유전자 및 조직 특이적 인핸서를 선택하기 위한 웹 기반 워크플로우

요약

생물학자가 브라우저 기반 도구만을 사용하여 조직 특이적 유전자 증강제를 식별할 수 있도록 코딩 없는 워크플로우를 제시합니다. 당사의 프로토콜은 공개 H3K4me1/H3K27ac 히스톤 마크 및 Hi-C 데이터를 활용하여 프로그래밍 전문 지식이 없는 연구자가 관심 유전자와 관련된 잠재적 조절 요소에 액세스, 분석 및 식별할 수 있도록 합니다.

초록

인핸서(Enhancer)는 유전자 발현을 조절하는 DNA 영역입니다. 인핸서 내의 돌연변이는 비정상적인 유전자 조절을 초래하여 질병을 유발할 수 있습니다. 따라서 특정 조직에서 유전자 활성을 조절하는 인핸서를 식별하는 것은 질병의 유전적 기초를 이해하는 데 중요합니다. 그러나 인핸서는 단백질을 암호화하지 않기 때문에 식별하기 어렵습니다. 수많은 enhancer 저장소 및 식별 도구를 사용할 수 있지만 이러한 도구의 복잡성으로 인해 생물학자에게 문제가 될 수 있습니다. 생물학자들이 이러한 리소스를 쉽게 사용할 수 있도록 H3K4me1 및 H3K27ac 히스톤 마크 및 염색질 형태 분석(Hi-C) 데이터와 같은 기존 웹 기반 유전체학 데이터를 활용하여 인핸서가 활성화된 타겟 조직에서 관심 유전자(GoI)와 관련된 인핸서를 발견하는 생물학자 친화적인 프로토콜(https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow)을 제시합니다. 이 프로토콜은 완전히 웹 기반이며 최종 사용자의 프로그래밍 기술이 필요하지 않습니다. 우리는 심장 발달에 중요한 유전자인 TBX5를 조절하는 후보 인핸서를 특성화하여 이 접근법의 유용성을 입증했습니다. 이 프로토콜은 좌심실에서 이 유전자와 관련된 인핸서(enhancer)를 쉽게 식별할 수 있습니다.

서론

인핸서(Enhancer)는 유전자 전사(gene transcription), 발달 및 세포 분화를 조절하는 비코딩(non-coding) DNA 영역입니다 ^1,2. 인핸서의 돌연변이는 발달 장애, 암 및 기타 유전 질환을 포함한 다양한 질병을 유발할 수 있습니다 3,4,5,6. 따라서 인핸서(enhancer)를 이해하는 것은 유전자 발현, 돌연변이 및 질병을 이해하는 데 가장 중요합니다.

인핸서(enhancer)가 표적 유전자와 어떻게 상호 작용하는지 이해하려면 게놈 내에서 인핸서의 위치를 식별하는 것이 중요합니다. 그러나, 인핸서가 전사 시작 부위(TSS)에 가깝고 훨씬 더 멀리 위치할 수 있기 때문에 인핸서 위치를 식별하는 것이 항상 간단한 것은 아니며, 수십에서 수백 킬로베이스에 걸쳐 있습니다 ^2,7,8,9.

예측할 수 없는 게놈 위치에도 불구하고 인핸서는 뚜렷한 생화학적, 구조적 시그니처를 보여 전신적으로 추적할 수 있습니다. 일반적으로 인핸서는 유전자 간 및 인트론 영역에서 농축되는 경향이 있으며 소수는 엑손 ^2,8 내에서 발견됩니다. 그들은 종종 특정 히스톤 변형 및 전사 인자 결합에 의해 표시되며, 이는 조절 역할을 정의하고 다양한 발달 단계 및 조직에 걸쳐 시공간 활성을 결정합니다^10,11.

ChIP-seq는 프로모터 영역 ^{1,12,13,14,15}에서 농축된 인핸서의 홀마크, H3K4me1, 활성 인핸서 마크, H3K27ac 및 H3K4me3 마크와 같은 전사 인자 결합 부위(TFBS) 및 히스톤 변형 마크를 식별하는 데 사용됩니다. 염색질 형태 캡처(3C) 기술과 4C, 5C, Hi-C 및 ChIA-PET와 같은 파생물은 먼 게놈 영역 간의 물리적 상호 작용을 매핑하는 데 사용됩니다. 3C는 특정 조직의 특정 상호 작용을 표적으로 하는 반면, Hi-C는 세포 유형^16,17 전반에 걸쳐 게놈 전체 아키텍처를 제공합니다.

