방법 논문

Triticum aestivum 및 Zea mays 의 구조적 특성 평가: Free hand 및 Semi-thin Section을 사용한 C3 및 C4 광합성 분화

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DOI:

10.3791/66843

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2024년 7월 12일

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

이 논문에서

요약

C3 및 C4 잎 단면 사이의 해부학적 차이를 평가하면 광합성 효율을 이해하는 데 도움이 됩니다. 이 논문은 Triticum aestivum 및 Zea mays 작물 종에 대한 준비 시 주의 사항과 함께 자유형 및 반얇은 잎 단면 준비 및 검사에 대해 설명합니다.

초록

C3 메커니즘에 비해 C4 광합성의 향상된 효율성은 번들 시스 셀에서 CO2 를 농축하는 능력에서 비롯됩니다. C4 광합성의 효과와 고유 물 사용 효율은 mesophyll 및 bundle leaf cell의 점유율, bundle sheaths의 크기 및 밀도, bundle sheath cell의 크기, 밀도 및 세포벽 두께와 직접적인 관련이 있습니다. 이러한 형질에 대한 신속한 현미경 분석은 기존의 광학 현미경을 사용하여 자유 및 반박형 절편에서 수행할 수 있으며, 특정 세포 유형을 식별하고 검사함으로써 C4 작물의 광합성 효율성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 또한 해부학적 측정 및 세포 유형 진단에 영향을 미치는 프리핸드 및 반박형 절편 준비의 오류와 이러한 오류를 방지하는 방법을 보여줍니다. 이 현미경적 접근 방식은 환경 변화에 대한 광합성 적응에 대한 통찰력을 수집하는 효율적인 수단을 제공하고 미래 기후를 위해 작물을 신속하게 선별하는 데 도움이 됩니다.

서론

광합성은 빛 에너지가 화학 에너지로 변환되는 기본 과정으로, 육상 영양 네트워크의 초석 역할을 합니다. 대부분의 식물은 광합성의 C3 경로를 따르며, 여기서 주요 광합성 생성물은 3 탄소 화합물 인 3- 인산입니다. C3 광합성은 20 억 년 전에CO2가 풍부하고O21이 낮은 대기에서 진화했습니다. 이러한 조건에서 진화한 핵심 광합성 효소 리불로스 1,5 비스포스페이트 카르복실라아제/산소화효소(Rubisco)는O2와 경쟁적으로 반응하여 광호흡2를 시작하기 때문에 현재의 낮은CO2 높은O2 조건에는 최적이 아닙니다. 광호흡은 에너지를 생산하고CO2를 부산물로 방출하는 대신 에너지를 소비하는 낭비적인 경로입니다. 결과적으로, 산소화를 방지하기 위해 엽록체에서 Rubisco 주변의 높은 CO2 농도를 유지하는 것이 중요합니다 3,4. C3 식물이 CO2 를 농축 할 수 없기 때문에 주변 공기에서 엽록체로CO2 가 크게 감소하여 광합성을 억제하고 식물 성장 및 바이오 매스 생산에 영향을 미칩니다 2,5,6.

C3 식물에서 광합성은 기공을 통한 CO2의 진입, 중엽을 통한 확산 및 광합성 효소의 생화학 활성에 의해 제한됩니다. CO2 의 진입은 먼저 기공 전도도에 의해 제한되며, 이는 기온 및 습도와 같은 환경 조건에 의해 제어됩니다. 그런 다음 CO2 는 잎의 내부 기체 및 액체 상태를 통해 Rubisco7로 확산됩니다. C3 식물에서 광합성의 모든 단계는 중엽막 세포의 엽록체에서 발생하며 식물은 대기에서 엽록체로 CO2 의 지속적인 유입을 유지해야합니다. 엽록체의CO2 가용성이 기공 개방성, 중엽막 구조, 개별 세포 및 엽록체 특성에 의존하는 것은 식물을 낮은 물 가용성 및 고온과 같은 광합성에 궁극적으로 영향을 미치는 환경적 제약에 취약하게 만듭니다 7,8,9,10, 특히 기후 변화 조건에 대한 취약성을 강조합니다 11.

C3 경로의 비효율성으로 인한 문제와 최적의 CO2 수준 유지의 한계 및 환경 요인에 대한 민감성을 감안할 때 특정 식물에서는 또 다른 경로 인 C4 광합성 경로가 발전했습니다. 특징적으로, C4 식물은 공간적으로 분리 된 두 개의 생화학적 경로를 가지고 있습니다. 초기 CO2 고정은 포스포에놀피루베이트 카르복실라아제에 의해 메소필 세포에서 발생하며, 이는 Rubisco보다 CO2에 대한 친화력이 높고 산소화 활성도 부족합니다. 형성된C4 생성물은 번들 시스 셀로 추가로 운반되어 탈카르복실화되고CO2는 다시 방출되어 Rubisco (C3 광합성)12,13,14에 의해 고정됩니다. CO2 및 다발 피복 세포의 두꺼운 세포벽에 대한 PEP 카르복실라제의 더 큰 친화력은 다발 피복 세포에서 CO2 농도를 허용하므로 C4 식물은 CO2 고정과 Calvin 회로를 공간적으로 분리하여 광 호흡을 최소화합니다. C4 경로의 채택은 환경 제약에 대한 자연의 적응 반응을 보여주며, 변화하는 기후 조건에서 작물 생산성과 회복력을 개선하기 위한 잠재적 전략에 대한 통찰력을 제공합니다15.

