초고속 도플러 초음파를 이용한 생쥐의 간 혈관 구조의 이미징 및 정량화

요약

높은 공간 해상도(100μm)와 감도를 가진 초고속 도플러 초음파(UFUS)는 간 혈관 구조에 대한 포괄적인 정성적 개요를 얻기 위한 적절한 비침습적 이미징 방식을 나타냅니다. UFUS는 또한 미세혈관 구조의 정량적 측정을 용이하게 하여 혈관 질환 메커니즘에 대한 이해를 높이는 것을 목표로 합니다.

초록

혈관 구조의 비침습적 생체 내 이미징은 설치류의 질병 메커니즘을 연구하기 위한 강력한 도구입니다. 도플러 초음파 방법을 사용하여 미세혈관 구조의 고감도 이미징을 달성하려면 초고속 이미징 개념을 사용하는 이미징 방식이 선호됩니다. 초음파 스캐너의 프레임 속도를 초당 수천 프레임으로 증가시킴으로써, 혈류의 감도를 2mm/s까지 향상시킬 수 있으며, 기존의 도플러 모드에서 약 1cm/s의 감도와 비교하여 미세순환에 대한 기능 정보를 얻을 수 있습니다. 초고속 도플러 초음파(UFUS) 영상은 신경혈관 결합을 통해 뇌 활동을 포착할 수 있는 신경과학에 채택되었지만, 호흡과 관련된 더 큰 움직임으로 인해 복부 장기의 혈관 구조를 영상화할 때 더 큰 어려움을 겪고 있습니다. 해부학적으로 횡격막 아래에 위치한 간은 특히 평면 밖의 움직임과 진동하는 호흡 운동에 취약합니다. 이러한 아티팩트는 도플러 이미징에 부정적인 영향을 미칠 뿐만 아니라 혈관 구조의 해부학적 분석과 혈관 매개변수의 계산을 복잡하게 만듭니다. 여기에서는 UFUS에 의한 마우스의 간 혈관 구조에 대한 정성적 및 정량적 이미징 분석을 제시합니다. 우리는 주요 해부학적 혈관 구조를 식별하고 간 거시적 해부학에 대한 그래픽 그림을 제공하여 도플러 판독을 기반으로 한 간 혈관 조직에 대한 심층적인 해부학적 평가와 비교합니다. 또한, 우리는 시간 경과에 따른 미세혈관 구조의 간 혈액량을 확실하게 측정하기 위한 정량화 프로토콜을 개발했습니다. 추가 연구를 고려하기 위해 정성적 혈관 분석은 포괄적인 개요를 제공하고 간 질환의 마우스 모델을 사용하는 연구자를 위한 표준화된 용어를 제안합니다. 또한, 생체 내 간 혈관 결손을 검사하고 장기 내 깊은 곳에서 기능적 미세혈관 변화를 측정하기 위한 비침습적 보완 방법으로 초음파를 적용할 수 있는 기회를 제공하며, 조직 절편에 대한 생체 외 염색을 사용하여 미크론 규모 수준에서 혈관 이상을 밝힐 수 있습니다.

서론

전임상 마우스 모델은 간 미세혈관 질환의 발병과 진행을 연구하는 데 널리 사용됩니다 ^1,2. 염증과 섬유화가 나타나기 전에 질병의 초기 단계에서 모세혈관 변화가 발생하여 시간이 지남에 따라 간경변을 유발할 수 있으므로 종단 추적 관찰이 유리합니다¹. 질병 진행을 조사하기 위해서는 생체 내에서 혈관 기능을 시각화하고 측정하는 데 강력한 이미징 도구가 필수적입니다. 초고속 도플러 초음파(UFUS)는 저렴한 비용, 휴대성, 단순성 및 실시간 기능으로 인해 적합한 방식일 뿐만 아니라 비침습적이고 시간을 절약하는 절차이기 때문에 적합한 방식입니다³. 유사한 공간 해상도에 도달할 수 있지만 큰 혈류로 제한되는 기존의 도플러 초음파와 비교하여, UFUS는 1cm/s에서 2mm/s까지 느린 혈류를 감지할 수 있으므로 훨씬 더 작은 혈관의 기여도를 조사할 수 있습니다⁴. UFUS는 단일 음파에서 넓은 시야를 가진 평면파 전송을 통해 수행되는 감도를 향상시켜 프레임 속도를 높이고 사용 가능한 초음파 이미지의 수를 증가시킵니다⁵. 많은 수의 시간 샘플은 조직에서 오는 신호의 상쇄를 개선하고 혈액 산란기에서 반사된 에코의 감지를 향상시켜 조영제 없이 감도를 높입니다⁶. 파워 도플러 추정을 통해 혈액 산란 에코의 에너지를 추정함으로써, 혈관이 너무 작아서 이미지⁷에서 분해되지 않더라도 각 픽셀의 혈액량에 비례하는 양을 얻을 수 있습니다.

