방법 논문

베이커의 미토콘드리아 변환

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DOI:

10.3791/66856

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2024년 6월 7일

 ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 연구는 생물학적 방법을 사용하여 효모 미토콘드리아를 형질전환하는 방법을 설명합니다. 또한 형질전환체를 선택하고 정제하는 방법과 미토콘드리아 게놈 내의 표적 위치에 원하는 돌연변이를 도입하는 방법을 보여줍니다.

초록

베이커 효모 맥주효 모균(Saccharomyces cerevisiae )은 수십 년 동안 미토콘드리아 생물학을 이해하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 이 모델은 진핵생물 사이에서 필수적이고 보존된 미토콘드리아 경로와 곰팡이 또는 효모 특이적 경로에 대한 지식을 제공했습니다. S. cerevisiae 의 많은 능력 중 하나는 미토콘드리아 게놈을 조작하는 능력으로, 지금까지 S. cerevisiae 와 단세포 조류 Chlamydomonas reinhardtii에서만 가능합니다. 효모 미토콘드리아의 생물학적 형질전환(biolistic transformation)을 통해 부위 지정 돌연변이(site-directed mutation)를 소개하고, 유전자를 재배열하고, 리포터(reporter)를 소개할 수 있습니다. 이러한 접근법은 주로 미토콘드리아에서 고도로 조정된 두 가지 과정, 즉 미토리보솜에 의한 번역과 호흡기 복합체 및 ATP 합성효소의 조립의 메커니즘을 이해하는 데 사용됩니다. 그러나 미토콘드리아 변환은 잠재적으로 다른 경로를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 본 연구에서는 고속 미세발사체 충격에 의해 효모 미토콘드리아를 형질전환시키는 방법, 의도한 형질전환체를 선별 및 정제하는 방법, 원하는 돌연변이를 미토콘드리아 게놈에 도입하는 방법을 보여줍니다.

서론

효모 Saccharomyces cerevisiae는 미토콘드리아 생물 발생을 연구하는 데 사용되는 널리 알려진 모델입니다. 효모는 혐기성, 통성 유기체이기 때문에 호흡을 손상시키는 돌연변이를 도입하는 원인과 결과를 광범위하게 연구할 수 있습니다. 또한 이 유기체는 미토콘드리아 경로를 연구할 수 있는 친근한 유전적 및 생화학적 도구를 보유하고 있습니다. 그러나 호흡 복합체 조립 및 미토콘드리아 단백질 합성의 메커니즘을 탐구하기 위한 가장 강력한 자원 중 하나는 미토콘드리아를 변형시키고 세포 소기관의 게놈을 수정할 수 있는 능력입니다. 이전에는 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 점 돌연변이 또는 작은 결실/삽입(1,2,3,4,5)을 도입하고, 유전자 6,7을 삭제하고, 유전자 재배열(7,8)을 만들고, 미토콘드리아 단백질(9,10)에 에피토프를 추가하고, 핵에서 미토콘드리아(11)로 유전자를 재배치하는 것이 도움이 되었다.12, BarStar13, GFP14,15, luciferase16 및 가장 널리 사용되는 ARG8m17,18과 같은 리포터 유전자를 소개합니다. 미토콘드리아 게놈 변형을 통해 다른 방법으로는 이해하기 어려웠을 메커니즘을 해부하고 식별할 수 있게 되었습니다. 예를 들어, 미토콘드리아 DNA의 COX1 유전자좌에 삽입된 ARG8m 리포터 유전자는 Mss51이 Cox1 생물 발생에서 이중 역할을 한다는 것을 이해하는 데 결정적이었습니다. 첫째, COX1 mRNA의 번역 활성제이며, 둘째, 새로 만들어진 Cox1 단백질 7,19의 조립 샤페론입니다. 이 연구는 S. cerevisiae 미토콘드리아를 형질전환시키는 상세한 방법을 제시합니다. 미토콘드리아 형질전환 프로토콜은 16,20,21,22,23 이전에 발표되었지만, 방법의 다양한 단계와 세부 사항을 철저히 이해하려면 비디오를 통한 시각적 접근이 필수적입니다. 이 방법은 다양한 단계로 구성되며 네 가지 일반적인 단계로 나뉩니다.

