방법 논문

말초 신경 세포의 특징을 연구하기 위해 다중 구획 장치에서 등쪽 뿌리 신경절을 수확, 삽입 및 배양합니다.

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DOI:

10.3791/66854

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2024년 6월 28일

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1Department of Biological Systems Engineering, University of Nebraska-Lincoln

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 다중 구획(MC) 장치에서 성인 Sprague Dawley 쥐에서 이식된 배근 신경절(DRG)을 수확하고 배양하는 기술을 제공합니다.

초록

통증의 가장 흔한 말초 신경 세포 특징은 자극 역치가 낮아지거나 배근 신경절(DRG)에서 말단 신경이 과민해지는 것입니다. 이러한 과민증의 제안된 원인 중 하나는 말초 조직의 면역 세포와 뉴런 간의 상호 작용과 관련이 있습니다. 체외 모델은 이러한 메커니즘이 어떻게 통각 수용기 과민증을 유발하는지 이해하는 데 기초적인 지식을 제공했습니다. 그러나 체외 모델은 효능을 인간에게 적용해야 하는 과제에 직면해 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 생리학적, 해부학적으로 관련성이 있는 in vitro 모델이 48웰 플레이트의 3개의 격리된 구획에서 온전한 DRG(dorsal root ganglia)의 배양을 위해 개발되었습니다. 1차 DRG는 인도적 안락사 후 성인 Sprague Dawley 쥐에서 수확됩니다. 과도한 신경근을 잘라내고 DRG를 배양에 적합한 크기로 절단합니다. 그런 다음 DRG는 천연 하이드로겔에서 성장하여 모든 구획에서 강력한 성장을 가능하게 합니다. 이 다중 구획 시스템은 신경 세포와 면역 세포 간의 상호 작용을 연구하기 위해 DRG 세포체를 신경돌기에서 해부학적으로 적절하게 분리하고, 생리학적으로 관련된 세포 유형 및 기계적 특성을 제공합니다. 따라서 이 배양 플랫폼은 치료 격리 전략을 조사하기 위한 유용한 도구를 제공하며, 궁극적으로 통증 예측을 위한 개선된 스크리닝 접근법으로 이어집니다.

서론

만성 통증은 전 세계적으로 장애와 실직의 주요 원인입니다1. 만성 통증은 전 세계 성인의 약 20%에게 영향을 미치며 상당한 사회적, 경제적 부담을 초래하고 있습니다.2 미국에서 매년 총 비용은 5,600억 달러에서 6,350억 달러 사이로 추산됩니다3.

만성 통증 환자가 나타내는 주요 말초 특징은 신경의 자극 역치가 낮아져 신경계가 자극에 더 잘 반응한다는 것입니다 4,5. 자극 역치가 낮아지면 이전에는 통증이 없었던 자극에 대한 고통스러운 반응(allodynia) 또는 고통스러운 자극에 대한 반응이 높아질 수 있습니다(통각과민증)6. 현재의 만성 통증 치료법은 효능이 제한적이며, 동물 모델에서 성공한 치료법은 통증 발현의 기계론적 차이로 인해 인간 대상 임상시험에서 실패하는 경우가 많다7. 말초 감작 메커니즘을 보다 정확하게 모방할 수 있는 시험관 내 모델은 새로운 치료제의 번역을 증가시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다 8,9. 또한, 배양 시스템에서 감작된 신경의 주요 측면을 모델링함으로써 연구자들은 낮은 임계값을 유발하는 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 개발하고 이를 역전시키는 새로운 치료 표적을 식별할 수 있습니다10.

이상적인 in vitro 플랫폼 또는 미세생리학적 시스템은 원위 신경돌기와 DRG(dorsal root ganglia) 세포체의 물리적 분리, 3차원(3D) 세포 환경, 생체 내 조건을 밀접하게 모방하기 위한 네이티브 지원 세포의 존재를 통합합니다. 그러나 Caparaso et al.11 의 최근 논문에 따르면 현재 DRG 배양 플랫폼에는 이러한 주요 기능 중 하나 이상이 부족하여 생체 내 조건에서 복제하기에 충분하지 않습니다. 이러한 플랫폼은 설정하기 쉽지만 말초 감작의 생물학적 기초를 모방하지 않으므로 in vivo 효능으로 변환되지 않을 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 신경돌기 및 DRG 세포체의 시간적 유체 분리를 가능하게 하는 3개의 격리된 구획이 있는 하이드로겔 매트릭스 내에서 배근 신경절(DRG)의 배양 과정을 위해 생리학적으로 관련된 시험관 내 모델이 개발되었다11. 이 모델은 생리학적 및 해부학적 관련성을 모두 제공하며, 이는 체외에서 뉴런의 말초 감작을 연구할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

3D 배양에서 DRG 외식의 사용에 대한 관심이 높아지는 이유는 DRG 생존력의 간접 지표 역할을 하는 강력한 신경돌기 성장을 촉진할 수 있는 능력 때문이다12. 1차 신생아 또는 배아 DRG 외식은 현재 체외 배양 플랫폼에서 주로 사용되지만(13,14), 성인 설치류의 외식을 사용하는 것은 신생아 또는 배아 설치류의 외식생에 비해 인간 DRG 생리학을 밀접하게 모방하는 성숙한 신경 생리학의 더 나은 모델을 제공한다15. Explant DRG는 주로 native non-neuronal support cell을 유지함으로써 native DRG 조직의 세포 및 분자 조직을 보존하는 것을 말합니다. 여기에서 이 프로토콜은 다중 구획(MC) 장치에서 성인 Sprague Dawley 쥐의 DRG 이식물을 수확하고 배양하는 방법론을 설명합니다(그림 1).