현재의 방법 외에도 EnhancerAtlas 또는 EnhancerFinder^18,19와 같은 통합 인핸서 데이터베이스를 포함하여 인핸서를 특성화하기 위한 전문화된 접근 방식이 개발되었습니다. 그러나 이러한 도구를 사용하려면 연구원이 여러 조직에 걸쳐 여러 인핸서를 조사하기 위해 여러 데이터 세트를 통합해야 하는 경우가 많으며, 이는 생물정보학 및 데이터 마이닝에 대한 경험이 없는 생물학자에게는 압도적일 수 있습니다.

여기에서는 전적으로 기존 웹 도구를 기반으로 인핸서를 선택하는 사용자 친화적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 이를 통해 연구자는 관심 유전자(GoI)를 쿼리하고 해당 인핸서를 검색할 수 있습니다. 여기서 프로토콜은 히스톤 변형, 염색질 상호 작용 및 조직 특이성 1,12,13,14,15,16,17,20,21과 같은 특정 기준 세트에 따라 인핸서를 선택합니다. 인트론 내에서 발견되는 인핸서(Enhancer)는 유전자 사이의 게놈 영역(genomic region)에 위치한 인덱서(intergenic enhancer)에 비해 조직 특이적 활성을 보일 가능성이 더 높다(intergenic enhancer)²². 잠재적인 활성 인핸서(active enhancer)에 대한 포괄적인 적용 범위를 보장하기 위해, 우리는 유전자체 외부에 위치한 조절 요소를 포착할 가능성을 높이기 위해 인접한 두 GoI 사이의 검색 범위를 정의했습니다. 인핸서 특이적 후성유전학적 특징인 H3K4me1과 활성 인핸서 마크인 H3K27ac를 사용하여 인핸서 후보를 나열했습니다. 그런 다음 이러한 후보 물질은 Hi-C 데이터를 기반으로 정제되어 해당 프로모터와의 물리적 상호 작용을 통해 인핸서를 유지했습니다. 이 프로토콜은 생물학자가 공개적으로 사용 가능한 웹 기반 도구만 사용하여 인핸서 식별 프로세스를 안내하도록 설계되었습니다. 후성유전학적 및 염색질 상호작용 데이터를 통합함으로써, 여기에 설명된 접근법은 추가적인 실험적 검증을 위해 잠재적 인핸서에 대한 가설을 생성할 수 있는 실용적인 프레임워크를 제공합니다.

프로토콜

참고: 단계별 안내는 https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow 에서 확인할 수 있습니다. 프로토콜에 사용된 데이터는 표 1 및 표 2 에 요약되어 있습니다.문제 해결은 보충 파일 1에서 사용할 수 있습니다.

1. GoI 찾기(그림 1)

1. EnsEMBL 게놈 브라우저(https://www.EnsEMBL.org)를 엽니다.
2. 종 및 버전과 일치하는 적절한 게놈 어셈블리를 선택합니다.
3. 검색창에 GoI를 입력하고 Go를 클릭합니다.
4. 해당 EnsEMBL 유전자 ID에 대한 링크를 선택합니다.
5. 요약 섹션 아래에 있는 Region in details(세부 정보 탭의 지역) 뷰어에 대한 링크를 클릭하여 GoI를 둘러싼 지역을 탐색합니다.

