κ-Carrageenan Sub-Microgel Medium을 사용한 조직 유사 구조의 임베디드 바이오프린팅

요약

이 연구는 새로운 κ-carrageenan 서브 마이크로겔 현탁액 수조를 소개하여 놀라운 가역적 재밍-언재밍 전이 특성을 보여줍니다. 이러한 특성은 임베디드 3D 바이오프린팅에서 생체 모방 조직 및 장기를 구성하는 데 기여합니다. 고해상도와 세포 성장으로 심장/식도 유사 조직의 성공적인 프린팅은 고품질 바이오프린팅 및 조직 공학 응용 분야를 보여줍니다.

초록

입상 하이드로겔 지지 수조를 사용하는 임베디드 3차원(3D) 바이오프린팅은 생체 모방 스캐폴드를 만들기 위한 중요한 기술로 부상했습니다. 그러나 정밀한 바이오잉크 증착과 세포 생존력 및 기능의 균형을 맞추는 적절한 겔 현탁액을 엔지니어링하는 것은 특히 원하는 점탄성 특성을 달성하는 데 있어 여러 가지 과제를 제시합니다. 여기에서 새로운 κ-카라기난 겔 지지 수조는 작동하기 쉬운 기계적 분쇄 공정을 통해 제작되어 균일한 서브 마이크로 스케일 입자를 생성합니다. 이 서브 마이크로겔은 항복 응력이 작고 빠른 전단 희석 특성을 가진 전형적인 Bingham 유동 거동을 나타내어 바이오잉크의 원활한 증착을 용이하게 합니다. 또한, κ-카라기난 마이크로겔 네트워크의 가역적 겔-졸 전이 및 자가 치유 기능은 인쇄된 구조물의 구조적 무결성을 보장하여 정의된 구조적 특징을 가진 복잡한 다층 조직 구조를 생성할 수 있습니다. 인쇄 후, κ-carrageenan 서브 마이크로겔은 간단한 인산염 완충 식염수 세척으로 쉽게 제거할 수 있습니다. 세포가 함유된 바이오잉크를 사용한 추가 바이오프린팅은 생체모방 구조 내의 세포가 92%의 높은 생존율을 가지며 가성발구를 빠르게 확장하며 강력한 증식을 유지한다는 것을 보여주며, 이는 조직 및 장기 제조를 위한 이 바이오프린팅 전략의 잠재력을 나타냅니다. 요약하면, 이 새로운 κ-카라기난 서브 마이크로겔 배지는 엔지니어링 조직 및 장기의 체외 개발에 중대한 영향을 미치는 탁월한 품질의 임베디드 바이오프린팅을 위한 유망한 방법으로 부상하고 있습니다.

서론

전기방사 섬유, 다공성 스폰지 및 폴리머 하이드로겔을 포함한 조직 공학 지지체는 세포 성장, 조직 재생 및 장기 기능 복원을 지원하는 구조적 프레임워크를 제공하여 손상된 조직 및 장기의 복구 및 재건에 중추적인 역할을 합니다 ^1,2,3. 그러나 전통적인 골격은 기본 조직 구조를 정확하게 복제하는 데 어려움을 겪어 공학적 조직과 자연 조직 간의 불일치로 이어집니다. 이러한 한계는 결함이 있는 조직의 효율적인 치유를 방해하며, 보다 정확한 생체 모방을 달성하기 위해 골격 설계의 발전이 시급히 필요하다는 점을 강조합니다. 3차원(3D) 바이오프린팅은 생체 재료 잉크와 세포를 사용하여 복잡한 생체 조직 구조를 층별로 정밀하게 구성하는 혁신적인 제조 기술입니다⁴. 다양한 생체 재료 중에서 고분자 하이드로겔은 세포의 현장 캡슐화를 촉진하고 결정적으로 세포의 성장을 지원하는 독특한 네트워크를 갖춘 이상적인 바이오잉크로 부상하고 있습니다 ^5,6. 그럼에도 불구하고, 많은 부드럽고 수분이 풍부한 하이드로겔은 바이오잉크로 사용될 때 프린팅 과정에서 인쇄된 스캐폴드 구조의 흐릿함 또는 급격한 붕괴를 유발하는 경향이 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 임베디드 3D 바이오프린팅 기술은 마이크로겔 배스를 지지 재료로 사용하여 정밀하고 부드러운 바이오잉크 증착을 가능하게 합니다. 하이드로겔 바이오잉크의 겔화 후, 마이크로겔 배스를 제거하여 복잡한 구조를 가진 정제된 바이오닉 스캐폴드를 얻습니다. 젤라틴 ^7,8, 아가로스⁹ 및 젤란 검^10,11과 같은 재료는 임베디드 3D 바이오프린팅을 위한 마이크로겔 배스를 만드는 데 사용되어 조직 공학에서 소프트 하이드로겔의 적용을 크게 발전시켰습니다. 그러나 이러한 미립자 겔의 미크론 수준 및 불균일한 입자 크기는 3D 프린팅의 해상도와 충실도에 해로운 영향을 미칩니다 12,13,14. 작고 균일하게 분산된 입자로 젤 같은 현탁액 플로트를 제작해야 하는 시급한 필요성이 있으며, 이는 충실도가 높은 바이오프린팅을 달성하는 데 이점을 제공합니다.

