방법 논문

PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸 및 그 검증

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DOI:

10.3791/66831

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2024년 5월 3일

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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Acupuncture and Tuina School, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS 및 ATP 유도 사멸을 기반으로 합니다. 당사는 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-AAD 이중 염색을 분석하여 세포 사멸을 검출하며, 전체 세포를 사용하고 주사 전자 현미경을 사용하여 세포막 형태를 관찰합니다.

초록

세포 사멸은 모든 살아있는 유기체의 근본적인 과정입니다. 이 프로토콜은 세포 사멸을 관찰하기 위해 인간 단핵구(THP-1) 대식세포 모델에서 지질다당류(LPS) 및 아데노신 삼인산(ATP) 유도 phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) 분화 지질 침착을 확립합니다. LPS와 ATP가 결합된 LPS는 전형적인 염증 유도 방법으로, 발톱증을 연구하는 데 자주 사용되지만, 세포사멸과 괴사도 LPS/ATP에 의한 자극에 반응합니다. 정상적인 상황에서, 포스파티딜세린은 원형질막의 안쪽 leaflet에서만 국한됩니다. 그러나 pyroptosis, apoptosis, necroptosis의 초기 단계에서는 세포막이 온전한 상태로 포스파티딜세린에 노출되고 후기 단계에서는 세포막이 무결성을 잃게 됩니다. 여기에서 유세포 분석을 사용하여 Annexin V 및 7-Aminoactinomycin D(AAD) 이중 염색을 분석하여 전체 세포에서 세포 사멸을 검출했습니다. 그 결과, LPS/ATP로 자극을 받은 후 상당한 세포가 죽었다는 것을 알 수 있었다. 주사 전자 현미경을 사용하여 개별 세포에서 가능한 세포 사멸 형태를 관찰합니다. 결과는 세포가 LPS/ATP로 자극된 후 발열증, 세포사멸사 또는 괴사(necroptosis)를 겪을 수 있음을 나타냅니다. 이 프로토콜은 LPS/ATP로 자극한 후 대식세포의 사멸을 관찰하는 데 중점을 둡니다. 그 결과, LPS 및 ATP 자극 후 세포 사멸이 파이롭토시스에 국한되지 않고 세포사멸 및 괴사멸도 발생할 수 있음을 보여주었으며, 이는 연구자들이 LPS 및 ATP 자극 후 세포 사멸을 더 잘 이해하고 더 나은 실험 방법을 선택하는 데 도움이 되었습니다.

서론

세포 사멸은 모든 살아있는 유기체에서 기본적인 생리학적 과정입니다. 최근 몇 년 동안 상당한 연구에 따르면 세포 사멸이 유기체 내의 면역과 균형에 관여합니다. 세포 사멸을 연구하면 질병의 발병과 발병을 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다. 프로그램된 세포 사멸의 여러 형태가 설명되었으며, 이러한 과정에서 일부 주요 표적이 확인되었습니다. Pyroptosis, apoptosis, necroptosis는 내부 균형 및 질병에 관여하는 유전적으로 정의된 세 가지 프로그램된 세포 사멸 경로입니다1.

Pyroptosis는 막 구멍의 형성과 세포 내용물의 방출을 특징으로합니다. 활성화된 카스파제 또는 그랜자임은 가스더민을 절단하여 N-말단 도메인을 분리한 다음 올리고머화되어 멤브레인에 결합하고 기공 2,3,4를 형성합니다. gasdermin pore는 세포막을 가로지르는 비정형 분비 채널을 제공하여 함량 방출 및 이온 유입 2,3,4를 포함한 다운스트림 세포 반응을 일으킵니다. 결국, 세포는 결국 ninjurin-1에 의해 촉진되는 원형질막 파열과 열병합 용해를 경험하게 된다5. 세포사멸에서 활성화된 Bax와 Bak은 미토콘드리아 외막에 올리고머를 형성하고 시토크롬 C를 방출하며, 이는 BCL-2 계열의 프로아포토시스 단백질과 항아사멸 단백질, 개시제 카스파제(카스파제-8, -9 및 -10) 및 효과기 카스파제(카스파제-3, -6 및 -7)1,6,7 사이의 균형에 의해 조절됩니다. 세포자멸사의 형태학적 변화에는 막 출혈, 세포 수축, 핵 단편화, 염색질 응축 및 자가사멸체 형성이 포함됩니다 6,8. 수용체 상호 작용 세린/트레오닌 단백질 키나아제 1(RIPK3) 및 혼합 계통 키나아제 도메인 유사(MLKL)는 괴사 메커니즘1의 두 가지 다운스트림 핵심 구성 요소입니다. RIPK3는 MLKL을 모집 및 인산화하고, p-MLKL은 올리고머화하고, 세포막과 결합하고, 막 천공을 시작하고, 이온 유입을 일으키고, 세포 내 삼투압을 증가시키고, 결국 세포 파열을 일으킵니다 6,9. 가스더민스(Gasdermins)와 MLKL은 각각 원형질막에 결합하여 열포화증(pyroptosis)과 괴사(necroptosis)를 매개하며, BAX/BAK는 미토콘드리아의 외막에 결합하여 세포사멸을 매개합니다6.

