흡입된 환경 오염 물질이 마우스의 후각 기능에 미치는 영향 연구

요약

본 논문은 흡입된 환경오염물질 노출이 마우스의 후각 기능에 미치는 영향을 평가하기 위한 매몰식품 검사와 사회적 악취 차별 실험에 대해 자세히 설명한다.

초록

후각 장애는 중요한 공중 보건 문제이며 신경 퇴행성 질환의 위험을 독립적으로 예측합니다. 흡입된 환경 오염 물질에 노출되면 후각이 손상될 수 있습니다. 이에 따라 흡입된 환경오염물질 노출이 후각에 미치는 영향을 평가할 수 있는 방법이 시급히 요구되고 있다. 생쥐는 고도로 발달된 후각 시스템과 행동 특성 때문에 후각 실험에 이상적인 모델입니다. 흡입된 환경오염물질 노출이 마우스의 후각 기능에 미치는 영향을 평가하기 위해 실험 준비, 실험 시설의 선정 및 건설, 시험 과정, 시간 지표 등 상세한 매몰식품 검사 및 사회적 악취 차별 실험을 제공합니다. 한편, 분석의 성공을 보장하기 위해 시간 측정 장비, 작동 세부 사항 및 실험 환경에 대해 논의합니다. 황산아연은 실험적 접근법의 타당성을 입증하기 위한 처리제로 사용됩니다. 이 프로토콜은 흡입된 환경 오염 물질이 마우스의 후각 기능에 미치는 영향을 평가하기 위한 간단하고 명확한 운영 프로세스를 제공합니다.

서론

후각 장애는 주목할 만한 공중 보건 문제로 부상했으며 신경 퇴행성 질환의 위험 증가와 독립적으로 관련이 있습니다. 이 상태는 전반적인 웰빙에 부정적인 영향을 미치고 우울 증상의 발병에 기여하며 삶의 질을 저하시킬 수 있습니다. 그 영향은 음식에 대한 인식의 변화, 사회적 의사소통의 장애, 부정적인 감정의 고조에서 두드러지게 관찰된다¹. 비강 질환, 상기도 감염, 외상성 뇌 손상을 포함한 다양한 요인이 인간의 후각 장애에 기여하는 것으로 간주되어 왔다². 특히, 2%에서 16%에 이르는 것으로 추정되는 PM2.5와 같은 흡입 가능한 환경 오염 물질은 흡입된 공기를 통해 체내로 들어가 비강을 통과하여 특정 후각 전용 영역에 도달하여 3,4,5,6,7 축적됩니다. 최근 연구 결과에 따르면 PM2.5 및 암모니아를 포함한 흡입 가능한 환경 오염 물질은 실제로 후각 감각 뉴런에 해를 끼칠 수 있습니다 ^8,9,10. 그러나 이러한 손상이 후각 기능 장애로 직접 이어지는지 여부를 확인하기 위해서는 추가 검증이 필요합니다. 따라서 흡입 가능한 환경 오염 물질이 후각 기능에 미치는 영향을 세심하게 평가하는 것이 특히 중요합니다.

현재 수많은 연구실에서 후각 기능의 변화를 이해하기 위한 행동 실험을 위한 대안 척추동물 모델로 마우스를 사용하고^있다 11,12,13,14. 생쥐는 척추동물의 화학적 의사소통을 조사하기 위한 선호 모델 시스템으로 선택되었으며, 이는 먹이 찾기와 사회적 의사소통에 중요한 놀라운 후각 민감성을 나타낸다¹⁵. 더욱이, 쥐의 행동을 관찰하고 영향을 미치기 위한 도구들이 지속적으로 발전함에 따라 이 종은 후각 기능 연구에 매우 매력적으로 다가왔다¹⁶.

이 연구에서는 흡입 가능한 환경 오염 물질에 노출된 마우스 모델의 후각 장애를 평가하기 위해 매장 식품 테스트와 사회적 냄새 차별 실험을 사용했습니다. 평가의 정밀도를 높이기 위해 후각 기능을 평가하는 가장 대표적인 방법을 선택했습니다. 우리는 이 방법을 체계적으로 개선하여 단순성과 명확성을 보장함으로써 흡입 가능한 환경 오염 물질에 의해 유발되는 후각 기능 장애의 정도를 효과적으로 측정할 수 있었습니다.