경추, 흉추 및 요추에서 DRG를 배양하는 데 효능이 나타났으며 신경돌기 성장에서 눈에 띄는 차이는 없었습니다. 이 응용 분야의 목표는 장치의 외부 구획으로 신경돌기 성장을 유도하는 것이었습니다. 따라서 이 기사는 DRG 수준을 구분하지 않았습니다. 그러나 특정 실험에 필요한 경우 실험자의 요구에 맞게 DRG 수준을 조정할 수 있습니다. 현재 DRG16의 3D 배양을 위한 다른 구획화된 배양 모델이 있지만, 이러한 장치에는 번역을 제한할 수 있는 보존된 천연 비신경 세포 지원 세포가 포함되어 있지 않습니다. 채취한 DRG의 본래 구조를 보존하는 것은 DRG 뉴런과의 상호 작용이 이러한 뉴런의 기능적 특성을 유지하는 데 필수적인 비뉴런 지원 세포의 유지를 보장하기 때문에 중요합니다. 여러 연구에서는 해리된 DRG를 슈반(Schwann) 세포와 같은 비토착 신경 세포와 공동 배양하여 신경 세포의 수초화를 촉진했습니다 17,18,19.

프로토콜

DRG 수확은 네브래스카-링컨 대학교(University of Nebraska-Lincoln)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행되었습니다. 생후 12주(~250g)의 암컷 Sprague Dawley 쥐를 연구에 사용했습니다. 연구에 사용된 동물, 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 다중 구획 장치 제작 및 조립

  1. 다중 구획 장치의 컴퓨터 지원 설계 및 3D 프린팅
    참고: MC 장치는 DRG 세포체와 신경돌기를 분리하기 위한 3개의 구획으로 구성됩니다(그림 2A). MC 장치는 상업적으로 사용할 수 없습니다. 그러나, 본 명세서에는 3D 프린팅을 가능하게 하기 위해 STL 파일(보충 코딩 파일 1)이 제공된다. MC 인쇄를 완료하는 데 1일이 걸립니다.
  2. 호환되는 소프트웨어를 사용하여 MC의 STL 파일을 Resin 3D 프린터에 업로드합니다.
    참고: 인쇄에 이상적인 재료는 고온 수지입니다. 고온 수지 사용의 주요 장점은 생체 적합성이 있고 고압멸균 및 재사용이 가능하다는 것입니다. DLP(Digital Light Processing) 3D 프린터 또는 기타 3D 프린터를 사용하여 장치를 인쇄할 수도 있습니다.
  3. 인쇄된 MC 장치의 표면에 남아 있는 수지를 제거하기 위해 이소프로판올(>96%)에서 30분 동안 세척 용액에 넣습니다.
  4. 시중에서 판매되는 경화제를 사용하여 80°C에서 120분 동안 장치를 후경화합니다( 재료 표 참조). 경화제는 인쇄된 MC 장치를 온도와 UV에 노출시킴으로써 기계적 특성을 향상시킵니다.
  5. MC 장치를 160°C의 오븐에서 180분 동안 열로 경화합니다.
  6. 중력 주기에서 45분 동안 오토클레이브를 사용하여 장치를 멸균합니다.

2. 하이드로겔 준비

  1. 메타크릴레이화 히알루론산(MAHA, 85%-115% 메타크릴화)을 합성하고 Seidlits et al.20에 설명된 프로토콜을 사용하여 특성화합니다.
    참고: DRG의 성장을 지원하기 위해 메타크릴레이티드 히알루론산, I형 콜라겐 및 라미닌으로 구성된 트리플 하이드로겔이 일반적으로 사용됩니다. 연구 결과에 따르면 DRG는 일반적으로 MAHA에서 1.25-2.5mg/mL, 콜라겐은 2.0-4.5mg/mL에서 자랍니다. 라미닌의 경우, 0.75mg/mL이면 DRG의 강력한 성장을 보장하기에 충분한 것으로 나타났습니다. 여기에서는 1.25mg/mL MAHA, 4.5mg/mL 콜라겐 및 0.75mg/mL 라미닌을 함유한 트리플 겔을 만드는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 하이드로겔 준비는 무균 작업 공간을 제공하기 위해 층류 캐비닛에서 수행해야 합니다.

3. 광개시제 용액 준비

알림: UV 광선 아래에서 MAHA를 가교 연결하려면 광개시제가 필요합니다. 일반적으로 0.3%에서 0.6% 사이의 비율로 사용됩니다.

