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방법 논문

설치류 모델에서 중뇌동맥 폐색 전 대뇌 혈류 모니터링을 위한 레이저 도플러 프로브의 안와 주변 배치

1.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66839

⸱

2024년 11월 22일

 ,  ,  , 
1College of Nursing, University of Arizona, 2Department of Surgery, College of Medicine, University of Arizona

이 논문에서

정오 공지

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요약

여기에는 레이저 도플러 프로브를 쥐와 생쥐에게 적합한 안와 주위 위치인 중간 대뇌 동맥(MCA)의 원위 영역 위에 두개골에 배치하여 일시적인 MCA 폐색 중 혈류를 평가하는 것이 포함됩니다.

초록

중뇌동맥폐색(MCAO)은 설치류에서 허혈성 뇌졸중의 전임상 모델링을 위한 최고의 표준 방법입니다. 그러나 가장 숙련된 수술 손으로도 성공적인 교합이 보장되지 않습니다. 오류는 주로 필라멘트가 올바른 깊이에 배치되지 않고 경색이 없거나 혈관 천공이 있을 때 발생하여 사망을 초래할 수 있습니다. 레이저 도플러 유량계(LDF)는 MCAO 절차 중 국소 뇌혈류(CBF)에 대한 실시간 피드백을 제공하는 신뢰할 수 있는 기술입니다. 여기에서는 생쥐와 생쥐 모두에서 CBF를 측정하기 위해 레이저 도플러 프로브의 궤도 주위 배치를 위한 신속한 기술을 보여줍니다. 우리의 이론적 근거는 LDF 구현을 단순화하여 수술 신뢰성 향상을 위해 광범위한 사용을 장려하는 것이었습니다. 이 기술은 두개골 솎아내기와 특수 장비의 필요성을 없애고, 등쪽 배치가 아닌 안와 주위 부위에 배치하여 효율성과 채택 용이성을 촉진합니다. 여기에 설명된 프로토콜에는 수술 전 준비, 안와 주위 도플러 프로브 배치 및 수술 후 관리가 포함됩니다. 대표적인 결과로는 성공적인 MCAO 수술을 보여주는 대표적인 LDF 추적과 함께 절차적 요소의 시각적 묘사가 있으며, 필라멘트 배치에 실패한 사례는 합병증을 유발합니다. 이 프로토콜은 적절한 필라멘트 배치를 확인하는 LDF를 설명하고 대체 방법에 비해 간소화된 절차를 제공합니다.

서론

중뇌동맥폐색법(MCAO)은 1986년 과학계에 소개된 이래 설치류에서 널리 사용되어 왔으며,1990년 2년에 기술된 Longa 적응법과 그 직후에 생쥐에 대한 적응이 이루어졌다.3. Longa의 간행물에는 설명되어 있지 않지만, 필라멘트 배치를 확인하기 위해 레이저 도플러 유량계(LDF) 신호를 사용하는 것이 곧 문헌4에 설명되었습니다. MCAO 절차 중 LDF 고용은 문헌에 두드러지게 나타나 있지만 현재 뇌졸중 전임상 평가 네트워크(SPAN) 표준 수술 절차(SOP)5에서는 선택 단계로 지정되어 있습니다.

LDF의 사용은 MCAO 절차 중 올바른 필라멘트 배치를 확인하므로 특히 약물 효능을 탐구하도록 설계된 실험에서 연구 설계 엄격성 및 후속 결과에 기여합니다. LDF를 사용하면 필라멘트가 충분히 멀리 배치되지 않았을 때 부상이 없거나 필라멘트가 너무 많이 삽입되었을 때 혈관 천공으로 인한 동물의 죽음이라는 이분법적 상황을 초래하는 잘못된 필라멘트 배치로 인한 수술 실수를 줄일 수 있습니다. 반면에, LDF의 사용은 MCAO 절차6에 따라 일반적으로 관찰되는 경색 크기 변동성과 관련이 없습니다. MCAO 절차에서 LDF를 사용하는 것은 두개골이 마우스보다 두껍고 LDF 배치 7,8 전에 두개골을 얇게 해야 할 수 있기 때문에 특히 랫트에서 어렵고 부담스러운 것으로 인식될수 있습니다. 또한, 등쪽 프로브 배치는 종종 특수 장비 또는 준비를 필요로 하는 일부 프로토콜로 설명됩니다 7,8,9. 이러한 장벽 중 하나로 인해 필라멘트 배치를 확인하기 위한 LDF의 구현이 이루어지지 않을 수 있습니다.

