Method Article

인간 심장의 다차원 3차원 해부학 연구를 위한 파이프라인

DOI:

10.3791/66817

⸱

June 28th, 2024

 ,  ,  , 
1University of California Los Angeles (UCLA) Cardiac Arrhythmia Center, UCLA Health System, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2Neurocardiology Program of Excellence, UCLA, 3Department of Molecular and Medical Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Crump Institute for Molecular Imaging, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Jonsson Comprehensive Cancer Center, David Geffen School of Medicine at UCLA

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 미시적 및 거시적 규모에 걸쳐 인간의 심장에서 얻은 샘플을 분석하기 위한 포괄적인 파이프라인을 제공합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이식을 거부당한 실패하지 않는 인간 심장에 대한 상세한 연구는 미시적 및 거시적 규모에 걸쳐 구조 분석을 수행할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 이러한 기술에는 조직 투명화(용매가 제거된 장기의 수정된 면역 표지 지원 3차원(3D) 이미징) 및 면역조직화학적 염색이 포함됩니다. Mesoscopic 검사 절차에는 입체 절개 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔이 포함됩니다. 거시적 검사 절차에는 전체 해부, 사진 촬영(애너글리프 및 사진 측량 포함), CT 및 물리적 또는 가상으로 절개된 심장 또는 전체 심장의 3D 프린팅이 포함됩니다. 거시적 검사 전에 심장의 3D 구조 및 생리학적으로 관련된 형태를 유지하기 위해 압력 관류 고정을 수행할 수 있습니다. 인간의 심장을 연구하기 위해 이러한 기술을 조합하여 적용하는 것은 심장의 3D 아키텍처의 맥락에서 관상 동맥 혈관 구조 및 심근 신경 분포와 같은 뚜렷한 해부학적 특징 간의 관계를 이해하는 데 독특하고 중요합니다. 이 프로토콜은 방법론을 자세히 설명하고 인간 심장 해부학 연구의 진행 상황을 보여주는 대표적인 결과를 포함합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

기능이 형태를 따르듯이 심장의 구조를 이해하는 것은 심장의 생리학을 이해하는 데 필수적입니다. 수많은 연구에서 미시적 규모에서 거시적 규모에 이르기까지 심장 해부학이 밝혀졌지만 1,2,3 특히 인간의 심장 해부학과 관련된 여러 질문은 해결되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이는 부분적으로는 기능적 해부학에 초점을 맞춘 기초 연구가 일반적으로 인간의 심장 1,7,8과 구별되는 동물의 심장 4,5,6을 활용했기 때문이다. 더욱이, 각 개별 연구는 심지어 인간의 심장 샘플을 사용하는 연구조차도 매우 특정한 구조에 초점을 맞추는 경향이 있어 연구 결과를 전체 심장의 맥락에서 적용하기가 어렵습니다. 이것은 초점이 맞춰진 구조가 perinexus9 및 ganglionated plexus10와 같은 마이크로 또는 중간 스케일에 있는 경우 더욱 그렇습니다.

이러한 맥락에서, 이식을 거부당한 인간 심장에 대한 체계적인 구조 연구는 미시적 및 거시적 규모에 걸쳐 초점을 맞춘 심장 구조에 대한 포괄적인 아틀라스를 얻을 수 있는 독특하고 드문 기회를 제공한다11. 현미경 검사 프로토콜에는 조직 투명화(용매 세척 장기의 수정된 면역 라벨링 지원 3차원(3D) 이미징, iDISCO+)12,13 및 면역조직화학적 염색이 포함됩니다. Mesoscopic 검사 프로토콜에는 입체 해부, 매크로 사진 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캐닝이 포함됩니다. 거시적 검사 프로토콜에는 총 해부14, 사진술(입체 문자 및 사진 측량 포함)15,16,17, CT, 가상 절개18, 물리적 또는 가상으로 절개된 심장 또는 전체 심장의 3D 프린팅17이 포함된다. 거시적 검사를 준비하기 위해, 심장의 3D 구조 및 생리학적으로 관련된 형태를 유지하기 위해 압력 관류 고정을 수행한다 14,19,20,21. 이러한 기술의 결합 적용은 인간 심장의 3D 아키텍처의 맥락에서 뚜렷한 해부학적 특징을 상호 연관시키는 데 독특하고 중요합니다.

비병리학적인 인간 심장 샘플을 얻을 수 있는 기회가 극히 제한적이기 때문에, 본원에 기술된 멀티-스케일 접근법은 샘플의 사용을 극대화한다. 아래에 설명된 다양한 절차를 적용함으로써, 대표적인 결과는 과학적 연구11 에서의 발견(심장 신경 분포에 대한 포괄적인 분석, 신경절 신경총 분포), 임상 절차의 개선(수술 및 중재적 접근을 위한 시뮬레이션) 및 해부학 교육(심장 해부학의 실제 3D 시연)을 포함하여 연구 결과가 다양한 목적으로 활용될 수 있는 방법을 독자에게 보여줄 것입니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 실패하지 않은 기증자의 심장에서 수집한 비식별화된 조직 샘플을 사용했으며 UCLA(University of California, Los Angeles)의 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 샘플은 이식을 위해 거부된 실패하지 않는 심장에서 얻었습니다. 심장을 압력 관류하고 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정하고 다음 방법에 따라 조직 처리 전에 이미지를 촬영했습니다. 그림 1 은 연구 순서의 순서도를 요약한 것입니다. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 마이크로 스케일 검사