  1. DRG 수확 3일 전에 광개시제 용액을 준비합니다.
  2. 광개시제 용액을 준비하기 전에 초음파 처리 수조를 37 ° C로 예열하십시오.
  3. 플로우 후드에서 멸균 기법을 사용하여 5x Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)-HEPES 용액에 NaHCO3를 용해시켜 23.125mg/mL 중탄산나트륨(NaHCO3) 용액을 준비합니다.
  4. 유리 바이알에 20% vol/vol 1x 멸균 인산염 완충 식염수(PBS) 및 80% vol/vol 5X DMEM/HEPES 용액에 0.6% 중량/부피(w/v) 광개시제를 혼합합니다.
  5. 빛으로부터 보호하려면 유리 바이알을 알루미늄 호일로 싸십시오. 그러나 바이알을 30-40 분 사이에 초음파 처리로 37 ° C로 가열 된 초음파 처리 수조로 옮기기 전에 알루미늄 호일을 제거해야합니다.
    알림: 광개시제 용액은 빛에 노출될 때 라디칼로 분해되어 중합 과정을 시작할 수 있으므로 빛으로부터 보호해야 합니다21.
  6. 0.22μm 주사기 필터로 용액을 멸균 여과하여 새 멸균 유리 바이알에 넣습니다.

4. 메타크릴레이트 히알루론산 용해

  1. 메타크릴레이티드 히알루론산(2단계에서 제조)을 광개시제 용액을 제조한 당일(3단계)에 용해시킨다.
  2. 냉동 동결건조된 MAHA를 건조기에 15분 동안 넣어 실온에 둡니다.
  3. 층류 후드에서 작업하고 멸균 계량 기술을 사용하여 유리 바이알에서 동결건조된 MAHA를 칭량합니다.
  4. 원하는 MAHA 농도에 도달하기 위해 필요한 부피의 여과된 광개시제 용액을 MAHA에 추가합니다. 일반적인 최종 겔 농도는 1.25mg/mL MAHA 및 4.5mg/mL 콜라겐입니다.
  5. 실험실 밀봉 필름으로 캡을 밀봉하고 유리 바이알을 알루미늄 호일로 감싼 다음 완전히 용해될 때까지(보통 3일) 실온에서 궤도 셰이커 플레이트에 놓습니다. 때때로, MAHA의 균일한 용해를 보장하기 위해 MAHA의 큰 덩어리를 부수기 위해 용액을 소용돌이치십시오.

5. 장치 조립

  1. DRG 수확 하루 전에 MC 장치를 48웰 플레이트에 넣습니다.
  2. 3mL 주사기를 사용하여 MC 장치(그림 2B) 아래의 홈에 얇은 실리콘 젤을 바릅니다. 이렇게 하면 장치가 웰 플레이트에 단단히 부착되는 데 도움이 됩니다.
  3. #3 겸자를 사용하여 그림 48C와 같이 MC 장치를 2웰 플레이트의 웰에 부드럽게 놓습니다.
    알림: 장치의 크기는 의도한 용도에 맞게 수정할 수 있으며 원하는 경우 다른 크기의 플레이트를 사용할 수 있습니다. 장치는 재사용할 수 있습니다. 재사용하려면 하이드로겔을 모든 터널에서 부드럽게 씻어내야 하며 장치 아래의 로딩 홈은 70% 에탄올과 함께 부드럽게 교반하여 사용해야 합니다. 이 작업이 완료되면 장치를 다시 고압멸균하여 사용하기 전에 멸균할 수 있습니다.

6. 동물 준비

  1. 수확을 시작하기 전에 필요한 모든 해부 도구를 고압 멸균하십시오.
  2. 12-20 주 된 성인 남성 또는 여성 Sprague Dawley 쥐를 얻으십시오. 쥐의 성별은 DRG 성장에 영향을 미치지 않습니다.
  3. 미국 수의학 협회 지침22에 따라CO2 과다 투여를 안락사의 주요 방법으로 사용하고 양측 기흉 천자를 안락사의 2차 방법으로 사용하여 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시킵니다.
  4. 복부 쪽이 아래로 향하게 하여 해부 테이블의 멸균 언더패드에 쥐를 놓습니다. 털에 70% 에탄올을 뿌립니다.