각 경로에는 특정 메커니즘과 결과가 있지만 세포막에서 유사한 변화를 일으킵니다. 정상적인 상황에서 포스파티딜세린(PS)은 원형질막의 내부 판단에만 국한됩니다. 그러나 pyroptosis, apoptosis, necroptosis의 초기 단계에서는 PS가 원형질막 외부로 노출됩니다. Caspase-3/caspase-7은 TMEM16 및 XKR 계열을 활성화하여 비대칭 세포막을 유도하고 세포사멸10 동안 PS를 외부화합니다. Gasdermin D 매개 및 MLKL 매개 Ca2+ 유입은 세포막에서 인지질 이중층의 대칭성을 잃고 PS를 노출시킵니다. 노출은 세포막 무결성11,12의 손실 전에 발생합니다. 이 세 가지 유형의 프로그래밍된 세포 사멸의 막에서 발생하는 유사한 변화를 기반으로 유세포 분석을 사용하여 Annexin V/7-Aminoactinomycin D(7-AAD) 이중 염색을 분석하여 세포 사멸을 검출합니다. 칼슘 의존성 인지질 결합 단백질인 Annexin V는 PS에 대한 친화력이 높고, 이는 원형질막(13)의 표면에서 노출된 PS를 검출하기 위한 민감한 프로브 역할을 할 수 있다. 7-AAD는 전체 세포막을 통과할 수 없는 핵산 염색제입니다. 일반적으로 사용되는 핵산 염료인 프로피듐 요오드화물(PI)과 유사합니다. 두 제품은 유사한 형광 특성을 갖지만 7-AAD는 방출 스펙트럼이 더 좁고 다른 검출 채널과의 간섭이 적습니다. 이러한 유사성으로 인해 pyroptosis, apoptosis, necroptosis를 구별하는 것만으로는 충분하지 않습니다. 우리는 전체 세포에서 세포 사멸을 검출하기 위해 유세포 분석을 사용했습니다. 두 번째 방법은 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 세포막을 캡처하는 데 사용되어 개별 세포에서 가능한 세포 사멸 형태를 관찰합니다.

세포 사멸을 관찰하기 위해 인간 단핵구(THP-1) 대식세포 모델에서 지질다당류(LPS) 및 아데노신 삼인산(ATP) 유도 phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) 분화 지질 침착을 확립했습니다. 이 프로토콜은 메커니즘을 조사하기보다는 세포 사멸을 관찰하는 데 중점을 둡니다.

프로토콜

1. 세포주와 세포배양

  1. 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.05mM β-메르캅토에탄올을 함유한 RPMI-1640 완전 배양 배지에서 인간 단핵구 세포주 THP-1을 성장시킵니다. 37°C에서 5%CO2 가습 공기에서 세포를 배양합니다. 2-3일마다 하위 배양 세포.
    참고: THP-1은 부유 세포이므로 하위 배양을 위해 배지의 절반을 변경하려면 선택합니다. 광학 현미경으로 많은 세포 단편을 관찰할 때는 실온에서 300 x g 으로 3분 동안 원심분리합니다. 미리 따뜻해진 신선한 완전한 세포 배양 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
  2. 모든 실험에 대해 로그 성장 단계에서 세포(단락 4-10)를 사용합니다. 세포의 상태가 양호하고 대수적 성장 단계에 있을 때, 세포는 둥글고 밝고 조밀하며 100 x의 광학 현미경에서 덩어리와 세포 조각이 없습니다.