UFUS는 공간 및 시간 해상도의 유리한 조합을 제공하여 간 혈관 구조의 정성적 평가에 적합한 도구입니다. 초음파 스캐너를 작동하는 것은 비교적 간단하지만, 생쥐의 다양한 간엽의 간 혈관 구조를 탐색하려면 간 해부학에 대한 포괄적인 이해가 필요합니다. 최근 연구에서는 3D 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μ-CT)을 사용하여 쥐의 간 해부학 및 간 혈관 트리를 설명하는 데 중점을 두고 있습니다^8,9. 인간과 생쥐의 간 사이의 형태학적 차이 중 일부는 잘 문서화되어 있지만¹⁰, 설치류를 대상으로 한 연구는 종종 인간과 관련된 해부학적 용어를 채택하여 사족 동물의 맥락에서 약간의 혼란을 야기합니다. NVA(Nomina Anatomica Veterinaria)와 같이 공인된 표준화된 명명법조차도 설치류의 간 혈관 구조에 대한 일관된 용어에 대한 충분한 정보가 부족하다¹¹. 설치류의 해부학적 구조가 제대로 문서화되지 않은 문제 외에도, 특히 재현 가능한 접근 방식이 예상되는 경우 초음파 판독값을 해석하는 데 훨씬 더 큰 어려움이 발생합니다.

다양한 공간 규모에 걸쳐 살아있는 장기에 대한 비침습적 기능 정보를 얻는 것은 생체 내 이미징에 어려움을 제기합니다³. CT, 자기공명영상(MRI/MRA) 또는 집속파를 이용한 기존의 도플러 영상과 같은 고급 간 영상 방식은 질병 진행을 평가하는 데 필수적이지만, 광음향 영상을 제외한 대부분의 혈류 역학을 포착하는 데는 실패한다 12,13,14. UFUS는 감도가 높으며 초당 센티미터보다 큰 유량에 국한되지 않는 작은 혈관에서 느린 혈류를 감지할 수 있습니다 ^4,15. 최근에는 UFUS를 사용하여 해부학적 고려 사항을 기반으로 한 맞춤형 이미징 방법을 개발하여 혈관 확장이 있는 마우스 모델에서 간 혈액량을 안정적으로 측정할 수 있게 되었습니다¹⁶.

이 프로토콜에서는 원래 기능적 뇌 이미징을 위해 개발된 상용 초음파 플랫폼을 사용하여 간의 비침습적 UFUS 이미징 절차를 간략하게 설명합니다. 프로세스를 간소화하고 정보 검색을 향상시키기 위해 해부학적 명명법과 완벽한 분석 방법을 통해 마우스 간에 대한 포괄적인 그림을 제공합니다. 또한, 획득한 이미징 판독값을 참조로 자세히 표시하여 일반적인 해부학적 구조와 랜드마크를 표시하여 작업자에 의존하는 평면 선택을 지원합니다. 또한, 우리는 간 혈관 구조에 대한 질적 및 정량적 분석에 대한 관련 그림을 포함합니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 유럽 법률(Directive 2010/63/EU) 및 네덜란드 정부 지침에 따라 수행되었으며 Leiden University Medical Center의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

1. UFUS 이미징을 위한 마우스 준비 (타이밍 ~ 10분)

1. 이미징 설정 준비
   1. 기포 형성을 방지하기 위해 100 x g 에서 3-5분 동안 50mL 튜브에 담긴 원심분리기 초음파 투과 젤.
   2. 가열 패드를 켜고 35°C까지 예열합니다. 3D 프린팅 물 탱크에 탈이온수를 채웁니다.
      알림: 물 속에 존재하는 기포나 작은 입자는 도플러 측정을 방해할 수 있습니다.
2. 동물의 마취
   1. 동물의 무게를 잰다. 체중이 19-32g인 생후 8-16주령의 수컷과 암컷 새끼 짝을 사용했습니다. 100mg/kg의 투여 용량으로 케타민과 0.9% NaCl에 10mg/kg의 자일라진의 마취 혼합물을 준비합니다. 혼합물이 안정적이지 않고 효능을 잃을 수 있으므로 매일 살균되고 신선하게 혼합물을 준비하십시오.
      참고: 선호하는 동물 체중은 23-30g입니다.
   2. 주사 부위, 즉 복부의 오른쪽 또는 왼쪽 사분면을 거즈와 70% 에탄올을 사용하여 소독합니다. 체중 10μL/g에 27G 바늘과 1mL 일회용 주사기 또는 30G 인슐린 주사기를 주사합니다.
   3. 케이지 뚜껑을 닫지 않고 동물을 가열 패드가 있는 케이지에 다시 넣습니다. 타이머를 시작합니다.
      참고: 깊은 마취는 약 40분 동안 지속되어야 합니다. 더 긴 이미징 세션을 원하는 경우 0.9% NaCl에 케타민 60mg/kg과 메데토미딘 0.4mg/kg을 혼합한 후 아티파메졸 1mg/kg의 피하 주사로 역전시키는 것과 같은 가역적 마취를 사용하는 것이 좋습니다. 주사 마취는 이미징 설정 때문에 흡입 마취보다 선호됩니다.
   4. 마취의 효과를 확인하십시오. 약 5분 후에 뒷발을 부드럽게 꼬집어 마취가 작동하는지 확인합니다. 동물이 여전히 반응하면 완전히 마취될 때까지 2-3분 더 기다립니다.
   5. 동물이 깊이 잠들었을 때 각막 건조와 눈 외상을 방지하기 위해 안과 연고를 바르십시오. 반사 신경을 다시 확인하고 동물이 꼬집음에 대해 반응을 보이지 않을 때만 절차를 시작하십시오.
3. 이미징 영역의 준비(그림 1)
   1. 동물을 발열 패드에 올려 놓고 수의사 트리머로 동물의 배를 부드럽게 다듬습니다. 가슴이나 복부에 압박을 가하지 않고 매우 부드럽게 트리밍을 수행하십시오.
   2. 제모 크림을 2분 이상 바르지 마십시오.
      주의: 제모 크림의 배양 시간을 연장하면 피부 염증을 유발할 수 있으므로 연장하지 마십시오. 이는 이미징 품질에 영향을 미칠 뿐만 아니라 동물에게 불편함을 유발할 수 있습니다.
   3. 종이 티슈로 제모 크림을 제거하고 따뜻한 물로 부드럽게 닦으십시오.
4. 도플러 측정을 위한 동물 및 이미징 설정을 배치합니다(그림 2A).
   1. 동물을 등쪽으로 가열 패드에 놓고 테이프를 사용하여 발을 부드럽게 고정합니다. 소량의 따뜻한 물로 피부에 수분을 공급하십시오.
   2. 원심분리된 초음파 투과 젤을 20mL 주사기를 사용하여 면도한 피부에 직접 바릅니다.
      참고: 기포는 도플러 이미징에 영향을 미치고 아티팩트를 유발할 수 있습니다.
   3. 물이 채워진 3D 프린팅 물탱크를 동물 위에 놓습니다. 물탱크의 높이가 동물에게 적합한지, 약 1mm 위, 동물을 쥐어짜지 않는지 확인하십시오.
   4. 초음파 투과 젤과 물 탱크의 폴리메틸펜텐 열가소성(PMP) 사이에 공기가 있는지 확인하십시오.