이 프로토콜에서는 임베디드 3D 프린팅을 위해 균일한 서브미크론 수준의 새로운 희생 과립 κ-카라기난 현탁액 수조가 제공됩니다. 빠른 재밍-언재밍 전이의 이 혁신적인 서브 마이크로겔 수조 거동은 높은 구조적 충실도를 가진 생체 모방 하이드로겔 지지체의 정밀한 제작을 용이하게 합니다¹⁵. 이 새로운 현탁 매체를 활용하여 다층 조직 구조를 특징으로 하는 일련의 생체 모방 조직 및 장기 구조가 성공적으로 인쇄되었으며, 젤라틴 메타크릴레이트와 실크 섬유 메타크릴레이트로 구성된 복합 바이오잉크를 사용합니다. 이 연구에서 우리는 식도를 3D 바이오프린팅 생체모방 대상으로 선택한 주된 이유는 식도가 다층 조직 구조를 가지고 있을 뿐만 아니라 근육층이 내부 원형 및 외부 종방향 복합 층 구조를 나타내기 때문입니다. 이러한 층의 적절한 정렬과 구성을 보장하는 것은 기능적 조직 재생에 필수적입니다. 따라서 우리는 식도의 다층 구조를 복제하기를 매우 원합니다. 더 중요한 것은 κ-carrageenan 서브 마이크로겔을 현탁액 수조로, GelMA/SFMA를 바이오잉크로 사용하여 조직 공학을 위한 생체 모방 스캐폴드를 설계하고 구성했다는 것입니다. 인쇄된 식도는 반복적인 인산염 완충 식염수 세척으로 쉽게 방출될 수 있습니다. 또한, κ-카라기난 서브 마이크로겔 수조는 세포독성 물질이 없어 높은 세포적합성을 보장합니다¹⁵. 이방성 지지체 내에 로드된 평활근 세포는 주목할 만한 확산 활동을 나타냅니다. 이 균일한 서브 마이크로겔 현탁 매체는 임베디드 3D 바이오프린팅을 통해 복잡한 조직과 장기를 제작할 수 있는 새로운 방법을 제공합니다.

프로토콜

1. κ-carrageenan sub-microgel 현탁액 배스의 제조

1. 1,000mL 유리병 내 500mL의 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4) 용액에 κ-카라기난 분말 1.75g을 첨가하여 κ-카라기난 현욕 수조 500mL(0.35% wt/vol)를 준비합니다.
2. 70mm 마그네틱 교반기 막대를 유리병에 삽입하여 수성 혼합물을 저어줍니다. 유리병 뚜껑을 조인 다음 반 바퀴 돌려 풉니다.
3. 유리병을 70°C 수조에 넣고 가열합니다. 300rpm의 속도로 자기 교반기를 켜고 병을 놓고 폴리머가 완전히 용해될 때까지 저어줍니다.
4. 다른 유리병을 가져다가 살균을 위해 오토클레이브에 넣고 121°C에서 30분 동안 작동합니다.
5. 고압 멸균기가 80°C로 냉각된 후 멸균기에서 병을 제거하고 추가 처리를 위해 매우 깨끗한 작업대로 옮깁니다.
6. 0.22μm 필터를 사용하여 완전히 용해된 κ-카라기난 용액을 멸균된 유리병에 여과합니다.
   알림: κ-카라기난이 냉각되어 필터를 막는 것을 방지하기 위해 용액이 뜨거울 때 신속하게 여과를 수행하십시오.
7. κ-카라기난 용액을 4°C에서 보관하여 12시간 동안 양이온 가교 겔화를 유도합니다.
8. 25°C에서 1200rpm의 교반 속도로 60mm 자기 교반기를 사용하여 약 60분이 소요되어 액체 상태로 성공적으로 변할 때까지 κ-카라기난 하이드로겔을 기계적으로 분쇄합니다.
   알림: κ-카라기난 하이드로겔을 25-37°C 사이에서 보관하여 저온에서 겔화가 발생하거나 고온에서 용해되는 것을 방지하십시오.

2. 젤라틴 메타크릴레이트/실크 피브로인 메타크릴레이트 복합 바이오잉크의 제조

1. PBS 용액(pH 7.4)에 10%(wt/vol) 젤라틴 메타크릴레이트(GelMA)와 6%(wt/vol) 실크 피브로인 메타크릴레이트(SFMA)를 결합하여 복합 바이오잉크를 제조합니다. GelMA 2.0g과 SFMA 분말 1.2g을 따로 계량합니다.
2. 분말을 두 개의 50mL 원심분리기 튜브에 천천히 추가합니다. 10mL의 PBS 용액을 50mL 원심분리 튜브에 별도로 추가합니다.
3. 각각에 10mm 마그네틱 교반기를 추가하고 45°C의 수조에서 지속적으로 저어주고 가열합니다. GelMA 및 SFMA 분말이 완전히 용해되도록 약 30분 동안 기다립니다.
4. GelMA와 SFMA 용액을 45°C에서 연속 교반하면서 동일한 부피로 혼합합니다. 100μm 공극 크기 필터를 사용하여 복합 바이오잉크를 필터링합니다.
5. 생물 안전 캐비닛에서 UV 조사를 통해 복합 GelMA/SFMA 바이오잉크를 12시간 동안 멸균합니다.
   알림: 자체 조립을 통해 SFMA의 조기 겔화를 방지하기 위해 바이오잉크를 즉시 준비하고 사용하십시오.