2. THP-1 세포의 분화

  1. 1mM 농도의 PMA 원액을 준비합니다(PMA 1mg을 디메틸 설폭사이드 1.62mL에 용해). PMA 원액을 완전한 세포 배양 배지로 희석하여 최종 작업 농도 100nM로 합니다.
  2. 배양 접시의 세포를 10mL 멸균 원심분리기 튜브에 수집합니다. 실온에서 3분 동안 300 x g 으로 원심분리하고 PMA가 포함된 3mL의 완전 배양 배지로 세포를 재현탁시킵니다.
  3. 세포 계수기와 계수 소프트웨어를 엽니다. 세포 카운터 보드에 20μL의 세포 현탁액을 피펫팅하고 세포 카운터 보드에 삽입합니다. 딸깍 하는 소리 Preview B1, 기기 오른쪽 하단의 노브를 돌린 다음 초점 거리를 조정하여 소프트웨어에서 명확한 윤곽과 함께 밝은 중심을 가진 셀을 만듭니다. 카운트 를 클릭하여 카운트를 시작합니다.
  4. 계수 결과에 따라 PMA가 포함된 완전 배양 배지를 사용하여 세포 밀도를 1 x 106 cells/mL로 조정합니다. 6 웰 플레이트에 세포를 종자하고 추가 처리를 시작하기 전에 37 ° C 및 5 % CO2 에서 24 시간 동안 플레이트를 배양합니다.

3. THP-1cell의 처리

  1. 1mg/mL 농도의 LPS 원액을 준비합니다(LPS 1mg을 인산염 완충 식염수(PBS) 1mL에 용해). LPS 원액을 무혈청 배지로 희석하여 최종 작업 농도 1μg/mL로 만듭니다. 500mM 농도의 Na2ATP 원액을 준비합니다 (PBS 1mL에 ATP 0.3026g을 용해).
  2. 웰에서 PMA 함유 매체를 흡입하고 PBS 1x로 세척합니다. 대조군에 무혈청 배지를 추가하고 모델 그룹에 LPS를 함유한 무혈청 배지를 추가합니다. 추가 처리를 진행하기 전에 37 ° C + 5 % CO2 에서 6 시간 동안 플레이트를 배양하십시오.
  3. 6시간 후, ATP 스톡 용액을 최종 작업 농도 500nM까지 모델 그룹에 추가합니다. 계속하기 전에 37 ° C + 5 % CO2 에서 45 분 동안 플레이트를 배양하십시오.

4. 유세포 분석(방법 1)

