Capacitive Biosensor를 사용한 Dynamic Multiparameter Platelet Function Assessment (동적 다중 파라미터 혈소판 기능 평가)

Summary

정전식 바이오센서를 사용한 새로운 동적 다중 매개변수 혈소판 기능 분석을 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 생리학적 관련성을 높이기 위해 반강성 미시환경 내에서 설계된 이 접근법은 혈소판 수, 자극 강도 및 활성화 경로에 민감한 세 가지 출력 매개변수를 제공합니다.

Abstract

혈소판은 유착, 확산, 과립 분비, 응집 및 세포골격 수축을 포함한 일련의 조절 반응을 통해 혈액 응고에 근본적인 역할을 합니다. 그러나 현재의 분석은 비생리학적 조건에서 혈소판 기능의 부분적 분석에 국한되어 있습니다. 따라서 생리학적 환경에서 혈소판 기능의 역동적이고 다면적인 특성을 반영하는 개선된 분석이 필요합니다. 이러한 맥락에서, 기존 분석법과 비교하여 생리학적으로 더 관련성이 높은 생체 외 반강성 미세환경에서 혈소판 기능과 관련된 몇 가지 주요 매개변수를 측정하기 위한 새로운 접근 방식이 도입되었습니다. 이 방법은 고급 전기 바이오센서인 MCS(Membrane Capacitance Sensor)를 활용하며, 이 센서는 세 가지 판독을 통해 응고 과정에 대한 고유한 통찰력을 제공합니다. 이러한 판독값은 혈소판 수, 자극 강도 및 특정 활성화 경로의 변화에 매우 민감합니다. 순수 전기 감지 플랫폼인 MCS는 원발성 지혈 기능 장애를 감지하고, 치료 효과의 효과를 평가하고, 지혈 및 혈전증에서 혈소판의 역할에 대한 광범위한 이해를 촉진하기 위한 진단 도구로서 상당한 잠재력을 보여줍니다.

Introduction

특수 혈액 세포인 혈소판은 부상 후 출혈을 멈추기 위해 지혈 반응을 조정하고 혈관의 치유를 촉진하는 데 중추적인 역할을 합니다¹. 또한, 그들은 또한 전 세계적으로 혈전색전증 질환 관련 사망의 주요 원인인 혈전증의 중요한 매개체 역할을 합니다 ^2,3,4,5,6. 혈관 손상이 발생하면 혈소판은 일련의 복잡하고 조절된 다단계 기능 과정을 거칩니다. 여기에는 내막 기질에 대한 접착, 세포 내 칼슘의 유입으로 혈소판 구조적 변화, 활성화, 과립 분비, 응집 및 세포골격 수축이 포함되며, 궁극적으로 손상된 부위를 밀봉하고 출혈을 방지하기 위해 지혈 플러그를 형성하고 안정화하는 것이 포함됩니다 ^7,8. 항혈소판제와 치료 전략의 상당한 발전에도 불구하고

Protocol

연구 제안은 워싱턴 대학교 내부 검토 위원회(UW-IRB; 연구 ID: STUDY00005211). 연구에 참여한 모든 자원 피험자는 서면 동의서를 제공했습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 멤브레인 정전식 센서(MCS)의 제작 단계

알림: MCS 센서는 기존의 미세 가공 기술을 사용하여 제작되었습니다. 이 바이오센서는 상단(T-) 및 하단(B-) 멤브레인 커패시턴스 칩(MCC)으로 구성되었습니다. 간단히 말해서 제작 단계는 그림 1에 나와 있습니다.

1. T-MCC의 미세 가공 단계(그림 1A)
   1. 4인치 실리콘 웨이퍼 기판용 표준 CAD 레이아웃 소프트웨어를 사용하여 T-MCC의 레이아웃을 설계합니다.
   2. 표준 마스크 제작 공정^29,30을 사용하여 디자인을 크롬 ....

Results

본 연구는 혈소판 기능에 대한 동적 평가를 수행하는 것을 목표로 한다. 상기한 프로토콜에 따라 c-PRP 용액을 제조하고, T-MCC의 Fn 코팅 전극에 혈소판을 파종하였다. 자유 부유 혈소판은 세척 단계에 의해 씻겨 나갔고, 부착된 혈소판을 활성화하기 위해 작용제를 첨가했습니다. 자세한 결과와 논의는 이전 보고서²⁸에서 확인할 수 있습니다.