프로토콜

모든 행동 테스트에 수컷 C57BL/6J 마우스(연령: 6-8주, 체중: 20-22g)를 사용했습니다. 마우스는 안정된 조건(즉, 온도, 23 ± 1 °C, 습도, 55% ± 5%, 7:00에 조명이 켜진 상태에서 12/12 시간 명암 주기)에 노출되었습니다. 모든 행동 검사는 10:00에서 17:00 사이에 수행되었습니다. 모든 동물 실험은 칭다오 대학 동물 실험 전문위원회 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 1주일의 적응 기간 후, 모든 쥐는 흡입 가능한 환경 오염 물질에 노출되었습니다.

1. 오염 물질에 대한 노출

1. 점안에 의한 비강 내 투여
   1. 흡입 가능한 환경 오염 물질을 0.9% 식염수에 용해시킵니다. 후각 기능 장애를 일으키는 것으로 입증된 5% 황산아연 용액을 한 번 사용하십시오¹⁷. 대조군 마우스의 경우 0.9% 생리식염수를 투여합니다.
   2. 1% 소듐 펜토바르비탈¹⁸ 의 복강 내 주사로 마우스를 마취하고 발가락 꼬집 반사를 사용하여 마취 깊이를 평가합니다. 건조함을 방지하기 위해 쥐의 눈에 수의사 연고를 바르십시오. 머리가 아래를 향하도록 하여 마우스를 등을 대고 경사진 표면에 놓습니다.
   3. 피펫팅 건을 사용하여 용액 10μL를 마우스의 한쪽 콧구멍에 투여하여 용액을 비강으로 자연스럽게 흡입할 수 있도록 합니다.
   4. 쥐의 건강을 보장하고 잠재적인 불편함을 방지하려면 10분 간격 후에 다른 쪽 콧구멍에 대한 흡입을 반복하십시오.
   5. 마우스에 점안하여 비강 내 투여 후 3일째 되는 날에 매몰된 식품 검사를 실시한다.

2. 매몰식품 시험

1. 테스트 18-24시간 전에 가정용 케이지의 식품 호퍼에서 모든 차우 펠릿을 제거하여 식품 박탈을 수행합니다. 쥐의 침구 재료를 바꾸십시오. 물병을 제거하지 마십시오.
2. 아래 설명에 따라 수술대를 정렬합니다.
   1. 테스트 시작 1시간 전에 마우스가 들어있는 케이지를 수술실로 가져가 휴식을 취합니다.
   2. 이 기간 동안 수술실을 배치하십시오. 투명 PVC 표준 마우스 케이지를 A로 사용하고 표시하면 친숙한 환경을 만들 수 있습니다. 투명한 PVC 표준 다람쥐 케이지인 테스트 케이지를 B로 사용하고 표시합니다. 실험 후 마우스를 배치하는 데 사용되는 일반 케이지를 케이지 C로 표시합니다.
   3. 케이지 A와 B를 3cm의 침구 재료로 덮고 자로 측정합니다. 각 케이지 사이에 0.5m의 거리를 두고 케이지를 나란히 배열합니다(그림 1).
   4. 실험 영역을 반경이 2m인 영역으로 정의하고 중심은 케이지의 중심이 됩니다. 2m 범위를 벗어난 영역을 관찰 영역으로 정의합니다.
   5. 케이지 C와 테스트되지 않은 마우스가 들어있는 케이지는 실험 영역에서 가능한 한 멀리 두십시오.
3. 아래 설명된 대로 음식을 찾는 시간을 기록하십시오.
   1. 케이지 B에서 무작위로 위치를 선택하고 침구 표면에서 1cm 아래에 음식을 묻고 침구 표면을 매끄럽게 합니다.
   2. 마우스를 케이지 A에 4분 동안 넣습니다. 타이밍이 끝나면 마우스를 케이지 B로 옮기고 비디오 장치를 켠 다음 관찰 구역으로 돌아갑니다.
   3. 쥐가 앞발로 음식 블록을 집어 들면 비디오 녹화를 중지하십시오. 어떤 경우에는 쥐가 음식 위로 머리를 구부리고 먹는 것을 볼 수 있습니다. 이 행동은 또한 쥐가 앞발로 음식을 잡고 있지 않은 경우에도 시험 성공을 나타냅니다.
   4. 데이터를 기록합니다. 케이지 B 바닥에 있는 매트와 접촉한 후 각 마우스에 대한 음식이 발견될 때까지의 시간을 기록합니다. 생쥐가 4분 후에도 먹이를 찾지 못하면 발견 시간을 240초의 지연 시간으로 기록합니다.
   5. 테스트 후 마우스를 케이지 C에 넣습니다.
   6. 케이지 B에서 사료를 제거하고 밀봉된 백에 넣습니다. 케이지 B의 식품을 교체하고 아래 설명된 대로 침구 재료를 교체한 후 다음 마우스를 테스트합니다.
      1. 동일한 케이지에 수용된 마우스의 경우 케이지 B에서 동일한 침구 재료 세트로 테스트합니다. 다른 케이지에 있는 쥐의 경우 알코올로 케이지를 청소하고 침구 재료를 교체하십시오.
   7. 실험 후 쥐에게 사료와 물을 추가하십시오. 1일 후에 사회적 악취 차별 실험을 실시합니다.
      참고: 공정 전반에 걸쳐 마스크를 착용해야 하며, 각 마우스가 실험을 마친 후에는 냄새가 교차하지 않도록 투명 장갑을 교체해야 합니다. 마우스 스트레스를 피하기 위해 움직임의 진폭을 가능한 한 작게 유지하십시오.

