000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리하여 괴사된 세포와 세포 파편을 제거합니다.
      참고: 원심분리 단계는 바람직하게는 4°C에서 수행되지만 유사한 결과로 실온에서도 수행할 수 있습니다.
    3. 이전 단계에서 얻은 상청액을 0.22μm 필터를 통해 새로운 컬렉션 50mL 폴리프로필렌 튜브로 통과시켜 잔류 세포 파편과 큰 EV를 제거합니다.
      참고: 여과된 컨디셔닝 배지는 엑소좀/sEV를 분리하기 위한 후속 단계에 즉시 사용하거나, 4°C에서 냉장고에 보관하고 3일 이상 사용하지 않거나, 엑소좀/sEV를 분리해야 할 때까지 장기 보관을 위해 -80°C에서 보관할 수 있습니다. -80°C에서 보관된 투명 컨디셔닝 배지는 최대 1-3개월 이내에 처리되는 것이 바람직합니다. 빠를수록 좋습니다.
  6. 7.5mL의 투명 컨디셔닝 배지(4.5단계에서 얻음)를 15mL 원심분리 튜브에 넣고 1.5mL의 시약을 추가합니다. 시약을 1:5 비율로 배지에 첨가합니다(즉, 배지 5mL당 Exoquick-TC 침전 시약 1mL). 그런 다음 튜브를 위아래로 뒤집고 여러 번 튕겨 침전 시약과 매체가 적절하게 혼합되도록 합니다.
    참고: 침전 시약은 무겁고 점성이 있는 시약입니다. 따라서 필요한 볼륨을 천천히 조심스럽게 인출하여 의도한 볼륨이 완전히 전송되도록 해야 합니다.
  7. 침전 시약이 들어 있는 배지가 있는 튜브를 4°C에서 약 16시간(최소 12시간) 동안 똑바로 세운 자세로 밤새 보관합니다.
  8. 다음날, 배지/침전 시약 혼합물을 1500 x g 으로 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 엑소좀/sEV 펠릿은 튜브 바닥에 침전된 매우 작은 흰색 또는 베이지색 펠릿으로 나타납니다.
    참고: 이 원심분리 단계는 실온에서도 유사한 결과를 얻을 수 있습니다. 이 원심분리 단계가 끝날 때 엑소좀/sEV 펠릿이 보이지 않는 경우, 4°C에서 20-30분 동안 3000 x g 에서 추가 원심분리 시간을 추가할 수 있습니다. 때때로 엑소좀/EV 펠릿은 연장된 원심분리 시간 후에도 보이지 않는 상태로 남아 있는데, 이는 소량의 엑소좀/sEV가 있음을 의미합니다. 이 경우 튜브의 하단 5-10μL를 남겨두고 프로토콜을 진행합니다.
  9. 상청액을 흡인하고 잔류 배지/침전 시약 혼합물을 1500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 매우 조심스럽게 침전된 엑소좀/sEV 펠릿을 방해하지 않고 남은 미량의 체액을 흡인합니다.
  10. 펠릿 크기와 가시성에 따라 엑소좀/sEV 펠릿을 100-300μL의 멸균 PBS에 현탁시킵니다. 그 후, 이러한 엑소좀/sEV는 즉시 활용하거나 후속 실험을 위해 -80°C의 초냉동고에 보관할 수 있습니다.
    참고: 동일한 배지(단계 4.9에 설명됨)에 대해 하나 이상의 원심분리기 튜브로 시작하고 엑소좀/sEV 펠릿(단계 4.10에서 얻음)이 보이지 않는 경우, 이들 모두에서 수집된 엑소좀/sEV 펠릿은 약 100-300μL의 멸균 PBS를 사용하여 풀링하여 함께 풀링된 모든 펠릿을 현탁시킬 수 있습니다.
  11. 제조업체에서 명시한 대로 상업적으로 이용 가능한 비신코닌산(BCA) 단백질 정량 키트를 사용하여 단백질 함량과 관련하여 수집된 엑소좀/sEV를 정량화합니다.
    참고: WJ-MSC 유래 엑소좀/sEV의 모든 분리 단계의 개략적인 표현은 그림 2에 나와 있습니다.

5. 투과전자현미경(TEM)을 이용한 분리된 엑소좀/sEV의 이미징

  1. 펠릿 크기 및 가시성에 따라 100-300μL의 멸균 PBS에 새로 분리된 엑소좀/sEV를 현탁시킵니다(앞서 4.11단계에서 설명한 대로).
    참고: TEM 이미징을 위해 냉동된 엑소좀/sEV보다 새로 분리된 엑소좀/sEV를 사용하는 것이 훨씬 선호됩니다
  2. 20μL의 엑소좀/sEV 현탁액을 탄소 코팅된 그리드에 피펫팅하고 10분 동안 건조시킵니다.
  3. 글루타르알데히드 용액(증류수에 2%)을 사용하여 약 15분 동안 배치된 엑소좀/sEV를 고정합니다.
  4. 그 후, 고정된 엑소좀/sEV를 2% 우라닐 아세테이트로 염색하고 어둠 속에서 약 3분 동안 방치한 다음 기본 TEM 설정을 사용하여 투과 전자 현미경(TEM)(20000 배율)에서 검사합니다.

