방법 논문

탄소 함유 미립자 물질에 노출된 기도 대식세포의 탄소 함량 측정

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DOI:

10.3791/66781

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2024년 7월 12일

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1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, Qingdao University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 논문은 개별 미립자 물질 노출 수준에서 내부 노출 선량을 평가하기 위해 기도 대식세포의 탄소 함량을 측정하기 위한 자세한 실험 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

폐 대식세포(pulmonary macrophage)는 식세포화(phagocytizing) 입자에서 용량 의존적 패턴을 보입니다. 삼킨 후, 이 대식세포는 이후 가래로 배설되어 대식세포와 입자를 볼 수 있고 광학 현미경으로 정량화할 수 있습니다. 특히 포유류 몸 내의 원소 탄소는 전적으로 외부 오염 물질에서 비롯됩니다. 결과적으로, 기도 대식세포(CCAM)의 탄소 함량은 유효한 노출 바이오마커 역할을 하여 탄소 함유 미립자 물질(PM)에 대한 개별 노출을 정확하게 추정합니다. 이 기사에서는 객담 채취, 보존, 처리, 슬라이드 준비 및 염색, 대식세포 사진 획득 및 분석과 관련된 프로토콜에 대해 설명합니다. 대식세포핵을 제거한 후 탄소입자(PCOC)가 차지하는 세포질 영역의 비율을 계산하여 각 대식세포의 탄소 함량을 정량화했습니다. 결과는 탄소 함유 PM에 노출된 후 CCAM 수치가 상승했음을 나타냅니다. 요약하면, 이 비침습적이고 정밀하며 신뢰할 수 있고 표준화된 방법은 표적 세포 내 탄소 입자를 직접 측정할 수 있으며 유도 가래를 통한 개별 CCAM의 대규모 정량화에 활용됩니다.

서론

주변 대기 오염은 호흡기 및 심혈관 질환으로 인한 사망과 관련이 있으며, 인간의 건강에 심각한 위협이 됩니다 1,2. 역학 데이터에 따르면 직경 2.5μm(PM2.5) 이하의 주변 미립자 물질에 대한 만성 노출이 전 세계적으로 400만 명에서 900만 명의 조기 사망의 원인입니다. PM2.5는 2015년 글로벌 질병, 부상 및 위험 요인 부담 연구(GBD)에서 전 세계 사망률의 다섯 번째로 중요한 위험 요인으로 선정되었습니다3,4,5,6. 연구에 따르면 WHO 대기 오염 지침을 준수하면 PM2.5 노출로 인한 연간 51,213명의 사망을 예방할 수 있습니다3. 현재 대부분의 연구는 개인 내 노출에 대한 평가가 부족하고 개별 노출 수준과는 거리가 먼 더 큰 지역 모니터링 사이트의 조잡한 평가에만 기반하고 있습니다. 요로 PAH 및 벤조피렌(benzo(a)pyrene)과 같은 내부 노출의 이용 가능한 바이오마커는 미세먼지 노출과 건강 영향 사이의 연관성을 반영하지 않습니다 7,8,9. 이로 인해 건강에 미치는 영향과 정확한 관계를 설정할 수 없습니다. 따라서 개인의 미립자 물질 노출 수준을 반영하는 마커를 찾는 것은 개인에 대한 정확한 노출 평가의 핵심 중 하나입니다.

기관지로 흡입된 입자는 기관지의 섬모 진동을 통해 가래와 함께 배설될 수 있습니다. 폐포에 섬모 점액 흐름 수송 시스템이 없다는 것은 폐포로 유입되는 입자의 주요 제거 경로가 대식 세포작용과 대식 세포에 의한 전좌를 통한다는 것을 의미합니다10,11. 폐의 해부학적 구조에 따라 불용성 미립자 이물질의 제거가 느립니다. 이를 통해 미립자 물질이 장기간 폐 세포와 상호 작용하고 다양한 생물학적 효과를 시작하여 폐 조직 및 기타 장기에 손상을 일으킬 수 있습니다12,13. 미세먼지에 의한 자극은 대식세포 활성화로 이어져 폐에 전신 염증 반응을 유발할 수 있는 일련의 염증 인자를 유발합니다14. 폐에서 사이토카인 폭풍을 유발하는 대식세포 세포형성(macrophage cytophagy)의 결정적인 역할을 고려할 때, 폐 대식세포의 탄소 입자가 공기 중 탄소 핵 미립자 노출의 생물학적으로 효과적인 용량을 반영할 수 있다는 이론이 제시되었습니다15. 더욱이, 포유류 세포에는 원소 탄소의 응집이 없고 탄소 함유 입자가 광학 현미경으로 검은색 입자상 물질로 관찰될 수 있기 때문에 폐포 및 기관지 대식세포의 수집과 그 안의 탄소 함량 측정은 미립자 물질 노출을 평가하기 위한 지표 역할을 할 수 있습니다16.