C4 식물의 잎 구조의 전문화 된 해부학은 엽록체를 포함하는 확대 된 혈관 다발 수초 세포로 둘러싸인 정맥과 다발 외피 세포 주위를 패턴화하는 외부 고리에 중엽 세포의 방사형 배열이 특징입니다. mesophyll cell은 bundle sheath cell에 매우 근접하여 두 세포 유형 간에 대사 산물의 빠르고 지속적인 수송을 가능하게 합니다. 이 세포의 배열은 C4 식물의 전형이며 Kranz 해부학16이라고합니다. C3 종에서 mesophyll cell의 전문화와 배치는 다양 할 수 있지만 bundle sheath cell은 뚜렷하게 작고 엽록체가 적거나 엽록체가 전혀 없습니다. 특정 Kranz 해부학은 C3- 카르복실화 효소 Rubisco가 위치한 번들 시스 세포의 엽록체에 CO2 를 농축 할 수있게하여 광 호흡을 효과적으로 방해합니다 4,17,18. 겉보기에 복잡한 배열에도 불구하고, 이러한 변화는 속씨식물의 진화에서 독립적으로 여러 번 발생했으며, 이는 상대적으로 실현 가능한 진화 경로임을 나타냅니다 19,20,21, 다양한 분류군이 C3 와 C4 개의 탄소 대사 사이의 중간 단계에 있는 것으로 나타났으며, 이는 C3-C 4 또는 C 2 라고 합니다. CO2 2 22,23,24,25를 집중하고 재동화하는 능력을 가짐.

많은 C4 식물은 경제적 중요성이 높은 작물이며, 기후 탄력성을 개선하고 수확량을 확보하기 위해 쌀과 같은 C3 작물을 유전자 조작하는 것이 지난 수십 년 동안 관심의 주제였습니다26,27. 그러나 공학적 노력에는 C4 특수 해부학과 광합성을 제어하는 방법에 대한 자세한 이해가 필요합니다 2,28.

C4 Kranz 해부학을 확립하는 것은 C4 광합성을 C3 작물25로 엔지니어링하는 야심 찬 목표를 달성하기 위한 전제 조건입니다. 그러나 Kranz 해부학적 구조의 규정과 주요 해부학적 특성을 신속하게 선별하는 방법에 대한 현재의 이해는 제한적이어서 하이브리드 종을 식별하기가 어렵습니다. 이전 연구는 C3 및 C4 식물에서 광합성 효율을 조절하는 주요 형질이 정맥 간 거리, 다발 외피 복합체의 직경 및 다발 수초 세포의 크기를 포함한다는 것을 보여주었습니다14,29. 이러한 형질은 자유 절편을 사용하여 쉽게 스크리닝할 수 있으며 반박형 절편을 사용하여 정량적으로 분석할 수 있습니다. 여기에서는 자유형 십자가 및 광학 현미경을 통해C3 및C4 해부학적 분화 진단을 가능하게 하는 특성, 즉 번들 외피 면적, 정맥 간 거리 및 정맥 빈도를 평가하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. 식물 성장 조건

  1. 밀 (Triticum aestivum L. Var. Winter Wheat, "Fredis")과 옥수수 (Zea mays L. Var. Saccharata, "Golden Bantam")를 각각 대표적인 C3 및 C4 식물로 선택합니다. 환경 제어 성장 챔버에서 씨앗으로 두 식물 종을 모두 성장시킵니다.
  2. 55시간의 조명 기간으로 25°C/18°C(낮/밤)의 공기 온도와 함께 상대 습도를 12%로 유지합니다. 식물 표면에서 광합성 광자 플럭스 밀도(Q)를 1200μmol/m2/s로 유지하여 자연적인 성장 조건을 나타냅니다. 주변 CO2 농도 400μmol/mol에서 모든 식물을 키웁니다.
  3. 증류수로 2일 마다 식물에 물을 주고 묘목이 출현한 후 10일 후에 Hoagland의 용액으로 비료를 줍니다. 60일 동안 주어진 조건에서 식물을 키우고 현미경 분석을 위해 완전히 확장된 잎을 사용합니다.

2. 자유 단면의 준비 및 보기

  1. 각 식물에서 성숙한 노화되지 않은 잎 3 개를 선택하여 증류수에 보관하십시오. 새로운 단면 면도날을 사용하여 잎 표면과 직각을 이루도록 한 번의 수평 절단을 하여 단면이 잎 표면에 수직으로 만들어진 가로 단면이 되도록 합니다.
  2. 잎 표본을 치과용 왁스 조각의 유리판에 올려 놓아 샘플을 안정화하고 미끄러지지 않도록 합니다. 칼날을 잎 표본에 똑바로 내려 세포를 깨끗하게 절단하여 자릅니다. 단면을 증류수에 보관하십시오.
  3. 샘플을 물방울에 놓고 현미경으로 보고 이미징할 수 있도록 유리 커버슬립으로 덮어 유리 슬라이드에 장착합니다. 기포를 가두지 마십시오.
  4. 복합 광학 현미경으로 10x 및 20x 배율로 슬라이드를 볼 수 있습니다. 소프트웨어 가이드에 따라 관련 축척과 함께 이미지를 저장하십시오.

