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방법 논문

결핍이 자손의 건강 결과에 미치는 영향을 연구하기 위해 산모의 식이 엽산 또는 콜린 수치를 수정합니다.

1.1K 조회수

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DOI:

10.3791/66827

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2024년 6월 28일

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Midwestern University, 2Department of Basic Medical Sciences, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, 3Department of Anesthesiology, Pharmacology, & Therapeutics, Faculty of Medicine, University of British Columbia, 4Center of Metabolomics, Institute of Metabolic Disease, Baylor Scott & White Research Institute, 5Department of Physiology, Southern Illinois University, 6Department of Child Health, College of Medicine Phoenix, University of Arizona, 7Department of Neuroscience, Carleton University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 임신 전 암컷 마우스에서 엽산 또는 콜린의 식이 섭취를 줄이는 방법을 설명하며, 모계 식이요법이 자손의 건강 결과에 미치는 영향을 조사하기 위한 것입니다.

초록

임신과 수유 중 산모의 영양은 자손의 신경 발달에 중요한 역할을 합니다. 엽산과 콜린, 그리고 다른 비타민 B군을 중심으로 하는 1탄소(1C) 대사는 발달 중인 태아의 신경관이 닫히는 과정에서 중요한 역할을 합니다. 그러나 임신 중 이러한 모계의 영양 결핍이 출산 후 태아의 건강 결과에 미치는 영향은 상대적으로 불분명한 상태로 남아 있습니다. 또한, 엽산이나 콜린의 모계 식이 결핍은 자손의 다른 건강 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 이는 가치 있는 모델입니다. 이 프로토콜은 식이 수정을 통해 암컷 마우스의 1C 대사 결핍을 유도하는 절차를 설명하는 것을 목표로 합니다. 암컷은 젖을 뗄 때 짝짓기 전 4-6주 동안 생후 2개월까지 다이어트를 하고 임신과 수유 기간 동안 다이어트를 유지합니다. 이 암컷의 자손은 건강 결과를 위해 평가할 수 있습니다. 암컷은 자손을 낳기 위해 여러 번 사용할 수 있으며 암컷의 조직을 수집하여 1C 대사 산물 측정을 위해 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 산모의 엽산 또는 콜린의 식이 결핍을 유도하여 자손의 건강 결과를 연구하는 방법에 대한 개요를 제공합니다.

서론

임신과 수유 중 산모의 영양은 자손 발달에 중요한 역할을 합니다. One-carbon(1C) 대사는 영양 신호를 생합성, 산화 환원 항상성 및 후성유전학과 통합하는 핵심 대사 네트워크입니다. 엽산과 콜린은 신경관의 폐쇄에 중요한 역할을 하는 1C의 핵심 구성 요소입니다. 여성은 가임기에 엽산과 콜린을 보충하는 것이 널리 권장됩니다1. 엽산이 태아 발달에 중요한 역할을 한다는 것은 명확하게 밝혀졌지만, 엽산과 관련된 근본적인 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 가임기 여성은 임신 전에 엽산을 섭취하는 것이 좋은데, 이는 신경관의 폐쇄가 임신 초기에 일어나기 때문이다2. 엽산이나 콜린과 같은 1C 성분이 결핍된 임산부는 임신 초기에 필요한 뉴클레오티드 합성 및 기타 과정에 대한 수요가 높기 때문에 신경관 결손이 있는 태아를 출산할 확률이 더 높다3.

1C 대사 섭취가 결핍된 산모의 식단이 자손의 건강 결과에 미치는 장기적인 영향은 잘 알려져 있지 않습니다. 우리 실험실과 다른 실험실의 연구는 전임상 모델을 사용하여 엽산이나 콜린이 결핍된 산모의 식단이 허혈성 뇌졸중 후 자손의 건강 결과에 실제로 영향을 미친다는 것을 입증했습니다 4,5,6. 산모의 식단이 미치는 영향은 임상 연구에서도 나타났는데, 뇌 부피가 작아지고 메틸화 수치가 변한 것으로 밝혀졌다7. DOHaD(Developmental Origins of Health and Disease) 이론에 따르면 장래의 만성 질환은 자궁 8,9에 프로그래밍되어 있으며 산모의 식단이 중요한 역할을 합니다.