이 연구는 CCAM(Carbon Content of Airway Macrophages)으로 알려진 개별 미립자 물질 노출 수준을 정확하게 평가하는 방법을 확인했습니다. 구체적으로, 참가자들이 초음파 분무기에서 생성된 긴장성 식염수를 흡입한 후 집단 가래 샘플을 수집했습니다. 그런 다음 이러한 샘플을 고정 용액을 사용하여 보존했습니다. 기도 대식세포를 분리하고, 염색하고, 광학 현미경으로 사진을 찍어 탄소 함유 입자를 포함하는 대식세포를 식별한 다음 정량화했습니다. 이 방법은 개별 미립자 물질 노출 수준을 정확하게 평가하기 위한 생물학적 마커를 제공합니다. 미립자 물질 노출과 건강 영향 사이의 관계를 조사하기 위한 방법론적 기반을 구축하여 PM 노출과 폐 질환과 같은 건강 결과 사이의 연관성을 탐구하기 위한 연구 기반 역할을 합니다.

프로토콜

이 연구는 중국 질병통제예방센터(NIOHP201604)의 산업보건 및 독극물 통제 연구소 의료 윤리 위원회의 승인을 받았으며, 연구 및 생물학적 샘플 수집 전에 모든 피험자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 본 연구를 위해 카본블랙 공장에서 1년 이상 근무하며 카본블랙 에어로졸에 노출된 카본블랙 패커를 선정하였다. 연구를 확립하기 위해 유해한 요인에 대한 직업적 노출이 크지 않은 상수도 공장의 상수도 근로자를 지역에서 대조군으로 모집했습니다. 연구 모집단에 대해 다음과 같은 포함 및 제외 기준이 선택되었습니다: 카본 블랙 패커에 대한 포함 기준에는 대부분의 교대 근무 중 카본 블랙과의 직접 접촉과 카본 블랙 노출 영역에서의 최소 1년의 작업이 포함되었습니다. 상수도 근로자는 작업 환경에서 카본 블랙 또는 기타 오염 물질에 직업적으로 노출되지 않은 경우 포함되었습니다. 제외 기준은 암 등 만성질환을 앓고 있는 근로자, 지난 3개월 이내에 X-ray에 노출된 근로자, 폐결핵, 폐 수술, 바이러스성 심근염, 선천성 심장 질환, 최근 발열 또는 염증 병력이 있는 근로자, 최근에 항생제를 복용한 근로자를 포함했습니다. 연구에 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 가래 보존

  1. 아래 단계에 따라 고정 용액을 준비합니다.
    1. 2% 폴리에틸렌 글리콜(PEG1500)을 수조에 녹입니다. 원심분리기 튜브에 녹은 PEG1500 20mL를 섭취합니다. 원심분리기 튜브에 50% 에탄올 20mL를 넣고 혼합물을 완전히 흔들어 모액을 만듭니다.
    2. 40mL의 모액을 960mL의 50% 에탄올에 서서히 붓습니다. 용액을 잘 흔들어 Saccomanno 고정 용액을 형성합니다. 용액을 서늘하고 어두운 곳에 보관하십시오.
  2. 준비된 정착액 20-30mL를 약 2mL의 가래가 들어 있는 원심분리 튜브에 추가합니다. 내용물을 잘 섞습니다.
    알림: 총 부피가 40mL를 초과하지 않는지 확인하십시오.
  3. 원심분리기 튜브를 밀봉 필름으로 밀봉합니다. 서늘하고 어두운 곳에 보관하십시오. 준비가 되면 추가 처리를 위해 튜브를 실험실로 운반합니다.
    알림: 항상 수조에서 PEG1500 녹이고 규정된 복용량에 따라 사용하십시오.