3. 반박형 절편의 준비

  1. 2.2단계와 같이 유리판에서 Z. mays 와 T. aestivum 의 잎에서 중간 갈비뼈를 따라 늑간 영역에서 약 3mm x 5mm 크기의 단면을 자릅니다. 절단된 부분의 길이가 잎의 결을 따라 이어지는지 확인하십시오.
  2. 식물 재료를 1mL의 고정 완충액(0.1M 인산염 완충액의 4% 글루타르 알데히드, pH = 6.9, 표 1)이 있는 주사기에 넣습니다.
  3. 주사기를 수직으로 잡고 공기를 제거한 다음 끝 부분에 손가락을 대고 주사기를 펌핑하여 진공을 만듭니다. 샘플이 주사기 바닥에 놓일 때까지 반복하여 성공적인 침투를 나타냅니다.
  4. 주사기의 내용물을 라벨이 부착된 유리 바이알로 옮기고 다음 단계 전에 48시간 동안 4°C에서 보관합니다(표 2).
  5. 각 바이알에 대해 피펫으로 정착제를 부드럽게 제거하고 샘플이 덮일 때까지 인산염 완충액을 추가합니다. 30분 동안 그대로 두십시오. 이 단계를 3번 반복합니다.
  6. 피펫으로 인산염 완충액을 제거하고 샘플이 덮일 때까지 사산화오스뮴(주의)을 추가합니다. 샘플 및 기타 유기물은 검게 변합니다. 이중 장갑을 사용하십시오. 1시간 동안 그대로 두십시오.
  7. 피펫으로 이전 용액을 제거하고 샘플을 증류수로 덮습니다. 30분 동안 그대로 두었다가 이 단계를 3번 반복하고 이중 장갑을 사용합니다.
  8. 피펫으로 이전 용액을 제거하고 샘플을 50/50 증류수-에탄올 용액으로 덮습니다. 30분 동안 그대로 두십시오. 100% 에탄올에서 30/70, 20/80, 10/90 및 2x 시리즈의 증류수-에탄올 용액으로 이 단계를 반복합니다. 이러한 용액의 샘플은 4°C에서 밤새 방치할 수 있습니다.
  9. 피펫으로 이전 용액을 제거하고 샘플을 1/3 수지-에탄올 용액으로 덮습니다. 샘플을 믹서 플레이트에 놓고 2시간 동안 그대로 둡니다. 100% 수지에서 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 및 2x 시리즈의 수지-에탄올 용액으로 이 단계를 반복합니다. 이러한 용액의 샘플은 4°C에서 밤새 방치할 수 있습니다.
  10. 플랫 임베딩 금형의 캐비티(캐비티 16개, 캐비티 치수: 14 L x 4.8 W x 3 D (mm))를 100% 레진으로 덮고 샘플을 캐비티의 한쪽 끝에 놓습니다. 각 샘플에 대해 연필로 쓴 종이 라벨을 준비하고 캐비티의 다른 쪽 끝에 놓습니다.
  11. 모든 캐비티를 100% 레진으로 완전히 채우고 샘플과 라벨이 움직인 경우 곧게 펴십시오. 금형을 임베딩 필름으로 덮고 아크릴 수지 제품 지침에 따라 오븐에서 중합합니다.
  12. 중합된 블록을 샘플과 함께 초박절편기의 표본 홀더에 놓습니다. 티슈가 보이고 과도한 수지가 제거될 때까지 거친 유리 칼을 사용하여 블록을 자릅니다.
  13. 유리나 다이아몬드 나이프를 사용하여 반얇은 부분을 가로(1μm) 자릅니다. 물 표면에서 금속 접종 루프를 사용하여 단면을 수집하고 유리 슬라이드에 놓습니다. 핫플레이트(60°C)에서 슬라이드를 건조시켜 섹션을 유리에 고정합니다.
  14. 고정 부분을 톨루이딘 블루(1% 수용액)로 5초 동안 염색한 후 증류수로 헹구고 핫 플레이트에서 다시 건조시킵니다.
    알림: 화학 물질 고정 과정이 흄 후드 아래에서 수행되는지 확인하십시오. 유리 칼은 찢어지거나 뒤틀림이 없는 부분을 허용하는 날카로운 절단을 보장하기 위해 주기적으로 교체해야 합니다.