그림 4A는 미리 결정된 혈소판 수(250 x 10,³ 혈소판 ^μL-1)를 가진 c-PRP 용액에 대한 결과를 나타냅니다. 측정의 접착 단계(그림 4B) 동안 커패시턴스는 시간에 따라 선형적으로 감소했습니다. 부착된 혈소판을 트롬빈(최종 농도: 3.5 U ^mL-1)으로 활성화한 후 커패시턴스 판독값이 정상 상태로 기하급수적으로 감소했습.......

Discussion

이 연구는 혈소판 기능을 평가하기 위한 새로운 커패시턴스 기반 방법을 개척했으며, 이는 단일 장치 내에서 접착 및 활성화 후 혈소판 역학을 모두 평가하여 이러한 접근 방식의 첫 번째 보고 사례를 표시합니다. 이 새로운 실험 프로토콜은 세척 절차를 통해 피브린 형성 및 혈장 응고 인자의 영향을 상쇄하기 위해 비교적 간단한 기술을 도입합니다. 그 결과 혈소판 기능에 영향을 미치는 다양한 요인을 식별할 수 있는 측정이 가능합니다. 기존의 광학 기반 평가 분석과 비교했을 때, 이 커패시턴스 센서는 접착 및 응집의 측면을 통합하여 혈소판 기능에 대한 보다 역동적인 평가를 제공할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다. 중요한 것은 고유한 모드에서 다양한 혈소판 기능 장애를 감지하는 기능을 보여 기존 평가 방법과 차별화된다는 것입니다.

제안된 센서 시스템은 미세 가공 기술, 표준화된 테스트 프로토콜 및 포괄적인 데이터 분석을 사용하여 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Dodecanethiol	Sigma-Aldrich, MO, 미국	471364-100ML	1 mM
200-proof 에탄올	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	EX0276-1
3D 프린터	Shenzhen Creality 3D Technology Co, Ltd.	Ender-3 V3
3D 프린팅 재료	HATCHBOX 3D, CA, U.S.A	3D PLA-1KG-1.75
Adenosine 5′-diphosphate	Sigma Aldrich, U.S.A	01905-250MG-F
ADP 아스피린	Sigma-Aldrich, MO, 미국	A2093-100G
딥 반응성 이온 에칭	Omega Engineering, Inc.	SPTS Rapier DRIE
디메틸 설폭사이드	시그마-알드리치, 미주리, 미국	D8418-50ML	DMSO
고진공 증착 시스템	CHA	SEC-600
인간 피브로넥틴	시그마-알드리치, 미주리, 미국	CLS356008-1EA	Fn
KOH	시그마-알드리치, 미주리, 미국	P1767-250G
LCR 미터	Keithley Instruments, Inc., 오하이오, 미국	Keithley EL 4980AL
LCR 계량기 홀더	Signatone Corporation, 캘리포니아, 미국	SCA-50-4
마스크 정렬기 시스템	ABM, U.S.A, Inc.	ABM / 6 / 350 / NUV / DCCD / SA
마이크로 포지셔너	Signatone, 캘리포니아, 미국	S-725
바늘 프로브	Signatone Corporation, 캘리포니아, 미국	SCAT5T-4	12.5 μ m radius
Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich, MO, U.S.A	P4474-1L	PBS, pH 7.4
Reactive Ion Etching	Plasma-Therm,U.S.A	RIE Vision 320
silicon substrate	Wafer World Inc	SKU# 1766
Standard 3.2% citrate tubes	Tiger Medical, NJ, U.S.A.	Covidien / Cardinal Health 8881340478 Monoject
Thrombin	Enzyme Research Laboratories, 미국	HT 1002a
Ticagrelor	Sigma-Aldrich, MO, 미국	PHR2788-400MG
Tyrode ' s 버퍼	보스턴 바이오 프로덕츠, 미국	BSS-375
UV 포토레지스트	AZ 전자 재료, 노스캐롤라이나, 미국	AZ 9260	15음