이 프로토콜은 임신 전 암컷 마우스의 1C 식이 섭취를 변경하는 방법을 설명하기 위해 고안되었으며, 자손의 건강 결과에 대한 모계 영양의 영향을 조사하기 위한 목적입니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 승인되었고, 모든 동물 피험자는 미드웨스턴 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 2983)의 지침에 따라 사용되었다. 이 연구에는 생후 2개월(체중, ~20g)의 암컷 C57BL/6J 마우스가 사용되었습니다. 일반적으로, 생식 연령의 암컷 마우스를 사용할 수 있다10. 깔짚의 영향을 피하기 위해서는, 각 식단에 여러 마리의 암컷을 사용해야 한다11. 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 실험적 준비

  1. 엽산 또는 콜린이 결핍된 식단은 상업용 설치류 식품 제조업체에서 구입하십시오. 결핍된 식단에 필요한 엽산 또는 콜린의 정확한 양을 포함하여 미량 및 거시 영양소의 자세한 목록은 표 1 을 참조하십시오.
    참고: 해당 대조 식단도 주문해야 합니다. 자세한 내용은 표 1에 나와 있습니다. 이 식단은 AIN93G를 기반으로 했으며 설치류10에 권장되는 영양소를 함유하고 있습니다.
  2. 제조업체와 협력하여 다이어트의 색상을 결정하면 실험 연구 중에 올바른 다이어트를 배포하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 연구는 엽산이 결핍된 식단에는 녹색, 콜린에는 노란색, 대조 식단에는 흰색을 사용했습니다. 그들은 모두 쉽게 구별할 수 있습니다.
    알림: 물 소비에는 제한이 없습니다. 물에는 엽산, 콜린 또는 기타 1C 대사 산물이 포함되어 있지 않습니다.

2. 엽산 또는 콜린 식이 결핍 유발

  1. 암컷에게 다이어트를 하기 전에 모든 동물의 무게를 잰다. 이를 기준 중량이라고 합니다.
  2. 개별 실험실 케이지 설정(환기 또는 비환기, 재료 표 참조)에 따라 각 케이지에 대한 특수 식단 펠릿을 일주일에 몇 번 교체하거나 보충하십시오. 케이지 푸드 후퍼에 특별한 식단을 과도하게 채우지 마십시오., 이렇게 하면 동물의 타액과 상호 작용하면 펠릿이 악화되고 시간이 지남에 따라 부패할 수 있습니다.
    알림: 다이어트 재고는 제조업체 지침에 따라 보관하고 만료일 이전에 사용해야 합니다.
  3. 짝짓기 전에 4-6 주 동안 암컷 쥐를 식단으로 유지하십시오.
  4. 짝짓기를 위해 수컷 쥐를 암컷 우리에 도입합니다. 암컷이 최소 4-6주 동안 특별한 식단을 섭취한 후 수컷이 암컷 우리에 도입되도록 합니다. 한 마리의 수컷을 한 마리의 암컷 케이지에 1-며칠 동안 투입하십시오.
    참고: 본 연구에서는 생쥐의 교미가 출생 후에 발생할 수 있기 때문에 생산되는 새끼의 수를 늘리기 위해 실험의 전체 기간(~4개월) 동안 수컷을 암컷과 함께 유지했습니다12. 생후 6개월 이후의 암컷은 어떤 연구에도 사용되지 않았다.
  5. 매일 암컷 쥐에게 교미 플러그가 있는지 확인하는데, 이는 번식이 발생했음을 나타냅니다.
  6. 매주 암컷 쥐의 체중 측정값을 수집하여 건강과 임신 상태를 추적합니다.
    참고: 여성은 임신(~21일)과 수유(~21일) 동안 식단을 유지하는 것이 안전합니다.
  7. 새끼가 어미로부터 젖을 뗄 때(출생 후 ~21일) 엽산과 콜린이 결핍된 식단과 대조 식단을 급여하십시오. 자세한 내용은 결과 섹션을 참조하세요.
    참고: 산모의 식단이 자손의 건강 결과에 미치는 영향을 연구할 때, 젖을 뗀 후 자손을 대조 식단에 배치하는 것이 권장됩니다. 대조 식단은 생존을 위해 적절한 양의 비타민과 영양소를 함유해야 합니다.
  8. 연구가 끝나면 (엽산 또는 콜린 결핍 식단으로 유지되는 여성의 전반적인 건강을 모니터링하기위한 주간 체중 결정), CO2 과다 복용 (복용량, 분당 10 % -30 % 부피 변위, 기관에서 승인 된 프로토콜에 따름)을 사용하여 어머니를 안락사시키고 조직을(3 단계) 수집하여식이 결핍을 확인합니다.

