식물 시스템에서 재조합 단백질을 정제하는 것은 일반적으로 식물 단백질에 의해 도전됩니다. 이 연구는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 아포플라스트(apoplast)에서 분비된 재조합 단백질을 효과적으로 추출하고 정제하는 방법을 제공합니다.
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방법 논문
식물에서 생산된 재조합 단백질의 순도를 향상시키기 위한 Apoplast-extraction 기반 방법
이 논문에서
요약
초록
식물은 치료용 단백질을 생산하기 위해 연구되고 있는 새롭게 개발된 진핵생물 발현 시스템입니다. 식물에서 재조합 단백질을 정제하는 것은 생산 공정에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 일반적으로 단백질은 총 용해성 단백질(TSP)에서 정제되었으며, 기타 세포 내 단백질 및 사이토크롬의 존재는 후속 단백질 정제 단계에서 문제를 제기합니다. 또한, 항원 및 항체와 같은 대부분의 치료용 단백질은 적절한 당화(glycosylation)를 얻기 위해 분비되며, 불완전하게 변형된 단백질의 존재는 일관성 없는 항원 또는 항체 구조로 이어집니다. 이 연구는 식물 아포가소성 공간에서 고도로 정제된 재조합 단백질을 얻는 보다 효과적인 방법을 소개합니다. 재조합 Green 형광 단백질(GFP)은 Nicotiana benthamiana 의 아포플라스트로 분비되도록 설계한 다음 침투 원심분리 방법을 사용하여 추출합니다. 추출된 아포플라스트로부터의 GFP-His는 그런 다음 니켈 친화성 크로마토그래피로 정제됩니다. TSP의 기존 방법과 달리 아포플라스트에서 정제하면 고도로 정제된 재조합 단백질이 생성됩니다. 이는 플랜트 생산 시스템의 중요한 기술적 개선을 의미합니다.
서론
요즘에는 항체, 백신, 생체 활성 단백질, 효소 및 작은 폴리펩티드 1,2,3,4,5,6을 포함한 다양한 식물 생산 재조합 치료 단백질이 연구되고 있습니다. 식물은 안전성, 저렴한 비용 및 생산을 빠르게 확장할 수 있는 능력으로 인해 치료용 단백질을 생산하기 위해 점점 더 많이 활용되는 플랫폼이 되고 있습니다 7,8. 단백질 정제와 함께 식물 시스템의 단백질 발현 및 변형은 식물 생물반응기 9,10의 생산성을 결정하는 중요한 요소입니다. 식물 생산성을 높이고 고순도 표적 단백질을 얻는 것은 식물 기반 생산 시스템이 직면한 핵심 과제입니다11,12
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프로토콜
1. N. benthamiana 식물의 준비
- 묘목 블록을 트레이에 넣고 물 1L를 넣고 완전히 포화 될 때까지 약 2 시간 동안 담가 둡니다.
- 묘목 블록에 야생형 N. benthamiana 씨앗을 골고루 뿌리고 뚜껑을 덮고 1주일 동안 발아시킵니다. N. benthamiana 는 18시간 광주기, 24°C, 45% 상대 습도의 온실에서 키우고 2주마다 비료를 줍니다.
- 씨앗이 싹을 틔우면 핀셋을 사용하여 뿌리에 손상을 주지 않도록 주의하면서 묘목을 부드럽게 제거합니다. 새 쟁반 중앙에 작은 구덩이를 파고 묘목을 그 안에 넣고 뿌리를 흙으로 가볍게 덮습니다. 뚜껑을 덮고 계속 자랍니다.
- 모종에 뚜껑을 덮고 세 개의 잎이 나올 때까지 자랍니다. 4번째 참 잎이 나오면 뚜껑을 제거하십시오.
- 식물이 그로인침습 전에 2주 더 자라도록 하십시오.
2. 재조합형 GFP-His의 구축
- 유전자 염기서열을 기반으로 GFP 및 PR1a(MGFVLFSQLPSFL....
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결과
GFP-His는 N. benthamiana의 아포플라스틱 공간으로의 분비를 목표로 합니다
GFP는 분비를 위한 N-말단 PR1a 신호 펩타이드와 정제를 위한 C-말단 His-태그를 사용하여 pCAMBIA1300 플라스미드에 클로닝하여 p35s-PR1a-GFP-His를 생성했습니다(그림 1A). 재조합 단백질은 N. benthamiana에서 일시적으로 발현되었으며 아그로인 여과 후 3일 후에 anti-His 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 30kDa 밴드를 검출하였다(그림 1B). Plasmolysis는 세포벽을 세포막에서 분리하기 위해 고긴장 용액을 사용하여 잎을 처리하는 것입니다(32). GFP가 apoplast에 위치하는지 확인하기 위해, 우리는 .......
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토론
식물을 사용하여 치료용 단백질을 생산하는 것은 최근 몇 년 동안 빠르게 확장되었습니다 1,2,3,4,5,6. 단백질을 암호화하는 유전자는 발현 벡터로 클로닝되어 아그로인filtration을 통해 식물 조직으로 전달됩니다. 식물 세포에 의한 생산 후, 단백질은 다운스트림 응용 분야를 위해 정제됩니다. 일반적으로 재조합 단백질은 TSP 추출물에서 정제됩니다. 그러나 추출 중 식물 세포에서 방출되는 풍부한 식물 단백질과 시토크롬은 정제를 방해할 수 있습니다33. 한편으로는, 식물 사이토크롬은 분리 컬럼을 막아, 처리를 늦출 수 있다
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공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 2021084(Youth Innovation Promotion Association CAS)와 중국과학원(Chinese Academy of Sciences) 미생물학 연구소(Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences)의 3개년 실행 계획(Three-Year Action Plan)의 핵심 배치 프로젝트 지원 기금(Key Deployment Project Support Fund)의 지원을 받습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
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참고문헌
- Zahmanova, G., et al. Green biologics: Harnessing the power of plants to produce pharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (24), 1757(2023).
- PREVAIL II Writing Group. A randomized, controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection. N Engl J Med. 37....
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