2. 가래에서 세포 현탁액의 제조

  1. 실제 복용량에 따라 식염수 100mL에 디티오트레이톨 0.1g을 용해하여 소화액을 준비합니다. 준비된 용액을 4°C에서 최대 48시간 동안 보관하십시오.
  2. 가래가 들어 있는 튜브를 1,998 x g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
  3. 상등액을 버리십시오. 침전물에 동일한 양의 가래 소화물을 첨가하십시오. 혼합물을 소용돌이치고 철저히 흔듭니다.
    1. 완전한 액화(10-15분)가 될 때까지 튜브를 37°C 수조에 넣습니다.
      알림: 액화 과정에서 튜브를 지속적으로 흔듭니다.
  4. 액화 혼합물을 70μm 필터 멤브레인으로 여과합니다.
  5. 여과된 용액을 500 x g 에서 4°C에서 7분 동안 원심분리합니다.
  6. 상등액을 버리고 세포 침전물을 유지합니다.
  7. 세포 침전물을 Duchenne 인산염 완충액에 재현탁시킵니다. 재현탁액을 500 x g 에서 4°C에서 7분 동안 원심분리하여 순수한 세포 침전물을 얻습니다.

3. 세포 도말의 준비

  1. 세포 침전물에 200-600 μL의 인산염 완충액을 추가합니다. 내용물을 철저히 섞으십시오. 세포 계수 결과에 따라 버퍼 부피를 조정합니다(>1.0 × 105 개 세포 목표).
  2. 세포 현탁액 20μL를 취하고 헤마토크릿 방법17을 사용하여 세포 도말을 생성합니다.
  3. 얼룩을 자연 건조시키십시오 (48 시간 이내). 시중에서 판매되는 염색 용액으로 10초 동안 얼룩을 고정합니다.
  4. 얼룩을 A 염색 용액에 8초 동안 담그십시오. 염색하는 동안 슬라이드를 위아래로 부드럽게 들어 올리고 흐르는 물로 과도한 얼룩을 헹굽니다.
  5. B 염색 용액으로 번짐을 8초 동안 염색합니다. 염색하는 동안 슬라이드를 들어 올리고 흐르는 물에 과도한 얼룩을 헹굽니다.
    참고: 염색 용액 A 및 B는 시중에서 판매되는 염색 키트에서 사용할 수 있습니다.
  6. 슬라이드를 무수 에탄올에 두 번, 매번 2-3초 동안 담그십시오.
  7. 건조되면 적당량의 중성 껌을 바르십시오. 커버 슬립으로 슬라이드를 밀봉하십시오.

4. CCAM의 정량 분석

  1. 100x 오일 렌즈 대물렌즈가 있는 광학 현미경을 사용하십시오. 무작위로 선택되고, 염색이 잘 되고, 형태학적으로 손상되지 않은 대식세포의 이미지를 캡처합니다. 각 샘플에 대해 무작위로 50개의 대식세포 사진을 촬영합니다.
  2. 아래 단계에 따라 Image J 소프트웨어에서 이미지 분석을 수행합니다.
    1. 스케일을 측정하고 실제 길이와 픽셀 간 변환(282픽셀 = 10μm)을 결정합니다. 이미지 J(분석 > 스케일 설정)에서 스케일을 설정하고, 픽셀( 픽셀) 거리 , 실제 길이, 길이 단위(μm)를 입력하고, 글로벌 틱을 선택합니다.
    2. 불규칙한 모양을 사용하여 셀의 윤곽을 그립니다. 배경을 제거합니다(자유형 선택, 편집 > 바깥쪽 지우기). 셀의 전체 면적을 측정합니다(Analyze > Measurement).
    3. 핵을 잘라냅니다(Edit > Cut). 회색 음영 이미지를 흑백으로 변환합니다(이미지 > 유형 > 8비트).
    4. 정확한 탄소 입자 계수를 위해 각 세포 염색에 특정한 그레이스케일 값을 조정합니다(이미지 > Apply > Threshold > Apply, Analyze >> Measurement를 조정합니다).
    5. Image J 소프트웨어에서 측정된 면적과 이미지 분석을 기반으로 샘플당 50개 대식세포의 탄소 함량을 계산합니다.