4. 샘플의 이미징

  1. 신선한 잎 단면의 이미징
    1. 설명서에 따라 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 복합 광학 현미경을 설정합니다.
    2. 유리 슬라이드를 무대에 놓습니다. 접안렌즈를 조정하고 view 10x에서 단면을 얻어.view 그런 다음 20x 및 40x 대물렌즈에서.
    3. 각 목표에서 Live channel을 탐색하고, 관심 영역에 초점을 맞추고, 정맥 주변의 bundle sheath cell을 찾습니다.
    4. 초점이 맞춰지면 Freeze 버튼을 클릭하고 Tools 탭에서 Scale Bar 버튼을 눌러 스케일을 추가합니다. 에 이미지를 저장합니다. 이미지 분석을 위한 TIF 형식입니다.
  2. 수지 침투 절편의 이미징
    1. 컴퓨터에 함께 제공되는 소프트웨어와 연결하여 자동 광학 현미경을 설정합니다.
    2. 투명 채널을 로드하고 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓습니다. 40x 대물렌즈 배율을 사용하여 해당 부분에 초점을 맞추고 밝기를 조정하여 모든 세포 구조가 보이도록 합니다.
    3. 네비게이터 기능을 사용하여 단면의 위치 영역을 설정하여 전체 단면이 이미지화되도록 하고 스티치 버튼을 클릭합니다.
    4. Done(완료)을 클릭한 다음 Start(시작)를 클릭하여 현미경이 전체 섹션을 이미지화할 수 있도록 합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 열고 현미경으로 촬영한 타일을 엽니다.
    5. 정렬 기능을 사용하여 타일이 겹치지 않도록 합니다. 이미지를 생성한 후 조정 탭을 사용하여 위치, 밝기 및 회전을 조정합니다.
    6. 에 저장하기 전에 이미지의 배율을 인쇄하십시오. TIF 형식으로 저장할 수 있습니다.
  3. ImageJ 소프트웨어를 사용한 해부학적 측정
    1. ImageJ 소프트웨어를 열고 이미지를 창으로 끌어다 놓습니다.
    2. [선] 도구를 사용하여 다음과 같이 축척을 보정합니다. 축척 막대 위에 선을 그리고, 분석 > [축척 설정]을 선택하고, 알려진 거리를 축척 막대의 길이로 변경하고, 길이 단위를 올바른 단위로 변경합니다.
    3. Line Tool을 선택하고 관심 영역을 가로질러 선을 그린 다음 M 키를 눌러 예상 특성을 측정합니다.
    4. 면적 측정의 경우 Polygon Selection Tool 을 선택하고 관심 조직 주위를 그립니다. M 키를 눌러 마칩니다. 측정값은 팝업 창으로 표시되며, 추가 데이터 분석을 위해 스프레드시트에 복사할 수 있습니다.

결과

그림 1A 는 새로운 절편과 광학 현미경 검사를 위해 잎을 절편하기 위한 올바른 방향을 보여줍니다. 단면 면도기와 치과용 왁스 시트를 사용하여 새로운 절편을 절단하는 방법은 그림 1B에서 볼 수 있습니다. 결과 섹션은 그림 1C에 나와 있습니다.

그림 2 는 C3 식물 T. aestivum 및 C4 식물 Z. mays의 대표 잎의 자유형 단면을 보여줍니다. 다발 칼집 세포는 정맥 주변에서 볼 수 있으며, 옥수수는 더 둥글고 더 푸른 세포를 가지고 있어 엽록체의 존재가 더 높다는 것을 나타냅니다. 이 이미지에서 잎 두께와 총 번들 덮개 면적을 얻을 수 있습니다. 그러나, 이 방법으로는 mesophyll의 추가 특성화가 불가능합니다.

그림 3 은 T. aestivum 및 Z. mays의 반박형 단면을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 잎의 모든 조직을 볼 수 있고 측정 할 수 있습니다. Kranz의 해부학은 Z. mays에서 분명하며, 정맥 주위에 중엽 세포가 배열되어 있습니다. 다발 덮개는 확대되고 엽록체로 채워져 있으며, 특히 중엽 세포 쪽으로 집중되어 있습니다. 이를 통해 다발초세포(bundle sheath cell)와 중간층세포(mesophyll cells) 사이의 대사산물을 빠르게 교환할 수 있습니다. 이 이미지로부터 다음과 같은 잎 구조적 특성을 측정했습니다: 작은 정맥과 큰 정맥 사이의 정맥 간 거리, 다발 칼집 직경, 총 다발 칼집 면적, 정맥 면적, 다발 칼집 세포 면적, 500μm 이내의 정맥 빈도 및 잎 두께. 그림 4 의 상자 그림은 T. aestivum 과 Z. mays 사이의 이러한 형질의 차이를 보여줍니다. 한 가지 특성, 즉 큰 정맥 사이의 정맥 간 거리를 제외한 모든 형질은 p-값이 0.05인 95% 신뢰 구간에서 유의< 다릅니다.

그림 4 는 T. aestivum 과 Z. mays 사이의 해부학적 형질 차이를 나타내는 상자 그림 모음을 보여주며,C3 및C4 번들 외피 구조 간의 차이점을 보여줍니다. 작물 종 사이의 정맥 간 거리, 다발 칼집의 직경(동일한 성장 조건에서), 다발 칼집 세포와 비광합성 물질(즉, 정맥)의 비율, 500μm 단면 너비의 정맥 빈도 사이에는 상당한 차이가 있으며, 이 모든 것은 C3 및 C4 잎 해부학 사이에서 예상되는 것을 강력하게 나타냅니다.