이 프로토콜에서는 마우스와 랫드 모두에서 MCAO 절차 중 혈류를 평가하기 위해 두개골과 중뇌 동맥의 원위 영역(안와 주위 배치)에 레이저 도플러 프로브를 배치하는 방법을 설명합니다. 우리의 이론적 근거는 문헌 7,8,9,10에 보고된 일부 방법에 비해 최소 침습적이고 빠르며 두개골 얇아짐 또는 레이저 도플러 프로브 이상의 특수 장비가 필요하지 않다는 점에서 여러 장점이 있는 절차를 개발하는 것이었습니다.

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프로토콜

이 프로토콜을 설명하기 위해 성체 마우스와 랫트를 사용하였다(25g, C57BL/6J, Jackson Laboratories; 250g, Sprague Dawley, Envigo). 동물 취급 및 실험 절차는 University of Arizona Institutional Animal Care and Use Committee, 국내법 및 실험실 동물 관리 원칙에 따라 승인 하에 수행되었습니다11. 쥐와 생쥐는 12 시간의 밝은 / 어두운 일정 (오전 7 시부 터 오후 7 시까 지)에 따라 음식과 물을 즉시 사용할 수 있습니다.

1. 수술 전 준비

참고: 일반적으로 설치류에 대한 MCAO 수술은 생존 수술로 수행되므로 기관별 IACUC 프로토콜에 설명된 대로 무균 또는 팁 전용 수술 기술을 사용해야 합니다. 이 경우 외과의는 멸균된 기구와 용품을 사용하여 팁 전용 기술을 사용합니다.

  1. 상업용 소독제로 수술 작업 표면을 소독하고 고압멸균으로 기구, 드레이프, 거즈, 면봉, 봉합사 및 메스 블레이드로 구성된 멸균 수술 팩을 준비합니다. 현미경 손잡이를 덮고 식품 등급의 플라스틱 랩을 사용하여 드레이핑하는 것과 같은 IACUC 승인 기술에 따라 생존 수술 중 멸균 상태를 유지합니다.
  2. 한 세션 동안 여러 설치류 수술을 수행하는 경우 시술 사이에 수술 기구를 다시 멸균하기 위해 germinator dry bead sterilizer를 사용하십시오.
  3. 쥐나 생쥐를 유도 챔버에 넣고 3%-5% 이소플루란(1% 공기와 80% 산소 혼합물을 결합한 20L/분)으로 마취를 유도합니다.
  4. 마취를 위해 동물을 챔버에서 벤치 및 노즈콘으로 옮깁니다(마우스: 0.5L/min 80%/20% 산소/공기 혼합물, 쥐: 1.5L/min 80%/20% 산소/공기 혼합물). 양쪽 눈에 안과 연고를 바르고 MCAO 수술 측면(일반적으로 오른쪽)의 귀와 안와(eye-socket) 사이의 공간을 클리퍼로 피부를 자르지 않도록 조심스럽게 면도합니다. 쥐의 경우 면도할 때 수염 보조개가 안와와 귀 사이의 대략 중간에서 볼 수 있습니다. MCAO 절차9 에 필요한 만큼 영역을 계속 면도합니다(이 문서의 범위에 포함되지 않음).
  5. 필요에 따라 동물을 챔버로 되돌리거나 37°C로 데워진 준비된 수술 테이블의 노즈콘으로 옮깁니다. 직장 체온계를 삽입합니다. 동물은 시술 기간 동안 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 약 36°C ± 1°C에서 보관해야 합니다.
  6. 면봉에 베타딘을 바르고 수술 부위 중앙에서 바깥쪽으로 나선형으로 피부를 소독합니다. 알코올 준비 패드로 닦으십시오. 총 3주기 동안 두 단계를 모두 반복합니다. 적절한 마취를 확인하고 발가락 꼬집기 역류를 사용하여 시술 중 15분마다 평가합니다.