결과

고정액으로 보존 및 처리된 가래는 형태학적 검사 중에 광학 현미경 하에서 온전한 대식세포 형태를 보여주었습니다. 대식세포는 투명하고 둥글거나 신장 모양이며 쉽게 염색할 수 있는 세포핵을 나타냈습니다. 염색 후 세포핵은 청자색으로 보였고 세포질은 연한 분홍색 또는 연한 파란색이었습니다. 현미경 필드는 최소한의 불순물을 보여 주어 세포 식별이 용이했습니다. 세포 내에서 블랙 카본 입자가 작은 응집체에서 뚜렷하게 보였기 때문에 탄소 입자의 정량적 분석이 가능했습니다.

가래 대식세포의 대표적인 이미지가 그림 1에 제시되어 있으며, 서로 다른 세포에 있는 다양한 수의 탄소 입자를 보여줍니다. 예를 들어, 그림 1A는 탄소 입자가 없음을 보여주는 반면 그림 1D는 가장 높은 농도를 나타냅니다. CCAM의 값은 대식세포(A-D)에 대해 각각 0.00%, 2.24%, 6.64% 및 34.61%로 측정되었습니다. CCAM 매개변수 결정 프로세스 동안, 대식세포 크기의 변화 및 탄소 입자와 세포핵의 중복으로 인해 발생하는 편향을 완화하기 위해 각 대식세포의 탄소 함량에 대한 정량적 평가를 수행했습니다. CCAM 계산 및 분석은 그림 2와 같이 연구 대상자 당 50개의 대식세포에 대해 수행되었습니다.

이 연구는 특정 아세틸렌 카본 블랙 공장의 카본 블랙 패커(CBP)를 노출 그룹으로 선택하고 유해 요인에 대한 명백한 직업적 노출이 없는 지역 수처리 공장의 워터 펌프 작업자를 대조군(Non-CBP)으로 모집했습니다. 그림 2 에 제시된 결과는 대조군에 비해 카본 블랙 패키징 작업자의 CCAM이 더 높다는 것을 나타냅니다.

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그림 1: 기도 대식세포 내의 탄소 입자를 보여주는 광학 현미경 이미지. 세포질의 검은색은 탄소 입자를 나타냅니다. 패널(A-D)은 기도 대식세포의 대표적인 이미지를 보여주며, 각 패널은 다양한 수준의 CCAM을 나타냅니다. (A-D)에서 대식세포에 대한 CCAM 값은 각각 0.00%, 2.24%, 6.64%, 34.61%였다. 가장 높은 CCAM 수준은 (D)에서 관찰되었습니다. 스케일 바: 10μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 모집단에서 CCAM의 정량적 수준. 50개의 세포질이 손상되지 않고 염색이 잘 된 대식세포를 연구 대상자 당 분석 및 정량화를 위해 무작위로 선택했습니다. 데이터는 학생의 t-검정(*P < 0.05)을 사용하여 분석되었습니다. CBP: 카본 블랙 패커; 비 CBP: 대조군. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 연구는 유도 가래 유래 CCAM을 대기 중 미립자 물질에 대한 내부 노출에 대한 생물학적 마커로 사용하기 위한 상세한 실험 프로토콜을 제시합니다. CCAM은 광학 현미경을 통해 검출하고 정량화할 수 있으며, 건강에 미치는 영향과의 관계를 반영하는 정밀한 내부 노출 바이오마커 역할을 합니다. 따라서 방법론적 절차를 표준화하기 위해 편리하고 신뢰할 수 있으며 효율적인 유도 객담 보존 방법과 CCAM 정량화 방법을 수립하고 최적화할 필요가 있습니다.

폐 대식세포의 탄소 함량 측정에는 폐 대식세포 수집, 번짐, 염색, 사진 촬영 및 이미지 분석을 포함한 여러 단계가 포함됩니다. 현재 폐 대식세포를 채취하는 방법에는 유도 가래와 폐 세척의 두 가지가 있으며, 각각 고유한 장점과 한계가 있습니다18,19. 폐 세척은 많은 균질한 폐 대식세포를 생성할 수 있지만 마취 및 기타 의학적 상태가 필요한 외상성 샘플링 방법입니다. 따라서 대규모 일반 인구 표본추출에는 적합하지 않습니다. 대조적으로, 유도 가래는 수행하기 쉽고 비침습적이며 일반 인구 집단의 대규모 샘플링에 적합합니다. 또한 반복 샘플을 얻을 수 있습니다. 폐 세척은 폐포 또는 원위 세기관지에서 대식세포를 얻는 반면, 유도 가래는 기도에서 유래할 수 있는 대식세포를 얻습니다. 본 연구에서는 유럽호흡기학회(European Respiratory Society20)에서 발표한 표준 프로토콜에 따라 유도 가래를 수행했다.