그림 5는 샘플을 절단하거나 준비할 때 발생할 수 있는 실수의 몇 가지 예를 보여줍니다. 이 이미지의 잎 해부학적 구조는 가려지거나 변형되어 특성 분석에 신뢰할 수 없습니다. 톨루이딘 블루를 사용한 과염색은 초박절편기로 절단된 부분에서 발생할 수 있으며, 염색이 너무 오래 남아 세포 구조를 모호하게 만들 수 있습니다(그림 5A,B). 수지가 잎 조직에 완전히 침투하지 못하는 침투 프로토콜 중에 일반적인 오류가 발생할 수 있습니다(그림 5C,D). 나뭇결을 따라 절단된 잎 단면은 중간엽 및 다발 외피 세포를 찾을 수 없거나 정확하게 측정할 수 없는 장방형 세포를 생성합니다(그림 5F,G,H).

통계 분석은 상자 그림을 만들기 위해 R (버전 4.3.1)에서 수행되었습니다. 잎의 해부학적 특성은 삼중(식물당 3개의 잎, 종당 3개의 식물)으로 측정되었습니다.

잎 단면 크로마토그래피 설정; 녹색 안료 추출. 안료 분리 단계 다이어그램.
그림 1: 신선한 잎 단면을 절단하는 올바른 방법. (A) 단면을 얻기 위한 잎 단면의 방향. (B) 평평한 치과용 왁스 조각에 단면 면도날을 사용하여 잎을 절단하는 기술. (C) 결과 단면은 유리 슬라이드에 장착하고 현미경으로 볼 수 있는 얇은 잎 조각으로 나타납니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

식물 잎 구조의 단면 현미경, 50μm 및 100μm 스케일, 혈관 조직 세부 정보.
그림 2: 대표 잎의 자유로운 단면. (A) C3 식물 Triticum aestivum (400x 확대); 및 (B) C4 식물 Zea는 (200x 배율)에서 사용할 수 있습니다. 세포 유형은 화살표로 표시되며, 여기서 V = 정맥, BSC = 다발 외피 세포, MC = 중엽 세포입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

조직 및 구조에 대한 라벨과 함께 혈관 다발 단면을 보여주는 식물 해부학 다이어그램.
그림 3: 반박형 단면. (A) Zea mays 및 (B) Triticum aestivum 은 Kranz 해부학이 있는 C4 종(A) 및 Kranz 해부학이 없는 C3 종(B)에서 다발 덮개 및 엽록체 위치의 차이를 보여줍니다. 약어: Tl = 잎 두께, BS = 다발 덮개, SV = 작은 정맥, ID = 정맥 간 거리, LV = 큰 정맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

T-테스트를 사용하여 T. aestivum과 Z. mays를 비교하는 상자 그림; 메트릭에는 SY-HD, LV-ID 및 VBA가 포함됩니다.
그림 4: Triticum aestivum 과 Zea mays 사이의 해부학적 특성 차이를 보여주는 상자 그림. (A) 작은 정맥 사이의 정맥 간 거리, (B) 큰 정맥 사이의 정맥 간 거리, (C) 다발 수막 직경, (D) 총 다발 수초 면적, (E) 정맥 면적, (F) 다발 수초 세포 면적의 분율, (G) 다발 수초 세포 면적, (H) 500μm 이내의 정맥 빈도 및 (I) 잎 두께. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세포 구조와 해부학을 강조하는 식물 조직 단면의 현미경 이미지.
그림 5: 조직 처리에서 발생할 수 있는 일반적인 실수의 예로, 빨간색 화살표로 표시되어 있습니다. LR White 아크릴 수지 (A) Triticum aestivum 및 (B) Zea mays에 내장 된 샘플의 과염색; Spurr의 에폭시 수지에 매립된 단면의 수지 파열: (C) Ceratozamia robusta 및 (D) Dioon mejiae; T. (E) 단면 및 (F) 세로 단면을 보여주는 aestivum 자유형 단면; (G) Annona muricata 및 (H) Encephalartos villosus의 비스듬한 절단으로 인한 절편의 편향. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

용액준비최종 볼륨
버퍼 1의 기준7.12g의 Na2HPO4를 녹입니다. 증류수 200mL에 포함된 2H2O200mL
버퍼 2의 기준7.12g의 NaH2PO4를 녹입니다. 증류수 200ml에 2H2O200mL
인산염 완충 용액염기 1 36mL, 염기 2 14mL 및 증류수 50mL를 혼합합니다.100mL
정착액5% 글루타르알데히드 9.25mL(주의: 재료 표 참조), 인산염 완충액 12.5mL 및 증류수 28.25mL를 혼합합니다. 4 °C에서 보관하십시오.50mL

표 1: 정착액의 제조법.