7. 등뿌리핵(DRG) 수확

  1. 86% Neurobasal A 배지, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS), 1% 글루타민 및 2% B27 플러스 50x를 포함하는 트리밍 배지를 준비하고 24웰 플레이트에 옮깁니다. 이 매체와 웰 플레이트는 하이드로겔에 매립하기 전에 수확된 DRG를 임시로 보관하는 데 사용됩니다.
  2. 실험실 가운, 수술용 마스크, 보닛, 보안경 및 장갑을 착용하십시오.
  3. 코가 뭉툭한 큰 가위를 사용하여 경추 기저부의 피부를 절개한 다음 척추 길이를 따라 자릅니다.
  4. 척추관에서 혈액을 더 빼내려면 견갑골 아래를 절개하고 근육을 통해 아래로 절개하여 주요 혈관을 절단합니다.
  5. 크고 날카로운 코가 있는 가위를 사용하여 척추에서 근육을 잘라냅니다. 척추를 시각화하기 위해 가능한 한 많은 근육을 제거합니다.
  6. 척추뼈의 등쪽과 옆쪽 부분을 제거합니다. 직선 룽거와 날카로운 코가 있는 가위를 사용하여 경추 끝에서 시작하여 요추 끝으로 이동하는 척추의 가시 및 횡돌기를 제거합니다.
  7. 척수를 제거합니다. 작고 날카로운 코 가위를 사용하여 척수 양쪽을 따라 DRG에 연결된 신경근을 조심스럽게 자릅니다. 척수의 경추 끝을 자르고 DRG에 연결된 남아 있는 신경근을 절단하여 척추관에서 서서히 조심스럽게 들어 올립니다.
    알림: 이 과정에서 DRG 본체가 절단되지 않도록 하려면 소근육 운동 기술이 필수적입니다.
  8. DRG를 노출시키려면 곡선 룽거(Rongeur)를 사용하여 척추뼈의 측면 부분을 더 많이 제거합니다. 정중선에서 바깥쪽으로 당겨 측면을 번갈아 가며 당깁니다. DRG 본체를 절단하면 세포체와 축삭에 손상을 줄 수 있으므로 절단하지 않도록 주의하십시오.
  9. #3 겸자와 직선 가장자리 스프링 가위를 사용하여 척추의 각 수준 사이에 있는 DRG를 제거합니다. DRG에서 척추 신경근을 잡고 주머니에서 조심스럽게 빼낸 다음 척추 신경의 다른 쪽 끝을 자릅니다. DRG 본체를 직접 잡지 않도록 주의하십시오.
  10. DRG를 얼음 위의 24웰 플레이트(트리밍 매체 포함, 7.1단계)의 웰에 놓습니다.
  11. 모든 DRG를 수거한 후 작업 공간을 청소하고 사체를 오토클레이브 백에 넣고 IACUC 프로토콜에 따라 적절하게 보관/폐기합니다.

8. DRG 트리밍 및 절단

  1. 깨끗한 벤치에 있는 60mm 페트리 접시에 트리밍 미디어를 채웁니다(7.1단계). 해부 스코프와 유리 비드 멸균기를 설정하고 스코프 옆에 트리밍 도구(#3 겸자 및 직선 가장자리 스프링 가위)가 있는 오토클레이브 도구 상자를 놓습니다.
  2. 절개 스코프에서 DRG 주변의 과도한 조직을 제거하고 DRG 몸체에 가까운 신경근(일반적으로 주변 신경보다 약간 어둡음)을 다듬습니다.
  3. 두 번째 60mm 페트리 접시에 새 매체를 채웁니다. 절개 범위에서 트리밍된 DRG를 약 0.5mm(또는 0.5mm에서 0.8mm 사이)로 자릅니다. 절단 DRG의 정확한 예상 크기를 갖기 위해 절단하는 동안 눈금자를 페트리 접시 아래에 놓습니다.
  4. 절단된 DRG를 매체를 얼음 위에 놓고 새 24웰 플레이트로 옮깁니다.
    알림: DRG 트리밍, 절단 및 매립은 무균 작업 공간을 제공하기 위해 층류 캐비닛에서 수행해야 합니다. 층류 캐비닛이 없는 경우 무균 기술을 준수해야 하며, 최소한의 적절한 개인 보호 장비(PPE)(실험실 가운, 마스크, 고글 및 장갑)를 권장하고 잠재적인 오염을 완화하기 위해 공정 전반에 걸쳐 모든 도구를 멸균해야 합니다.

9. 콜라겐 중화

  1. DRG를 정돈하고 절단한 후 DRG 수확과 같은 날에 콜라겐을 중화시킵니다.
  2. 얼음, 피펫 작업 ~ 8.16 % 초순수, ~ 1.84 % 1M 수산화 나트륨 (NaOH), ~ 10 % 10x PBS 및 총 용액 부피의 ~ 80 % 콜라겐을 유리 바이알에 넣습니다.
  3. 멸균 저잔류 피펫 팁을 사용하여 혼합물에 피펫 콜라겐(일반적으로 마지막에 추가)에 천천히 혼합합니다. 기포가 생성되지 않도록 혼합하는 동안 피펫 팁을 용액에 유지하십시오. pH 스트립을 사용하여 중화된 콜라겐의 pH를 확인하여 ~7인지 확인합니다.
    참고: 중화된 콜라겐은 겔화 없이 2-3시간 동안 얼음에 보관할 수 있습니다. 따라서 하이드로겔 제조는 콜라겐이 중화되면 신속하게 수행해야 합니다.

