이 논문은 쥐에서 신경절 후 요추 교감신경 신경을 외과적으로 제거하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차는 원위 조직 표적에서 교감신경 분포의 역할을 조사하기 위한 다양한 연구를 용이하게 할 것입니다.
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이 논문에서
요약
초록
말초 신경 손상은 흔하며, 손상 후 완전한 기능 회복은 환자의 10%에서만 이루어집니다. 교감신경계는 신체의 항상성을 유지하는 데 많은 중요한 역할을 하지만 말초 신경 손상의 맥락에서 연구된 적은 거의 없습니다. 말초의 원위 표적에서 신경절 후 교감신경 신경 기능의 범위는 현재 불분명합니다. 말초 표적의 교감신경 분포의 역할을 더 잘 탐구하기 위해 외과적 "녹아웃(knock-out)" 모델이 대안적인 접근법을 제공합니다. 이는 화학적으로 달성될 수 있지만, 신경절 후 교감신경 뉴런의 화학적 파괴는 비특이적이고 용량에 따라 달라질 수 있습니다. 한때 작은 동물에서는 "사실상 실행 불가능하다"고 여겨졌던 쥐에서 외과적 요추 교감신경 절제술을 사용하면 뒷다리에 신경을 자극하는 신경절 후 교감신경 신경 세포를 특이적으로 표적으로 삼을 수 있습니다. 이 논문은 생존 수술로 쥐의 L2-L5 요추 교감신경절을 외과적으로 제거하는 방법을 설명하고 있으며, 이를 통해 뒷발의 땀 반응과 좌골 신경의 교감신경 축삭 수를 확실하게 감소시킬 수 있습니다.
서론
말초 신경 손상(PNI)은 기능적으로 거의 완전히 회복되지 않는 원위 조직 표적에서 운동, 감각 및 교감신경 결손을 유발할 수 있습니다1. PNI 연구는 종종 운동 및 감각 재생에 초점을 맞추었습니다. 그러나 쥐의 좌골 신경의 거의 4분의 1은 수초화되지 않은 교감신경 축삭돌기로 구성되어있다 2. 그럼에도 불구하고 말초 조직에서 교감신경 분포의 역할은 완전히 이해되지 않았습니다3. 교감신경계는 신체의 항상성을 유지하고 면역 조절, 체온 조절, 혈관 긴장도, 미토콘드리아 생물 발생 등에 관여하는 데 중요한 역할을 합니다 4,5,6,7,8,9,10,11 . 신경근 접합부에서 교감신경 분포가 소실되....
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프로토콜
모든 실험은 에모리 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(IACUC 프로토콜 번호 PROTO201700371에 따라). 이 연구에는 14주 된 16-21g 체중의 성체 암컷 야생형 C57BL/6J 마우스 4마리가 사용되었습니다. 여기에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 수술 전 준비
- 수술 도구를 오토클레이브: 날카로운 가위 1쌍, 끝이 가는 핀셋 2개, 바늘 드라이버 1개.
- 발열 패드를 37°C로 예열하고 수술용 탁자 아래에 놓습니다.
- 마취 유도실을 포함한 수술 부위에 소독제를 뿌리고 종이 타월로 철저히 닦아냅니다.
- 마우스를 다루기 전에 적절한 가운과 손 씻기를 확인하십시오.
- 체중 5mg/kg의 멜록시캠을 마우스에 먹이고, 유도 중 흡인을 피하기 위해 마우스가 약물을 완전히 삼킬 수 있는 충분한 시간을 허용합니다.
- 3L/min의 산소에 1% 이소플루란으로 마취 중인 쥐를 유도합니다(기관에서 승인된 프로토콜에 따름).
- 쥐가 마취되면(발가락....
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결과
이 프로토콜은 쥐에서 신경절 후 요추 교감신경 신경 세포를 외과적으로 제거하는 것을 설명합니다. 두 마리의 쥐는 요추 교감신경 절제술을 받았고, 두 마리의 쥐는 대조군으로 사용되었습니다. 성공적인 외과적 요추 교감신경 절제술을 위해서는 그림 1에서 볼 수 있듯이 최소한 L2 및 L3 양측 요추 교감신경절의 적절한 시각화가 이루어져야 합니다. L4 및 L5 신경절을 제거하면 하체의 완전한 교감신경 변성을 얻을 수 있습니다. 그러나 하부 신경절의 시야는 비뇨생식기 기관에 의해 방해받을 수 있습니다. 이전의 역행 추적 연구에 따르면 L2-L5 신경절에 있는 대부분의 뉴런은 L2 및 L3 신경절에 위치합니다. 대표적인 결과를 얻기 위해 연령이 일치하는 암컷 마우스만 사용되었지만, 이 수술 절차는 수컷과 암컷 마우스 모두에서 여러 번 재현되었으며 고환 또는 난소 동맥 및 교감신경절의 위치 측면에서 유의한 해부학적 차이는 관찰되지 않았습니다.