  1. iDISCO+(Modified Immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs) 프로토콜을 사용한 조직 투명화.
    1. 컨포칼 현미경 검사를 위해 3mm × 16mm × 25mm 챔버 내에 맞도록 메스로 4% PFA 고정 조직을 절개합니다. 더 두꺼운 조직을 이미지화하기 위해 추가 챔버 및/또는 스페이서를 슬라이드에 쌓을 수 있습니다.
    2. 등급이 매겨진 메탄올(MeOH) 시리즈(탈이온화된 H2O[vol/vol]에서 20%, 40%, 60%, 80% 및 100% MeOH)를 사용하여 교반과 함께 실온(RT)에서 각각 1시간 동안 표본을 탈수합니다.
    3. RT에서 100% MeOH로 1시간 동안 세척하고 RT에서 66% 디클로로메탄/33% MeOH에 밤새 교반하면서 담급니다.
    4. 다음날 RT에서 1시간 동안 MeOH(100%)로 두 번 세척하고 4°C에서 냉각한 다음 4°C에서 밤새 MeOH(vol/vol)에서 5% H2O2 로 처리합니다.
    5. 등급이 매겨진 MeOH 시리즈(80%, 60%, 40% 및 20% MeOH)로 재수화하고 교반과 함께 RT에서 각각 1시간 동안 0.01mol/L PBS로 세척합니다.
    6. RT에서 0.2% Triton X-100을 사용하여 0.01mol/L PBS로 조직을 1시간 동안 두 번 세척합니다.
    7. 0.01 mol/L PBS, 20% dimethyl sulfoxide(DMSO), 0.2% Triton X-100 및 0.3 mol/L 글리신을 교반과 함께 37°C에서 2일 동안 투과시켜 면역 표지를 준비합니다.
    8. 10% DMSO, 0.2% Triton X-100 및 5% 일반 당나귀 혈청이 포함된 0.01mol/L PBS를 교반과 함께 37°C에서 2일 더 차단합니다.
    9. 0.01 mol/L PBS에 10mg/mL 헤파린(PTwH), 0.2% 트윈-20, 5% DMSO 및 3% 일반 당나귀 혈청으로 희석한 형광단에 접합된 MeOH와 호환되는 1차 항체가 있는 라벨입니다.
    10. 항체 용액을 보충하고 교반하면서 37°C에서 3-4일 더 배양합니다.
    11. 1 차 항체 용액에서 1 주일 배양 후 RT에서 밤새 PTwH로 4-5 회 세척합니다.
    12. PTwH, 3% 정상 당나귀 혈청에 희석된 형광단에 접합된 2차 항체로 교반과 함께 37°C에서 3일 동안 배양합니다.
    13. 2차 항체 용액을 보충하고 교반하면서 37°C에서 3일 더 배양합니다.
    14. 2차 항체 용액에서 6일 배양 후 RT에서 하룻밤 동안 PTwH로 세척합니다.
    15. 등급이 매겨진 MeOH 시리즈(20%, 40%, 60%, 80%, 100% 및 100% MeOH)로 탈수합니다. 샘플은 RT에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다.
    16. 66% 디클로로메탄/33% MeOH에서 교반과 함께 RT에서 3시간 동안 배양합니다.
    17. 100% 디클로로메탄으로 교반하면서 RT에서 15분 동안 두 번 세척합니다.
    18. 표본을 배양하고 벤질 에테르에 보관합니다. 공기가 시료를 산화시키는 것을 최소화하기 위해 튜브를 채우십시오.
  2. 이미징 조직 투명 표본
    1. 접착제가 들어있는 챔버를 슬라이드에 부착하고 챔버 둘레에 매니큐어를 바릅니다. 더 두꺼운 조직의 경우 추가 챔버 및/또는 스페이서를 슬라이드에 쌓을 수 있습니다.
    2. 투명한 조직을 챔버에 넣고 벤질 에테르로 채우고 커버슬립을 적용합니다.
    3. 커버슬립 주위에 매니큐어를 바르고 밀봉합니다.
    4. 5x 또는 10x 렌즈가 있는 정립 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 타일스캔 및 Z 스택 이미지를 획득하여 렌즈의 작동 거리까지 깊이에서 이미지를 얻을 수 있습니다.
    5. 1024 x 1024 해상도의 이미지: 사용된 형광단의 방출 스펙트럼에 적합한 레이저 라인을 사용합니다. 근육 자가형광은 488nm 레이저 라인을 사용하여 볼 수 있습니다.
    6. z축 스텝 크기가 지정된 대물렌즈11의 개구수를 기반으로 하는 나이퀴스트 샘플링에 적합한지 확인합니다.
    7. 이미지를 스티칭하고 3D 시각화를 위한 소프트웨어를 사용합니다.
    8. 개별 채널 및 병합된 채널에 대한 Z 스택의 MIP(Maximum Intensity Projection) 이미지를 사용하여 그림을 만듭니다(그림 2).
  3. 면역조직화학(Immunohistochemistry)
    참고: 조직을 파라핀으로 포매한후 22, 다음 절차를 사용하여 면역조직화학 연구를 위한 슬라이드를 만듭니다.
    1. 굴절률 정합 용액(RIMS) 준비.
      1. 탈이온화된H2O에 10.9g의Na2HPO4(무수) 및 3.1g의 NaH2PO4(일수화물) 3.1g을첨가하여 총 부피 1L(pH 7.4)가 되도록 인산염 완충액을 제조합니다. 용액을 여과 멸균하여 RT에 보관합니다.
      2. 인산염 완충액을 0.02mol/L로 희석합니다.
      3. 증발 및 오염을 최소화하기 위해 밀봉될 수 있는 최종 저장 병에 자석 교반 막대로 용액을 10분 동안 저어 0.02mol/L 인산염 완충액 30mL에 Histodenz를 용해합니다.
      4. 아지드화나트륨을 총 농도 0.01%(w/v)로 첨가하고 NaOH로 pH를 7.5로 조정합니다.
      5. Histodenz의 최종 농도를 변경하여 RI를 조정합니다.
      6. RIMS를 RT에 몇 달 동안 보관합니다. 미생물 오염이 발견되면 폐기하십시오.
        알림: 아지드화나트륨이 포함된 용액을 고압멸균하지 마십시오.
    2. 면역조직화학적 연구를 위한 슬라이드 준비
      1. 마이크로톰으로 5μm 두께의 단면을 만듭니다. 충전된 슬라이드에 조직 절편을 적용합니다.
      2. 슬라이드를 >75% 크실렌에 10분 동안 배양하여 파라핀을 제거합니다. 슬라이드를 크실렌이 있는 두 번째 용기로 10분 더 이동합니다.
      3. 슬라이드를 100% EtOH에 10분 동안 담근 다음 95% EtOH에 5분 동안, 70% EtOH에 5분 동안 담가 크실렌을 제거합니다.
      4. 탈이온화된 H2O로 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다.
      5. 슬라이드를 항원 회수 완충액에 25-90°C에서 95분 동안 담그십시오.
      6. 용기를 교반하여 1시간 동안 RT로 냉각시킵니다.
      7. 슬라이드를 담그는 완충액(0.01mol/L PBS + 0.4% Triton X-100)에 4°C에서 30분 동안 담급니다.
      8. PAP 펜으로 조직을 둘러쌉니다. 각 슬라이드에 PBS를 추가하고 건조를 방지하기 위해 가습 챔버에 넣습니다.
      9. RT에서 PBS로 슬라이드를 5분 동안 교반하면서 세척합니다.
      10. 차단 완충액(0.01mol/L PBS + 10% 당나귀 혈청 + 0.1% TX-100)으로 교반하면서 1시간 동안 차단합니다.
      11. 차단 완충액에 희석한 1차 항체로 4°C에서 밤새 배양합니다.
      12. 다음 날, 슬라이드를 15분 동안 RT로 데우십시오.
      13. 0.01 mol/L PBS + 0.2% TritonX-100으로 5분 동안 슬라이드를 3회 세척합니다.
      14. 차단 완충액에 희석한 2차 항체로 교반과 함께 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
      15. 0.01 mol/L PBS + 0.2% TritonX-100으로 5분 동안 슬라이드를 3회 세척합니다.
      16. 0.01mol/L PBS로 슬라이드를 3분 동안 5회 세척합니다.
      17. 스포이드로 RIMS 1방울을 떨어뜨리고 커버슬립을 바릅니다.
      18. 커버슬립 주위에 매니큐어를 바르고 씰을 만듭니다.
      19. 음성 대조군으로, 특정 염색이 없음을 입증하기 위해 1차 항체 없이 검체를 실행합니다.
    3. 이미징 면역염색 슬라이드
      1. 10x, 20x 및 40x 대물 렌즈가 있는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 슬라이드를 이미지화합니다.
      2. 사용된 2차 항체의 방출 스펙트럼에 적합한 레이저 라인을 사용하여 1024 x 1024 해상도로 이미지화.
      3. 개별 채널 및 병합된 채널에 대한 Z 스택의 MIP(Maximum Intensity Projection) 이미지를 사용하여 그림을 만듭니다(그림 3).