3. κ-carrageenan sub-microgel 현탁액 배스의 유변학적 특성 분석

1. 유변학 관련 장비를 시작하고 준비합니다.
   1. 공기 압축기를 30분 동안 켜고 압력이 30psi에 도달하는지 확인합니다. 베어링 cl 제거amp 드로우 로드를 시계 반대 방향으로 돌립니다. 아래의 검은색 커버를 고정하고 기기 상단의 손잡이 축을 시계 방향으로 돌립니다.
   2. 레오미터의 전원을 켜고 초기화할 때까지 기다립니다. 순환수 스위치를 켜고 온도가 15°C에 도달하도록 합니다.
   3. 레오미터 제어 소프트웨어를 열어 온라인 연결을 설정합니다.
2. 레오미터를 보정하고 평행 플레이트 형상을 설치합니다.
   1. 제어 소프트웨어에서 기기 교정을 수행하며, 주로 교정 기기 관성 경로 조정이 포함됩니다. 40mm 직경의 평행 플레이트 형상을 드로우 로드의 끝에 맞춥니다. Lock 버튼을 3초 동안 누르고 있으면 모터 샤프트를 홈 위치로 이동하여 일관된 형상 배치를 할 수 있습니다.
   2. 제어 소프트웨어에서 Calibrate Manager를 선택한 다음 Inertia, Friction Calibration, Rotational Mapping을 클릭하여 평행 플레이트 형상을 캘리브레이션합니다.
3. 정확한 측정을 보장하기 위해 표준 갭 제로화 절차를 수행하여 레오미터 갭 높이를 제로화합니다.
4. 0.01에서 1000 1/s 전단 속도 범위의 흐름 램프, 10 rad/s에서 0.1%에서 100% 변형률 범위의 진폭 스윕, 10rad/s에서 1%와 100%의 교대 변형률로 60초 동안 지속되는 다단계 진동 시간 스윕, 0.1 1/s 및 10 1/s의 교대 전단 속도로 120초 동안 지속되는 다단계 Peak Hold 스윕을 포함하여 실험 단계를 설정합니다.
5. 0.35% κ-카라기난 현탁액 2mL를 레오미터의 펠티에 플레이트에 떨어뜨립니다.
6. 형상 간격을 510μm로 배치하고 클램프 장치의 가장자리에서 과도한 오버플로를 제거합니다. 샘플 간격을 500μm로 설정하여 샘플이 클램프 가장자리를 약간 넘어 확장될 수 있도록 합니다.
7. 실험 설계 옵션에서 Flow Ramp 를 선택하여 흐름 실험을 수행합니다.
   1. 실험 설계에서 Flow Ramp 테스트를 선택합니다. 25°C의 온도에서 전단 속도를 0.001에서 10 1/s로 설정합니다.
   2. 추가된 샘플에 대해 3.5단계와 Flow Ramp 실험을 수행합니다.
8. 재료의 회수 성능을 평가하기 위해 주기적 Peak Hold 테스트를 수행합니다.
   1. 실험 설계에서 Peak Hold 스윕을 선택하고 25°C에서 120초의 시간으로 5개의 연속 실험을 설정합니다.
   2. 첫 번째, 세 번째 및 다섯 번째 단계에 대해 전단 속도를 0.01 1/s로 설정하고 두 번째 및 네 번째 단계에 대해 10 1/s로 설정합니다.
   3. 2mL의 새 검체를 추가합니다. 3.5단계와 순환 회복 테스트를 수행합니다.
9. 점탄성 분석을 수행하여 κ-카라기난 현탁액 수조의 잠재적인 겔-졸 전이를 평가합니다.
   1. 실험 설계에서 진폭 스윕 테스트를 선택합니다. 25°C의 온도에서 진동 변형률을 0.1%에서 100%로 설정합니다. Start(시작 )를 클릭하여 추가된 샘플에 대해 Amplitude Sweep 실험을 수행합니다.
10. 대체 변형 해석을 수행하여 재료의 탄성 회복 성능을 평가합니다.
    1. 실험 설계에서 Oscillation Time Sweep 을 선택하고 25°C에서 60초의 시간으로 5개의 연속 실험을 설정합니다.
    2. 첫 번째, 세 번째, 다섯 번째 단계에서는 변형률을 1%로, 두 번째와 네 번째 단계에서는 100%로 설정합니다.
    3. 2mL의 새 검체를 추가합니다. 3.5 단계 및 연속 순환 회복 테스트를 수행합니다.
       참고: 각 실험 테스트 후 지오메트리 플레이트와 펠티에 플레이트를 청소하고 2mL의 새 샘플을 추가합니다.

4. 맞춤형 마이크로 압출 바이오프린터를 사용하여 생체 모방 하이드로겔 지지체 인쇄

1. 3D 그래픽 소프트웨어를 사용하여 STL 형식의 큐브를 설계하고 3D 데이터베이스에서 조직과 같은 모델을 다운로드합니다(www.thingiverse.com; https://3d. nih.gov/.).
   1. STL 형식 모델을 PANGO 소프트웨어로 가져오고 인쇄 매개변수를 입력합니다. 3D 공간에서 모델의 특정 X, Y 및 Z 좌표를 설정하고, 모델의 예상 배율 크기를 밀리미터(mm) 단위로 입력하고, X, Y 및 Z축에서 개체의 크기와 배율 비율을 조정하고, 필요에 따라 공간에서 모델의 회전 각도를 조정합니다.
   2. 예상 필라멘트 직경(일반적으로 대부분의 바이오잉크의 경우 약 200-500μm)을 층 두께 필드에 입력하여 각 층의 Z축 두께를 결정합니다. 예상 선 두께(약 10-90mm/s)에 따라 인쇄 속도를 설정하고 채우기 농도를 30%-80%로 설정합니다.
   3. 최종 매개 변수를 G 코드로 SD 카드에 내보냅니다.
2. 바이오프린터와 마이크로 압출 펌프를 가동합니다.
   1. 미세 압출 펌프 컨트롤러를 켜고 해당 부피 주사기(5mL)를 선택한 다음 압출 속도를 0.08mL/분으로 설정하고 하이드로겔 부피를 압출 속도로 나누어 얻은 원하는 인쇄 시간에 따라 압출 시간을 조정합니다.
   2. 내경이 210 μm인 바늘이 있는 주사기를 바이오프린터의 주사기 슬롯에 끼웁니다.
   3. 주사기 컨트롤러를 조정하여 주사기의 플런저가 나사에 밀착되도록 합니다.
   4. 3mL의 현탁액 항온조를 35mm 세포 배양 접시에 넣습니다. 코드 설정에 따라 접시를 플랫폼에 놓고 인쇄 헤드가 접시 바닥에서 1mm 위에 있는지 확인합니다.
      알림: 인쇄하는 동안 인쇄 플랫폼에서 접시 위치의 정확성을 보장하기 위해 사전 테스트를 수행하십시오.
   5. 코드가 포함된 SD 카드를 3D 바이오프린터에 삽입하고 코드 파일을 활성화한 다음 바이오프린터를 시작한 다음 컨트롤러의 시작 버튼을 클릭합니다.
3. 구조체의 처리
   1. 인쇄된 구조물을 405nm 청색광에 1분 동안 노출시켜 광가교를 시작합니다.
   2. 1mL 피펫을 사용하여 κ-카라기난 겔을 제거한 다음 세척 및 후속 제거를 위해 3mL의 PBS(pH 7.4)를 추가합니다. 철저한 세탁을 위해 이 과정을 반복하십시오.
      알림: 인쇄된 구조물이 손상되지 않도록 세척 과정을 부드럽게 수행하십시오.