2. Enhancer 검출 영역 정의(그림 2)

1. GoI의 인접한 두 유전자를 식별하여 검출 영역을 정의합니다. 유전자 범례(Gene Legend) 트랙을 사용하여 이러한 유전자를 검색하며, 이러한 유전자는 GENCODE의 기본 유전자 주석(Basic Gene Annotations from GENCODE) 트랙에서 병합된 EnsEMBL/Havana와 관련된 시각적 요소로 주석이 추가됩니다. < 및 > 기호로 GoI의 방향성을 GENCODE 트랙에서 적절한 유전자 이름으로 결정합니다.
2. 클릭하고 드래그하여 이러한 유전자 사이의 유전자 간 영역을 선택하고 팝업 상자에서 영역으로 이동을 클릭하여 선택한 영역을 시각화합니다. 이 단계를 반복하여 언제든지 관심 영역을 재정의할 수 있습니다.
3. (선택 사항) 트랙 뷰어 상단에서 Add/remove tracks(트랙 추가/제거 )를 선택하여 디스플레이를 사용자 지정합니다. 트랙 뷰어 위의 확대/축소/탐색 컨트롤을 사용하여 확대/축소 수준을 조절합니다.

3. 히스톤 마크 분석 (그림 3)

1. Region in Detail(지역 세부 정보) 탭 뷰어의 사이드바에서 Configure this page(이 페이지 구성)를 선택합니다.
2. Configure Region Image(영역 이미지 구성) 탭 디스플레이의 사이드바에 있는 Regulation(규제) 드롭다운에서 Activity by Cell/Tissue(셀/조직별 활동)를 선택합니다.
3. Cell/Tissue 검색창을 사용하여 관심 조직을 검색하고 선택합니다. 또는 검색 창 아래의 알파벳순 탐색 모음을 사용하여 관심 있는 조직을 찾습니다.
4. 세포/조직 옆에 있는 실험 탭을 선택합니다.
5. H3K4me1 및 H3K27ac를 인핸서 마커로 선택하고 H3K4me3을 프로모터 마커로 선택합니다.
6. 트랙 표시 구성을 선택합니다.
7. 트랙 보기를 선택하여 인핸서 감지 영역의 H3K4me1 표시 영역과 GoI 업스트림의 H3K4me3 표시 영역을 시각화합니다.
8. 인핸서 후보의 경우, 새로 추가된 H3K4me1 트랙에서 색상이 지정된 시각/상자 요소를 클릭하여 정의된 검출 영역 내에서 H3K4me1로 표시된 게놈 영역의 좌표를 검색합니다. 이것은 "Hists & Pols" 팝업을 나타내며, 여기에는 염기쌍(bp)에서 원소의 게놈 위치에 대한 정보가 포함되어 있습니다.
   1. H3K4me1 및 H3K27ac의 컬러 비주얼/박스 요소가 겹치는 H3K4me1 영역을 선택하여 활성 인핸서 후보를 검색합니다. 확대/축소 수준의 세분성은 이 트랙에 표시되는 인핸서 후보의 수에 영향을 줄 수 있습니다.
   2. 또는 트랙을 클릭하고 드래그하여 각 게놈 특징에 대한 관심 영역을 수동으로 정의하여 H3K4me1/H3K27ac 트랙 아래의 그래프 피크를 캡슐화할 수 있습니다. 게놈 위치 좌표를 텍스트 파일에 복사하고 .bed 형식으로 저장합니다.
9. 마찬가지로, 프로모터 영역의 경우 H3K4me3 트랙을 사용하여 3.8단계를 반복하고 GoI의 업스트림 영역에 초점을 맞춥니다.

4. 염색질 형태 포획(Hi-C) 분석(그림 4)