2. 중간 규모 검사

  1. 입체 해부
    1. 클램프가 있는 돋보기 책상 램프, 수술용 망원경 또는 실체현미경을 사용하여 방실 결절, 방실 결절 동맥 및 심장 신경총(서브밀리미터에서 밀리미터 단위)과 같은 작거나 얇은 구조에 초점을 맞춘 섬세한 절개를 수행합니다.
  2. Micro-CT 스캐닝
    참고: CT 영상은 압력 관류 및 고정 후 그리고 마이크로 양전자 방출 단층 촬영(PET)/CT 스캐너를 사용하여 절개의 모든 단계에서 수행됩니다(그림 4).
    1. 샘플 이미징 전에 CT X선 소스를 25분 동안 예열합니다.
    2. 심장 샘플을 스캐너 베드에 놓습니다.
    3. 스캐너 베드를 수평 544mm, 수직 14mm로 이동하여 CT 시야(FOV)에서 심장을 중앙에 놓습니다.
    4. 200 μm의 공간 분해능에서 1분 스캔 시간 동안 720개의 투영으로 80kVp, 150μA에서 CT 이미지를 획득합니다.
    5. 12cm x 12cm x 10cm 시야각과 600 x 600 x 500 복셀의 행렬로 CT 데이터를 재구성하고 DICOM 파일로 저장합니다.