  1. 실험 샘플의 준비
    1. 2단계에 따라 6-well plate에 세포를 파종하고 배양합니다. 무처리 대조군 4개: 무염색 대조군 1개, 단일 염색 대조군 2개(각 염색제에 하나씩) 및 이중 염색 대조군 1개. 하나의 치료군을 설정하고 3단계에 따라 치료합니다.
    2. 처리 후 우물에서 모든 상층액을 흡인하고 PBS 2x로 세척합니다. 각 웰에 500μL의 0.05% 트립신(non-EDTA)을 추가하고 인큐베이터에서 30초 동안 배양합니다.
    3. 각 웰에 RPMI-1640 완전 배양 배지 1mL를 추가하여 세포 분리를 중지하고 세포를 5mL 튜브에 수집합니다. 실온에서 3분 동안 300 x g 으로 원심분리합니다.
    4. 세포를 재현탁시키기 위해 1mL의 PBS를 추가합니다. 세포가 있는 튜브를 37°C의 수조에 3분 동안 넣습니다. 모든 샘플을 300 x g 에서 실온에서 3분 동안 원심분리합니다.
    5. 200μL의 5x 결합 완충액을 800μL의 증류수와 1x 결합 완충액으로 희석합니다. 100 μL의 1x 결합 완충액을 추가하여 세포를 재현탁시키고 세포를 5 mL 튜브로 옮깁니다.
    6. 5 μL의 Annexin V-PE 용액을 대조군 세포의 한 튜브에 10분 동안 추가하고 5 μL의 7-AAD 용액을 대조군 세포의 다른 튜브에 5분 동안 추가합니다(단일 염색 대조군으로 별도). 각 튜브를 부드럽게 소용돌이치게 하여 염료를 혼합하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 샘플을 배양합니다. 각 튜브에 400μL의 PBS를 추가하고 부드럽게 와류하여 배양을 종료합니다.
    7. 나머지 튜브에 5μL의 Annexin V-PE 용액을 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 각 튜브를 부드럽게 소용돌이치게 하여 염료를 혼합하고 빛으로부터 보호되는 실온에서 샘플을 배양합니다. 5분 후 실온에서 5분 동안 5μL의 7-AAD 용액을 추가합니다. 각 튜브에 400μL의 PBS를 추가하고 부드럽게 소용돌이쳐 배양을 종료합니다.
    8. 5mL 폴리스티렌 원형 바닥 튜브의 일부인 35μm 나일론 메쉬를 사용하여 셀 현탁액을 여과합니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 테스트를 기다립니다. 테스트하기 전에 부드럽게 혼합한 다음 기기에 삽입하십시오.
  2. 유세포 분석
    1. 테스트를 위해 형광 활성화 세포 분류 유세포분석기를 사용합니다. 유세포분석기 데이터 분석 소프트웨어를 열고 검출기와 레이저의 성능을 확인합니다. Cytometer 를 클릭하고 Fluidics startup을 선택한 후 시스템이 준비될 때까지 기다립니다. Cytometer(유세포분석기) > Clean Modes(클린 모드) > De-gas Flow cell(플로우 셀)을 클릭하여 플로우 챔버 기포를 제외합니다.
    2. Experiment(실험)를 클릭하고 New folder(새 폴더), Experiment(실험), Specimen(표본), Tube(튜브) 및 Edit Name(이름 편집)을 순서대로 선택합니다. 튜브 앞에 있는 오각형 모양의 화살표는 불이 켜지면 녹색으로 바뀝니다.
    3. Cytometer FACSCelersta(단축키 아이콘) 아이콘을 클릭하고 Parameter를 선택한 다음 FSC, SSC 및 PE signal을 선택합니다. Global Worksheet 아이콘(바로 가기 키 아이콘)을 클릭하여 PE 히스토그램을 설정합니다. 이 연구에 사용된 유세포 분석기의 경우 586nm에서 Annexin V에 PE를 사용하고 X축에 플롯합니다. 7-AAD의 경우 PerCP-Cy5.5, 700nm에서 Y축에 플롯.
    4. 염색되지 않은 대조군 샘플을 먼저 기기에 삽입합니다. Acquisition Dashboard (바로 가기 키 아이콘) 아이콘을 클릭하고 원하는 모집단에서 최소 10,000개의 이벤트를 획득합니다. FSC-A 및 SSC-A 점도표에서 게이트(P1)를 사용하여 파편을 제외합니다. 유량을 중간 속도로 조정하고 데이터를 기록합니다. 전압을 조정하여 FSC/SSC 히스토그램의 대각선에 세포 집단을 배치하고 Restart(다시 시작)를 클릭합니다. 유량을 중간 속도로 조정하고 데이터를 기록합니다.
    5. 다음 튜브를 클릭하고 Annexin V 및 7-AAD의 단일 염색 제어를 실행하여 보정을 조정합니다. 나머지 튜브를 실행하고 데이터를 수집합니다.