1. 4DN 데이터 포털(https://data.4dnucleome.org/)에 액세스합니다. 4DN 홈페이지의 기본 누적 막대 차트(그림 5)에서 실험 세트가 Y축으로 선택되었고, 실험 유형이 X축으로 선택되었으며, 플롯이 유기체별로 그룹화되어 있는지 확인하십시오.
2. 기본 막대 차트의 X축을 따라 in situ Hi-C 막대를 찾습니다. Human Experiment Sets 에 대해 그룹화된 막대 부분을 클릭한 다음 팝업에서 Browse 버튼을 클릭합니다. 왼쪽 패널을 사용하여 관련 데이터 세트를 필터링합니다.
3. 관심 조직에 대한 관련 Biosample의 Title 열에 있는 링크를 클릭합니다.
4. Processed Files 탭에서 Explore Data를 클릭하여 Hi-C 데이터셋을 자세히 살펴봅니다.
5. 관심 조직에서 식별된 promoter의 좌표를 입력하고(3.9단계에서) 히트맵을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 영역을 수평으로 표시합니다(그림 4). 추가된 선은 프로모터 영역이 히트맵에서 시각적으로 추적되도록 합니다. 선을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 horizontal/vertical rule 및 Close Series를 선택하여 실수로 줄을 제거합니다.
6. 실험적으로 검증된 모든 제어 인핸서²³ 의 좌표를 입력하여 최소값을 기준으로 상호 작용 임계값을 계산합니다. 이러한 control enhancers는 이전에 promoter 영역과 상호 작용하는 것으로 확인되었으며, 최소 유의한 상호 작용을 정의하기 위한 벤치마크 역할을 합니다.
7. 매트릭스 오른쪽에 있는 색상 키에 따라 가장 낮은 0이 아닌 상호 작용 점수를 기반으로 control enhancers를 사용하여 promoter-enhancer 임계값을 정의합니다.
8. 모든 H3K4me1 관련 영역의 게놈 좌표를 입력하고(3.8단계부터) Hi-C 히트맵에 세로로 표시합니다. 이를 통해 H3K4me1로 표시된 인핸서(수직)와 프로모터 영역(수평) 사이의 교차점을 검사하여 유의미한 상호 작용을 확인할 수 있는 교차 확인 패턴을 수행할 수 있습니다.
   1. 그런 다음 H3K4me3로 표시된 영역의 상호 작용 점수를 상호 작용 임계값과 비교하여 약하게 상호 작용하는 영역을 필터링합니다(4.6단계).
   2. 4DN 포털 히트맵에 정의된 임계값보다 높은 상호 작용 빈도를 나타내는 게놈 좌표를 선택합니다. 이러한 영역은 히트맵에서 더 집중된(더 어두운) 신호로 나타나며 BED 형식으로 저장됩니다.

결과

제시된 프로토콜의 사용을 설명하기 위해 인간 심장의 TBX5 유전자를 조사하고 H3K4me1, H3K27ac 및 Hi-C 데이터를 포함하는 포괄적인 워크플로우를 사용하여 TBX5 관련 인핸서를 탐색했습니다. TBX5 는 4개의 방(four chambers)의 형성과 중격 분리(septum separation²⁴)를 포함하여 사지와 심장의 발달에 기여하는 유전자입니다. 이 유전자의 돌연변이는 홀트-오람 증후군(Holt-Oram syndrome, HOS)의 주요 원인이며, 이는 사지 기형과 중격 결손(septum defectum)을 포함한 선천성 심장 질환(CHD)을 유발한다²⁴. TBX5 관련 심장 강화제의 돌연변이는 CHD²⁴에 결정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 이전 연구에서는 인간 심장 특이적 조직에서 3가지 알려진 TBX5 인핸서, 즉 "Enhancer 2", "Enhancer 9" 및 "Enhancer 16"(보충 파일 2)을 발견했으며, 이는 형질전환 마우스²³에서 비교 표현형을 갖는 것으로 입증되었습니다.

TBX5 유전자 자리에서 추정 인핸서를 회수하기 위해 인간에서 TBX5의 다운스트림과 업스트림에 있는 두 개의 측면 유전자인 RBM19와 TBX3 사이의 H3K4me1 및 H3K27ac 농축 영역을 조사했습니다(그림 1 및 그림 2). 심장 특이적 강화인자를 식별하기 위해 심장 근육 세포를 선택했습니다. 추정되는 TBX5 심장 증강 부위를 좌표(chr12: start-end)로 검색하고, H3K4me1 및 H3K27ac 관련 부위 22개를 식별했습니다(그림 3 및 보충 파일 3). 추정되는 TBX5 심장 강화제는 EnsEMBL 게놈 데이터베이스에서 4DNucleome 데이터베이스에 보관된 Hi-C 데이터를 상호 참조하기 위해 검색되었습니다(그림 4). 이는 잠재적 인핸서와 TBX5 심장 프로모터 사이의 가능한 상호 작용을 측정하기 위해 수행되었습니다. 여기에 기술된 프로토콜에 따라, 22개의 게놈 영역 중 21개가 심장 근육 세포에서 TBX5 프로모터(chr12: 114400143-114410103)와 상호 작용하는 것으로 확인되었다(보충 파일 4). 프로모터와 물리적 상호작용이 없는 영역이 하나 있었습니다(그림 4, 단계 4.8). 마지막으로, 우리는 이 프로토콜을 생물학적으로 검증된 인핸서 및 심장 인핸서의 현재 골드 스탠다드 데이터베이스인 VISTA Cardiac Enhancers Browser와 비교한 결과, 현재 데이터베이스에 포착되지 않은 추가 인핸서를 밝혔습니다²⁵.