2. 궤도 주위 도플러 프로브 배치

  1. 그림 2A (마우스) 및 그림 3A (쥐)와 같이 작은 가위로 눈꼬리와 귀 주름 사이를 세로로 자릅니다(마우스: ~0.5cm, 쥐: ~0.7cm).
    알림: IACUC 프로토콜 승인에 따라 수술 전에 통증을 치료하십시오.
  2. 날카로운 집게와 구부러진 가위를 사용하여 두개골에 닿을 때까지 근육층을 조심스럽게 자릅니다. 두개골은 평평하고 집게 끝으로 만지기 어렵습니다. 이것은 그림 2B에서 시각화된 것처럼 레이저 도플러 프로브가 위치할 창입니다.
  3. 겸자 소작 도구를 사용하여 나오는 혈액을 응고시키고 창을 넓히며 두개골로 가는 경로를 확인합니다.
  4. 창문이 열리면 필요에 따라 면봉으로 닦아 과도한 피를 제거합니다.
    쥐나 쥐를 앙와위 위치에 놓습니다.
  5. 겸자를 사용하여 피부나 조직을 집어넣고 도플러 프로브를 안와 주위 창에 배치하여 레이저 신호를 방해하는 피부나 근육이 없는 상태에서 두개골과 수직으로 맞닿도록 합니다. 이 영역은 그림 1A,B와 같이 원위 MCA 위에 있습니다. 실험실 테이프로 프로브 배치를 고정합니다. 이 프로토콜에서는 직선 프로브의 사용에 대해 설명합니다.
    참고: 수술 프로토콜은 실험실마다 다르다는 것을 알고 있습니다. 문헌(보고될 때)에 의하면 어떤 사람들은 두개골을 얇게 갈고 다른 사람들은 그렇지 않다9. 두개골이 안와 주위 영역에서 더 얇기 때문일 수 있지만 이것은 단지 추측일 뿐입니다. 우리의 경험에 따르면, 생쥐와 쥐에서 분쇄 없이 직접 배치할 수 있으며 이 프로토콜에서 입증되었습니다.
  6. 적절한 소프트웨어를 사용하여 모니터의 상대 혈류 판독값을 모니터링합니다(그림 2D, 그림 3C, D). LDF 판독값은 다를 수 있습니다. 그러나 혈류 강하를 감지하기 위한 최적의 범위는 >200 관류 단위(PU)입니다.
  7. MCAO 수술9 로 진행합니다(이 문서의 범위에 포함되지 않음). MCAO 수술 중에는 혈류가 갑자기 떨어지는(~50%) 유발하는 총경동맥을 잠시 묶어 프로브 배치를 테스트합니다.

3. 도플러 프로브 제거 및 수술 후 관리

  1. MCAO가 끝나거나 혈류 판독이 완료될 때마다 수술 창에서 레이저 도플러 프로브를 제거합니다. 도플러 프로브는 허혈 시간이 종종 90분 미만이기 때문에 마우스 MCAO 수술 기간 동안 일반적으로 제자리에 유지됩니다. 반면에, 랫트 MCAO 절차에서, 도플러 프로브는 필라멘트를 배치한 후 허혈 동안(일반적으로 90분 >) 제거한 후 안와 주위 창에 다시 배치하여 2.6 및 2.7 단계를 반복하여 재관류를 확인할 수 있습니다.
    알림: 마우스 MCAO의 일반적인 LDF 연속 추적은 그림 4A에서 관찰할 수 있습니다. 랫트 MCAO 절차의 일반적인 LDF 추적은 그림 4B에 나와 있습니다.
  2. IACUC에서 승인한 국소 마취제를 예상 절개 부위를 따라 피하에 주입합니다.
  3. 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 흡수성 봉합사 또는 수술용 접착제가 있는 표준 수술용 매듭을 사용하여 1-2개의 봉합사로 피부를 닫습니다. IACUC 프로토콜 승인에 따른 수술 후 통증 치료(예: bupivacaine HCL 0.5% 및 lidocaine 2%, 생쥐 및 생쥐에 대한 절개 1회). 동물은 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 때까지 방치해서는 안 되며, 완전히 회복될 때까지 어떤 동물도 다른 동물과 함께 돌려보내서는 안 됩니다.