3. 사회적 악취 차별 실험

1. 소변 채취
   1. 성적으로 성숙한 수컷 마우스와 암컷 마우스의 소변을 별도로 수집하고 동일한 부피의 튜브에 분취한다¹⁹. 각 튜브에 300μL의 소변이 있는 2mL 미세 원심분리기 튜브에 포장합니다.
   2. 사용할 때까지 샘플을 -80 ° C에서 보관하십시오. 해동 후 샘플이 고르게 분포되도록 튜브를 흔듭니다. 샘플을 반복적으로 해동 및 냉동하지 마십시오.
2. 아래 설명에 따라 수술대를 정렬합니다.
   1. 테스트 시작 1시간 전에 마우스가 들어있는 케이지를 수술실로 가져가 휴식을 취합니다.
   2. 이 기간 동안 2.2.2-2.2.5단계에 설명된 대로 수술실을 배치합니다.
3. 아래 설명과 같이 소변을 찾는 시간을 기록하십시오.
   1. 300μL의 남성과 여성의 소변이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브를 담을 수 있을 만큼 충분히 큰 케이지 B의 넓은 두 면 주위에 테이프로 홈을 만듭니다. 튜브를 놓고 지금은 두 개의 튜브 덮개를 닫아 두십시오.
   2. 마우스를 케이지 A에 넣고 4분 동안 카운트다운을 설정합니다. 타이밍이 끝날 때 케이지 B의 두 튜브를 엽니다.
   3. 두 튜브에서 같은 거리에 있는 케이지 B의 중간 위치로 마우스를 옮긴 다음 비디오 녹화 장비를 켜고 부드럽고 천천히 관찰 영역으로 후퇴합니다.
   4. 쥐가 튜브 벽/입 또는 튜브 내부의 냄새를 맡으면 튜브에서 성공적으로 냄새를 맡은 것입니다. 이때 스톱워치를 누르고 튜브 냄새를 맡은 시간(MS)으로 시간을 기록한 다음 마우스가 튜브에서 멀어질 때까지 체류 시간(XXS)을 계속 기록합니다.
   5. 다른 튜브를 스니핑하는 시간을 계속 측정하십시오. 쥐가 튜브 벽/입 또는 튜브 내부의 냄새를 맡으면 튜브에서 성공적으로 냄새를 맡은 것입니다. 스톱워치를 누르고 다른 튜브의 냄새를 맡는 데 걸린 시간(NS)을 기록한 다음 마우스가 튜브에서 멀어질 때까지 체류 시간(YS)을 계속 기록합니다.
   6. 실험이 끝날 때 마우스를 케이지 C로 옮깁니다.
   7. 각 마우스 테스트 후 케이지 B의 소변관과 침구 재질을 교체하십시오. 사용한 쥐 소변은 성별에 따라 깨끗한 봉지에 넣는다.
   8. 장갑을 교체하고 위에서 설명한 대로 다음 마우스를 테스트합니다.
4. 뚜렷한 냄새가 없는 실험실에서 실험을 수행합니다. 강한 냄새가 나는 개인 제품은 피하십시오. 시술 내내 장갑과 마스크를 착용하여 가능한 한 냄새가 나지 않도록 하십시오. 마우스 스트레스를 피하기 위해 움직임의 진폭을 가능한 한 작게 유지하십시오.