유도 가래의 성공률은 분무된 흡입 식염수의 농도와 환자의 호흡기 질환 유무 등 다양한 요인에 의해 영향을 받는다 21,22,23. 객담 샘플에는 또한 타액이 포함될 수 있으며, 이는 대식세포 탄소 함량 측정을 방해할 수 있으며, 잠재적으로 샘플에서 기도 대식세포의 수를 감소시킬 수 있습니다24. 이 연구의 운영 절차는 표준화되어 있었고 방법은 간단했으며 재현성이 높았습니다. 분무된 흡입 유속의 크기, 유도 시간의 적절성, 유도 중 간격의 존재와 같은 요인이 유도 가래의 성공률에 영향을 미치는 것이 관찰되었습니다. 이러한 고려 사항은 미립자 물질 노출에 대한 바이오마커로서 CCAM의 정확하고 신뢰할 수 있는 측정을 보장하는 데 중요합니다.

50% 에탄올과 2% 폴리에틸렌 글리콜로 구성된 Saccomanno 정착 용액은 일반적으로 기관지 폐포 세척액과 같은 생물학적 샘플을 보존하기 위한 정착제로 사용됩니다. 본 연구에서는 역학 현장 조사에서 얻은 가래를 보존하기 위해 처음으로 이 정착액을 활용하였다. 그 결과는 대식세포에서 탄소의 후속 정량화와 일치했으며, 이는 명확한 암세포 도말25를 얻기 위해 아침에 가래 세포를 보존하는 것과 유사했습니다. 운영 절차가 표준화되었고, 방법이 간단했으며, 재현성이 높았습니다. 본 연구에서 유도 가래 보존의 장점은 (1) 정착제의 구성이 용이하고, (2) 보존을 위한 냉장 보관이 필요하지 않아 대규모 역학 조사에 편리하며, (3) 검체를 빛을 피해 서늘한 곳에 보존할 수 있다는 점이다. 염색 후 현미경으로 명확하게 볼 수 있으며, 식별 가능한 핵, 최소한의 불순물 및 완전한 세포 형태가 있습니다. 이는 형태학 측면에서 직접 객담 처리 및 도말 적용보다 우수하다26.

실험 방법과 관련하여 다음과 같은 세부 사항이 기록되었습니다 : 가래는 완전히 액화될 때까지 37°C 수조에서 소화하는 동안 주기적으로 흔들었습니다. 액화 후, 보다 깨끗한 염색 배경을 위해 불순물을 제거하기 위해 원심분리 전에 70μm 멤브레인에서 여과를 수행했습니다. 세포 침전물은 슬라이드에 번지기 전에 DPBS로 다시 세척되었습니다. 염색하는 동안 과도한 액체는 흐르는 물로 슬라이드를 세척하여 제거했습니다. 잔류물을 방지하기 위해 염색 I과 염색 II 사이에서 슬라이드 홀더를 교체했습니다. 사진 촬영의 경우, 완전한 형태와 양호한 염색을 가진 대식세포를 무작위로 선택하여 CCAM 정량화에 영향을 미쳤습니다27.

이 연구를 위한 정량 분석 소프트웨어 옵션에는 Image SXM 및 Image J28이 포함됩니다. 이미지 SXM은 정확도를 높이기 위해 분석 전에 수동 이미지 편집이 필요하므로 필요한 시간이 크게 연장됩니다. 또한 단일 셀 유형을 처리하는 것으로 제한됩니다. 대조적으로, 이 연구에 사용된 Image J 소프트웨어는 이미지 처리에서 더 나은 특이성과 더 넓은 호환성을 제공합니다. 다른 분야에서는 형광 표지된 세포의 선택 및 후속 분석을 위해 high-content screening microscopy 방법이 사용되어 자동화된 고처리량 작업을 달성했습니다. 방법론적 연구의 향후 방향에는 객담 내 대식세포의 자동 표지 개발 및 스크리닝 절차가 포함될 수 있습니다29. Image J 처리 중에 CCAM 측정에 영향을 미치는 요인에는 샘플 정보에 대한 측정자의 지식과 그레이스케일 값 임계값 결정이 포함됩니다. 블라인드 접근법을 채택하면 관찰자 편향을 줄일 수 있으며, 재현성을 평가하기 위해 일부 샘플을 반복적으로 측정해야 할 수도 있습니다. 높은 수준의 전문 지식을 갖춘 두 명의 개인이 독립적으로 이미지를 캡처하고 분석하면 대식세포 식별의 정확도를 높일 수 있습니다.