2. 프로브 작동 및 평면 선택 (타이밍 ~ 10분)

1. 소프트웨어를 시작하고 시스템에서 실험적 세션을 만듭니다. 스캔 소프트웨어를 시작합니다.
   참고: 스캔 소프트웨어는 시스템에 통합되어 있습니다.
2. 팝업 창에서 Yes(예 )를 클릭하여 모터를 중앙에 배치합니다. 전동 시스템은 스캐닝 소프트웨어로 프로브를 원격으로 제어하는 데 사용됩니다. 모터를 중앙에 배치하면 프로브가 자동으로 세 방향, 즉 수직, 측면 및 회전으로 이동합니다. 장비 손상을 방지하기 위해 프로브의 궤적을 방해하는 물체가 없는지 확인하십시오.
   알림: 모터를 중앙에 배치하는 것이 중요합니다. 이렇게 하지 않으면 소프트웨어 기능 장애가 발생할 수 있습니다.
3. 메뉴에서 Session(세션 )을 선택하여 새 실험 세션을 만듭니다. 세션 패널에서 프로젝트, 제목, 세션, 사용자 이름, 설명 및 태그를 포함한 필수 정보를 입력합니다. 유효성 검사를 클릭합니다.
   참고: 이미징 데이터를 수집하거나 저장하기 전에 세션을 생성해야 합니다. 세션 정보는 실험 중에 변경될 수 있지만 데이터 저장 대상도 변경된다는 점에 유의하세요.
4. 프로브를 배치합니다. 128개의 소자를 가진 선형 15MHz 초음파 프로브는 4축 모터 모듈, 즉 3개의 병진 이동 방향과 1개의 회전 이동 방향으로 구성된 전동 시스템을 통해 시스템에 연결됩니다.
   1. 프로브 이동 메뉴로 이동하고 컴퓨터 제어 포지셔닝 시스템을 사용하여 프로브를 3D 프린팅 물 탱크의 물 속으로 이동합니다. 프로브 위치에 표시된 제어 버튼을 사용하여 모터를 이동하고, 평행 이동 (X, Y 및 Z)의 경우 mm 단위로, 회전 이동 (R)의 경우 ° 단위로 단계를 정의합니다. Z 방향에서 사고를 예방하려면 안전에서 Z 한계를 정의합니다.
      알림: 프로브의 요소가 물과 접촉하는 것이 중요합니다. 그러나 장비에 해를 끼칠 수 있으므로 프로브를 물 속으로 완전히 옮기지 마십시오. 모터가 해당 위치에 도달할 수 없으면 Out of workspace 경고가 표시됩니다.
   2. Set Home을 클릭하여 좌표를 참조 위치로 저장합니다. R은 X, Y, Z에 상대적이므로 이동과 회전을 동시에 수정하지 마십시오. R을 수정하기 전에 항상 Set Home을 클릭하십시오.
   3. 이미징 및 시각화 매개변수를 정의합니다. Live view 메뉴로 이동하고 Play 를 클릭하여 관심 평면을 선택합니다.
      주의 : 라이브 뷰만 실행 view 또는 초음파 프로브의 요소가 장비의 수명을 보장하고 과열을 방지하기 위해 음향 임피던스와 일치하는 매체로 둘러싸여 있을 때 획득.
5. 사전 설정에서 이미징 매개변수를 선택합니다.
   1. 로드 시퀀스 버튼을 사용하여 10ms 도플러 초고감도 초음파 시퀀스를 로드합니다(예: 이미징 전압 25V와 도플러 프레임 속도 10ms)를 가진 11개의 복합 평면파(-10°에서 10° 각도).
      참고: 분석 중 장기의 호흡 움직임을 이미지화하고 필터링하기 위해 빠른 도플러 시퀀스(예: 10ms)를 사용할 필요가 없습니다.
   2. 이미징 깊이를 1mm에서 50mm 사이로 정의하고 최대 이미징 가능 깊이는 50mm입니다. 기본 설정은 1mm에서 10mm까지 9mm의 깊이이며 권장 깊이는 2mm에서 12mm 사이입니다.
      참고: 동물의 크기와 물탱크에 따라 이미징 깊이를 특정 요구 사항에 맞게 조정할 수 있습니다.
6. 시각화 매개변수를 선택합니다.
   1. Doppler를 선택하여 혈관 구조를 이미지화합니다.
      참고: U.U.의 픽셀 강도는 혈액량을 나타내며 동일한 프로브와 염기서열을 사용하는 경우에만 비교해야 합니다.
   2. 신호 대 잡음비를 최적화하기 위해 시간적 평균화를 적용하려면 평균을 선택합니다.
      참고: 이미지를 시간적으로 평균화하면 이미지 품질은 향상되지만 프레임 속도는 느려집니다. 목표에 따라 적절한 절충안이 이루어져야 합니다.
   3. 이미지 압축을 선택합니다: 로그(높음), 제곱근(중간) 또는 선형(낮음). 또는 고대비 및 저대비 옵션에 대한 슬라이더를 사용하여 대비 범위를 자동 또는 수동으로 조정할 수 있습니다.
      참고: 데이터는 이미지 압축 선택의 영향을 받지 않습니다. 실시간 이미징의 표시에만 영향을 미칩니다.
   4. Grey 옵션을 선택하여 검은색에서 흰색으로 색상 맵 스케일을 선택하거나 Hot을 선택하여 적검은색에서 노란색으로 선택합니다.
7. 평면 선택(그림 2B)
   1. 해부학적 랜드마크에서 이미징 평면을 선택합니다. 도플러와 B-모드 사이를 전환하여 간엽과 혈관 구조의 해부학적 구조에 익숙해집니다.
   2. 중지(Stop) 아이콘을 클릭하여 라이브 뷰(Live view)를 클릭합니다.
   3. Move probe 메뉴로 이동하여 프로브를 탐색하고 Set Home 을 클릭하여 평면을 선택하여 좌표를 참조 위치로 저장합니다. 혈관 나무가 잘 정의되고 가능한 한 적은 평면 이탈 신호로 볼 수 있는지 확인합니다.
   4. 메뉴로 돌아가서 라이브 뷰 중지 아이콘을 클릭합니다 .