3. 1C 및 관련 대사 산물의 측정을 위한 조직 수집

참고: 동물을 안락사시킬 때 동물이 발가락 꼬집음에 반응하지 않는지 확인하는 것이 중요합니다. 동물이 반응하지 않으면 조직 해부를 시작할 수 있습니다. 절개할 조직은 사전에 결정되어야 합니다13,14, 그리고 재료는 준비되어야 합니다. 이러한 재료에는 보관용 튜브, 적절한 해부 도구, 드라이아이스 또는 액체 질소가 포함됩니다.

  1. 이전에 발표된 프로토콜15,16에 따라 혈액 및 간 조직을 수집합니다.
    1. 아래 단계에 따라 심장 천자를 사용하여 ~500-1000μL의 혈액을 수집합니다. 자세한 내용은 Parasuraman et al.17을 참조하십시오.
      1. 피부와 복벽을 V자 모양으로 절개합니다. 복부 장기를 옆으로 이동하고 횡격막을 통해 바늘을 심장에 삽입하여 혈액 샘플을 채취합니다.
      2. 혈액 샘플을 EDTA 코팅 튜브에 넣습니다. 튜브는 모든 샘플이 수집될 때까지 실온에 두실 수 있습니다.
    2. 1000-2000 x g 의 원심 분리기에서 4 ° C에서 7 분 동안 혈액 샘플을 스핀 다운하여 혈장을 분리합니다. 혈장을 1.5mL 미세분리 튜브에 수집한 다음 분석할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
    3. 간을 제거하려면 복부를 열고 이전에 발표된 프로토콜15에 따라 전체 간을 절개합니다.
      1. 체강에서 간을 제거한 후 작은 가위로 조직을 더 작은 조각으로 자르고 드라이 아이스 또는 액체 질소를 사용하여 얼립니다.
        참고: 동결된 조직 조각은 1.5mL 극저온 미세 원심분리기 튜브에 넣고 분석할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

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결과

이 연구의 초점은 산모의 식이 결핍이 엽산 또는 콜린에 미치는 영향이 자손의 건강 결과에 미치는 영향을 조사하는 것이었습니다. 엽산 또는 콜린이 결핍된 식단으로 유지되는 여성의 전반적인 건강을 모니터링하기 위해 주간 체중을 측정하기로 했습니다. 이전 연구에서는 산모의 식단 그룹 간에 체중의 변화가 관찰되지 않았다4. 그림 1 은 짝짓기 전 4주 동안 대조군, 콜린 또는 엽산 결핍 식단으로 유지된 암컷의 기준선 및 주간 체중을 보여줍니다(F (1.144,4.577) = 11.96, p = 0.196). 일반적으로 관찰된 바에 따르면, 이러한 특별한 식단을 섭취하는 자손의 수는 표준 쥐 차우에 비해 자손의 수가 줄어듭니다. 이는 통계적으로 유의한 것으로 확인되지 않았습니다.

암컷 쥐에게 엽산이나 콜린과 같은 1C가 결핍된 식단을 먹이면 1C를 처리하는 ...

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토론

연구 실험실에서 이 프로토콜을 구현하는 동안 연구자가 실험을 시작하기 전에 고려해야 할 몇 가지 중요한 참고 사항이 있습니다. 첫째, 다이어트 제조에서는 실험 연구가 시작되기 전에 다이어트를 제조하기 위해 충분한 리드 타임을 제공해야 합니다. 리드 타임은 회사마다 다를 수 있으며 식단 배송도 고려해야 합니다. 생식 연령 (연령에 있는 ~2-2.5 개월)에 있는 암컷 쥐는 짝짓기 4,6,14 4-6 주 전에 규정식에 둘 수 있다. 이전 연구에서는 C57Bl/6J 마우스만 사용했지만, 다른 그룹은 유사한 연구에서 BALB/c 마우스를 사용했...