3. 거시적 심사

  1. 압력 관류 및 고정
    참고 : 저자는 이전에 설명 한 압력 관류 및 고정 기술을 수정하여 이식을 거부 한 실패하지 않는 인간 심장에 적용합니다 14,19,20,21.
    1. 관류 고정을 위해 고유량 펌프를 사용하십시오. 정착제에는 100% 에탄올14, 4% PFA 또는 10% 포르말린을 사용하십시오.
      참고: 심장은 상행 대동맥, 폐 몸통, 대정맥 및 폐 정맥을 가능한 한 원위부로 절제하고 University of Wisconsin Solution23에서 전달하여 회복됩니다.
    2. 우심 및 좌측 심장 관류를 위해 2개의 20-24 Fr 수술용 캐뉼라를 사용합니다. 우심 관류의 경우 상대정맥을 캐뉼레이션하고 3방향 마개에 부착된 Luer-Lock 팁이 있는 반쯤 절단된 12-30mL 크기의 플라스틱 주사기로 폐 줄기 또는 폐동맥에 통풍구를 배치합니다.
    3. 적절한 크기의 잠긴 반절단 플라스틱 주사기 또는 1.5-5.0mL 원심분리기 튜브를 넣은 후 노끈으로 하대정맥과 다른 폐동맥을 폐색합니다.
      1. 왼쪽 심장의 전방 관류를 위해 폐 정맥 중 하나를 캐뉼레이션하고 대동맥의 원위 절단 끝에 통풍구를 배치하여 3방향 마개에 부착된 Luer-Lock 팁이 있는 반쯤 절단된 12-30mL 크기의 플라스틱 주사기를 배치합니다.
      2. 왼쪽 심장의 역행성 관류를 위해 대동맥 아치 가지 중 하나를 캐뉼레이션하고 대동맥 아치의 다른 가지에 통풍구를 배치합니다. 캐뉼라의 끝을 양쪽 심실에 놓습니다.
    4. 적절한 크기의 잠긴 반컷 플라스틱 주사기 또는 1.5-5.0mL 미세 원심분리기 튜브를 삽입한 후 꼬기로 다른 용기 구멍을 막습니다. 얇은 거즈를 사용하여 주사기/튜브/캐뉼라의 삽입 부분을 덮어 누출 및 미끄러짐을 방지하십시오. 봉합사, 밴딩 또는 클럼핑을 사용하여 큰 누출을 수정하십시오. 작은 누출은 허용됩니다.
    5. 플라스틱 용기에 심장을 매달아 놓습니다.
    6. 22-24 Fr 연질 플라스틱 튜브를 각 캐뉼라에 연결하고 튜브의 다른 쪽 끝을 고정액으로 채워진 용기에 삽입합니다.
    7. 우심실의 경우 약 100-300mL/min, 좌심실의 경우 200-400mL/min으로 설정된 고유량 펌프를 사용하여 우심실에서 각각 약 20mmHg, 좌심실에서 약 80mmHg를 달성하여 우심실과 좌심실 회로를 통해 고정액을 순환시킵니다.
    8. 4시간 동안 24°C에서 관류를 유지합니다.
    9. 0.01mol/L PBS로 30분 동안 교반하면서 4회 심장을 세척합니다.
    10. 심장을 4°C에서 0.01mol/L PBS/0.02% 아지드화나트륨에 보관합니다.
      알림: 압력 관류 고정은 방부 처리된 시체에서 회수된 심장이 아닌 신선한 심장에만 효과적입니다.
  2. 총체적 해부
    1. 각 해부 단계에서 사진 기록으로 점진적 해부를 수행합니다.
    2. 임상적 타당성을 유지하려면 심장의 생리적 형태를 유지하기 위해 구조를 왜곡/변형하지 않도록 특별한 주의를 기울이십시오.
    3. 우측 전방 경사 방향과 같이 임상적으로 관련된 방향을 사용하여 구조를 표적으로 표시합니다.
  3. 사진술
    1. 여러 갈래가 장착된 플랫폼과 360도 회전할 수 있는 기능이 있는 삼각대에 압력 관류 및 고정 심장을 놓습니다.
    2. 디지털 일안 반사식 카메라(그림 5)24 를 사용하여 심장 사진을 찍으면서 C-스탠드에 설정된 여러 발광 다이오드 조명 패널과 넓은 검은색 듀베틴 배경 천을 사용합니다.
    3. 피사체의 왜곡을 최소화하기 위해 200-4피트의 작동 거리에서 긴 초점 거리(6mm)의 렌즈를 사용하여 촬영합니다14.
  4. 애너글리프
    1. 입체 문자 이미지를 표시하려면 CT 데이터 세트에서 수평면의 회전 각도가 10° 차이인 한 쌍의 사진 또는 볼륨 렌더링 이미지를 재구성합니다.
    2. 스테레오그램(stereogram)이라고 하는 이러한 2차원(2D) 이미지 세트를 프리웨어16을 사용하여 애너글리프로 변환합니다.
    3. 입체 문자를 보려면 빨간색/청록색 안경을 사용합니다.
  5. 사진 측량
    참고: 사진 측량은 다양한 각도에서 촬영된 여러 개의 2차원 사진으로부터 3차원 표면 렌더링 재구성을 생성하는 응용 과학입니다17.
    1. 샘플을 C-Stand에 매달아 놓거나 회전 테이블에 올려 놓으면 스마트폰으로 수백 장의 다방향 사진을 얻을 수 있습니다.
    2. 시중에서 판매되는 소프트웨어를 사용하여 FBX 형식으로 3D 모델을 생성합니다.
  6. CT 스캔
    알림: CT 스캔은 압력 관류 및 고정 후 및 박리의 모든 단계에서 수행할 수 있습니다.
    1. 용기 상단을 가로질러 놓인 막대에서 심장 샘플을 매달아 놓습니다. 스캔하는 동안 심장이 흔들리는 것을 방지하려면 용기 바닥에 고정된 플라스틱 갈래로 심장 바닥을 지지합니다. 따라서 공기는 음의 대비로 작용합니다.
    2. 튜브 전압 120kV, 튜브 전류 800-900mA, 갠트리 회전 280ms의 매개변수와 함께 시중에서 판매되는 다중 검출기 행 CT 스캐너를 사용하여 CT 스캔을 수행합니다. 투여 길이 제품은 일반적으로 500-1200 mGy.cm 입니다.
    3. 다음 매개변수를 사용하여 축 이미지 데이터를 재구성합니다: 단면 두께, 0.6mm; 증분 간격, 0.3mm; 가능한 한 작은 시야(일반적으로 100-200mm); 및 매트릭스, 512 × 512.
  7. 가상 해부
    1. 가상 해부 이미지를 생성하기 위해 상용 소프트웨어를 사용하여 CT 스캔 이미지를 분석합니다.
      주의: 가상 해부는 체적 렌더링 과정의 수정으로, 초점이 심장 챔버 및 혈관의 벽으로 이동된다(18). 이 과정에서 수동 임계값 설정은 원래 데이터 세트에서 향상된 챔버를 가상으로 제거합니다.
    2. 가상 해부로 강화되지 않은 벽, 격막 및 밸브를 시각화하여 총 해부와 유사한 이미지를 생성합니다. 심장 표본의 전체 해부와 달리, 가상 해부 중 절단면은 실질적으로 무제한입니다. 필요에 따라 관심 있는 구조를 시각화하기 위해 거의 모든 보기를 다시 만들 수 있습니다.
  8. 3D 프린팅
    1. 3D 프린터 소프트웨어에서 심장 샘플의 호환 가능한 파일을 엽니다.
    2. 3D 프린터의 인쇄 설정에 0.10mm Fast DETAIL 프로파일을 사용하고 인쇄 속도를 20mm/s로 줄입니다. 지원 자료 생성을 활성화합니다.
    3. 3D 프린터의 "필라멘트 설정"에 TPU 필라멘트의 프로파일 을 사용합니다.
    4. 프로를 사용하십시오.file 프린터의 "프린터 설정"을 위해 Original Prusa MK4 Input Shaper 0.4 노즐 을 사용합니다.
    5. 슬라이싱이 완료되면 3D 인쇄를 위해 BGCODE 파일을 USB 플래시 드라이브에 저장합니다.
    6. 1.75mm TPU 필라멘트를 사용하여 인간의 심장 샘플을 3D 프린팅할 수 있습니다. 3D 프린팅 전에 필라멘트 건조기를 사용하여 TPU 필라멘트를 6시간 동안 건조시킵니다.
    7. 3D 프린팅 중 필라멘트 장력을 줄이려면 필라멘트 스풀 회전을 용이하게 하기 위해 베어링이 내장된 스풀 홀더에 필라멘트 스풀을 놓습니다. 질감이 있는 분말 코팅된 강판이 있는 시중에서 판매되는 3D 프린터를 사용하여 3D 프린팅을 수행합니다.
    8. 3D 프린팅이 완료되면 서포트 재료를 조심스럽게 제거하십시오.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마이크로 스케일 검사
조직 투명화를 적용하면 컨포칼 현미경을 사용하여 더 많은 양의 조직을 3D로 이미징할 수 있습니다. 심장에서는 심장 뉴런을 포함하는 신경절과 심근 신경 분포의 신경 패턴을 시각화할 수 있습니다(그림 2). 그림 3 은 신경 및 평활근 세포에 대해 면역이 염색된 인간 좌심실 심근의 컨포칼 이미지를 보여줍니다. 혈관은 심근을 가로지르는 것으로 알려져 있으며, 혈관과 관련되어 있거나 혈관과 독립적으로 수많은 신경 섬유가 확인됩니다.