걸음묘사기간반복하다
1버퍼로 헹굼피펫으로 정착제를 부드럽게 제거하고 샘플이 덮일 때까지 인산염 완충액을 추가합니다. 30분 동안 그대로 두십시오.30분3배
21% 오스뮴 테트라옥사이드로 염색(주의: 재료 표 참조): 피펫으로 인산염 완충액을 제거하고 샘플이 덮일 때까지 사산화오스뮴을 추가합니다. 샘플 및 기타 유기물은 검게 변합니다. 이중 장갑을 사용하십시오.60분1
3증류수로 시료 헹구기피펫으로 이전 용액을 제거하고 샘플을 증류수로 덮습니다. 30분 동안 그대로 두십시오. 이 단계를 3번 반복합니다. 이중 장갑을 사용하십시오.30분3 시간
4에탄올 계열 침투피펫으로 이전 용액을 제거하고 샘플을 50/50 증류수-에탄올 용액으로 덮습니다. 30분 동안 그대로 두십시오. 30/70, 20/80, 10/90 및 100% 에탄올 시리즈의 증류수-에탄올 용액으로 이 단계를 반복합니다.30분1
5수지-에탄올 계열 침투피펫으로 이전 용액을 제거하고 샘플을 1/3 수지-에탄올 용액으로 덮습니다. 샘플을 믹서 플레이트에 놓고 2시간 동안 그대로 둡니다. 1/2, 1/1, 2/1, 3/1 및 100% 수지 시리즈의 수지-에탄올 용액으로 이 단계를 반복합니다.120 분1
6중합 전에 72시간 동안 냉장고에 보관하십시오.
7제품 사양에 따라 침윤된 잎 절편을 중합하여 수지 포매 시료를 얻습니다.

표 2: 수지 침투 프로토콜.

토론

이 기사에서는 잎 해부학적 구조를 측정하는 정량적 및 정성적 방법과 이를 최적화할 수 있는 방법에 대해 설명합니다. 또한, 이 방법론은 대표적인 작물 종에 적용되어 어떤 해부학적 특성이C3 및C4 단면을 구별하는 데 가장 유용한지 결정합니다. C2 광합성이라고 하는 잡종 종이 더욱 유망한 연구 분야가 되고 있기 때문에 이러한 특성을 이해하는 것이 필수적입니다. 현재로서는 Diplotaxis tenuifolia (arugula) 한 가지 작물 종만이 C2 광합성을 사용하는 것으로 확인되었지만 현재 기록이 나타내는 것보다 더 많을 가능성이 있습니다25. 높은 수준의 종내 광합성 다양성과 가소성은 C2 계통 내에 존재합니다. 이는C2 광합성의 발생을 확인하기 위해서는CO2 보상점, 초구조적 분석 및 면역조직화학(immunohistochemistry 30)과 같은 여러 라인의 증거가 필요하다는 것을 의미한다.

수년 동안 특정 식물 조직을 식별하고 측정하는 데 자유 손 및 반박형 섹션이 사용되어 왔지만, 이 기사에서는 C3 및 C4 작물 식물 간의 광합성 분화에 영향을 미치는 해부학적 잎 구조의 특정 사용 사례를 논의하는 것을 목표로 합니다. 프리핸드 섹션과 반얇은 섹션 모두에 대해 고려해야 할 주의 사항이 있습니다. 자유로운 단면은 빠르게 얻을 수 있지만 두께가 일정하지 않은 리프 절편이 생성되어 정량 분석을 방해할 수 있습니다. 이는 신선한 식물 재료의 절단을 위한 특수 장비(예: 진동 또는 저온 유지 장치)를 사용하여 방지할 수 있습니다. 수작업 절편으로 인해 두꺼운 부분이 두꺼워지면 여러 층의 세포가 서로 겹쳐져 세포가 흐려지고 따라서 해부학적 구조가 흐려질 수 있습니다. 절편의 목적이 순전히 정성적인 경우, 자유형 절편은 식물 조직의 화학적 처리(즉, 조직화학)의 이점을 제공합니다.31. 이를 통해 식물 세포에서 특정 화합물의 존재를 정성적으로 표시 할 수 있습니다. 반대로, 반얇은 단면은 거의 항상 일관되게 두꺼운 단면을 생성합니다. 그러나 프로세스가 더 길고 섬세하므로 오류가 발생하기 쉽습니다. 발생할 수 있는 문제와 이를 방지하는 방법에 대해 자세히 설명합니다.

설정
자유로운 부분과 반얇은 부분, 즉 충분히 수분이 공급된 식물의 잎에는 신선한 재료를 사용해야 합니다. 시든 잎의 절편은 세포의 turgor 압력이 감소하기 때문에 구조적 무결성을 갖지 않습니다. 수지가 내장된 재료에서 반박형 절편을 얻을 때는 잎 내부의 공기를 교체하기 위해 잎 부분이 진공 아래에 고정되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이를 통해 침투 과정에서 구조적 무결성과 삼투를 얻을 수 있습니다. 이 단계가 올바르게 수행되지 않으면 세포가 붕괴되어 실제 잎 구조를 정확하게 묘사하지 못하는 단면이 발생하고 결과적으로 부정확한 해부학적 측정이 발생할 수 있습니다32.