이 연구는 NIOSH(National Institute for Occupational Safety and Health)의 표준 방법을 사용하여 직업 미립자 물질에 대한 피험자의 노출을 평가했습니다. 카본 블랙 포장 구역과 대조군 수처리 공장 작업자의 작업 영역에서 미세 입자상 물질(PM2.5) 수준과 PM2.5 관련 원소 탄소(EC) 함량에 대해 여러 평가가 수행되었습니다. 카본블랙(CB) 입자의 최대 99.6%는 공기역학적 직경이 2.5μm보다 작았고 96.7%는 1.0μm보다 작았습니다. 2012 년 가을, CB 포장 시설의 평균 PM2.5 수준은 입방 미터당 800 마이크로 그램이었고 PM2.5 관련 EC 수준은 입방 미터 당 657.0 마이크로 그램이었습니다30,31. 2018년 가을, CB의 기하 평균은 637.4 μg/m3 였고 PM2.5 관련 EC 수준은 364.6 μg/m3 였습니다. 두 관찰 모두에서 EC/TC 비율은 92.5%를 초과했으며, 이는 CB가 거의 순수한 EC라는 사실과 일치합니다. 따라서, 이 연구에서 대식세포의 탄소 입자는 주로 카본 블랙30,31에 대한 노출에서 파생된다는 것을 추론할 수 있습니다. 그 결과, 본 연구에서 카본 블랙에 노출된 인구의 작업 환경 내 PM2.5 농도는 637.4 μg/m3로 대조군의 작업 환경에서의 PM2.5 농도(130.0 μg/m3)보다 유의하게 높았으며, 대조군의 PM2.5 농도보다 약 5배 높았다. 카본 블랙에 노출된 집단의 원소 탄소 농도는 364.6 μg/m3 로 대조군 집단의 2.0 μg/m3 보다 훨씬 높았습니다.

요약하면, 본 연구는 고긴장성 식염수 유도 객담을 사용하여 샘플을 수집하고, 폐 대식세포를 획득하고, 세포 도말 검사를 하고, 각 개인의 대식세포 탄소 함량 수준을 나타내기 위해 중앙값을 사용하여 50개 대식세포 내의 탄소 함량을 정량화했습니다. 이 연구 방법론은 대규모 인구 표본에 적용할 수 있으며 미립자 물질에 대한 개인의 내부 노출 수준을 정확하게 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 중국국가자연과학재단(82273669, 82241086, 42207488), 산둥성 타이산장학생 프로그램(No. tsqn202211121), 산둥성 고등교육 우수 청년 학자를 위한 혁신 및 기술 프로그램(2022KJ295)의 재정 지원을 받았다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3mL 멸균 빨대Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD84202ES03
50mL 원심분리기 튜브Thermo Fisher Scientific, USA339652
절대 에틸 알코올Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LTD64-17-5
삼나무 기름Shanghai McLean Biochemical Technology Co., LTDC805296
Diff-quick staining 솔루션Shanghai YEASEN Biotechnology Co., LTD40748ES76
DithiothreitolSolebo Bio Co., LTDD8220
Duchenne phosphate buffer (DPBS)Thermo Fisher Scientific, USA14190144
현미경 카메라일본 Olympus CorporationDP72
중립 나무 껌Solebo Bio Co., LTDG8590
나일론 필터 멤브레인 70umBD Falcon Bioscience, 미국211755
광학 현미경Olympus CorporationBX60
폴리에틸렌 글리콜Sinopharm Group Chemical Reagent Co. Ltd,25322-68-3
초원심분리기Thermo Fisher Scientific, 미국SL40R
점성 슬라이드Jiangsu SHitAI EXPERIMENTAL Equipment Co., LTD
일본 188105

참고문헌

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