5. 식도 근육층 유사체의 임베디드 3D 바이오프린팅

1. 토끼 식도 평활근 세포(eSMC) 배양.
   1. 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 15mL의 DMEM 배지를 사용하여 2 x 10⁶ 세포로 T75 플라스크에서 배양을 시작합니다.
   2. eSMC는 37% 밀도에 도달할 때까지 5% CO₂ 및 95% 공기의 가습된 분위기에서 80°C로 유지합니다.
2. 식도 근육층 바이오잉크의 제조
   1. 밀도에 도달하면 배지를 흡인하고 5mL의 1x PBS로 eSMC를 세척합니다.
   2. 플라스크에 0.2% 트립신-EDTA 2mL를 넣고 세포를 분해하기 위해 2분 동안 배양합니다. 플라스크를 눌러 벽에서 셀을 분리합니다.
   3. 2mL의 DMEM을 추가하여 분해를 종료하고 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 10 μL의 cell-suspension이 있는 cell counter를 사용하여 cell 밀도를 측정합니다.
   4. 675 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 흡입하고 세포 펠릿을 복합 GelMA/SFMA 바이오잉크에 재현탁시킵니다(2.1단계에서 준비). 바이오잉크에서 10 x 10⁶ cells/mL의 밀도를 달성하도록 최종 세포 농도를 조정하여 후속 3D 바이오프린팅 응용 분야를 위한 조건을 최적화합니다.
3. 3D 바이오프린터 및 관련 재료의 준비
   1. 주사기 바늘, 집게, 자기 교반기 및 1000mL 규산염 유리병을 포함한 필수 인쇄 기기를 표준 멸균 조건(121°C에서 30분)에서 고압멸균하여 인쇄 공정을 위한 무균 환경을 보장합니다.
   2. 바이오프린터를 생물 안전 캐비닛 내부에 넣고 멸균 상태를 유지하기 위해 30분 동안 자외선(UV)으로 멸균합니다.
   3. 1단계 및 2단계에서 각각 설명한 대로 50mL의 멸균 κ-카라기난과 5mL의 멸균 GelMA/SFMA 복합 바이오잉크를 준비합니다.
   4. 모델을 설계하고, 원하는 매개변수를 설정하고, 4.1단계에 설명된 대로 바이오프린터를 준비합니다.
4. 바이오프린팅 공정의 시작
   1. 4.2 및 4.3 단계에 설명 된 절차를 수행하여 3D 식도 근육 층을 바이오 프린팅 한 다음 PBS 세척 및 교체합니다.
   2. 인쇄 공정 전반에 걸쳐 멸균 기술로 세포 인쇄를 수행하여 인쇄된 구조의 세포 오염 위험을 최소화합니다.
5. 프린팅 후 세포 배양 배지 교체
   1. PBS를 조심스럽게 흡입하고 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM 3mL로 교체합니다. 최적의 세포 성장 조건을 제공하기 위해 인쇄된 구조물이 완전히 물에 잠겼는지 확인하십시오.
   2. 인쇄된 구조체를 포함하는 세포 배양 접시를 5%_CO2로 37°C로 설정된 인큐베이터에서 배양합니다. 세포 배양 배지를 매번 3mL를 사용하여 매일 새로운 배지로 교체하고 광학 현미경을 사용하여 구조물 내 세포의 상태를 모니터링합니다.

6. Live/Dead assay staining을 통한 인쇄된 구조물 내 eSMC의 생존력 평가

1. 배양 5시간 후 세포 배양 배지를 제거하고 세포가 함유된 구조를 PBS로 세척합니다.
2. 표준 칼세인-AM/프로피듐 요오드화물 용액(1:1000) 2mL를 인쇄된 세포 래든 구조체에 추가하고 배양합니다.
3. 45분 배양 후 PBS로 작물을 3번 세척한 다음 새 세포 배양 배지를 추가합니다.
4. 살아있는 세포와 죽은 세포를 관찰하고 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)을 사용하여 형광 이미지를 캡처합니다.