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토론
요추 교감신경절(lumbar sympathetic ganglia)은 많은 중요한 복부 장기와 큰 혈관 뒤에 위치한 매우 작은 구조입니다. 따라서 이 절차에는 상당한 정밀도와 정확성이 필요합니다. 대부분의 어려움은 수술 중에 교감신경절을 식별하는 데 있습니다. 학습자는 살아있는 쥐에서 이 절차를 시도하기 전에 먼저 쥐 시체에서 신경절을 식별할 수 있는 것이 좋습니다. 문제 해결은 장이 전환된 후 교감신경절을 식별할 때 종종 발생해야 합니다. 적절한 시각화를 보장하려면 내림차순 콜론이 표시되어야 합니다. 복강 외부의 장 전환에는 맹장이 포함되어야 합니다. 또한 방광이 가득 차고 커질 수 있으며, 이로 인해 하행 결장과 하행 복부 대동맥 및 하부 대정맥의 시야를 방해할 수 있습니다. 이상적으로는, 초기 피부 절개를 하기 전에 마우스가 마취된 후 방광을 수동으로 표현합니다. 그러나 방광이 발현되지 않고 수술 중 시야가 차단된 경우에는 2개의 멸균 면 팁 어플리케이터로 부드러운 발현이 가능합니다. 방광의 뒤쪽에 붙어있는 요관이 손상되지 .......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 NIH 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke)의 수상 번호 K01NS124912에 의해 지원되었으며, 일부는 NIH가 자금을 지원하는 Emory Specialized Center of Research Excellence in Sex Differences U54AG062334 및 Emory University School of Medicine의 Medical Scientist Training Program의 개발 보조금으로 지원되었습니다. 좌골 신경을 절개한 포스트바칼로레아(postbaccalaureate)의 David Kim과 연구 전문가인 HaoMin SiMa에게 비디오 촬영을 가능하게 한 실체 현미경용 휴대폰 거치대를 3D 프린팅으로 제작해 주셔서 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5-0 흡수성 봉합사 | CP Medical | 421A | |
| 5-0 나일론 봉합사 | Med-Vet International | MV-661 | |
| 70% 에탄올 | Sigma-Aldrich | E7023-4L | |
| 마취 유도 챔버 | Kent Scientific VetFlo | VetFlo-0530XS | |
| 마취 기화기 | Kent Scientific VetFlo | 13-005-202 | |
| Betadine | HealthyPets | BET16OZ | |
| C57BL/6J 마우스 | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Chicken 안티 뉴로필라멘트 헤비 | Abcam | ab72996 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| 데이터 분석 소프트웨어 | 프리즘 | ||
| 팁 핀셋 | World Precision Instruments | 500233 | |
| 형광 현미경 | Nikon | Ti-E | |
| 염소 안티 닭 488 | Invitrogen | A32931 | |
| 염소 안티 토끼 647 | Invitrogen | A21245 | |
| 가열 패드 | Braintree Scientific | 39DP | |
| 이미지 분석 소프트웨어 | 피지 | ||
| 이미징 소프트웨어 | Nikon | NIS-Elements | |
| Isoflurane | Med-Vet International | RXISO-250 | |
| Meloxicam | Med-Vet International | RXMELOXIDYL32 | |
| 바늘 드라이버 | Roboz Surgical Store | RS-7894 | |
| Normal Goat Serum | Abcam abcam | ab7481 | |
| Ophthalmic ointment | Refresh | Refresh P.M. | |
| Phox2bCre:tdTomato 돌연변이 생쥐 | Jackson Laboratory | #016223, #007914 | |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| 토끼 안티-티로신 하이드록실라제 | Abcam | ab112 | |
| 작은 직선 가위 | Fine Science Tools | 14084-09 | |
| 멸균 면봉 2x2 | Dynarex | 3252 | |
| 멸균 면 팁 애플리케이터 | Dynarex | 4301 | |
| 멸균 드레이프 | Med-Vet International | DR4042 | |
| 멸균 식염수 | Med-Vet International | 1070988-BX | |
| ThCre:mTmG 돌연변이 마우스 | 돌연변이 마우스 자원 및 연구 센터 | 균주 #017262-UCD | Jackson Laboratory, 균주 # |
| 007576ThCre:tdTomato mutant 마우스 | 유럽 마우스 돌연변이 아카이브 균 | 주 #00254 | Jackson Laboratory, 균주 #007914 |
참고문헌
- Scholz, T., et al. Peripheral nerve injuries: An international survey of current treatments and future perspectives. J Reconstr Microsurg. 25 (06), 339-344 (2009).
- Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215
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재인쇄 및 허가