중규모 및 거시적 검사
24시간 압력 관류 및 고정을 위해 앱솔루트 에탄올을 사용할 때 샘플의 자연스러운 색상이 표백되고 조직이25 탈수되며 탄성이 크게 감소합니다. 반면에 PFA와 포르말린을 결합하면 자연스러운 색상과 탄력이 현저하게 유지됩니다. 이러한 이유로 PFA 또는 포르말린이 주로 선호되는 정착제로 사용됩니다.

그림 6 은 총 해부, 가상 해부, STL 다각형 모델 및 3차원 인쇄의 대표 이미지를 보여줍니다. 그림 7 은 총체적 해부 이미지와 가상 해부 이미지 모두에서 생성된 입체 문자의 대표 이미지를 보여줍니다. 깊이 인식은 입체 안경으로 얻을 수 있습니다. 캡처된 단일 사진 측량 모델은 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 거의 모든 방향에서 관찰할 수 있으며 일상적인 경피적 심장 시술과 관련된 복잡한 해부학적 특징을 보여줍니다. 이러한 기술을 압력 관류 및 고정으로 준비된 심장에 적용하면 심장에 대한 3차원 정보를 디지털 또는 물리적으로 거의 영원히 보관하고 경계 없이 공유할 수 있습니다. 그림 8 은 이식을 거부한 절개된 심장에서 복제된 50% 스케일의 3D 프린팅을 보여줍니다.