5. SEM 이미징(방법 2)

  1. 실험 샘플의 준비
    1. 2단계에 따라 6웰 플레이트에서 세포를 파종하고 배양하고 3단계에 따라 처리합니다.
    2. 처리 후 우물에서 모든 상층액을 흡인하고 PBS로 2번 세척합니다. 각 웰에 500μL의 0.05% 트립신(non-EDTA)을 추가하고 인큐베이터에서 30초 동안 배양합니다.
    3. 각 웰에 RPMI-1640 완전 배양 배지 1mL를 추가하여 세포 분리를 중지하고 세포를 5mL 튜브에 수집합니다. 실온에서 3분 동안 300 x g 으로 원심분리합니다.
    4. 500μL의 전자 현미경 고정제(2.5% 글루타르산 알데히드, 100mM 인염)로 세포를 실온에서 2시간 동안 고정한 다음 4°C에서 밤새 고정합니다.
    5. 크롬 명반 용액 준비: 초순수 1.0mL에 젤라틴 100g을 넣고 70°C 수조 가열로 고르게 저어줍니다. 크롬 명반 0.05g을 넣고 고르게 저어준 후 여과지로 걸러냅니다. 깨끗한 커버 유리를 크롬 명반 용액에 37°C에서 2시간 동안 담그고 나중에 사용할 수 있도록 37°C 오븐에서 건조시킵니다.
      참고: 실험 중 세포 분리를 방지하는 것이 목적입니다.
    6. 고정 용액에서 세포를 수집합니다. 실온에서 3분 동안 300 x g 으로 원심분리합니다. PBS 100μL를 넣고 세포를 부드럽게 불어냅니다. 셀 현탁액을 커버 유리에 떨어뜨리고 5분 동안 그대로 두십시오. 모든 상층액을 흡인하고 매번 5분 동안 PBS로 3번 세척합니다.
      알림: 셀 분리를 방지하기 위해 작업을 부드럽게 수행해야 합니다. 세게 흔들지 말고 천천히 움직이고 벽을 따라 천천히 액체를 넣으십시오.
    7. 500μL의 1% 오스믹산 고정을 1시간 동안 추가합니다. 모든 상층액을 흡인하고 매번 5분 동안 PBS로 3번 세척합니다.
    8. EtOH 용액당 15분 동안 일련의 에탄올(EtOH) 농도(30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 100%)로 샘플을 연속적으로 탈수합니다.
      참고: 커버 유리는 4°C에서 며칠 동안 100% EtOH로 보관할 수 있지만 과도한 탈수를 피하기 위해 가능한 한 빨리 건조해야 합니다.
    9. 임계점 건조기를 켜고 CO2 탱크를 열고 챔버를 10°C로 냉각합니다. 챔버 압력이 0psi일 때 샘플을 여과지로 빠르게 감싸고 챔버에 넣습니다.
    10. 입구 밸브를 열고 CO2 관찰 창을 통해 관찰하고 두 개의 빨간색 선 사이의 액체 CO2 수준을 높이고(상한을 초과하지 마십시오) 입구 밸브를 닫습니다. 샘플을 10분 동안 담그십시오. 입구 밸브와 배기 밸브를 동시에 열어CO2 를 1분 동안 균등화합니다(액체 CO2 는 EtOH를 대체함). 배기 밸브를 닫아 액체 CO2 수준을 지정된 위치로 올리고 입구 밸브를 닫습니다.
    11. 온도를 35°C로 설정하고 압력을 1250psi로 설정합니다. 온도와 압력이 안정되면 100psi/min으로 감압합니다. 챔버 압력이 0일 때 샘플을 꺼내고 기기를 끕니다.
    12. 전도성 테이프를 사용하여 SEM 알루미늄 시편 홀더에 시편을 장착합니다. 스퍼터 코팅기를 사용하여 샘플을 금 층(2-5nm)으로 덮습니다.
  2. 이미징
    1. 이미징을 위해 고해상도 냉전계 방출 SEM을 사용합니다. SEM의 가속 전압을 3kV로 설정합니다. 작동 거리를 10mm로 설정합니다. 배율을 1,000배로 설정하여 파노라마를 관찰합니다. 배율을 5,000x 및 20,000x로 설정하여 원형질막을 찾고 샘플을 이미지화합니다.
      참고: SEM을 통해 PMA 분화 THP-1 대식세포를 시각화하는 과정은 다른 유형의 세포 및 조직과 유사하며 사용하는 기기에 따라 다릅니다. 참조(14 )는 동반되는 비디오와 함께 상세한 SEM 프로토콜을 제공한다.

결과

세포 샘플은 프로토콜에 설명된 대로 처리하고 유세포 분석 검출을 수행했습니다. 정상 세포는 Annexin V 및 7-AAD(Annexin V-/7-AAD-)로 염색할 수 없습니다. pyroptosis, apoptosis, necroptosis의 초기 단계에서 PS는 노출되어 Annexin V에 결합되었지만, 세포막은 여전히 온전했고 세포외 공간(Annexin V+/7-AAD-)에서 7-AAD를 제외했습니다. 후기 단계에서는 세포막이 무결성을 잃고 세포는 Annexin V 및 7-AAD에 의해 동시에 염색되어 이중 양성 결과(Annexin V+/7-AAD+)를 나타냅니다. 괴사성 세포는 7-AAD(Annexin V-/7-AAD+)로만 염색했습니다. 그림 1 은 LPS/ATP 자극 후 Q2 영역의 세포가 크게 증가하여 세포 사멸을 나타냅니다.

우리는 SEM을 사용하여 원형질막 표면을 캡처하고 단일 세포에서 막의 특성을 직접 관찰합니다. 그림 2A는 대조 세포를 보여주고, 그림 2B-D는 LPS/ATP 자극 후의 세포를 보여줍니다. 막출혈 및 막파열을 포함한 pyroptosis의 특성을 가진 세포(그림 2B), 막출혈 및 세포 수축을 포함한 세포사멸 특성을 가진 세포(그림 2C), 세포 팽창 및 막파열을 포함한 괴사 특성을 가진 세포(그림 2D)를 관찰했습니다.