3. 도플러 스캔 획득 (타이밍 ~ 20분)

1. 10ms 프레임 속도로 도플러 수집을 시작합니다.
   1. fUS 2D 메뉴로 이동하여 특정 위치에서 시간 경과에 따른 혈류역학적 변화를 이미지화합니다(그림 3). 대비를 증가시키기 위해 50μL의 볼루스를 꼬리 정맥에 mL당 2 x 10⁸ 마이크로버블 농도로 주입된 마이크로버블(iv)을 투여합니다.
   2. Preset 탭에서 총 녹음 시간을 초(30초) 단위로 정의합니다. 이미지 간 간격을 0초로 설정하여 이미지 사이에 일시 중지가 없는 연속 모드를 선택합니다.
   3. 녹화 버튼을 눌러 2D 획득을 시작합니다. 녹음은 중지 버튼을 눌러 취소할 수 있습니다. 수집이 완료되기 전에 중단되면 데이터가 손실될 수 있습니다.
2. 획득한 녹음을 시각화하고 조정합니다.
   1. 원하는 경우 Tap Visualization에서 대비와 컬러맵을 수정합니다. 필요한 경우 Time 함수에 포함된 슬라이더로 프레임을 스크롤하여 녹음을 재생합니다.
3. 데이터를 저장합니다.
   1. 가져온 녹음의 이름을 제공하여 세션 폴더에 파일을 .scan 형식으로 저장합니다. 데이터를 저장할 수 있는 팝업 창은 모든 녹음이 끝날 때 자동으로 제안됩니다. 데이터는 자동으로 저장됩니다.
4. 사전 설정 탭을 클릭하여 다른 획득을 시작하고 3.1.1단계부터 반복합니다.
5. 이미징 설정을 제거하고 동물을 돌보십시오.
   1. Move probe(프로브 이동) 메뉴로 이동하여 프로브를 3D 프린팅 물 탱크 밖으로 수직으로 이동합니다. 설정 및 초음파 젤을 제거하고 동물을 고정시킵니다.
   2. 실험 설계가 종점에 도달하면 동물을 안락사시킵니다. 그렇지 않으면 다음 단계를 계속합니다.
   3. 종단 측정이 의도된 경우 동물의 면도한 피부 부위에 보습 크림을 바르십시오.
   4. 동물을 다시 우리에 넣고 저체온증을 방지하기 위해 열 램프 아래에서 마취에서 깨어나게 합니다. 회복하는 동안 동물을 모니터링하십시오.
   5. 동물이 다시 정상적으로 걸을 때 개별 환기가 되는 케이지 랙에 다시 넣으십시오. 데이터 세트를 분석하기 전에 실험실 동물 실험을 마칩니다.