반대로, 높은 진공 압력은 연조직(예: 자엽)이 있는 잎을 손상시켜 세포가 축소되거나 샘플이 파괴될 수 있습니다. 이는 적절한 진공 펌프 설정을 사용하거나 완전히 건너뛰고 샘플을 정착액에 담그면 방지할 수 있습니다. 후자가 선호되는 경우, 정착액이 조직으로 침투하는 것을 용이하게 하기 위해 모든 면에서 샘플을 절단할 수 있습니다.

사전 침투
세포벽 두께와 경피 조직은 표본의 최적 고정 및 침투를 허용하는 용액의 투과에 가장 영향력 있는 해부학적 특성입니다. 식물 조직에서 공막의 목적은 침윤 과정에 영향을 미칠 수 있는 기계적 지지 및 보호입니다33. 이러한 조직은 매우 두꺼워진 세포벽을 가지고 있기 때문에 용액의 투과가 방해받을 수 있습니다. 침투 문제가 있는 샘플은 셀이 깨지고 수지가 찢어진 반얇은 절편이 발생합니다(그림 5C,D). 종방향 절편은 세포를 왜곡시켜 해부학적 분석과 세포 크기 및 세포 밀도와 같은 잎 형질 측정에 편향을 일으킵니다(그림 5F-H).

수지 침투
품질 절편은 표본이 매립된 매체에 의해 직접적인 영향을 받는 해부학적 조직의 관찰에 매우 중요합니다. 식물 조직학에 사용되는 가장 일반적인 임베딩 매체는 파라핀 왁스, 에폭시 및 아크릴 수지34,35입니다. 왁스 매립은 화학적 고정제에 의한 시료 준비와 실온에서 경화된 액체 왁스로 침투해야 합니다. 이러한 절단은 일반적으로 두께가 5-10 μm인 절편을 생성하며, 여기에서 볼 수 있듯이 수작업으로도 충분히 달성할 수 있으며(그림 2) 고정되지 않은 새 조직만 필요합니다. 이 경우, 번들 피복 주위의 세포 배열은 C3 및 C4 식물을 구별하는 데 매우 중요하며, 이를 위해서는 보다 견고하고 견고한 임베딩 매체를 사용해야 합니다. 이 연구에서 에폭시 수지(Spurr's resin36)와 아크릴 수지(LR White)는 경도, 수명, 시료 침투 및 절편 내구성에 대해 모두 테스트되었습니다. 에폭시 수지는 수십 년 동안 생물학적 재료의 매립에 사용되어 왔습니다37. 아크릴 수지는 비교적 새롭고, 에폭시 수지와 달리 UV 노출로 인해 변색되지 않고 수축이 적기 때문에 시간이 지남에 따라 탄력성이 있기 때문에 처음에는 식물 표본을 내장하는 것으로 고려되었습니다38. LR White 아크릴 수지(경질 등급)는 무독성 및 UV 안정성 공식으로 선택되었습니다. 아크릴 수지는 에폭시 수지보다 점성이 상당히 낮은 경향이 있어 시료가 더 빨리 침투할 수 있고, 재료의 경도로 인해 마이크로톰(39)으로 더 깔끔하게 절단할 수 있습니다. 그림 5C,D는 아크릴 수지에 비해 에폭시 수지의 부드러움으로 인해 찢어짐이 불가피한 구조 조직이 많은 잎 표본에서 에폭시 수지의 결과를 보여줍니다(그림 3).

초현미경 절제술
과도한 수지를 잘라내면 수지에 균열이 생겨 샘플로 침투할 수 있습니다. 이를 피하려면 임베딩을 위해 선택한 수지의 밀도와 취성을 고려하는 것이 중요합니다. 단면을 더 깊게 절단하면 손이나 거친 칼 다듬기로 인한 유물이 발생하지 않도록 해야 합니다. 샘플은 샘플 홀더에 수직으로 정렬되어야 하며 접안렌즈를 통해 배율을 높이고 고정되고 염색된 부분을 확인하여 검증해야 합니다. 완벽하게 직각으로 절단되지 않은 식물 세포는 한쪽 끝이 다른40개보다 큰 가늘어진 세포로 나타납니다.

염색 후
톨루이딘 블루(수용액에서 1%)를 사용하여 초박편절편에서 절단된 반박형 절편을 염색했습니다. 단면을 너무 오래 건조시키면 과염색이 발생하여 이미지화할 때 단면의 과포화가 발생합니다(그림 5A). 염색이 잘 여과되지 않으면 단면에서 용해되지 않은 입자가 건조되어 해부학적 구조의 시각화를 방해합니다(그림 5B). 이 문제는 톨루이딘 블루 용액을 만들 때 미세 필터를 사용하고 해당 부분이 염색에 노출되는 것을 제한함으로써 피할 수 있습니다. 샘플은 염색하기 전에 60°C의 핫 플레이트에서 건조하여 단면이 유리 현미경 슬라이드에 접착되도록 하지만, 헹구고 다시 건조하기 전에 톨루이딘 블루에 10초 이상 노출되어서는 안 됩니다41.