figure-results-1
그림 1: 프로토콜의 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 인간 오른쪽 아트리움의 조직이 제거된 부분. (A) 조직 청소를 위해 절개된 우측 심방신경총(RAGP)이 있는 인간 우심방의 우측 후방 경사도. (B) 조직 투명화 전후의 RAGP 표본. (C) pan-neuronal marker protein protein product 9.5(PGP9.5)로 면역염색된 신경절(화살촉)을 보여주는 인간 RAGP의 iDISCO+ 투명 부분의 최대 강도 투영. 스케일 바는 1cm(A), 5mm(B) 및 500μm(C)입니다. 이 그림은 Hanna et al.11에서 발췌한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 인간 좌심실의 면역염색 슬라이드. 범 신경 마커 단백질 유전자 산물 9.5(PGP9.5) 및 평활근 세포 마커 α-평활근 액틴(αSMA)으로 면역염색된 인간 좌심실 심근 슬라이스의 컨포칼 이미지. 근육 자가형광은 488nm 레이저 라인(녹색)을 사용하여 볼 수 있습니다. 눈금 막대는 50 μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 심장 샘플의 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 이미징. (A) 심장 샘플 이미징을 위한 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 설정. (B) 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 이미징을 위한 사용자 인터페이스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: UCLA 심장 부정맥 센터의 사진 스튜디오 환경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 대동맥 및 승모판 복합체의 총 해부(왼쪽 위), 가상 해부(오른쪽 위), STL 다각형 모델(왼쪽 아래) 및 3차원 인쇄(오른쪽 아래) 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 대동맥 및 승모판 복합체의 총 절개(왼쪽)와 가상 박리(오른쪽)의 애너글리프. 입체 안경(빨간색/청록색)은 깊이 인식을 얻기 위해 필요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-8
그림 8: 심장 샘플의 3차원 프린팅. (A) TPU 필라멘트를 사용한 심장 샘플 3D 프린팅을 위한 3차원(3D) 프린터 설정. (B) 이 연구에 설명된 방법을 사용하여 제작된 대표적인 심장 3D 프린트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 인간의 심장 전체에서 채취한 샘플을 분석하기 위한 포괄적인 파이프라인을 보여줍니다. 대표적인 결과는 단일 심장에 대해 일상적으로 수행되는 미시적 및 거시적 해부학적 검사를 보여줍니다. 인간의 심장 검체는 매우 소중하기 때문에 과학 연구의 발견, 임상 절차의 개선, 전체 심장의 맥락에서 해부학적 상관 관계를 유지하는 해부학 교육 등 다양한 목적으로 여러 프로토콜을 적용하여 검체의 어떤 부분도 낭비하지 않도록 다중 척도 접근 방식이 이상적이고 효과적입니다.

마이크로 스케일 검사와 관련하여 면역 염색 및 현미경 검사는 인간 심장 표본의 세포 구조를 이해하기 위해 적용될 수 있습니다. 여기에서 세포 규모에서 심장 신경 해부학을 연구하기 위한 조직 투명화 및 면역조직화학의 적용이 입증됩니다. 이러한 기법의 사용은 심장 전도 시스템 및 심장 챔버와 같은 관심 구조와 관련하여 심장 신경계 및 심근 신경 분포 패턴의 특성화에 도움이 됩니다. 뛰어난 공간 해상도를 얻을 수 있지만, 특히 조직이 투명화된 표본의 경우 컨포칼 현미경을 사용하는 데 시간이 많이 걸립니다. Lightsheet 현미경 검사는 공간 해상도를 희생하는 대신 이미지 획득 시간을 줄이는 데 사용할 수 있습니다.

중규모에서 거시적 검사와 관련하여, 저자의 기관에서 마이크로 CT 스캐너의 공간 해상도는 10-200 μm 범위입니다. 샘플 크기는 10 μm 스캔의 경우 20 mm, 100-200 μm 스캔의 경우 120 mm로 제한됩니다. 저자의 기관에 있는 Micro-CT 스캐너는 심장 전체를 수용할 수 없습니다. 따라서 저자의 기관에서는 전체 심장 스캔을 위해 600μm 공간 해상도의 임상 CT 스캐너를 사용해야 하지만, 발전으로 전체 심장을 촬영할 수 있는 마이크로 CT 스캐너가 개발될 수 있게 되었습니다2. 광자 계수 CT와 같은 기술 개발은 분명히 더 많은 가능성을 확장할 것입니다. STL 파일의 공간 해상도 개선은 3D 프린팅의 품질을 더욱 향상시키기 위한 첫 번째 단계가 되어야 합니다. 3D 프린팅의 높은 비용은 일상적인 임상 실습에 기술을 적용하는 것을 제한합니다. 모든 스마트폰 애플리케이션에서 생성된 사진 측량 이미지는 개발하기 쉽고 허용 가능한 품질이지만 해상도를 개선하기 위해서는 더욱 정교하지만 비용과 시간이 많이 소요되는 시스템이 필요합니다26. 3D로 시각화하기 위해, 전용 헤드 기어(27,28) 및 홀로그램 모니터(29)를 갖춘 확장 현실은 추가적인 도구들이지만, 또한 더 높은 비용에 의해 제한된다.