4. 정량 분석 (타이밍 ~ 1 시간)

1. 보충 파일 1에 있는 분석 스크립트 gui_analysis.m을 엽니다.
2. 스캔을 선택하고 설정에서 정량적 매개변수를 설정합니다: 복셀 크기가 2 x 2인 10개의 관심 영역(ROI). 각 프레임에 대해 40ms를 선택하여 도플러 통합을 수행합니다.
3. 장기의 혈관 주변을 그립니다. 10개의 ROI는 명확하게 보이는 동맥 사이에 자동으로 사전 배치되며 필요한 경우 수동으로 조정할 수 있습니다(그림 4A). 위치에 만족하면 부동 대화 상자를 닫습니다. 강력한 혈액량 계산을 위해 안정적인 획득(그림 4B)을 보장하고, 강한 운동 아티팩트의 영향을 받는 획득을 방지합니다(그림 4C).
4. 30초 기록 내에서 조용한 프레임 값의 평균 및 표준 편차를 자동으로 추정하여 총 10개의 ROI 중 평균 간 혈액량(A.U.)을 정량화합니다(그림 4D).
   참고: ROI 강도의 데이터 테이블은 스프레드시트 파일에 직접 복사/붙여넣기할 수 있습니다.
5. 꼬리 방향으로 두 개 이상의 추가 평면(-0.3mm 및 -0.6mm)에 대해 해석을 반복합니다. 통계 분석을 수행하기 전에 모든 획득 데이터를 정량화합니다.
6. 전체 이미지에서 intensitys의 표준 편차를 확인하고 모션 아티팩트에 취약한 측정을 객관적으로 제외하기 위해 2개의 표준 편차(2σ)를 사용하여 컷오프를 전체 평균(μ)으로 결정합니다(그림 4E).
   참고: 전체 이미지에 대해 추정된 조용한 프레임 값의 평균 및 표준 편차는 데이터 테이블의 첫 번째 행에 제공됩니다.
   주의: 모션 아티팩트는 강력한 정량화를 방해하므로 전체 시간 이미지 분석을 기반으로 객관적으로 식별해야 합니다.
7. 4.3단계에서 동물당 30개의 ROI에서 3개의 서로 다른 평면에 걸쳐 정량화된 모든 평균 간 혈액량의 평균을 취합니다(그림 4F). 통계 분석 소프트웨어에서 ROUT 테스트 1%를 적용하여 동물당 평균 30 ROI를 얻기 전에 이상치 ROI를 식별합니다. 혈액량 추정을 개선하려면 동물당 추가 평면을 기록합니다.
8. 차량 치료를 관리하려면 거즈와 70% 에탄올을 사용하여 주사 부위, 즉 복부의 오른쪽 또는 왼쪽 사분면을 소독합니다. 27G 바늘과 1mL 일회용 주사기 또는 30G 인슐린 주사기로 20μL의 식염수 또는 DMSO ip를 주입하거나 둥근 팁의 재사용 가능한 공급 바늘 30G를 사용하여 100μL의 (하이드록시프로필) 메틸셀룰로오스를 위아래로 투여합니다. 셀룰로오스의 IP 또는 경구 투여(po)로 식염수 또는 DMSO를 투여하는 3개 코호트의 플롯 데이터(그림 4G). 상태 및/또는 받은 치료를 밝히지 않고 맹목적으로 분석을 수행합니다.
   알림: 차량 관리는 혈액량 측정에 영향을 미치지 않습니다.

결과

프로토콜에 따라, 간 혈관 구조의 이미징은 해부학적 구조의 표준화와 해당 용어를 기반으로 촉진됩니다(그림 1). 전임상 간 모델을 사용하는 연구자를 위한 표준화된 명명법을 제안하기 위해 마우스의 복강에서 일반적인 간 위치를 개략적으로 표시하고(그림 1A), 다양한 간엽의 구조적 배열을 제공하고(그림 1B), 동맥 혈관 네트워크(그림 1C)를 지정했습니다. 해부학적 전문 지식을 갖춘 생체 내 UFUS 이미징은 움직임 아티팩트를 줄이기 위해 3D 프린팅된 물 탱크를 사용하여 수행되었습니다(그림 2A). 음향 임피던스는 프로브를 물에 넣고 초음파 투과 젤을 동물의 면도한 피부에 직접 적용하여 수정했습니다. 이 설정을 채택하면 프로브가 동물의 움직이는 가슴과 복부에 직접 접촉하지 않기 때문에 호흡 및 기타 움직임 아티팩트가 줄어듭니다. 이러한 방식으로 우리는 표면적인 위치로 인해 UFUS가 쉽게 접근할 수 있는 오른쪽과 왼쪽 엽의 혈관 구조를 시각화했습니다(그림 2B). 미상엽(caudate lobe) 및 사분면엽(quadrate lobe)과 같은 다른 간엽(liver lobes)은 신체 깊숙이 위치하기 때문에 UFUS로 간 혈관 구조를 해부학적으로 올바르게 식별하기가 더 어렵습니다.