결과

흡입 가능한 환경 오염 물질은 쥐의 후각 기능을 손상시킵니다. 소각로와 자동차에서 배출되는 대기 중 아연은 알레르기성 폐 염증을 유발할 수 있는 흡입 오염 물질로 입증되었습니다²⁰. 황산아연은 후각 기능 장애를 일으키는 전형적인 화합물 중 하나로 간주된다²¹. 따라서 비강 내 점안으로 쥐를 노출시키는 치료제로 황산아연을 이용하여 매몰식품 검사와 사회적 악취 판별 실험을 이용하여 시험하고 있습니다. 식품 매장 테스트에서 황산아연에 노출된 쥐가 식품을 찾는 데 대조군에 비해 240초 이상 걸렸습니다(그림 2). 정상적인 후각을 가진 음식이 부족한 쥐는 일반적으로 1분 이내에 묻힌 음식을 찾습니다. 쥐가 후각 기능 장애를 일으켰을 때, 먹이를 찾는 데 더 오래 걸리거나 심지어 음식을 찾을 수 없었다. 대조군에 비해 노출된 그룹의 쥐는 먹이를 찾는 데 더 오래 걸렸으며, 240초 이내에 음식을 찾지 못한 경우도 있어 후각 기능 손상을 나타냈다.

사회적 악취 차별 실험에서도 비슷한 결과가 관찰되었다. 황산아연에 노출된 마우스에서는 설정된 관찰 시간 동안 수컷이나 암컷 소변 모두 냄새를 맡을 수 없었습니다(그림 3A). 설정된 시간을 넘어 황산아연에 노출된 마우스는 잠시 암컷과 남성의 소변 냄새를 맡았지만, 냄새를 맡는 시간은 대조군 마우스보다 현저히 짧았습니다(그림 3B). 동일한 양의 암컷 소변과 수컷 소변이 동시에 제시될 때, 수컷 쥐는 일반적으로 암컷 소변을 선호한다²². 노출된 그룹의 쥐는 암컷과 수컷의 소변을 구별하는 데 더 오랜 시간이 필요하거나 심지어 구별할 수 없었습니다. 구체적으로, 대조군에 비해 노출된 그룹의 마우스는 소변 냄새를 맡는 데 더 오랜 시간을 보냈고, 소변 근처에서 더 짧은 시간을 보냈다.