10. 하이드로겔 제조

  1. 얼음, 피펫 라미닌(최종 농도 0.75mg/mL까지) 및 1x PBS를 유리 바이알에 넣습니다.
  2. 멸균 저잔류 피펫 팁을 사용하여 피펫은 콜라겐과 MAHA 용액을 중화시켜 혼합물에 주입하여 원하는 농도에 도달했습니다.
  3. 천천히 혼합하고 생성된 하이드로겔의 pH를 확인합니다(~7이어야 함).

11. DRG 임베딩

  1. 다중 구획 임베딩을 수행합니다.
    1. 사전 혼합된 하이드로겔 65.1 μL 및 52.8 μL를 각각 소마 및 신경석 구획에 피펫팅합니다.
      알림: 이것은 48웰 플레이트에서 MC 장치를 사용한다고 가정합니다. 이러한 볼륨은 사용하는 MC 장치의 크기에 따라 변경할 수 있습니다.
    2. 절단된 DRG를 소마 구획(그림 2A)에 부드럽게 삽입하여 웰 플레이트의 바닥을 긁지 않도록 합니다. 신경돌기가 터널을 통해 인접한 구획으로 자랄 수 있도록 DRG를 중앙에 배치합니다.
    3. 37°C에서 30분 동안 인큐베이터의 하이드로겔을 열로 가교합니다. 이 경우 UV 램프를 켜서 예열하십시오.
    4. 열가교 후 UV는 하이드로겔을 90초 동안 가교합니다.
    5. DRG 성장 배지를 하이드로겔 및 DRG에 추가하고 한 시간 후에 전체 배지 교체를 수행하여 배지에 남아 있는 미반응 또는 남아 있는 광개시제의 흔적을 제거합니다.
    6. 3일마다 절반의 매체 교체를 수행하고 현미경으로 관찰하여 DRG의 성장을 모니터링합니다.
    7. ~4주 후 DRG 신경돌기가 자라기 시작하면(그림 3A) 형광판 이미저로 이미지를 캡처하고 FIJI(ImageJ)를 사용하여 신경돌기의 길이를 정량화합니다.

12. DRG 임베딩 제어

  1. 48웰 플레이트에 250μL의 하이드로겔을 피펫팅합니다(MC 제외).
  2. 절단된 DRG를 웰 중앙과 하이드로겔 중간에 부드럽게 배치하여 웰 플레이트의 바닥이 긁히지 않도록 합니다.
  3. 37°C에서 30분 동안 인큐베이터의 하이드로겔을 열로 가교합니다.
  4. UV는 하이드로겔을 90초 동안 가교합니다.
  5. DRG 성장 배지를 하이드로겔 및 DRG에 추가하고 한 시간 후에 전체 배지 교체를 수행합니다.
  6. 3일마다 절반의 매체 교체를 수행하고 현미경으로 DRG를 관찰하여 DRG의 성장을 모니터링합니다.
  7. ~4주 후 DRG 신경돌기가 자라기 시작하면(그림 3B) 형광판 이미저로 이미지를 캡처합니다.
    참고: 모든 명시야 현미경은 이미징에 사용할 수 있습니다. 자동화된 플레이트 기반 현미경을 사용하면 이 과정을 더 빠르게 수행할 수 있습니다. 장치 없이 일반 겔에 삽입을 제어하여 다중 구획에서 DRG 신경돌기의 성장을 비교합니다. 사용자가 DRG가 MC 및 대조군 겔에서 유사하게 성장한다는 것을 확인하면 매번 대조군 겔을 반복할 필요가 없을 수 있습니다.

13. DRG 이미징

  1. 다양한 초점 거리에서 형광판 이미저를 사용하여 4배 배율로 명시야 이미지를 캡처하여 전체 DRG 및 MC 장치를 시각화할 수 있습니다.
  2. 신경돌기를 더 쉽게 볼 수 있도록 이미지의 밝기와 대비를 조정합니다.
  3. 이미지를 .tiff 파일로 저장합니다.

14. DRG 신경돌기 정량 분석

  1. FIJI(ImageJ)를 다운로드하여 설치합니다.
  2. ImageJ를 엽니다. 이미지 파일을 열고 파일이 흑백인지 확인합니다.
  3. 가장 작은 신경돌기가 보이도록 대비를 향상시킵니다. 단축키 Ctrl+Shift+C를 사용하여 밝기 및 대비 옵션을 열면 됩니다.
  4. 필요에 따라 컨트롤러의 슬라이더를 조정하여 신경석을 시각화하고 원하는 밝기와 대비를 위해 Apply( 적용 )를 클릭합니다.
  5. 플러그인(Plugins) 메뉴를 열고 세그멘테이션(Segmentation)을 선택한 다음 Simple Neurite Tracer를 클릭하여 신경돌기 추적기를 엽니다.
  6. DRG 본체 바로 위에 있는 신경돌기의 한쪽 끝을 클릭하여 새 추적을 시작합니다.
  7. 신경돌기를 따라 다른 점을 클릭하여 신경돌이 끝에서 끝까지 추적될 때까지 추적을 추가합니다. 신경돌기를 추적한 후 Finish Path(마침 경로 )를 클릭합니다.
  8. 추적한 길이를 실제 단위로 변환하고 결과를 복사하여 Excel에 붙여 넣어 저장합니다.
  9. FIJI의 직선 도구를 사용하여 축척 막대와 동일한 길이의 선을 그리고(선의 끝을 놓지 않음) 도구 모음 아래에 표시되는 길이 값을 확인합니다. 길이 값은 변환에 사용됩니다.
  10. 그림 4와 같이 DRG의 양쪽에서 뻗어 있는 6개의 긴 신경돌기의 길이를 측정하고(그림 3C,D) 이러한 신경돌기의 평균 길이를 계산하여 DRG의 대표적인 평균 길이를 제공합니다.
    참고: 면역염색은 비신경세포 지지 세포의 존재를 보여주기 위해 일반 겔의 DRG 외식물에서 테스트되었습니다7. DRG는 실온에서 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정하고 1x PBS로 15분 동안 3회 세척한 후 면역염색이 이루어질 때까지 4°C에서 1x PBS에 보관합니다.
  11. MC 장치의 이식 식물의 경우 MC 장치를 제거하고 위에서설명한 것과 동일한 프로세스 7을 따르십시오.