7. FITC-Phalloidin/DAPI 염색을 통한 인쇄된 구조물 내 eSMC 관찰

1. F-actin에 대해 phalloidin(녹색)으로 표시된 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 사용하고 핵 배양 후 5일 후에 4',6-Diamidino-2-Phenylindole(DAPI, 파란색)을 사용하여 인쇄된 구조물을 염색합니다.
2. 정착 용액 준비
   1. 5mL 폴리에틸렌(PE) 튜브에 4mL의 1x PBS와 0.16mL의 파라포름알데히드(PFA)를 결합하여 최종 농도 4%를 달성합니다.
   2. 바이오프린팅된 구조체가 들어있는 배양 접시를 깨끗한 표면에 놓습니다. 매체를 제거하고 PFA 용액으로 구조물을 부드럽게 덮어 완전히 침수되도록 합니다. 용액을 버리기 전에 실온에서 20분 동안 고정을 진행하십시오.
      참고: 바이오프린팅된 구조물의 구조적 무결성을 보존하기 위해 추가 및 제거 과정에서 액체를 조심스럽게 다루십시오.
   3. 배양 접시에 2.5mL의 1x PBS를 주입하고 조성물을 완전히 담가 잔류 염색 시약을 제거합니다.
3. 세포막 투과화
   1. 5mL PE 튜브에 20μL의 Triton X-100을 4mL의 1x PBS에 첨가하여 0.5% Triton X-100 용액을 제조합니다.
   2. Triton X-100 용액을 실온에서 30분 동안 구조물에 투여하여 세포막에 침투시킨 다음 용액을 제거합니다.
   3. 배양 접시에 2.5mL의 1x PBS를 주입하고 조성물을 완전히 담가 잔류 염색 시약을 제거합니다.
4. 비특정 바인딩 차단
   1. 3x PBS 4mL에 BSA 0.12mL를 추가하여 5mL PE 튜브에 4% 소 혈청 알부민(BSA) 차단 용액을 만듭니다.
   2. BSA 용액을 실온에서 30분 동안 구조물에 주입하여 비특이적 부위를 차단한 다음 용액을 폐기합니다.
5. FITC-Phalloidin을 사용한 액틴 염색
   1. 5mL PE 튜브에 4mL의 1x PBS 및 8μL의 염색 시약을 사용하여 0.2% FITC-phalloidin 용액을 준비합니다.
   2. 이 용액에 구조물을 어두운 곳에서 실온에서 60분 동안 담근 다음 용액을 폐기합니다.
   3. 배양 접시에 2.5mL의 1x PBS를 추가하고 조성물을 완전히 담가 잔류 염색 시약을 제거합니다.
6. DAPI를 사용한 핵 염색
   1. 4mL의 DAPI 염색 용액을 구조물에 도포하여 완전한 커버리지를 보장합니다.
   2. DAPI 용액을 제거하기 전에 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 배양합니다.
7. 최종 세척 및 PBS 침수: 배양 접시에 2.5mL의 1x PBS를 추가하고 구조물을 완전히 담가 잔류 염색 시약을 제거합니다.
   알림: 염색 용액을 미리 준비하고 부드럽게 다루십시오. 어떤 경우에도 세포는 배양 용기 내에서 건조되어서는 안 됩니다.
8. 컨포칼 현미경을 사용하여 관찰: 컨포칼 현미경을 사용하여 염색된 구조를 검사하고 이미지화하여 세포 성장을 평가하고 결과를 포괄적으로 문서화합니다.

8. CCK-8 assay를 사용한 인쇄된 구조물 내 eSMC 증식 평가

1. 7일과 14일에 구조물에서 배양 배지를 제거합니다. PBS로 구조물을 세척하여 잔류 배지 및 분리된 세포를 제거합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 각 구조물에 CCK-8 용액을 추가합니다. CCK-8 용액의 부피가 각 구조물을 완전히 덮을 수 있도록 충분한지 확인하십시오.
3. 37°C에서 2시간 동안 CCK-8 용액으로 조성물을 배양합니다. 배양 후 상층액을 새로운 96웰 플레이트로 조심스럽게 옮깁니다.
4. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정합니다.

결과

입상 κ-카라기난 겔 배스는 벌크 하이드로겔을 미립자 겔 슬러리로 기계적으로 분해하여 생성되었습니다. 가장 최근의 연구는 κ-카라기난 입자가 1000rpm의 기계적 혼합(¹⁵)에서 균일한 형태로 약 642 ± 65nm의 평균 직경을 나타냈음을 보여주었으며, 이는 이전에 문헌 16,17,18에 보고된 마이크로겔의 치수보다 훨씬 작습니다. 이 연구에서 1200rpm에서 60분의 혼합 시간으로 더 긴 파괴 시간과 더 큰 속도는 더 작은 미립자 크기를 생성하며, 평균 직경이 565 ± 86nm인 하위 미립자를 생성합니다(보충 그림 1). 이러한 작은 입자 크기는 인쇄 공정의 해상도를 향상시킬 것으로 예상됩니다. 이러한 입자는 수소 결합 및 양이온 상호 작용의 형성을 통해 입상 겔로 조립됩니다(그림 1A). 응력을 받으면 κ-카라기난 서브 마이크로겔 배지는 항복, 전단 희석, 가역적 재밍-언재밍 전이와 같은 특징적인 거동을 나타내며, 이 모든 것은 성공적인 임베디드 3D 바이오프린팅에 필수적입니다. 그림 1B는 유동 램프 테스트에서 입상 κ-카라기난 겔의 대표적인 항복 거동과 전단 박화를 보여줍니다. 전단 속도가 0.001에서 10 ^s-1로 증가하면 0.35%(wt/vol) 입상 κ-카라기난 겔의 전단 응력은 0.3 ^s-1 미만의 전단 속도에서 상대적으로 변하지 않은 상태로 유지되어 3.5Pa의 낮은 항복 응력을 나타냅니다. 그 후, 전단 응력이 전단 속도에 따라 선형으로 증가하는 것이 관찰되었으며, 이는 Bingham 유체와 유사한 유동 거동을 시사합니다. 또한, κ-carrageenan sub-microgel의 변형 스윕 유변학적 측정은 겔에서 졸로의 독특한 전이를 보여줍니다. 이러한 겔은 10%를 초과하는 균주에서 수율을 보이고 35% 균주에서 겔-졸 전이를 거칩니다(그림 1C). 서브 마이크로 입자 겔의 작은 수율 변형은 수소 결합과 양이온 상호 작용을 통해 확립된 물리적 네트워크에 기인합니다. 이러한 겔-졸 전이 거동은 가역적이다. 그림 1D에서 볼 수 있듯이 100%의 변형률에서 κ-carrageenan 서브 마이크로겔의 저장 탄성률은 38Pa에서 6Pa로 급락하여 손실 탄성률보다 낮으며 이는 졸 상태를 나타냅니다. 반대로, 변형률이 1%로 갑자기 감소하면 저장 탄성률은 약 38Pa로 빠르게 되돌아갑니다. 이는 5초 이내에 손실 계수를 능가하며, 이는 κ-카라기난 서브 마이크로겔이 입자 간의 물리적 가교를 빠르게 재확립할 수 있음을 시사합니다.