그림 1: 작업 테이블 레이아웃. 케이지 A와 B는 0.5m의 거리를 유지했습니다. 비디오 녹화 장비는 케이지 B 위에서 휴대폰 홀더에 의해 제어되었으며, 비디오 필드는 케이지의 내부 환경을 기록하도록 조정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 매립된 식품 테스트 결과. 먹이를 찾기 위해 황산아연에 노출된 대조군 마우스와 마우스의 통계적 분석. 대조군의 생쥐는 30초 이내에 먹이를 찾았고, 황산아연에 노출된 생쥐는 240초 이상 먹이를 찾았으며, 이는 240초로 계산되었습니다. 두 그룹 간의 차이를 비교하기 위해 독립적인 표본 t-검정을 사용했습니다. 데이터는 평균 ± SD(n = 그룹당 마우스 3개)로 표시됩니다. ** P < 0.01. 어떤 동물이 240초 후에도 먹이를 찾지 못하면, 처리된 모든 동물의 경우와 마찬가지로 먹이를 찾는 데 걸리는 시간은 240초로 기록되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 사회적 악취 차별 실험. (A) 대조군 마우스와 소변을 찾기 위해 황산아연에 노출된 마우스의 통계적 분석. 대조군의 생쥐는 30초 이내에 소변을 찾았고, 황산아연에 노출된 생쥐는 암컷 또는 수컷 소변을 찾는 데 240초 이상을 보냈으며, 이는 240초로 계산되었습니다. 어떤 동물이 240초 후에도 소변 바이알을 찾지 못하면 처리된 모든 동물의 경우와 마찬가지로 바이알을 찾는 데 걸리는 시간은 240초로 기록되었습니다. (B) 황산아연에 노출된 대조군 마우스와 마우스에 대해 소변과 접촉하는 체류 시간을 통계적으로 분석하였다. 두 그룹 간의 차이를 비교하기 위해 독립적인 표본 t-검정을 사용했습니다. 데이터는 평균 ± SD(n = 그룹당 3개의 마우스)로 표시됩니다. ** p < 0.01, * p < 0.5. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 기사에서는 생쥐의 후각 장애를 신속하게 평가하기 위해 고안된 두 가지 기본 프로토콜을 소개합니다. 다양한 흡입 가능한 환경 오염 물질은 마우스에서 뚜렷한 수준의 후각 기능 장애를 초래합니다. 매립식품 검사는 휘발성 냄새를 감지하는 능력을 평가하기 위해 사용되며, 사회적 악취 차별 실험은 다양한 사회적 냄새를 식별하고 구별하는 동물의 능력을 평가합니다. 이 프로토콜은 환경 오염 물질이 후각 기능에 미치는 독성 영향을 평가하는 역할을 합니다.

오존, 암모니아 및 디젤 배기 가스를 포함한 흡입 된 환경 오염 물질은 샘플 냄새를 맡는 동안 마우스의 후각 인식에 영향을 줄 수있는 냄새를 가지고 있습니다^23,24. 노출이 끝난 직후 마우스에서 행동 실험을 수행하면 잠재적으로 위음성 결과가 나올 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다²². 이러한 우려를 해결하기 위해 실험의 신뢰성을 높이기 위한 조치를 시행했습니다. 특히, 케이지를 철저히 청소하고 노출 기간 후에 침구 재료를 교체했습니다. 이어서, 노출 후 24시간 간격으로 행동 실험을 수행하였다²². 이 절차 조정은 정확하고 의미 있는 결과를 보장하는 것을 목표로 합니다.

음식 매장 실험에서 핵심 매개변수는 쥐가 숨겨진 음식을 찾는 데 걸리는 시간이었습니다. 스트레스를 받은 마우스는 테스트 중에 활동이 증가하고 집중력이 떨어지는 경향이 있으며, 이는 잠재적으로 위양성 결과로 이어질 수 있다는 점에 유의할 가치가 있습니다 25,26,27,28. 따라서 테스트 단계에서 마우스가 침착함을 유지하고 과도한 스트레스를 받지 않도록 하는 것이 중요합니다. 잠재적인 간섭을 피하기 위해, 실험 1시간 전에 마우스를 하우징에서 테스트 영역으로 옮겼습니다. 이 단계는 쥐가 적응하고 스트레스를 줄일 수 있도록 하기 위해 취해졌습니다. 정확한 시간 기록을 용이하게 하기 위해 생쥐를 실험 케이지 B에 소개했을 때 비디오 레코더가 활성화되었고, 관찰자는 즉시 관찰 구역으로 후퇴했습니다. 관찰자는 케이지에서 2m의 최적 거리에 배치되어 방해를 일으키지 않고 선명한 관찰을 보장했습니다. 성공적인 먹이 발견을 식별하기 위한 기준에는 쥐가 앞발을 사용하거나 먹이 위로 머리를 구부린 사례가 포함되었습니다. 두 행동 모두 먹이를 찾는 것을 나타내는 것으로 간주되었으며, 널리 받아들여지는 기준에 부합했다¹⁹. 동일한 용량군 내의 여러 마우스에 대한 테스트가 필요한 경우, 원래의 사육 케이지로 돌려보내지 않고 임시로 일반 케이지 C에 배치하도록 했습니다. 같은 우리에 있는 모든 쥐를 테스트한 후에만 원래 서식지로 집단적으로 돌아갔습니다. 테스트된 식품의 잠재적인 냄새를 감안하여 사전에 밀폐 백에 보관하고 사용 후 다시 밀봉하거나 밀폐 용기에 넣기 위한 예방 조치를 취했습니다. 이러한 조치는 실험 조건의 무결성을 유지하고 신뢰할 수 있는 결과를 보장하기 위해 구현되었습니다.