요약하면, 미시적 및 거시적 규모에 걸친 포괄적인 구조 분석을 통해 각 구조의 미시적 해부학적 구조와 그 기능적 기여도를 전체 심장의 맥락에서 이해할 수 있습니다. 고해상도 이미징의 발전과 함께 미시적 및 거시적 해부학 사이의 거리가 극적으로 확장되고 있습니다. 심근세포의 전자 현미경 분석 전문가는 승모판 판의 수에 익숙하지 않을 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 심장 형태에 대한 포괄적인 이해를 돕기 위해 과학자들은 전체 숲에 대한 조감도를 유지하면서 각 나무에 대한 더 자세한 정보를 계속 탐구해야 합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 교육과 연구의 발전을 위해 자신의 몸을 기증한 개인들에게 감사드립니다. 연구를 위해 기증자의 심장을 얻을 수 있는 기반을 마련한 OneLegacy Foundation에 감사드립니다. 또한 CT 데이터 수집을 지원해 준 UCLA Translational Research Imaging Center(방사선과)의 Anthony A. Smithson과 Arvin Roque-Verdeflor에게도 감사드립니다. 이 프로젝트는 UCLA Amara Yad Project의 지원을 받았습니다. 연구를 위한 인간 심장 파이프라인을 구축하고 유지해 주신 Kalyanam Shivkumar 박사와 Olujimi A. Ajijola 박사님께 감사드립니다. 연구 운영 관리자인 Amiksha S. Gandhi의 프로젝트 지원에 대한 헌신에 감사드립니다. 이 연구는 NIH 보조금 OT2OD023848 & P01 HL164311 및 Leducq 보조금 23CVD04를 Kalyanam Shivkumar에게, American Heart Association Career Development Award 23CDA1039446을 PH에 수여하고, UCLA Amara-Yad Project (https://www.uclahealth.org/medical-services/heart/arrhythmia/about-us/amara-yad-project)의 지원으로 가능했습니다. 이 연구에 사용된 GNEXT microPET/CT 스캐너는 NIH Shared Instrumentation for Animal Research Grant(1 S10 OD026917-01A1)의 지원을 받았습니다.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x 인산염 완충 식염수Sigma-AldrichP3813
3D 뷰어Microsoft
647 AffiniPure 당나귀 Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Laboratories711-605-152
647 AffiniPure 당나귀 Anti-Sheep IgGJackson ImmunoResearch Laboratories713-605-147
AF Micro-NIKKOR 200 mm f/4D IF-ED 렌즈Nikon
Anti-Actin, α-Smooth Muscle - Cy3 항체Sigma-AldrichC6198
항원 회수 버퍼 (100x EDTA 버퍼, pH 8.0)Abcamab93680
Anti-PGP9.5 (단백질 유전자 제품 9.5)Abcamab108986
Anti-TH (티로신 하이드록스 일라제)Abcamab1542
Anti-VAChT (소포형 아세틸콜린 수송체)Synaptic Systems139 103
벤질 에테르Sigma-Aldrich108014
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA4503-10G
Cheetah 3D 프린터 필라멘트(95A), 1.75mmNinjaTek
커버슬립, 22mm x 30mm, No. 1.5VWR48393 151
Cy3 AffiniPure 당나귀 안티 토끼 IgG잭슨 면역 연구소711-165-152
디클로로 메탄시그마 - 알드리치270997-100ML
디메틸 설폭 시드시그마 - 알드리치D8418-500ML
에탄올, 100 %데콘 실험실2701
글리신시그마 - 알드리치G7126-500G
GNEXT PET/CTSOFIE Biosciences
돼지 장 점막에서 추출한 헤파린 나트륨 염Sigma-AldrichH3149-50KU
HistodenzSigma-AldrichD2158-100G
과산화수소 용액Sigma-AldrichH1009-500ML
이미징 소프트웨어ZeissZEN(블랙 에디션)
이미징 소프트웨어옥스포드 인스트루먼트Imaris 10
iSpacer선진 연구소iSpacer 3mm
KIRI 엔진KIRI 혁신
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경ZeissLSM 880
LEAD-2 - 수직 & 다중 채널 연동 펌프LONGER
Lightview XL Brightech
메탄올 (ACS 인증)Fischer ScientificA412-4
Nikon D850Nikon
NinjaTek NinjaFlex TPU @MK4NinjaTek
Normal 당나귀 혈청Jackson ImmunoResearch Laboratories017-000-121
Original Prusa MK4 3D 프린터Prusa Research
PAP 펜Abcamab2601
파라포름알데히드, 32%전자 현미경 과학15714-S
폴리캠폴리캠
1차 항체
PrusaSlicer 2.7.1Prusa Research
SARA-Enginepita4 mobile LLC
ScaniverseNiantic
2차 항체
SlowFade Gold Antiface MountantInvitrogenS36936
Sodium azide, 5% (w/v)Ricca Chemical Company7144.8-32
SOMATOM Definition ASSiemens Healthcare
Standard Field Surgi-Spec Telescopes, Vision
Stereomicroscope System SZ61OLYMPUS
StereoPhoto MakerMasuji Suto
Superfrost Plus Microscope Slides, PrecleanedFisher Scientific12-550-15
Triton X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ML
크실렌시그마-알드리치534056-4L
Ziostation2Ziosoft, 아민
디자인