여기에 제시된 프로토콜로 검색된 21개의 TBX5 인핸서를 기존 데이터베이스와 교차 비교했습니다. VISTA Cardiac Enhancer Browser(Supplementary File 5)에서 4개의 TBX5 인핸서를 검색했습니다²⁵. VISTA에서 식별된 4개의 심장 강화제 중 3개의 강화제인 hs2329, mm1282 및 m370은 이 웹 기반 강화제 감지 프로토콜에 의해 식별된 영역과 중복되었습니다(그림 5). 예측된 각 인핸서는 이전에 실험적으로 검증된 인핸서 Smemo et ^al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) 및 Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38)과 게놈 영역을 공유했지만, Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38)와 중복되지 않았습니다. VISTA로 확인된 인핸서 중 하나인 hs498은 해당 영역이 H34Kme1 마크와 부분적으로 겹쳤음에도 불구하고 이 프로토콜 또는 Smemo et al.의 실험적으로 검증된 인핸서²³(그림 5)에 의해 예측된 인핸서와 겹치지 않았습니다. 마찬가지로, Enhancer 9는 이 파이프라인에 의해 예측된 Enhancers와 겹치지 않았지만 H3K4me1 마크와 연관되어 있었습니다(그림 5).

그림 1: EnsEMBL 게놈 브라우저에서 GoI를 찾기 위한 단계별 가이드. 사용자는 먼저 EnsEMBL 홈페이지(1.1)를 열고 종(Human)을 선택한 다음 검색창에 유전자를 입력합니다(1.2-1.3). 결과 목록에서 적절한 유전자 ID(1.4)가 선택되고 유전자 요약 페이지가 열립니다. 그런 다음 사용자는 Region in Detail 하이퍼링크(1.5)를 클릭하여 인접 요소 및 조절 기능을 포함하여 GoI를 둘러싼 게놈 영역을 시각화합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: EnsEMBL Genome Browser를 사용하여 GoI 주변의 인핸서 검출 영역 정의. 인핸서 검출 영역을 정의하려면 유전자가 병합된 EnsEMBL/Havana 주석으로 표시된 짙은 노란색 블록으로 표시되는 GENCODE 트랙의 Basic Gene Annotations 를 사용하여 GoI 옆에 있는 두 개의 인접 유전자를 식별합니다. 각 유전자의 전사 방향은 유전자 이름(2.1) 옆에 화살촉(< 또는 >)으로 표시됩니다. 인접 유전자 사이의 intergenic region을 선택하려면 관심 영역을 클릭하고 드래그한 다음 팝업 상자에서 Jump to region(영역으로 이동 )을 선택하여 확대합니다(2.2). 규정 또는 인핸서 관련 주석을 추가하려면 트랙 추가/제거 (2.3)를 클릭합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: EnsEMBL Genome Browser를 사용한 인핸서 검출 영역에서 히스톤 변형 트랙 구성. 왼쪽 도구 모음에서 이 페이지 구성 (3.1)을 클릭하여 트랙 구성 패널에 액세스하고 규정 섹션(3.2) 아래의 "세포/조직별 활동"으로 이동합니다. 열린 탭에서 "실험" 섹션(3.3)을 선택하고 세포/조직 검색 창을 사용하여 관심 조직(심장 근육 세포)을 찾아 선택합니다(3.4). 히스톤 마크 패널(3.5)에서 H3K4me1 및 H3K27ac를 활성 인핸서 마크로, H3K4me3를 프로모터 마크로 활성화한 다음 "트랙 디스플레이 구성"(3.6)을 클릭합니다. 트랙 선택을 확인한 후 "트랙 보기"(3.7)를 클릭하여 게놈 뷰어로 돌아갑니다. 히스톤 마크 피크는 이제 검출 영역(3.8)에서 해당 조직 레이블(노란색: H3K4me1, 파란색: H3K27ac 및 주황색: H3K4me3) 아래에 컬러 블록으로 표시됩니다. "Hists & Pols" 팝업은 염기쌍(chr:start-end)으로 영역의 게놈 좌표를 포함하며, 다운스트림 분석을 위해 복사 및 저장할 수 있습니다. "Hists & Pols" 팝업은 트랙에서 색상이 지정된 요소를 클릭하면 나타납니다. 팝업에는 염기쌍(예: 프로모터 영역의 경우 chr12:11443450-114451611)으로 영역의 게놈 좌표가 포함되어 있으며, 다운스트림 분석(3.8)을 위해 복사 및 저장할 수 있습니다. 마찬가지로, 후보 인핸서를 추출하려면 트랙 전체에 걸쳐 피크와 박스의 수직 정렬에서 볼 수 있듯이 H3K4me1 및 H3K27ac 피크가 겹치는 영역의 우선 순위를 지정합니다(3.9). 겹치는 영역은 상자를 클릭하거나 정렬된 피크를 가로질러 수동으로 클릭하여 드래그하여 영역을 정의할 수 있습니다(예: 활성 후보 영역의 경우 chr12:114400143-114410103). 