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그림 1: 유세포분석을 사용한 Annexin V/7-AAD 이중 염색 검출. (A) Annexin V 음성 및 7-AAD 음성 염색(Q4), Annexin V 양성 및 7-AAD 음성 이중 염색(Q3), Annexin V 양성 및 7-AAD 양성 염색(Q2), Annexin V 음성 및 7-AAD 양성 염색(Q1). (B) (A)에 대한 정량적 데이터. 데이터는 평균 ± SD(n=3), 쌍을 이루지 않은 t 검정, **p < 0.01로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: PMA 분화 THP-1 대식세포의 주사 전자 현미경 이미지. (A) 대조군, 5,000x/20,000x 배율. (나, 씨, 디) LPS/ATP 그룹은 5,000x/20,000x 배율에서 막 번짐, 막 파열(↑), 세포 팽윤(↑) 및 세포 수축(↑)을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 원고에서는 PMA 분화 THP-1 대식세포의 LPS와 ATP 유도 사멸을 감지하기 위해 두 가지 방법을 사용했습니다. Annexin V/7-AAD 이중 염색을 사용하였으며, 전체 염색으로부터 유세포 분석으로 결과를 분석하였다. 다른 유세포 분석과 마찬가지로, 염색되지 않은 세포 그룹과 단일 염색된 세포 두 그룹을 설정하여 위양성 및 위음성 결과를 제외했습니다. 그 결과, LPS/ATP 자극 후 여러 세포가 막 무결성을 잃었으며, 이는 세포 사멸이 발생했을 수 있음을 나타냅니다. 이 검출 방법을 사용하면 전체 세포의 세포 사멸을 평가할 수 있습니다. Annexin V/7-AAD 이중 염색은 pyroptosis, apoptosis, necroptosis를 구별하기에 충분하지 않다는 점에 유의할 필요가 있습니다. 이 세 가지 형태의 초기 단계에서 PS는 원형질막 외부로 노출되고 Annexin V 염색은 양성입니다. 멤브레인의 무결성은 이 세 가지 형태의 후기 단계에서 손실되며 염색 결과는 이중 양성 염색을 보여줍니다. 따라서 우리는 SEM을 사용하여 발생할 수 있는 세포 사멸의 가능한 형태를 추가로 관찰했습니다.

세포사멸에서는 미토콘드리아 외막에 BAX/BAK 기공이 형성되고 후속 세포 수축 및 세포막 출혈이 발생합니다. Necroptosis는 MLKL을 사용하여 세포막의 기공을 열고, pyroptosis 신호는 gasdermin을 활성화하여 세포막에 기공을 형성합니다. pyroptosis와 necroptosis는 모두 최종 단계에서 세포막 파열을 동반한다는 점에 주목할 가치가 있습니다. 그러나 gasedermin 기공은 MLKL 기공보다 훨씬 크기 때문에 gasdermin 기공에는 이온 선택성이 없습니다. 괴사세포는 형태학적으로 상당한 팽창을 보인다15. 결국 막이 파열됩니다. 세포막 투과성 활성화의 상류에 있는 신호 전달 경로에 관계없이 세포막의 변화는 이 세 가지 형태의 세포 사멸을 동반합니다. 우리는 SEM을 사용하여 세포막을 추가로 관찰했으며, 이는 세포 사멸을 검사하는 직관적인 방법을 제공합니다. 우리는 이전 연구자들이 연구한 특성과 일치하는 막 출혈 및 파열 막을 포함한 pyroptosis와 세포 팽창 및 파열 막을 포함한 necroptosis의 특성을 관찰했습니다15. 우리는 이전 연구자들이 연구한 세포자멸사의 특성과 일치하는 막 출혈과 세포 수축을 관찰했다16.