6. 입자 크기 분석기를 사용하여 분리된 엑소좀/sEV의 평균 크기 측정

  1. 새로 분리된 엑소좀/sEV를 멸균 PBS pH 7.4로 1:250의 비율로 희석합니다.
  2. 25°C에서 입자 크기 분석기를 사용하여 분리된 엑소좀/sEV의 평균 입자 크기 분포를 측정합니다.

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결과

WJ-MSC의 분리 및 특성화

그림 3에서 볼 수 있듯이, 작은 섬유아세포 유사 세포는 처음에 WJ 외식편 조직 아래 및 주변에 나타났으며, 해당 외식편을 파종한 후 5-10일 이내에 나타났습니다(그림 3A). 이러한 방출된 WJ-MSC는 계속 증식하며 일반적으로 분리 후 14-18일 이내에 약 80% 합류에 도달합니다. 여기서 주목할 만한 점은 외식편 조직이 배양되는 동안 크기가 계속 줄어들고 분리일에 6웰 플레이트에 처음 파종한 후 거의 12-14일 후에 제거된다는 것입니다. 이러한 WJ 외식편 조직을 제거할 때 WJ-MSC는 일반적으로 제거된 외식편 아래에 고밀도...

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토론

이 프로토콜에서 우리는 인간 UC 조직에서 WJ-MSC를 분리하고 파생된 엑소좀/sEV를 분리하기 위한 자세한 단계를 제시할 수 있었습니다. UC는 MSC를 얻기 위해 쉽게 얻을 수 있는 미개척 비침습적 소스이며 수집 또는 처리를 위한 특수 장비가 필요하지 않습니다 11,15,30,32,48. UC 조직에서 WJ-MSC를 분리하기 위해 다양한 프로토콜이 활용되었습니다. 기본적으로, 이 프로토콜과 달리, 조직 외식편(32,48) 및 화학적 효소 분해

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공개 사항

모든 공동 저자는 이 작업과 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 이집트 아인 샴스 대학교 - 전략 계획 연구 지원 보조금(2024/2025)과 이집트 카이로에 있는 이집트 영국 대학교(BUE)의 나노기술 연구 센터(NTRC) - 액세스 어워드(2019/2020)에서 부분적으로 자금을 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
알시안 블루 8GX시그마-올드리치, 미국A3157
알리자린 레드 S시그마-올드리치, 미국A5533
수산화암모늄피셔 사이언티픽, 독일1336-21-6
인간 CD-105 항체, FITCR& D 시스템즈 주식회사, 미네소타, 미국FAB10971F
인간 CD-14, PE용 항체벡맨 쿨터, 미국IM0650U
인간 CD-34 항체, PE에 대한 항체벡맨 쿨터, 미국IM1420
인간 CD-44 항체, PE에 대한 항체벡맨 쿨터, 미국A32537
인간 CD-73용 항체, PE용 항체R& D 시스템즈 주식회사, 미네소타, 미국FAB5795P
인간 CD-90 항체, PER& D 시스템즈 주식회사, 미네소타, 미국FAB2067P
인간 HLA-DR, FITC 항체벡맨 쿨터, 미국IM1638U
비신코닉산(BCA) 단백질 정량 키트서모피셔23227
바이오세이프티 캐비닛, 층류 흐름, MSC 어드밴티지미국 열모과학
CO2 인큐베이터, 직접 포르마미국 열모과학
냉각 원심분리기시그마, 독일
냉각 원심분리기에펜도르프, 독일
CytoFLEX 유동 세포계  미국 플로리다주 벡맨 쿨터
디메틸 설폭사이드 (DMSO)피셔 사이언티픽, 독일BP231-100
DMEM - 저혈당 1 g/L론자, 스위스12-707F
DMEM/F12 론자, 스위스12-719F
DNAase/RNAse 자유수깁코 써모피셔, 미국10977-035
에탄올 절대, 분자생물학 등급시그마-알드리히, 독일24103
엑소퀵-TC시스템 생명과학(SBI), 미국EXOTC50A-1침전제(preatating agent)
태아 소 혈청 (FBS)깁코 써모피셔, 브라질10270-106
포름알데히드 37%피셔 사이언티브BP531-500
빙하 아세트산시그마 알드리히, 독일A38S-500
글루타알데히드 용액  시그마G7776
염산(HCl)피셔 사이언티픽, 독일A144-212
역현미경올림푸스, 일본
L-글루타민깁코 써모피셔, 미국25030-024
중간엽 줄기세포 기능 식별 키트  R& D 시스템즈 주식회사, 미네소타, 미국SC006
마이크로플레이트 리더크로메이트, 어웨어니스 테크놀로지스, 미국
오일 레드 스테인시그마-올드리치, 미국O0625
페니실린-스트렙토마이신-암포테리신깁코 써모피셔, 미국15240062
인산염 완충 식염수 1회 사용, Ca/Mg 없이론자, 스위스BE17-516F
흔들리는 물욕대한와이즈배스, 한국
주사기 필터, 0.2마이크론코닝, 미국431224
투과 전자현미경JEM-1200EX II, 전, 독일
트리판 블루와 nbsp;깁코 써모피셔, 미국15250061
트립신-버센-EDTA, 1회론자, 스위스CC-5012
우라닐 아세테이트 용액 (2%)전자 마이크로소피 사이언스, 미국22400-2
자외선 가시광광도계일본 시마즈
소용돌이실로젝스
제타-사이즈 나노 ZN말번 파날리티컬 주식회사, 영국  입자 크기 분석기

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