결과

본 프로토콜은 다중 구획(MC) 장치에서 성인 Sprague Dawley 쥐에서 DRG를 수확하고 배양하는 기술을 설명했습니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 성체 쥐에서 채취한 DRG를 잘라내어 ~0.5mm로 절단했습니다. 그런 다음 트리밍 및 절단된 DRG를 MC 장치의 소마 영역에 있는 하이드로겔에 삽입하고(그림 2) 신경돌기 정량 분석 전에 27일 동안 배양했습니다. DRG는 대조군으로 작용하기 위해 플레인 겔에서 배양되었습니다. 이 실험에 사용된 하이드로겔 제형의 농도는 4.5/1.25mg/mL 콜라겐(MAHA)이었습니다. 다중 구획 겔과 일반 겔의 경우 각각 27일과 21일째에 신경돌기가 강하게 성장했습니다(그림 3). MC에서 신경돌기의 평균 길이(894.22μm ± 308.75μm)는 대조군 일반 겔의 신경돌기 길이(864.26μm ± 362.84μm)와 비슷했습니다(그림 4). 이는 DRG 배양 및 신경돌기 성장을 지원하는 MC 장치의 능력을 보여줍니다. 신경돌기 길이는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화했습니다.

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그림 1: 실험 절차를 보여주는 개략도. (A) 성체 Sprague Dawley 쥐의 Dorsal root ganglia (DRG) 수확. (B) 수확한 DRG의 트리밍 및 절단. (C) 48웰 플레이트에 장착된 MC 내 하이드로겔의 하이드로겔 제형, DRG 포매 및 배양. (D) 배양 21-30일 후 DRG 신경돌기의 성장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 3개의 격리된 구획이 있는 인쇄된 다중 구획이며 48웰 플레이트에서 사용할 수 있습니다. (A) 인쇄된 MC 장치의 상단 뷰를 보여주는 대표 이미지는 DRG 및 신경석 구획(빨간색 선)과 DRG 내장 영역(녹색)을 보여줍니다. (B) MC의 측면 view (C) 48웰 플레이트에 장착된 MC의 이미지. 눈금 막대 = 10mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: MC(multi-compartment) 장치에서의 신경돌기 성장 및 대조군 일반 겔. (A) 명시야의 MC(Multi-Compartment) 장치에서 추적된 신경석 성장을 보여주는 대표적인 이미지. (아래) MC의 터널을 통해 자란 신경석은 화살표로 표시됩니다. (B) 대조군 플레인 겔(MC 제외)에서의 신경돌기 성장 이미지. (C) 대조군 일반 겔(보라색 선)에서 12개의 긴 신경돌기의 신경돌기 추적을 보여주는 대표적인 이미지. DRG의 양쪽에 있는 6개의 긴 신경돌기를 정량화하여 평균 신경돌기 길이를 얻었습니다. 이미지는 형광판 이미저로 4배 배율로 캡처하고 FIJI(ImageJ)를 사용하여 신경돌기를 정량화했습니다. 스케일 바 = 1000 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 다중 구획(MC)의 신경돌기 길이와 일반 겔(PG)의 길이. 개별 신경돌기 길이를 보여주는 산점도이며, 평균 및 표준 편차는 오차 막대로 표시됩니다. MC의 평균 신경돌기 길이는 1204.40 μm ± 690.43 μm(평균 ± SD)인 반면, 플레인 겔에서는 864.26 μm ± 362.84 μm(평균 ± SD)로 MC가 신경돌기 성장을 지원함을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 코딩 파일 1: CAD(Computer-Aided Design) 소프트웨어를 사용하여 생성된 다중 구획(MC) 장치의 STL 파일입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 성체 Sprague Dawley DRG를 수확하여 3D 천연 하이드로겔에서 배양하는 방법을 설명합니다. 이 방법과는 대조적으로, 생쥐와 랫드에서 DRG를 채취하는 다른 접근법은 척추를 분리하는 것입니다. 절제된 척추를 반으로 자르고 척수를 제거하여 DRG 23,24,25를 노출시킵니다. 척수의 손상은 혈액 공급을 제한하며, 이는 DRG와 내부 뉴런에 영향을 미친다26. 이는 DRG의 활동을 감소시켜 수술적 접근법을 더욱 적합하게 만듭니다. 또한, DRG의 생리학적으로 관련된 배양을 가능하게 하는 견고한 MC 장치를 3D 프린팅하는 방법이 설명되었습니다.