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결과

MCA 영역에서 레이저 도플러 프로브의 배치는 그림 1에 시각적으로 묘사되어 있으며, 혈관 구조의 상형 문자를 제공하고 시상 및 등쪽 관점에서 시각적 가이드 역할을 합니다. 그림 2 는 레이저 도플러 프로브 배치에 대한 중요한 단계와 마우스에서의 결과를 요약한 것입니다. 그림 2A 는 후속 레이저 도플러 프로브 배치에 필요한 수직 절개 부위에 점선 표시가 있는 마취 및 준비된 마우스의 이미지를 나타냅니다. 두개골에 대한 안와 주위 창은 그림 2B에 설명되어 있습니다.

그림 3은 쥐의 레이저 도플러 프로브 배치를 요약한 것입니다. 후속 레이저 도플러 프로브 배치에 필요한 수직 절개 부위에 점선 표시가 있는 마취 및 준...

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토론

MCAO는 설치류의 대뇌 동맥 폐색 및 재관류를 모델링하기 위한 표준 절차이며 전임상 뇌졸중 연구의 초석이 되어 설치류의 국소 허혈 유도를 통해 인간 뇌졸중 병태생리학을 모방할 수 있습니다. 이는 외과 의사 간 및 외과 의사 내 변동성이 상당한 엄격한 수술 절차입니다. LDF의 적용이 변동성을 줄인다는 증거는 없지만 일부 설계에서는 과학적 엄격성과 연구 결과를 향상시킬 수 있습니다. 이는 LDF가 필라멘트 배치를 검증하고 수술 중 CBF에 대한 실시간 정보를 제공하여 MCA의 폐색이 발생했는지 여부를 확인하기 때문에 수행됩니다. 생쥐 연구의 약 75%가 레이저 도플러 프로브(12,13)의 사용을 설명하고 있지만, 이는 생쥐 연구(14)의 메타 분석에서는 보고된 매개변수가 아니었다. LDF에 대해 자주 사용되는 대안은 표시된...

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공개 사항

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 NINDS 1R41NS124450의 지원을 받았습니다. 바이오렌더: KT26JWLYF6

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
곡선 스프링 가위Castroviejo1501710
집게 # 5미세 과학 도구11250-20
집게 # 5 / 45미세 과학 도구1151-35
Forcepts Cautery 도구ConmedM18019-01
실험실 테이프Fisherbrand 라벨링 테이프15-950
레이저 도플러 모니터무어 인스트루먼트 MOORVMS-LDF
LDF 소프트웨어Windows 용 Perisoft 또는 moorSOFTNA
마우스 클리퍼Philips NorelcoMG7910
Periflux System 4000, 프로브 407Perimed장비 더 이상 사용할 수
플라스틱 랩Gladpress n seal
쥐 클리퍼osterA5 또는 이와 유사한 제품
작은 설치류 마취JD 의료주문
주문 작은 가위excelta362 시저 또는 이와 유사한
PhysitempTCAT-2AC 컨트롤러가있는 온도 모니터 시스템
없음프로브

참고문헌

  1. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese J Stroke. 20 (1), 84-91 (1986).
  2. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84(1989).
  3. Hata, R., et al. A reproducible model of middle cerebral artery occlusion in mice: hemodynamic, biochemical, and magnetic resonance imaging. J Cereb Blood Flow Metab. 18 (4), 367-375 (1998).
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  5. Lyden, P. D., et al. The stroke preclinical assessment network: Rationale, design, feasibility, and stage 1 results. Stroke. 53 (5), 1802-1812 (2022).
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  12. Ingberg, E., Dock, H., Theodorsson, E., Theodorsson, A., Ström, J. O. Method parameters' impact on mortality and variability in mouse stroke experiments: a meta-analysis. Sci Rep. 6, (2016).
  13. Morais, A., et al. Embracing heterogeneity in the multicenter stroke preclinical assessment network (SPAN) trial. Stroke. 54 (2), 620-631 (2023).
  14. Ström, J. O., Ingberg, E., Theodorsson, A., Theodorsson, E. Method parameters' impact on mortality and variability in rat stroke experiments: a meta-analysis. BMC Neurosci. 14, 41(2013).

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재인쇄 및 허가

정오


Formal Correction: Erratum: Periorbital Placement of a Laser Doppler Probe for Cerebral Blood Flow Monitoring Prior to Middle Cerebral Artery Occlusion in Rodent Models
Posted by JoVE Editors on 3/18/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66839

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