해부학적 측정에 대한 고려 사항
이 논문에 나타난 측정은 세포 간 공역의 일부, 평균 중엽 두께(혈관 조직 제외) 및 잎 면적단위당 세포 간 공기 공간에 노출된 중엽 표면적을 포함하여 반박형 절편을 사용하여 정량적으로 평가할 수 있는 많은 해부학적 특성의 예일 뿐입니다. 그러나, 다발초세포 크기는C3 및C4 대사를 구별하는 중요한 지표이지만, 다발초초세포벽 두께는 다발초세포의 누설 정도, 즉 중엽세포(mesophyll cell) 내로 다시 확산되는CO2의 양을 결정하기 때문에 광학 현미경만으로는 볼 수 없는 또 다른 중요한 형질이다(42). 43. 높은 누출은 PEP 카르복실라아제에 의한 CO2 고정에 사용되는 에너지의 상당 부분이 손실되기 때문에 광합성 효율을 감소시킵니다 44,45,46. 이러한 초구조적 분석에는 투과 전자 현미경 및 이미지 분석이 필요합니다. 본 연구에서는 광학 현미경만 고려되었지만, 이 프로토콜에는 TEM 현미경의 초석인 조영제 및 고정제인 오스뮴 테트라옥사이드를 사용한 처리가 포함됩니다. 따라서 중합 시료는 준비 시 고려하지 않더라도 필요할 때마다 TEM 분석에 계속 사용할 수 있습니다.

해부학적 진단은 Kranz와 같은 구조를 쉽게 감지할 수 있지만, C4 의 존재는 전형적인 C4 생리학, 즉 낮은 CO2 보상 점, 광합성의 제한된 O2 억제 및 다른 탄소 동위 원소 조성 2,4,47을 보여줄 수 있는 가스 교환 측정에 의해 추가로 진단할 수 있습니다.

또한 단세포 C4 식물 48,49,50의 발견에서 알 수 있듯이 C4 광합성이 발달하기 위해 Kranz 해부학이 필요하지 않다는 점에 유의해야합니다. 따라서 해부학적 분석만으로는 연구가 덜 된 분류군에서 C4 생리학을 검출하기에 충분하지 않을 수 있습니다. 해부학적 특성 분석과 생리학적 분석의 결합은 작물과 야생 식물 모두에서 잎의 형질과 그 구조-기능 관계를 조사하기 위한 강력한 도구를 제공합니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 유럽 연합 H2020 프로그램(프로젝트 GAIN4CROPS, GA 번호 862087)을 인정합니다. Center of Excellence AgroCropFuture Agroecology and new crops in future climates는 에스토니아 교육 연구부(Ministry of Education and Research)의 재정 지원을 받습니다. T. aestivum 과 Z. mays의 씨앗을 제공해 주신 Evelin Loit-Harro 교수님, 잎 단면을 준비하는 데 도움을 주신 Paula Palmet 씨와 Vaiko Vainola 씨, 그리고 분석을 도와 주신 João Paulo de Silva Souza 씨에게 감사드립니다. 모든 이미지는 다양한 프로젝트에서 에스토니아 생명 과학 대학의 현미경 부서에서 얻었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인산수소이나트륨 이수화물(Na2HPO42H2O) 순수PENTA, CZ10028-24-7
임베딩 필름, 7.8mil 두께, 8 x 12.5, (203 x 318mm)ACLAR, US10501-10
에탄올, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000위험: 고인화성 액체 및 증기.
EVOS Invitrogen FL Auto 2 이미징 시스템Thermo Fisher Scientific, US
플랫 임베딩 PTFE 몰드(금속 프레임 포함), 16개 캐비티PELCO, US10501
유리 바이알 2mlVWR Life Science, US548-0045
글루타르알데히드 50% 용액VWR Life Science, US23H2856331위험: 흡입하면 치명적입니다. 삼키면 독성이 있습니다. 피부에 심한 화상을 입히거나 눈에 손상을 일으킵니다. 호흡기 자극을 일으킬 수 있습니다. 보호 장갑, 보호복, 눈 및 안면 보호구를 착용하십시오.
Histo 다이아몬드 나이프Diatome, US
LEICA EM UC7Leica Vienna, AT
LR White resin hard gradeElectron Microscopy Sciences, US14383위험: 피부 자극을 일으킵니다. 눈에 심한 자극을 일으킴 호흡기 자극을 일으킬 수 있음. 졸음 또는 현기증을 유발할 수 있음 보호 장갑, 보호복, 눈 및 안면 보호구를 착용하십시오.
현미경 슬라이드Normax, PT5470308A
Nikon Eclipse E600 및 Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JP
Osmium Tetroxide (OsO4)Agar Scientific Ltd, GBR1019위험: 삼키거나 피부에 닿거나 흡입하면 치명적입니다. 심한 피부 화상 및 눈 손상을 일으킵니다 이중 보호 장갑, 보호복, 눈 및 안면 보호구를 착용하십시오.
피펫 및 피펫 팁Thermo Scientific, FIKJ16047
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate (NaH2PO4 . 2H2O) purePENTA, CZ13472-35-0
Syringe 10 mlEcoject, DE20010
Toluidine blue, 범용 등급Fisher Scientific, GB2045836

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