이 프로토콜은 DRG를 체외에서 배양하는 방법을 설명하며, 해부학적, 생리학적으로 관련된 모델에서 뉴런의 말초 감작을 연구하는 것을 강조합니다. 이 배양 방법은 3D 환경에서 원위 신경돌기와 DRG 세포체의 물리적 분리를 확립할 수 있습니다. MC 장치는 세포가 있는 DRG explant가 보존되고 native glial cell과 공동 배양될 수 있기 때문에 in vivo 환경을 모방합니다. DRG 외식물에는 생리학적 조건을 모방하기 위해 다른 세포와 공동 배양할 수 있는 비토착 신경 세포가 포함되어 있습니다. 이러한 생리학적 관련성은 비신경 세포가 신경 돌기 활동을 조절하는 방법에 대한 연구를 촉진하고 통각과 관련된 기본 메커니즘을 이해하는 데 도움이 됩니다. 이러한 비신경 세포 상호작용을 통합하면 해리된 DRG를 사용하는 단순화된 배양 모델에 비해 세포 신호 전달 결과를 더 정확하게 예측할 수 있습니다. 두 개의 신경돌기 구획의 존재는 단일 DRG가 생체 내에서 다른 조직을 자극하기 때문에 생리학적 관련성을 극대화합니다. 이 설계는 하나의 신경돌기 구획을 처리하는 동안 다른 하나는 대조군 역할을 합니다. 단일 소마에 연결된 대조 및 처리 구획은 교차 구획 효과를 연구하는 데 사용할 수 있으며, 신경돌기가 단일 소마에서 확장되어 다른 조직을 자극할 때 다른 자극을 경험하는 생체 내 조건을 모방하여 신경돌기 간의 누화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 인접한 구획의 신경돌기 간에 누화가 발생하는 경우, 처리되지 않은 DRG가 진정한 대조군이 될 수 있습니다.

이 장치는 치료 격리 또는 통증의 맥락에서 뉴런과 DRG 간의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 원위 신경돌기는 DRG soma 및 proximal neurites와 별도로 선택적으로 치료할 수 있기 때문에 이 시스템은 말초 감각 뉴런의 말단 부분을 직접 치료하는 표적 관절 치료와 같은 말초 치료에 사용할 수 있습니다.

MC 장치의 주요 장점은 MC 장치가 48웰 플레이트에 맞도록 설계되었기 때문에 동일한 플레이트의 여러 웰에서 고처리량 실험을 수행할 수 있다는 것입니다. in vitro 플랫폼의 또 다른 이점은 다양한 조직 미세환경의 특성을 모방하기 위해 콜라겐 및 MAHA 농도를 조정하여 MC 내의 하이드로겔 강성을 변경할 수 있는 능력입니다. 이 프로토콜의 한 가지 잠재적 한계는 신경돌기와 DRG soma compartment 사이의 유체 분리가 배지 변경 없이 72시간 이상의 배양에 이상적이지 않다는 것입니다. 이전 연구에서는 매체 변경 없이 최대 72시간 동안 구획에서 유체 격리가 유지됨을 확인했습니다11. 종래의 연구들은 히알루론산 농도를 증가시키는 것이 콜라겐 가교 밀도를 현저히 향상시키고, 따라서 하이드로겔 매트릭스(27)를 가로지르는 거대분자의 확산성을 제한한다는 것을 보여주었다. 따라서, 72시간 이후의 배양에 대한 유체 분리를 개선하기 위해, MAHA의 농도를 증가시킬 수 있으며, 이는 Caparaso et al.7의 연구에서 입증되었으며, 여기서 MAHA의 증가는 유체 분리를 개선시켰다. 제어 임베딩은 MC 및 플레인 겔에서 DRG 신경돌기의 유사한 성장을 보장하기 위해 수행됩니다. 이는 MC가 DRG 성장에 영향을 미치지 않도록 하기 위한 것입니다. MC의 DRG 성장이 검증되면 모든 실험에서 제어 임베딩을 반복하지 않는 것이 좋습니다.