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tawara, S. Das reizleitungssystem des säugetierherzens. Eine anatomisch-histologische studie über das atrioventrikularbündel und die purkinjeschen fäden. Jena: Gustav fischer. , https://wellcomecollection.org/works/gnxjxg9e (1906).
  2. Stephenson, R. S., et al. High-resolution 3-dimensional imaging of the human cardiac conduction system from microanatomy to mathematical modeling. Sci Rep. 7 (1), 7188(2017).
  3. Kawashima, T., Sato, F. First in situ 3D visualization of the human cardiac conduction system and its transformation associated with heart contour and inclination. Sci Rep. 11 (1), 8636(2021).
  4. Bojsen-Moller, F., Tranum-Jensen, J. Whole-mount demonstration of cholinesterase-containing nerves in the right atrial wall, nodal tissue, and atrioventricular bundle of the pig heart. J Anat. 108, Pt 3 375-386 (1971).
  5. Zhao, Y., et al. Ganglionated plexi and ligament of marshall ablation reduces atrial vulnerability and causes stellate ganglion remodeling in ambulatory dogs. Heart Rhythm. 13 (10), 2083-2090 (2016).
  6. Chung, W. H., et al. Ischemia-induced ventricular proarrhythmia and cardiovascular autonomic dysreflexia after cardioneuroablation. Heart Rhythm. 20 (11), 1534-1545 (2023).
  7. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: Comparisons with normal human cardiac structure. J Anat. 193, Pt 1 105-119 (1998).
  8. Saburkina, I., Pauziene, N., Solomon, O. I., Rysevaite-Kyguoliene, K., Pauza, D. H. Comparative gross anatomy of epicardiac ganglionated nerve plexi on the human and sheep cardiac ventricles. Anat Rec (Hoboken). 306 (9), 2302-2312 (2023).
  9. Hoagland, D. T., Santos, W., Poelzing, S., Gourdie, R. G. The role of the gap junction perinexus in cardiac conduction: Potential as a novel anti-arrhythmic drug target. Prog Biophys Mol Biol. 144, 41-50 (2019).
  10. Aksu, T., Gopinathannair, R., Gupta, D., Pauza, D. H. Intrinsic cardiac autonomic nervous system: What do clinical electrophysiologists need to know about the "heart brain". J Cardiovasc Electrophysiol. 32 (6), 1737-1747 (2021).
  11. Hanna, P., et al. Innervation and neuronal control of the mammalian sinoatrial node a comprehensive atlas. Circ Res. 128 (9), 1279-1296 (2021).
  12. Rajendran, P. S., et al. Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies. Nature Communications. 10, 1944(2019).
  13. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  14. Mcalpine, W. Heart and coronary arteries: An anatomical atlas for clinical diagnosis, radiological investigation, and surgical treatment. Springer-verlag. , ISBN 13: 9783540069850 (1975).
  15. Mori, S., Shivkumar, K. Stereoscopic three-dimensional anatomy of the heart: Another legacy of dr. Wallace a. Mcalpine. Anat Sci Int. 96 (3), 485-488 (2021).
  16. Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Stereogram of the living heart, lung, and adjacent structures. Tomography. 8 (2), 824-841 (2022).
  17. Sato, T., Hanna, P., Ajijola, O. A., Shivkumar, K., Mori, S. Photogrammetry of perfusion-fixed heart: Innovative approach to study 3-dimensional cardiac anatomy. JACC Case Rep. 21, 101937(2023).
  18. Tretter, J. T., Gupta, S. K., Izawa, Y., Nishii, T., Mori, S. Virtual dissection: Emerging as the gold standard of analyzing living heart anatomy. J Cardiovasc Dev Dis. 7 (3), 30(2020).
  19. Thomas, A. C., Davies, M. J. The demonstration of cardiac pathology using perfusion-fixation. Histopathology. 9 (1), 5-19 (1985).
  20. Glagov, S., Eckner, F. A., Lev, M. Controlled pressure fixation apparatus for hearts. Arch Pathol. 76, 640-646 (1963).
  21. Iaizzo, P. A. The visible heart(r) project and free-access website 'atlas of human cardiac anatomy. Europace. 18, suppl 4 163-172 (2016).
  22. Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. Multiplex immunohistochemistry staining for paraffin-embedded lung cancer tissue. J Vis Exp. (201), e65850(2023).
  23. Tripathy, S., Das, S. K. Strategies for organ preservation: Current prospective and challenges. Cell Biol Int. 47 (3), 520-538 (2023).
  24. Mori, S., Shivkumar, K. Atlas of cardiac anatomy (anatomical basis of cardiac interventions. Vol. 1). Cardiotext. , (2022).
  25. Crosado, B., et al. Phenoxyethanol-based embalming for anatomy teaching: An 18 years' experience with crosado embalming at the university of otago in new zealand. Anat Sci Educ. 13 (6), 778-793 (2020).
  26. Titmus, M., et al. A workflow for the creation of photorealistic 3d cadaveric models using photogrammetry. J Anat. 243 (2), 319-333 (2023).
  27. Silva, J. N. A., Southworth, M., Raptis, C., Silva, J. Emerging applications of virtual reality in cardiovascular medicine. JACC Basic Transl Sci. 3 (3), 420-430 (2018).
  28. Maresky, H. S., et al. Virtual reality and cardiac anatomy: Exploring immersive three-dimensional cardiac imaging, a pilot study in undergraduate medical anatomy education. Clin Anat. 32 (2), 238-243 (2019).
  29. Mori, S., Shivkumar, K. Real three-dimensional cardiac imaging using leading-edge holographic display. Clin Anat. 34 (6), 966-968 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Heart AnatomyThree Dimensional ImagingTissue ClearingConfocal MicroscopyMicro CT ScanningPressure Perfusion FixationImmunohistochemical StainingGross DissectionCardiac Innervation3D Heart Model

Related Articles