작고 균질한 형태가 특징인 입상 κ-카라기난 겔은 전단 담화 특성, 빠른 자체 회복 및 항복 응력 거동을 나타내어 임베디드 3D 바이오프린팅 응용 분야에 사용하기에 유리합니다. 임베디드 프린팅을 위한 지지 배스로서 κ-카라기난 서브-마이크로겔 현탁액의 효능을 평가하기 위해, 10%(wt/vol) 젤라틴 메타크릴레이트 및 6%(wt/vol) 실크 피브로인 메타크릴레이트 복합체(GelMA/SFMA)로 구성된 널리 사용되는 바이오잉크가 κ-카라기난 매체^19,20 내의 프린팅 시험에 사용됩니다. GelMA는 향상된 시각화를 위해 로다민으로 라벨링되었습니다²¹. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 세분화된 κ-카라기난 겔 배스는 투명도가 매우 높아 인쇄 공정을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 노즐에 의해 생성되는 전단 속도는 노즐 속도가 10-90mm/s 범위 내에서 변할 때 0.66에서 ^6s-1 범위입니다. κ-carrageenan 서브 마이크로겔 수조는 6 ^s-1 및 0.01 ^s-1의 교대 속도로 연속 순환 전단 시 20초 이내에 여전히 자가 치유 거동을 나타냅니다(보충 그림 2). 층 두께가 150 μm인 15 x 15 x 2^mm3 크기의 격자 구조가 κ-카라기난 서브 마이크로겔 수조 내에서 유지되었습니다. 특히 그리드는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경(CLSM) 이미지로 확인된 바와 같이 약 200μm의 너비와 약 350μm의 필라멘트 간 간격으로 놀라운 무결성과 해상도를 보여주었습니다. 또한 3D 그리드 구조는 상호 연결된 기공이 있는 다공성 네트워크를 특징으로 합니다. 이는 인쇄 가능성에 영향을 미치고 궁극적으로 세포 생존, 증식 및 분화 가능성과 같은 세포 행동에 영향을 미치는 중요한 속성입니다.

복잡한 조직 및 장기 구조를 생성하기 위한 κ-카라기난 서브 마이크로겔 배지의 적합성을 추가로 확인하기 위해 GelMA/SFMA 잉크를 사용하여 80%의 높은 충전 밀도로 인간 심장 모델과 tri-leaflet 심장 판막을 제작했습니다. 인쇄된 심장 모델은 주요 정맥과 동맥을 포함한 3D 해부학적 형태를 정확하게 복제하며(그림 2D), 수분 제거 후 기계적 안정성을 나타냅니다(그림 2E). 삼엽 심장 판막은 뚜렷한 판막 판막과 지지 구조를 보여줍니다(그림 2F). 또한 구조물 내의 필라멘트는 쉽게 벗겨집니다(그림 2G). 또한 식도와 같은 계층적 순환 모델이 정확하게 재현됩니다. 그림 2H 및 2I에서 볼 수 있듯이 인쇄된 식도는 해당 식도 조직층을 복제하기 위해 개별 층 사이에 뚜렷한 경계가 있는 명확한 층화를 나타내며, 이는 κ-카라기난 서브 마이크로겔 배지가 조직 공학에 필요한 구조적 복잡성을 지원한다는 것을 시사합니다. 현재 모델은 실제 인체 조직 및 장기의 전체 기능을 복제하기에는 부족하지만, κ-카라기난 서브 마이크로겔 수조는 복잡한 조직 및 장기의 체외 제작을 위한 실행 가능하고 유망한 전략을 제공할 수 있으며, 연구, 치료 및 진단에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

종방향 및 횡방향 이방성이 있는 그리드 지지대는 식도의 근육층을 모방하며(그림 3A,B), 뚜렷한 내부 원형 근육층과 외부 세로 근육층으로 구성됩니다. 이러한 비등방성 구조를 in vitro에서 복제하기 위해 토끼 식도 평활근 세포(eSMC)를 GelMA/SFMA 바이오잉크에 조심스럽게 삽입했습니다. κ-카라기난 서브 마이크로겔 배지를 활용하여 식도의 이중층 근육 구조와 매우 유사한 eSMC가 있는 생체 모방 골격을 성공적으로 달성했습니다. 하이드로겔 내에 캡슐화된 세포의 생존력은 배양 5시간 후 Live/Dead 염색으로 평가되었습니다. 그 결과, 하이드로겔 네트워크 내에서 살아있는 세포(녹색으로 염색)가 우세하게 존재하고 죽은 세포(빨간색으로 염색)의 비율이 최소인 것으로 나타났으며, 이는 높은 세포 생존율을 나타냅니다(그림 3C). 정량 분석 결과 최대 92%의 매우 높은 생존율을 보여주었습니다(그림 3D). 이러한 결과는 하이드로겔 물질의 생체 적합성뿐만 아니라 세포 무결성 보존에 대한 인쇄 및 가교 방법론의 효능을 나타냅니다. GelMA/SFMA 구조체 내의 세포 형태를 추가로 조사하기 위해 세포 배양 3일 후 phalloidin(녹색)/DAPI(파란색) 이미지를 캡처했습니다. 그림 3E에서 볼 수 있듯이, 생체 모방 구조 내의 상당수의 eSMC는 풍부한 pseudopodia를 투영하고 3일간의 배양 후 나타난 바와 같이 미세섬유를 따라 정렬을 나타냈습니다. 3D 재구성은 식도 근육층의 정확한 복제를 추가로 확인합니다(보충 그림 3). 또한 1일, 7일 및 14일에 CCK-8 분석을 사용하여 eSMC 증식을 평가했습니다. 450nm에서의 흡광도 값은 1일차부터 7일째 및 14일째까지 눈에 띄게 증가했으며, 이는 강력한 증식 거동을 반영합니다(보충 그림 4). 이러한 결과는 κ-카라기난 서브 마이크로겔 배지가 고품질 생체 모방 바이오프린팅을 촉진하는 데 상당한 잠재력을 가지고 있음을 나타냅니다.