표준화되고 일반적으로 받아들여지는 해부학적 적응증과 혈관 구조 해석의 중요성을 입증한 후, 생쥐에서 조영제 강화 UFUS로 이미지화된 간 혈관 구조에 대한 포괄적인 개요를 제공하기 위해 다양한 평면에서 여러 도플러 스캔을 수행했습니다(그림 3). 우리는 개별 간엽, 즉 좌측 측측(LL), 좌측 내측(LM), 우측 측측(RL) 및 우측 내측(RM)의 간 동맥 네트워크를 설명했습니다. 또한 복부 대동맥(AA), 간동맥(HA), 좌측 외측 간동맥(LLHA) 및 우측 내측 간동맥(RMHA)과 같은 주요 동맥이 표시되어 있습니다. 간엽은 소장(SM)의 위치와 연동 운동, 위(S) 충전 상태에 따라 약간 다른 위치에 있을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 전체 마우스 간 혈관 구조에 대한 이 조영제 강화 개요는 UFUS에 의한 생체 내 간 이미징을 위한 포괄적인 혈관 지도를 제공합니다.

해부학적 평면의 정확한 선택은 하나의 간엽에서 파생된 정량적 판독값을 얻는 데 중요합니다. 평면당 10개의 관심 영역(ROI)을 수동으로 선택하여 강력한 혈액량 측정을 달성할 수 있습니다(그림 4A). 미세순환의 신뢰할 수 있는 혈액량 정량화를 위해서는 평균 이미지 강도의 변동이 적은 안정적인 획득이 필요합니다. 이는 시간 경과에 따른 전체 이미지의 평균 이미지 값(MIV)을 기반으로 결정되며(그림 4B), 중요한 모션 아티팩트에 취약한 기록과 대조됩니다(그림 4C). 모션 아티팩트를 처리하기 위해 전체 이미지의 모든 시간적 낮은 MIV의 표준 편차를 플로팅하여 간 혈액량 측정(그림 4D)의 신뢰할 수 있는 정량화를 위해 낮은 MIV의 자동 선택을 사용했습니다(그림 4E). 동물당 여러 평면에 대한 도플러 스캔은 ROUT 테스트 1%로 동물당 30개의 ROI에 대해 이상치 처리 후 3개의 다른 코호트의 마우스 내부 및 마우스 간에 허용 가능한 내부 및 상호 변동성을 보여줍니다(그림 4F). 동물당 혈액량 추정치를 개선하려면 추가 평면을 기록하거나 평면당 선택한 ROI 수를 늘리는 것이 좋습니다. 또한 혈액량 판독값을 사용하여 특히 미세혈관 구조를 표적으로 하는 약물 치료를 모니터링할 수 있습니다. 두 가지 투여 경로를 통해 차량을 관리함으로써 간 혈액량 측정에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증했습니다(그림 4G). 이러한 결과는 유전자 결실 또는 치료제 전달이 차량 투여의 영향을 받지 않음을 나타내며 강력한 실험 설계를 보장합니다. 전반적으로, 다양한 마우스 모델에서 간 혈관 결손을 탐구하기 위한 향후 연구를 위해 객관적이고 재현 가능한 정량적 프로토콜이 제공됩니다.