저자들은 인간 DRG가 쥐 DRG에 비해 더 크고, 더 많은 세포를 포함하며, 다양한 비율의 뉴런 아형을 가지고 있음을 인정한다28. 설치류 DRG의 사용은 클리닉으로의 번역 측면에서 이 연구의 한계입니다. 그러나 이 시스템은 신경 세포 흥분성에 영향을 미치는 화합물을 식별하기 위한 스크리닝 플랫폼으로 유용할 수 있습니다. 설치류와 인간 DRG 사이에는 구성상의 차이가 있지만, 쥐와 인간 DRG 사이에는 단백질체 내에서도 높은 중복이 존재한다29. 이러한 단백질체의 중복과 동일한 신경 세포 아형의 존재는 랫트 DRG를 사용하여 높은 수준의 치료제를 스크리닝할 수 있으며, 랫트 DRG의 변화가 기계적으로 인간 DRG로 변환되는지 조사하기 위해 추가 테스트를 수행할 수 있음을 시사합니다.

이 플랫폼을 사용하면 표적 약리학적 자극과 시간적 제어를 통해 뉴런 또는 세포체를 연구할 수 있습니다. 신경 세포 흥분성 및 신호 전달의 변화는 신경돌기 또는 DRG를 조작하여 쉽게 측정할 수 있습니다. 외식물 DRG가 있는 플레인 컨트롤 하이드로겔에서 칼슘 이미징을 사용하여 신경 세포 흥분성을 평가하는 능력이 입증되었습니다7. 신경 세포 흥분성을 평가하기 위해 MC 장치에서 유사한 방법을 사용할 수 있습니다.

이 방법은 디스크 관련 요통과 같이 말초 일차 감각 뉴런의 자극이 주도 요인인 다양한 통증 상태를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 통각수용체 과민증을 선별하는 것은 과흥분을 줄이기 위한 새로운 약물을 발견하는 유망한 도구가 될 수 있습니다. 과흥분을 줄이면 임상적으로 통증 감소로 이어질 수 있습니다. 이 플랫폼은 고처리량 약물을 스크리닝하여 통증과 유사한 거동 분석을 사용하여 in vivo 검증을 위한 가장 효과적인 후보를 식별할 수 있습니다.

공개 사항

이 연구의 저자들은 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 NSF Grant(2152065)와 NSF CAREER Award(1846857)의 지원을 받았습니다. 저자들은 이 프로토콜에 기여한 Wachs Lab의 모든 현재 및 과거 구성원에게 감사를 표하고 싶습니다. 그림 1 의 다이어그램은 Biorender로 만든 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#5 집게Fine Science Tools11252-00트리밍 및 절단용 DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (오토클레이브)실험실7.3 - 7.5 pH
24 웰 플레이트VWR82050-892수확 및 절단 DRG를 임시로 보관하기 위해
3 mL 주사기 멸균, 일회용BD309657
48 웰 플레이트Greiner Bio-One677180
60mm 페트리 접시Fisher ScientificFB0875713A트리밍 및 절단용 매체를 고정하기 위해
Fisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044DRG 매체용
콜라겐 유형 IIbidi50205
곡선형 컵 Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14해부용
Dumont #3 집게Fine Science Tools11293-00해부
용 Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher16000044DRG 매체
용 Form cureForm Labs경화제
Form washForm LabsMC에서 여분의 수지를 씻어냅니다
유리 구슬 살균기Fisher ScientificNC9531961
유리 바이알 (8mL)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061DRG 매체
용 HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
고온 V2 수지FormLabsFLHTAM02
히알루 론산 나트륨 염MilliporeSigma53747MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
Laminin. D Systems344600501
대형 무딘 코 가위MilitexEG5-26해부용
대형 집게 (톱니 모양의 팁)Militex9538797해부용
대형 날카로운 코 가위Fine Science Tools14010-15해부용
저유지 피펫 팁Fisher Scientific02-707-017콜라겐 및 피펫 MAHA
메타크릴화 히알루론산(MAHA)실험실에서 준비N/A85 - 115 % 메타크릴화
신경 성장 인자(NGF)R& D Systems556-NG-100DRG 매체
Neurobasal A 매체ThermoFisher10888022DRG 매체
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicillin/Streptomycin (PS)EMD Millipore516106DRG 매체
pH 테스트 스트립VWR InternationalBDH35309.606
피펫 팁(1000 µ L)USA Scientific1111-2021
프리폼 3.23.1 소프트웨어FormslabSTL 파일 업로드용
RatCharles River
Resin 3D 프린터Form LabsForm 3L3D 프린팅 MC 장치
작은 날카로운 코 가위Fine Science Tools14094-11해부용
중탄산나트륨MilliporeSigmaS6014
스트레이트 컵 롱거파인 사이언스 도구16004-16해부용
스트레이트 엣지 스프링 가위파인 사이언스 도구15024-10해부용
외과용 스카플렐 블레이드 (No. 10)Fisher Scientific22-079-690
주사 필터, PES (0.22 &마이크로; m)Celltreat229747
Tiny spring scissorsWorld Precision Instruments14003DRG UV 램프 트리밍 및 절단 용
Analytik Jena US광 가교 하이드로 겔 (15-18 mW / cm2)
에서 준비 알루미늄 호일 . R&를 만드는 데 사용됩니다

참고문헌

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말초 신경 세포의 특징을 연구하기 위해 다중 구획 장치에서 등쪽 뿌리 신경절을 수확, 삽입 및 배양합니다.
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