그림 1: 자가 조립된 κ-carrageenan 서브 마이크로겔 매체 및 그 유변학 분석. (A) 임베디드 3D 바이오프린팅을 위한 수소 결합 및 양이온 상호 작용을 통해 형성된 κ-카라기난 서브 마이크로겔 플로트의 개략도. (B) 25°C에서 0.35%(wt/vol)가 끼인 κ-카라기난 서브 마이크로겔의 유량 램프. (C) 25°C에서 0.1%에서 100% 범위의 진폭 스윕을 통한 κ-카라기난 서브 마이크로겔의 겔-졸 전이 측정. (D) 25°C에서 1% 및 100% 변형률을 번갈아 가며 1% 및 100% 변형률로 연속 순환 전단 시 0.35%(wt/vol) κ-카라기난 서브 마이크로겔의 자가 치유 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: κ-carrageenan sub-microgel 현탁액 수조를 사용한 로다민 표지 GelMA/SFMA 잉크의 고충실도 임베디드 3D 바이오프린팅. (A) κ-carrageenan sub-microgel 현탁액 수조 내에 내장된 3D 프린팅의 실시간 관찰. (나, 씨) 인쇄된 그리드의 (B) 3D 재구성 및 (C) 내부 구조를 보여주는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 이미지. (디, 마) 3D 프린팅된 하트 모양의 모형을 수용액(D)과 자연 상태(E)에서 촬영한 사진. (F) 세 개의 소엽 심장 판막과 (G) 구조물에서 필라멘트가 벗겨지는 사진. (H) GelMA/SFMA 잉크로 인쇄된 식도 모델을 캡처한 상단 및 (I) 전면 사진으로, 계층적 4층 구조를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: κ-carrageenan sub-microgel 현탁액 수조를 사용한 임베디드 세포 함유 바이오프린팅. (A, B) (A) 식도의 내부 원형 및 외부 세로 근육 구조와 (B) 임베디드 3D 바이오프린팅으로 생성된 이방성 식도 근육층 생체 모방 골격의 개략도. (C) 라이브/데드 염색 이미지 및 (D) 5시간에 GelMA/SFMA 스캐폴드에서 성장한 eSMC의 정량적 생존력. (E) 3일차에 GelMA/SFMA 스캐폴드에서 성장한 eSMC의 투영 이미지. 왼쪽에서 오른쪽으로: 핵, F-actin, 병합 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: (A) κ-카라기난 서브 마이크로겔의 균일한 형태를 보여주는 주사 전자 현미경 이미지. (B) κ-카라기난 미세입자의 직경 분포는 레이저 나노미터 입자 크기 분석기로 측정하였다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 25°C에서 교대로 0.01 ^s-1 및 6 ^s-1 속도로 연속적으로 반복 전단할 때 0.35%(wt/vol)의 κ-carrageenan 서브 마이크로겔에 대한 자가 회복 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 인쇄된 그리드의 3D 재구성 이미지. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 4: 1일, 7일, 14일 후 GelMA/SFMA 하이드로겔에 캡슐화된 eSMC의 증식 활성을 CCK-8 분석(n=3)을 사용하여 평가했습니다. 통계적 유의성은 일원 분산 분석(one-way ANOVA)으로 분석한 후 **p<0.01, ****p < 0.0001의 세 그룹 간에 Tukey 사후 분석을 수행했습니다. 데이터는 평균± 표준 편차로 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

바이오프린팅에 사용하기 위한 κ-카라기난 서브 마이크로겔 현탁액 배스의 준비는 생성된 배지가 바이오잉크를 지지하는 데 필요한 특성을 나타내도록 하기 위한 몇 가지 중요한 단계를 포함하는 신중하게 조정된 프로세스입니다. 처음에, κ-카라기난 용액은 κ-카라기난 분말을 고온에서 탈이온수에 용해시켜 균질한 혼합물을 생성함으로써 제조됩니다. 용액의 농도가 핵심이며 후속 겔화를 위해 최적화해야 합니다. 0.3-0.6%(wt/vol) κ-카라기난은 임베디드 3D 바이오프린팅에서 우수한 성능을 입증했습니다¹⁵. 냉각 시 이 용액은 벌크 겔로 전환됩니다.