그림 1: 쥐 간의 해부학적 구조. (A) 마우스의 횡격막 아래 복강에서의 간 위치에 대한 개략적 개요. (B) 4개의 간엽, 즉 좌엽, 사분면, 미상엽, 우엽이 있는 쥐 간과 문맥, 간동맥 및 담관으로 구성된 문맥 삼엽에 대한 개략적인 설명. (C) 촉각 혈관 구조의 동맥 네트워크에 대한 개략도. 라틴어 명명법을 사용한 간동맥(ha) 및 분지(ramus)의 식별. 약어 : HA = 간 동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 마우스의 간 혈관 구조에 대한 초고속 도플러 초음파(UFUS) 이미징. (A) 비침습적 생체 내 이미징을 위한 실험 설정의 개략도. (B) UFUS에 의해 이미지화된 오른쪽 및 왼쪽 내측엽과 왼쪽 측엽의 이미징 방향과 관련 대표자의 개략도. 약기 : AA = 대동맥 복부, LLL = 왼쪽 측면 엽, 내 인생을 사랑 = 왼쪽 내측엽, RML = 오른쪽 내측. 스케일 바 = 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 쥐 간 혈관 구조의 대표적인 조영제 강화 초고속 도플러 초음파(UFUS). 성인 마우스의 전체 간 혈관 구조에 대한 개요는 두개골에서 꼬리를 향해 4개의 평면에서 3개 위치, 즉 측면 오른쪽, 내측 및 측면 왼쪽에서 이미지화되었습니다. 참조는 내측에서 촬영되고 오른쪽과 왼쪽에서 옆으로 1cm 떨어진 곳에 촬영된 횡격막 바로 아래에 위치하며 꼬리 방향의 동일한 평면을 사용합니다. 약기 : AA = 대동맥 복부, HA = 간 동맥, LLL = 왼쪽 외측 엽, LLHA = 왼쪽 외측 간동맥, 내 인생을 사랑 = 왼쪽 내측엽, RLL = 오른쪽 외측엽, RMHA = 오른쪽 내측 간동맥, RML = 오른쪽 내측엽, SI = 소장, S = 위. 눈금 막대 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 간 혈액량의 초고속 도플러 초음파(UFUS) 정량적 측정. (A) 10개의 관심 영역(ROI)을 선택하여 다이어프램 아래에서 선택된 평면 1에서 성인 C57BL/6 야생형 대조군 마우스의 내엽(ML)을 대표하는 0mm, 평면 2에서 -0.3mm, -0.6mm에서 평면 3에 해당). 눈금 막대 1mm. 정량적 평가를 위해 전체 이미지의 임의의 단위(A.U.) 단위의 평균 이미지 값을 기반으로 (B) 안정적인 획득(회색) 및 (C) 조직 움직임(빨간색)을 가진 30대의 파워 도플러 그림. (D) 시간 경과에 따른 정량적 혈액량 측정을 위한 낮은 강도(AU)의 자동 인식. (E) 성체 C57BL/6 야생형 대조군 마우스의 생리학적 조건(회색)에서 낮은 강도(A.U.)의 표준 편차(SD)에 대한 평가와 함께 3개 코호트의 동물 수(N)에서 전체 평균(μ)의 단절로 표시된 모션 아티팩트로 인한 불안정한 획득(빨간색)으로 인한 불안정한 획득(빨간색)을 식별하기 위해 플롯된 낮은 강도의 표준 편차(St. Deviation). (F) 3개의 평면에 걸쳐 평균적으로 시간 경과에 따른 생체 내에서 측정된 혈액량 변화, 즉 동물당 총 30 ROI의 정량화는 픽셀 강도(A.U.)로 표시됩니다. ROUT 테스트에 의한 이상치 감지 1%. (G) 배송 차량의 종류와 관리 경로 사이에는 차이가 없습니다. 코호트 1(n=6)은 복강내(ip) 식염수, 코호트 2(n=3)는 DMSO IP 주사, 코호트 3(n=6)은 셀룰로오스 경구 투여(po)를 받았습니다. Dunnett의 다중 비교 검정을 사용한 일원 분산 분석, ns P > 0.05. 약기 : AU = 임의의 단위, DMSO = 디메틸 설폭 사이드, IP = 복강 내, PO = 경구 투여, ROI = 관심 영역, St. 편차 = 표준 편차, UFUS = 초고속 도플러 초음파. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 간 혈액량 측정의 초고속 도플러 초음파(UFUS) 정량적 스크립트. Script gui_analysis.m은 혈액량 측정을 위한 관심 영역(ROI)의 자동 위치 지정을 위한 그래픽 인터페이스를 제공합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜에서는 마우스 간 혈관 구조의 비침습적 UFUS 이미징을 수행하는 방법을 보여줍니다. 동물 취급, 초음파 스캐너 작동, 생체 내 혈액량 변화를 계산하기 위한 데이터 분석을 포함하는 이미징 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 초음파 데이터 해석을 용이하게 하기 위해 UFUS로 명확하게 시각화할 수 있는 해부학적 구조에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다. 또한 혈관 매개변수의 강력한 측정을 위한 표준화된 정량화 절차를 설명합니다. 조영제를 사용하지 않고도 적절한 해상도를 얻을 수 있어 미세순환의 간 혈액량에 대한 안전하고 직접적인 정량적 평가가 가능합니다. 우리는 특히 미세혈관 구조의 정량적 측정을 평가할 때 혼동과 오해를 방지하기 위해 표준화된 해부학적 명명법의 사용을 강조합니다.

쥐 혈관 구조의 UFUS 영상은 주로^{신경과학 7} 분야에서 이전에 보고된 바 있다. 뇌 영상은 호흡 움직임에 매우 민감한 간과 달리 운동 인공물에 의해 부정적인 영향을 받지 않습니다. 횡격막 아래의 해부학적 위치로 인해 복부 부위의 제모는 가슴과 복부 부위에 가해지는 물리적 힘을 최소화하여 불규칙한 호흡이 발생하지 않도록 매우 부드럽게 수행해야 합니다. 또한, 규칙적인 진동 호흡을 보장하기 위해서는 적절한 수준의 마취를 달성하는 것이 필수적이며, 이는 후처리 단계에서 비교적 쉽게 교정할 수 있는 요소입니다. 여기에서 UFUS의 민감도는 SVD(Singular Value Decomposition) 필터를 적용하여 모션^{아티팩트6를} 제거하고 높은 모션 프레임을 추가로 중도절단함으로써 향상되었습니다. 높은 프레임 속도의 파워 도플러 무비는 여기에서 10ms로 획득되어 모션 아티팩트로 인해 높은 값의 피크를 생성한 프레임에서 호흡 모션의 효과를 시각화하고 측정할 수 있습니다. 그런 다음 평균 이미지 신호의 고속 푸리에 변환의 피크에서 호흡 속도를 식별할 수 있으며, 기관의 높은 움직임에 해당하는 해당 피크 프레임을 버릴 수 있습니다.