팝업에 표시된 좌표는 다운스트림 유효성 검사 또는 시각화를 위해 BED 형식으로 저장해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 4D Nucleome Data Portal의 Hi-C 히트맵을 사용한 promoter-enhancer 염색질 상호 작용 시각화. 4D Nucleome Data Portal 홈페이지에는 유기체별로 사용 가능한 실험 유형을 요약한 누적 막대 차트가 표시됩니다. 인간 샘플에 대한 "in situ Hi-C" 데이터 세트는 막대의 해당 섹션(4.1)을 클릭하여 선택합니다. 관련 데이터 세트의 필터링된 목록이 표시됩니다. 심장 근아세포로 분화된 H9 세포에서 파생된 Hi-C 데이터 세트가 선택됩니다(4.2). 선택한 데이터셋(4.3)은 데이터 탐색 버튼(4.4)을 통해 HiGlass 브라우저에서 열립니다. 관심 게놈 영역은 좌표 상자(4.5)에 입력되고 접촉 매트릭스는 색상 스케일링된 히트맵으로 렌더링됩니다. 어두운 색상(짙은 빨간색에서 검은색)은 더 강한 염색질 접촉 빈도를 나타내고 더 밝은 색상(흰색에서 주황색)은 더 약한 상호 작용을 나타냅니다. 수평 규칙은 프로모터 좌표에 배치되고 수직 규칙은 실험적으로 검증된 3개의 제어 인핸서(4.6)의 위치에 그려집니다. 이러한 교차점은 promoter-enhancer 접촉(4.7) 중에서 가장 강한 가시 신호(가장 어두운 색상)에 의해 설정되는 엄격한 상호 작용 임계값을 정의하는 데 사용됩니다. 후보 H3K27ac 및 H3K4me1 표시 인핸서의 위치에서 추가 수직 규칙이 그려집니다(3.8단계에서). promoter-enhancer 교차점이 임계값과 같거나 어두운 후보는 유지되는 반면 신호가 약한 후보(더 밝은 색상 사각형)는 제외됩니다(4.8). 유지된 좌표는 수동으로 추출되어 다운스트림 분석을 위해 BED 형식으로 저장됩니다. (a. 인핸서 2, b. 인핸서 9 및 c. 인핸서 16) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 예측된 TBX5 인핸서의 게놈 브라우저 보기와 VISTA 검증 심장 인핸서 및 대조군 인핸서와 비교. 게놈 브라우저 스냅샷은 웹 기반 프로토콜에 의해 검색된 예측된 인핸서(아래)와 VISTA 검증 인핸서(위) 및 실험적으로 검증된 제어 인핸서(가운데)를 비교하여 인핸서 검색 범위(STEP 2)를 표시합니다. 메인 패널에는 심장 근육 세포 특이적 H3K4me1(노란색), H3K27ac(파란색) 및 H3K4me3 피크(주황색)를 포함하여 주석이 달린 조절 요소가 있는 전체 게놈 자리가 표시됩니다. 세 개의 확대된 그림은 프로토콜, VISTA 및 제어 향상기에 의해 검색된 정렬을 캡처합니다. Control Enhancers와의 중복은 빨간색 상자로 표시됩니다. 각 하위 영역에 대한 좌표는 아래쪽 브라우저 패널에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 연구에 사용된 데이터. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 연구에 사용된 웹 기반 도구. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: EnsEMBL Genome Browser에 대한 문제 해결 지침. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: GRCh38 형식의 BED 파일, 실험적으로 검증된 TBX5 심장 조절 강화제²³. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: GRCh38 형식의 BED 파일, STEP3에 의해 Ensembl에서 검색된 TBX5 심장 강화제. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: GRCh38 형식의 BED 파일, Ensembl에서 STEP4에 의해 검색된 TBX5 심장 강화제. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 5: GRCh38 형식의 BED 파일, VISTA 심장 강화제 브라우저²⁵에서 검색된 TBX5 심장 강화제. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 설명된 웹 기반 프로토콜은 enhancer 예측이 아닌 enhancer 검색을 위한 워크플로우로 작동합니다. 공개적으로 사용 가능한 조직 관련 데이터 세트, 히스톤 변형(H3K4me1 및 H3K27ac) 및 Hi-C 상호 작용 데이터를 활용하여 GoI와 관련된 잠재적 인핸서를 좁힙니다. 기계 학습 또는 시퀀스 기반 모델에 의존하는 계산 예측 도구와 달리 우리의 접근 방식은 실험 데이터만을 기반으로 인핸서를 검색하는 데 중점을 둡니다. EnsEMBL 게놈 브라우저에 대한 문제 해결 지침은 보충 파일 1에 제공됩니다.