사회적 악취 차별 실험에서는 성적으로 성숙한 마우스에서 유래한 소변 샘플을 활용하는 것이 필수적이다¹⁹. 성적 성숙도의 결정은 마우스의 나이를 기반으로 하며, 이는 다양한 마우스 균주에 따라 달라지는 매개변수입니다. 채취 후에는 남성의 소변과 여성의 소변을 따로 -80°C의 냉장고에 보관하는 것이 좋습니다. 이전 연구에서는 타이밍 목적으로 스톱워치를 사용했습니다. 그러나 이 방법은 관찰자가 실험 케이지에서 상당한 거리에 위치하는 등의 한계가 있어 불분명한 관찰 및 부정확한 타이밍과 같은 잠재적인 문제로 이어졌습니다 19,22,29. 이러한 문제를 해결하기 위해 스톱워치 대신 비디오 장비를 통합하여 타이밍 절차를 개선했습니다. 이러한 수정은 보다 정확한 데이터 수집을 용이하게 할 뿐만 아니라 여러 실험 그룹에서 데이터를 수집할 수 있도록 합니다.

이러한 실험에서는 생쥐의 행동을 기록하기 위해 비디오 장치를 사용하였는데, 이는 영상의 프레임 속도를 감소시키고 관찰자가 생쥐의 다양한 행동 활동 시간을 보다 정확하게 기록할 수 있게 하는 장점이 있어, 관찰자가 관찰 영역에서 생쥐의 행동을 관찰할 수 없다는 단점을 보완하였다. 그러나 비디오 녹화 장비를 사용하면 분석 시간이 길어진다는 단점이 있습니다. 실험이 끝날 무렵 각 쥐의 다양한 행동 활동 시간을 기록하기 위해 비디오를 다시 시청해야 했습니다. 마우스의 수가 많을 경우 각 마우스의 비디오를 분석해야 하므로 실험실의 노동 부담이 증가합니다.

연구 결과에 따르면 흡입 가능한 다양한 환경 오염 물질이 후각 기능에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이 논문은 흡입 가능한 환경 오염 물질과 관련된 후각 독성을 평가하기 위한 신속하고 복잡하지 않으며 합리적으로 정확한 접근 방식을 소개합니다. 이 방법은 인간 피험자의 환경 오염 물질로 인한 후각 기능 장애에 대한 위험 평가를 수행하는 데 중요합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5-10 &무; 엘  조정 가능한 마이크로 피펫	Eppendorf, Germany	3123000225	비강 내 점안
0.9 % 식염수 Solarbio		7647-14-5	오염 물질 용해
무수 황산 아연	Macklin	7733-02-0	마우스
노출 원심 분리기 튜브 (2 mL)	Biosharp Incorporated	BS-20-M	장소 소변
전자 저울	Changzhou Ohaus Co.	EX125DZH	무게 마취제 및 오염물질
GraphPad Prism	GraphPad 소프트웨어	8.0.1	통계 분석
휴대용 먼지 탐지	TSI  통합	DuatTrak 8532	흡입에 노출된 쥐
비디오 녹화 장비	Apple Inc.	iPhone 6s Plus	생쥐의 활동 시간을 기록했습니다
Vortex mixer	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.	소용돌이-5	혼합 용액