그런 다음 벌크 겔은 기계적 분쇄 전략을 거쳐 서브 마이크로겔 입자를 생성합니다. 여기에는 겔을 균일한 크기의 입자로 분해하는 고전단 기계적 힘이 포함됩니다. 전단 강도, 시간 및 온도를 포함한 연삭 공정 매개변수는 원하는 입자 크기 분포를 달성하기 위해 정밀하게 제어됩니다. 분쇄 후 서브 마이크로겔 입자는 25-37°C에서 보관되어 응집 또는 용해를 방지하며, 이는 복잡한 바이오프린팅 작업을 지원하는 균일한 현탁액을 유지하는 데 필수적입니다. 젤을 즉시 준비하고 사용하는 것이 좋습니다.

κ-carrageenan 서브 마이크로겔 현탁액 수조의 생산은 작동이 용이하여 산업 응용 분야와 연계하고 대규모 조직 공학 및 재생 의학 노력에 대한 수요 증가를 보장합니다. 또한, κ-carrageenan 서브 마이크로겔 현탁액 배조는 세포 호환 PBS 또는 배양 배지를 용매로 사용하여 우수한 생체 적합성을 보장하고 바이오프린팅 구조 내에서 세포를 지지하는 데 이상적인 배지입니다. 과립상 젤의 저장 수명은 무균 준비 조건 하에서 대략 1 달입니다.

Bingham 소성 유동 거동(그림 1B)을 특징으로 하는 κ-카라기난 서브 마이크로겔 수조는 신속한 자가 치유 능력(그림 1C, D)과 결합된 우수한 전단 희석 특성을 보여주며, 이는 인쇄된 구조물의 정밀도를 향상시키는 데 중추적인 역할을 합니다. 이 서브 마이크로겔 수조의 적용은 다층 구조를 특징으로 하는 조직 생성에 효과적인 것으로 입증되었으며(그림 2), 높은 충실도와 해상도를 가진 구조 생산을 보장합니다. 세포가 함유된 바이오잉크에 내장된 세포에서 빠른 pseudopodia 확장 능력이 있다는 점은 주목할 만하며(그림 3), 이는 세포 과정과 수조의 호환성을 강조합니다. 결과적으로, 이 κ-carrageenan 서브 마이크로겔 수조는 체외 조직 및 장기 제조 분야에 대한 혁신적인 약속을 가지고 있습니다. 이는 보다 복잡하고 실행 가능하며 기능적으로 통합적인 조직 구조의 개발을 가능하게 함으로써 조직 공학 및 재생 의학에 지대한 영향을 미칠 것입니다.

바이오프린팅 및 조직 공학 응용 분야를 위한 κ-carrageenan 서브 마이크로겔 수조의 상당한 잠재력에도 불구하고 몇 가지 과제와 한계가 여전히 존재합니다. 주요 관심사는 그 구성이 세포 배양 배지와 매우 유사해야 한다는 것이며, 이는 대형 장기의 장시간 인쇄 중에 세포 생존력을 유지하는 데 중요합니다. κ-카라기난 서브 마이크로겔은 주로 PBS를 용매로 사용하여 생산되며, 이를 위해서는 물질을 용해하기 위해 다양한 세포 배양 배지를 통합해야 합니다. PBS 외에도 κ-카라기난은 염화칼슘 용액을 사용하여 젤라틴화됩니다. 그러나 염화칼슘 용액은 세포에 독성을 일으키거나 삼투압 불균형을 일으킬 수 있습니다. 따라서 세포 배양 배지를 사용하는 것은 κ-카라기난 용매 및 가교제에 이상적입니다. 또한, 마이크로겔의 고처리량 멸균 생산을 달성하는 것은 중요한 도전 과제입니다. κ-카라기난 용액의 멸균은 고온에서 0.22μm 필터를 통해 여과해야 합니다. 그러나 멸균 κ-카라기난의 수율은 PBS 용액의 품질 및 여과 공정 중 κ-카라기난의 냉각을 포함한 다양한 요인에 의해 종종 방해를 받습니다. 각 여과 배치는 일반적으로 20-50mL의 멸균 κ-카라기난을 생성하며, 이는 κ-카라기난 마이크로겔의 고처리량 생산에 상당한 장벽이 됩니다. 결과적으로, 향후 연구는 생체 제조 공정을 최적화하고, 장기적인 세포 생존력 및 기능을 평가하고, 인쇄된 조직을 살아있는 시스템에 통합하는 방법을 탐구하는 데 중점을 둘 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3D 바이오 프린터	맞춤형 설계
4',6-Diamidino-2-Phenylindole	Solarbio Life Science	C0065	즉시 사용 가능한
405nm 자외선	EFL	XY-WJ01
세포 계수기	Corning	Cyto smart 6749
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	Leica	STELLARIS 5
DMEM 고포도	VivaCell	C3113-0500	고포도당, 피루브산 나트륨 및 L-글루타민
동적 회전 유변계	TA Instrument	Discovery HR-20
식도 평활근 세포	보 대학교 건강 과학 센터 세포 생물학 및 재생 의학과에서 공급	식도
		F9070L
플루오레세인 이소티오시아네이트 표지 팔로이딘	Solarbio Life Science	CA1610	300T
젤라틴 메타크릴레이트	EFL	EFL-GM-60	60% 치환
k-카라기난	알라딘	C121013-100g	시약 등급
리튬 페닐(2,4,6-트리메틸벤조일) 포스피네이트	알라딘	L157759-1g	365~405nm
Live-Dead 키트	beyotime	C2015M
마이크로플레이트 리더	Potenov	PT-3502B
파라포름알데히드	Solarbio 생명 과학	P1110	4%
페니실린/스트렙토마이신	Solarbio 생명 과학	MA0110	100 &급성;
인산염 완충 식염	VivaCell	C3580-0500	pH 7.2-7.4
실크 피브로인 메타크릴레이트	EFL	EFL-SilMA-001	39% 치환
Triton X-100	Solarbio Life Science	T8200
Trypsin-EDTA	VivaCell	C100C1	0.25%, 페놀 레드 없음