이전 연구에서는 LPS와 ATP의 조합이 종종 발열증을 유발하는 데 사용되었습니다. 흥미롭게도, 우리는 세포사멸(apoptosis)과 괴사(necroptosis)의 특징을 관찰했다. 세 가지 형태 모두 LPS/ATP 유발 세포 사멸에서 발생할 수 있지만, 이전 연구에서는 파이롭토시스가 여전히 지배적인 사멸 방식으로 남아 있음을 보여주었습니다. LPS는 가장 특징적인 병원체 관련 분자 패턴 중 하나입니다. 죽어가는 세포에서 방출되는 ATP는 세포 내에 농도가 높습니다. 세포외 ATP는 위험과 관련된 분자 패턴 중 하나이다17. LPS/ATP는 발열증을 유발하는 전형적인 2단계 자극 방법입니다. 연구에 따르면 LPS 자극 세포에 ATP를 추가하면 caspase-118을 빠르게 활성화할 수 있는 반면 caspase-1 유전자를 침묵시키면 LPS/ATP 유도 세포 사멸을 크게 역전시킬 수 있습니다19. 이전 연구에서 우리는 또한 apoptotic 및 necroptotic 표적 단백질20,21의 LPS/ATP 유도 활성화를 발견했습니다. LPS/ATP는 전형적인 파이롭토시스 유발제이지만, 세포사멸과 괴사(necroptosis)를 유발할 수도 있습니다.

사실, 이 세 가지 형태는 종종 독립적으로 존재하지 않으며 신호 단계 간에 누화가 발생합니다. 예를 들어, gasdermin 단백질은 미토콘드리아를 표적으로 하여 시토크롬 c 방출을 촉진하여 미토콘드리아 세포사멸 경로(22)를 향상시킵니다. 카스파제-3의 활성화는 가스더민 E를 절단한 다음 pyroptosis23을 유발할 수 있습니다. 한 연구에 따르면 MLKL/PIPK3 신호전달이 NLRP3 인플라마좀의 활성화에 관여한다고합니다 24. 이 복잡한 혼선은 PANoptosis의 개념으로 이어졌으며, 이는 PANoptosome 복합체에 의해 조절되는 염증성 프로그램된 세포 사멸 경로로 정의되며, 이러한 프로그래밍된 세포 사멸 경로 중 어느 것으로도 설명할 수 없는 pyroptosis, apoptosis, 및/또는 necroptosis의 주요 특징을 가지고 있습니다25. PANoptosis의 개념이 제안됨에 따라 과학자들은 프로그래밍된 세포 사멸의 발생을 보다 포괄적으로 설명했으며, 이는 또한 프로그래밍된 세포 사멸의 복잡성을 강조합니다. 한편 이는 이 연구 방법의 한계를 지적하는 대목이기도 하다. 비록 pyroptosis가 LPS/ATP-유도 세포 사멸에서 우세한 것으로 간주되지만, 이러한 사멸 형태의 비율이나 그들이 모두 존재하는지 여부를 결정할 수 없으며, 심지어 다른 형태의 프로그램된 죽음과 관련되어 있는지도 알 수 없습니다. 이것은 나중에 조사해야 할 영역이 될 수 있습니다.

이 프로토콜은 LPS 및 ATP에 의한 대식세포의 사멸을 기반으로 합니다. 우리는 전체에서 개인으로 테스트하는 방법을 설명했으며, 이는 다른 모델 및 세포에도 적용 가능합니다. 이 결과는 세포가 pyroptosis에 국한되지 않는 pyroptosis, apoptosis, 또는 necroptosis를 겪었을 수 있음을 나타내며, 연구자들은 LPS 및 ATP 자극 후 세포 사멸을 더 잘 이해하고 더 나은 실험 방법을 선택할 수 있습니다. 이전 연구에서는 Annexin V/7-AAD 또는 Annexin V/PI 이중 염색이 일반적으로 세포사멸26,27의 발생을 나타내는 데 사용되었으며, 일부 연구자들은 세포사멸28을 연구하는 데에도 이를 사용했습니다. 사실, 우리는 이러한 이중 염색을 통해 세 가지 유형의 세포 사멸을 구별할 수 없습니다. 이 프로토콜은 연구자, 특히 초보자에게 Annexin V/7-AAD 또는 Annexin V/PI 이중 염색이 세포 사멸 유형을 정성적으로 평가할 수 없다는 점을 상기시킵니다. 그것은 단지 세포 전체의 손상과 죽음을 보여주거나 세포가 어떤 형태의 죽음을 겪었을 수 있음을 나타낼 수 있습니다. 보다 표적화된 연구에서는, 결정적으로 프로그램 죽음이 임박했다는 것을 보여주기 위해 다른 죽음을 억제하는 대조군을 도입할 필요가 있다. 이와 유사하게, 추가적인 기계론적 연구는 서로 다른 프로그램된 죽음의 중요한 목표를 조사할 것이다.