시간이 지남에 따라 단일 동물 내에서, 그리고 체중이 다른 동물 간의 재현 가능한 초음파 도플러 이미징은 여전히 몇 가지 한계에 직면할 수 있습니다. 첫째, 간 위치는 배가 많이 채워지거나 장의 연동 운동과 같은 요인에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 이러한 영향은 특히 좌측 외측 간엽을 기준으로 선택할 때 두드러집니다. 따라서 큰 동물에서는 왼쪽 측엽을 선택하고 작은 동물에서는 오른쪽 또는 왼쪽 내측을 선호하는 것이 좋습니다. 둘째, 괴로워하는 동물에서 무거운 비진동 호흡 동작이 발생할 수 있으며, 이로 인해 수정하기 어려운 동작 아티팩트가 생성되어 결과적으로 혈액량 계산에 사용할 수 없습니다. 따라서 체중에 맞는 용량과 함께 적절한 마취 선택이 중요합니다. 마지막으로, 해상도 한계는 간 미세혈관 구조의 시각화를 제한하는데, 즉, 혈관은 최소 100mm³ 범위의 직경으로 시각화할 수 있습니다.

조영제의 사용은 최근에 microbubbles를 추적해서 쥐 vasculature의 상세한 이미지를 획득하기 위하여 제안되었습니다. 이러한 접근 방식은 높은 공간 해상도를 달성하고 정량적 혈액 속도 측정을 제공할 수 있습니다¹⁷. 그러나 미세 기포를 추적하는 것은 특히 2D로 획득할 때 내부 장기를 이동하는 데 매우 어려운 상태로 남아 있습니다.

여기서, 우리는 초고속 도플러에 의해 얻어진 안정적인 간 혈액량 측정이 IP 주사 또는 경구 위장에 의해 투여되는 다른 차량을 받는 3개 코호트의 대조군 마우스에서 획득될 수 있음을 보여주었습니다. 최근에, 이러한 혈액량 측정은 간 질환 마우스 모델¹⁶에서 성공적으로 사용되었다. 자세히 설명하자면, 혈관 확장은 전자 현미경 수준에서 감지되었으며 UFUS를 사용한 정량적 측정으로 확인되었습니다. 이 연구는 임상 진단 및 모니터링에 유망한 보존된 간 혈관 구조를 사용하더라도 기능적 및 정량적 수준에서 혈관 결함을 조사하기 위한 생체 내 평가의 민감성을 강조했습니다.

요약하면, 이 프로토콜은 마우스의 간 혈관 구조에 대한 비침습적 질적 및 정량적 연구를 위한 가이드 역할을 합니다. 또한 비침습적이고 간단한 절차로 인해 종단 추적 관찰에 사용할 수 있습니다. 또한 혈관의 기능 평가를 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
(하이드록시프로필)메틸셀룰로오스 HPMC	Sigma-Aldrich	H7509	0.5% HPMC
원심분리기 ZentriMix 380 R	Hettich	3200
원심분리기 튜브 50mL 원추형 멸균 폴리프로필렌	CELLSTAR 튜브	227 261
면 팁	Meditip Clean	G80215
집안			탈이온수
모 크림	약국
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650-5X5ML	sterile
Ethanol absolute	FRESENIUS KABI	010-0622-1
수유 바늘, 재사용 가능한	FST Fine Science Tools	18064-20
파인 팁 포함 Dumont # 5 집게	FST Fine Science Tools	11252-00
거즈 패드 5 x 5 cm	Klinipress	175 004
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	버전 9
GUI 분석 스크립트	Inserm	gui_analysis.m	은 10 ms 도플러 스캔
필요 가열 패드 17 x 17 cm, 6 W	ThermoLux Acculux	461265
인슐린 주사기 30G 0.30 x 8 mm, 0.3 mL 및 0.5 mL	BD Microfine + Demi	25636
케타민 아네스케틴	Dechra	REG NL 111764	100 mg/mL
Kimwipes KIMTECH 저보푸라기 와이퍼	ULINE	S-8115
랩 테이프 19 mm x 50 m x 0.125 mm	Stokvis	M451
MATLAB 소프트웨어	MathWorks	버전 R2022b
근처 보습 크림	약국
니들 옐로우 30G 0.3 x 13 mm	BD Microlance	304000
안과 연고 Oculentum Simplex	추가 제약	220201
집에 종이 티슈
영구 실험실 마커	VWR	52877-310
생리 소금 용액 (NaCl 0.9 %)	FRESENIUS KABI	B102986	멸균
날카로운 물건 일회용 용기 의료 Dispo 2.5 L	APmedical	UN3291
멸균 안전 잠금 1.5 mL 튜브	Eppendorf	0030 120.086
주사기 1 mL	BD Plastipak	303172
주사기 20 mL Luer-Lok	BD Plastipak	300629
타이머	West Bend	40053
트리머	Exacta Aesculap	GT416
초고속 초음파 플랫폼	Iconeus &   INSERM 'Biomedical Ultrasound' ART	Iconeus	10ms 시퀀스
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