이 워크플로우는 히스톤 마크 및 염색질 상호작용 데이터와 같은 핵심 요소를 통합하며, 이는 ChIA-PET 및 PLAC-seq와 같은 고급 방법과 유사하며, 더 높은 정확도로 인핸서-프로모터 상호작용을 매핑합니다^10,11. 그러나 이 방법은 고해상도 실험 기법이 실현 가능하지 않은 경우 프로토콜이 리소스 집약적이지 않고 상당한 시간을 절약할 수 있기 때문에 유용합니다.

위에 제시된 접근 방식의 주요 한계는 기존 데이터 세트의 가용성과 품질에 의존한다는 것이며, 이는 검색된 상호 작용의 정밀도에 영향을 미칠 수 있습니다. TBX5 관련 유전자 돌연변이의 맥락에서 심장 발달 중 인핸서 활성을 조사하려면 조직 특이적 해상도가 필요합니다. 이러한 분석을 위해서는 배아 심장 조직이 발달 조절과의 관련성을 감안할 때 가장 적합할 것입니다. 그러나 분석 당시 히스톤 변형 데이터가 공개적으로 사용 가능하지 않은 배아 데이터 세트가 포함되지 않았습니다. 이를 설명하기 위해 ENCODE, Enhancer Atlas 2.0 또는 EnhancerFinder와 같은 대체 리소스를 통합하면 Enhancer 식별 및 검증을 위한 추가 데이터 세트를 제공하여 파이프라인의 유용성을 확장할 수 있습니다^18,19.

TBX5 REPFIX에서 H3K4me1 기반 분석은 추가 조사를 위한 시작점으로 22개의 추정 인핸서를 밝혔습니다. 후속 Hi-C 분석은 이전 히스톤 변형 표시를 기반으로 한 22개의 인핸서 후보 중 21개가 심장 근육 세포의 TBX5 프로모터와 상호 작용함을 보여주었습니다(그림 5). 이는 관심 영역을 예측하는 데 있어 히스톤 변형 마크 기반 접근 방식의 신뢰성을 뒷받침합니다.