또한, 실험을 준비하는 동안, 우리는 현재 부착 세포의 SEM에 대한 많은 세부 실험 절차가 있으며 부유 세포에 대한 설명은 거의 없다는 것을 발견했습니다. 여기에서는 부유 세포에 대한 시료 전처리 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 5.5단계는 부유 세포를 세포 슬라이드에 고정하는 데 필요한 단계입니다. 후속 작업은 세포 분리를 방지하기 위해 부드럽게 수행해야 합니다. 크롬 명반 용액 외에도 폴리-L-라이신은 세포를 고정시킬 수 있습니다.

공개 사항

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

유세포 분석에 도움을 준 Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy의 Jiayi Sun과 Lu Yang, 주사 전자 현미경 검사에 도움을 준 Southwestern Chinese Medicine Resources의 State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources의 Cuiping Chen에게 큰 감사를 표합니다. 이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China)[82104491], 쓰촨성 자연과학재단(Natural Science Foundation of Sichuan)[2023NSFSC0674], 중국 박사후 과학재단(Post-doctoral Science Foundation of China)[2021M693789]의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% 췌장 효소 용액 (EDTA 제외)BOSTER Biological Technology co.ltdPYG0068
5 mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브CORNING352235
5 mL 원심분리기 튜브Labgic Technology Co., Ltd. BS-50-M
6웰 플레이트 Sorfa 생명 과학 연구 Co., 주식 회사220100
Annexin V-PE/7-AAD apoptosis 분석 장비Absin (상해) 생물학 기술 co.ltdabs50007Annexin V-PE, 7-AAD, 5× 결합 완충액, Apoptosis Positive Control Solution
celculture CO2 인큐베이터Esco (Shanghai) Enterprise Development Co., Ltd.N/A
세포 배양 접시, 100mmSorfa Life Science Research Co., Ltd230301
셀로미터 K2 형광 세포 계수기Nexcelom Bioscience LLC셀로미터 K2
셀로미터 SD100 카운팅 챔버Nexcelom Bioscience LLCCHT4-SD100-002
원심분리기Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., LtdL530
크롬 명반 광동 Wengjiang 화학 시약 Co., Ltd.
커버 안경, 9mmLabgic Technology Co., Ltd. BS-09-RC
임계점 건조기Quorum TechnologiesK850
디메틸 설폭사이드BOSTER 생물학 기술 co.ltdPYG0040
전자 현미경 고정 서비스바이오 기술 co.ltd G11022.5% 글루타르 알데히드, 100mM 인염
전자 저울SHIMADZUATX124
에탄올 절대Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd2021033102
유세포 분석기Becton, Dickinson and CompanyFACSCanto figure-materials-1
유세포 분석 소프트웨어Becton,Dickinson and CompanyBD FACSDivaTM 소프트웨어
젤라틴Guangdong Wengjiang Chemical Reagent Co., Ltd.PA00256 
고해상도 냉전계 방출 주사 전자 현미경TITACHIRegulus 8100
인간 단핵 세포주 THP-1Procell Life Science& Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사)CL0233
도립 현미경 Leica Microsystems Co., LtdDMi1
IR 소용돌이 믹서VELP Scientifica SrlZX4
지질다당류 베이징 솔라바이오 사이언스 & 테크놀로지 주식회사 L8880LPS는 대장균 055:B5
Na2ATPBeijing Solarbio Science & 테크놀로지 주식회사 A8270
phorbol-12-myristate-13-acetate 베이징 솔라바이오 사이언스 & 테크놀로지 주식회사 P6741
인산염 완충 식염수Servicebio Technology co.ltd G4202
피펫Eppendorf AGN/A
피펫 팁, 10 μ LServicebio Technology co., ltd T-10PL
피펫 팁, 1 mL 서비스바이오 테크놀로지 co.ltd T-1250L
피펫 팁, 200 μ LServicebio Technology co., ltd T-200L
RPMI-1640 완전 배양 매체Procell Life Science& Technology Co., Ltd. (테크놀로지 주식회사)CM0233RPMI-1640 + 10% FBS + 0.05mM &베타;-메르캅토에탄올 + 1% P/S
RPMI-1640 배양 배지 상하이  바살미디어  기술 Co., LTD.
쉬스 유체BECKMAN COULTER8546733
스퍼터 코터Cressington Scientific Instruments Ltd108
온도조절 수조GUOHUA Electric Appliance CO., Ltd HH-1
PA04354K211104

참고문헌

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