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 튜브Eppendorf
C57BL/6 암컷 마우스, Charles River27마우스는 집에서 사육할 수도 있습니다.
콜린 결핍 다이어트EnvigoTD.06119
컨트롤 다이어트EnvigoTD.190790
EDTA 튜브
엽산 결핍 다이어트EnvigoTD.01546
GraphPad 프리즘https://www.graphpad.com/features
설치류 용 하우징Lab Products, LLCOne 케이지환기 랙 &
액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)SCIEX, Framingham, MA5500 QTrap
Ultra-performance liquid chromatography (UPLC)Shimadzu, Columbia, MD, USANexera
, 케이지

참고문헌

  1. Van Gool, J. D., Hirche, H., Lax, H., De Schaepdrijver, L. Folic acid and primary prevention of neural tube defects: A review. Reprod Toxicol. 80, 73-84 (2018).
  2. Ali, S. A., Economides, D. L. Folic acid supplementation. Curr Opin Obstet Gynecol. 12 (6), 507-512 (2000).
  3. Osterhues, A., Ali, N. S., Michels, K. B. The role of folic acid fortification in neural tube defects: a review. Crit Rev Food Sci Nutr. 53 (11), 575966(2013).
  4. Hurley, L. Maternal dietary deficiencies in folic acid and choline result in larger damage volume, reduced neuro-degeneration and -inflammation and changes in choline metabolites after ischemic stroke in middle-aged offspring. Nutrients. 15 (7), 1556(2023).
  5. Clementson, M. Maternal dietary deficiencies in folic acid or choline worsen stroke outcomes in adult male and female mouse offspring. Neural Regen Res. 18 (11), 2443-2448 (2023).
  6. Pull, K., et al. Impact of maternal dietary folic acid or choline dietary deficiencies on vascular function in young and middle-aged female mouse offspring after ischemic stroke. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 325 (6), H1354-H1359 (2023).
  7. Virdi, S., Jadavji, N. M. The impact of maternal folates on brain development and function after birth. Metabolites. 12 (9), 8766(2022).
  8. Barker, D. J. P. Fetal nutrition and cardiovascular disease in later life. Br Med Bull. 53 (1), 96-108 (1997).
  9. Barker, D. J. P. Maternal nutrition, fetal nutrition, and disease in later life. Nutrition. 13 (9), 807-813 (1997).
  10. Jackson, S. J. Does age matter? The impact of rodent age on study outcomes. Lab Anim. 51 (2), 160-169 (2017).
  11. Jiménez, J. A., Zylka, M. J. Controlling litter effects to enhance rigor and reproducibility with rodent models of neurodevelopmental disorders. J Neurodev Disords. 13 (1), 2(2021).
  12. Breeding and Reproduction of Mice - All Other Pets. Merck Veterinary Manual. , Available from: https://www.merckvetmanual.com/all-other-pets/mice/breeding-and-reproduction-of-mice 159-185 (2024).
  13. Jena, S., Chawla, S. The anatomy of the laboratory mouse. Essentials of Laboratory Animal Science: Principles and Practices. , 159-185 (2021).
  14. The anatomy of the laboratory mouse. , Available from: https://www.informatics.jax.org/cookbook/imageindex.shtml (2024).
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  16. Aboghazleh, R. Rodent brain extraction and dissection: A comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
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  18. Jadavji, N. M., Deng, L., Malysheva, O. V., Caudill, M. A., Rozen, R. MTHFR deficiency or reduced intake of folate or choline in pregnant mice results in impaired short-term memory and increased apoptosis in the hippocampus of wild-type offspring. Neuroscience. 300, 1-9 (2015).
  19. Pickell, L., et al. High intake of folic acid disrupts embryonic development in mice. Birth defects research. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 91 (1), 8-19 (2011).
  20. Mikael, L. G., Deng, L., Paul, L., Selhub, J., Rozen, R. Moderately high intake of folic acid has a negative impact on mouse embryonic development. Birth Defects Res A Clin Mol Teratol. 97 (1), 47-52 (2013).
  21. Mikael, L. G., Pancer, J., Wu, Q., Rozen, R. Disturbed one-carbon metabolism causing adverse reproductive outcomes in mice is associated with altered expression of apolipoprotein ai and inflammatory mediators. J Nutr. 142 (3), 411-418 (2012).

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