우리는 이 프로토콜에서 종 전반에 걸쳐 염기서열 보존을 우선시하지 않기로 결정했지만, 이는 인핸서를 식별하기 위한 일반적인 기준입니다. 이전에 조직 또는 종 특이적 강화제(enhancer)에 덜 효과적인 것으로 입증되었기 때문에 그 중 많은 부분이 진화 과정에서 강력하게 보존되지 않습니다²⁶. 이를 감안하여, 우리는 기능성 강화제 활성을 보다 직접적으로 나타내는 염색질 기반 마커에 초점을 맞추기로 결정했습니다. 그러나 염기서열 보존은 진화론적으로 중요한 인핸서를 연구하는 것과 같은 특정 상황에서 여전히 가치를 가질 수 있습니다. 이 경우, 보존된 규제 요소에 관심이 있는 사용자를 위한 선택적 단계로 추가될 수 있습니다.

이 프로토콜은 기존 플랫폼인 VISTA Cardiac Enhancers Browser로 식별되지 않았던 EnsEMBL 웹사이트에서 TBX5 유전자에 대한 21개의 심장 특이적 인핸서를 검색하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 인핸서 중 하나인 hs498을 검색할 수 없어 검출 제한 가능성을 시사했지만, 이 접근 방식은 VISTA Cardiac Enhancers Browser에서 감지되지 않는 일부 인핸서를 발견했습니다. 그러나 프로토콜이 선별된 VISTA 데이터베이스에 비해 더 많은 수의 추정 영역을 생성하므로 검색된 enhancers에 대한 추가 검증이 필요합니다. 이 수치가 높을수록 거짓 긍정의 위험이 증가하며, 예측된 인핸서의 수가 많다고 해서 반드시 특이성이나 기능 관련성이 향상되었음을 나타내는 것은 아닙니다. 유전자 발현 분석, CRISPR 섭동 또는 리포터 분석과 같은 추가 실험 데이터 세트 또는 기능 분석을 통합하는 것은 Smemo 등에서 수행된 바와 같이 이러한 후보의 생물학적 유효성을 확인하는 데 매우 중요합니다." s 연구²³.

실험적으로 검증된 3개의 인핸서(enhancer)에 대한 교차 비교는 예측된 영역과 부분적으로 중복되는 것으로 나타났습니다(그림 5). 예측된 인핸서 "e1"은 검증된 인핸서 2보다 더 광범위하게 포지셔닝된 반면, "e18"은 인핸서 16과 부분적으로 겹치는 것으로 나타났습니다(그림 5). 이러한 결과는 이 접근 방식이 알려진 조절 활성이 있는 영역을 성공적으로 식별한다는 것을 시사하지만, 예측된 인핸서의 더 넓은 범위는 인핸서 경계의 유연성을 반영할 수 있습니다. 인핸서(Enhancer)는 종종 모듈러 요소(modular elements)로 기능하며, 이들의 활성은 염색질 상황(chromatin context), 세포 유형(cell type) 및 발달 타이밍(developmental timate)에 따라 달라질 수 있다 ^2,27. 그러므로, 예측된 영역에는 조절 기능에 기여하는 인접 서열을 가진 핵심 활성 부위가 포함될 수 있지만, 이러한 광범위한 예측의 어느 부분이 조직 특이적 또는 발달적 맥락에서 기능적으로 활성화되는지를 결정하기 위한 실험적 검증이 필요함에도 불구하고. VISTA Cardiac Enhancer Browser는 정의된 범위 내에서 4개의 영역을 식별했지만, 특히 H3K4me1로 표시된 영역에서 실험적으로 검증된 인핸서인 Enhancer 16과 부분적으로 겹치는 인핸서인 mm370 하나뿐이었습니다(그림 5)²³. 인핸서(16)와 중첩되지 않는 mm370의 나머지 부분은 인핸서(^28,29)의 비기능적 또는 비활성 소영역을 나타낼 수 있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
컴퓨터 워크스테이션	해당 사항 없음	해당 사항 없음	웹 브라우저 지원 컴퓨터, Windows/Mac/Linux 운영 체제
4DN 데이터 포털	4DN 데이터 포털	https://data.4dnucleome.org/
은하	은하	https://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445
기피	기피	https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow
비스타	VISTA 심장 강화제 브라우저	https://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/