유전자 편집 과정 다이어그램; 텅스텐 입자, DNA 코팅, 미토콘드리아 게놈 통합 단계.
그림 1 : 고속 미세 발사체 충격에 의한 미토콘드리아 변환 절차 개요 : 1) 텅스텐 입자는 DNA 코팅 전에 멸균 및 제조됩니다. 2) 두 개의 서로 다른 플라스미드가 WP 표면에 침전됩니다. 하나는 미토콘드리아 기질로 향하는 구조를 포함하는 박테리아 플라스미드입니다. 다른 하나는 auxotrophy marker를 운반하는 핵 효모 발현 벡터입니다. 3) 미토콘드리아 DNA(rho0)가 결핍된 수용체 효모 균주는 미토콘드리아 유전자 발현의 포도당 억제를 가하지 않는 갈락토스 또는 라피노스와 같은 발효 탄소원에서 성장합니다34,35. 문화는 폭격 매체를 포함하는 페트리 접시에 퍼집니다. 4) 플라스미드로 코팅된 WP는 고속 미세발사체 충격에 의해 수용체 변형에 발사됩니다. 5) 미토콘드리아 플라스미드를 함유하는 positive synthetic rho-colony는 tester strain과 교배하여 선택합니다. 6) 미토콘드리아 구조체는 세포유도(cytoduction)로 알려진 과정을 통해 합성 rho-train(donor)을 acceptor train과 결합함으로써 원하는 유전자좌에서 미토콘드리아 게놈에 통합됩니다. 7) 미토콘드리아 구조를 운반하는 양성 수용체, 반수체 균주는 다른 매체에서 선택되고 정제됩니다. 약어 : WP = 텅스텐 입자; mtDNA = 미토콘드리아 DNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

미토콘드리아 게놈에 통합하기 위한 DNA 구조를 가진 세포의 형질전환 (그림 1, 1-4단계)
완전한 미토콘드리아 게놈(rho+)을 포함하는 효모를 직접 형질전환하는 것이 가능하지만, 세포에 미토콘드리아 DNA(rho 0)가 없는 경우 형질전환이 10-20배 더 효율적입니다(rho0)24. 텅스텐 입자 (WP)는 공 형질전환 될 두 개의 다른 플라스미드로 코팅됩니다. 첫 번째는 LEU2 또는 URA3 (예: 각각 YEp351 또는 YEp352)와 같은 보조 영양 마커를 운반하는 효모 2 μ 발현 벡터입니다. 효모 세포에 DNA를 생물학적으로 도입하는 데 성공하면, 형질전환체는 보조영양 배지(즉, 류신 또는 우라실이 결핍된 배지)에서 성장할 것이다. 이 플라스미드는 핵 플라스미드를 획득한 세포의 첫 번째 선택을 하는 데 도움이 됩니다. 그렇지 않으면, 결과 콜로니의 수가 플레이트를 포화시킬 것입니다. 두 번째 플라스미드는 미토콘드리아 게놈에 통합되도록 의도된 미토콘드리아 구조를 포함하는 박테리아 플라스미드(예: pBluescript 또는 이와 유사)입니다. 구조체는 관심 미토콘드리아 영역과의 재조합을 위해 최소 100nt의 5' 및 3' 측면 미토콘드리아 서열을 포함해야 합니다. 우리의 경험에 따르면, 더 큰 플랭킹 염기서열은 미토콘드리아 게놈의 표적 자리와 성공적으로 재결합할 가능성이 더 높습니다.

구체적인 예가 그림 225에 나와 있습니다. 이 예에서 목표는 해당 단백질(Cox1ΔC15)의 마지막 15개 아미노산을 암호화하는 미토콘드리아 COX1 유전자의 영역을 삭제하는 것이었습니다(그림 2A). COX1ΔC15 돌연변이를 운반하는 박테리아 플라스미드는 유전자의 5' 및 3' 번역되지 않은 영역의 각각 395 nt 및 990 nt를 포함하고 있었습니다. 플라스미드는 pBluescript(pXPM61)에서 파생되었으며 2개의 μ 플라스미드 YEp352와 함께 WP 표면에 응고되었습니다(그림 2B). 그런 다음 WP는 마이크로 발사체 충격에 의해 선택된 수용 균주에 도입되었습니다(그림 2C). NAB6926으로 명명된 이 균주는 kar1-1 및 ade2 대립유전자를 지닌 MATa, rho0 균주입니다(이러한 특성의 중요성은 아래에서 논의됨). 세포는 2 μ 플라스미드를 획득한 세포를 선택하기 위해 우라실이 결핍된 충격 매체에 도말되었습니다(그림 2C). 세포를 30°C에서 5-7박 동안 성장시켰다.

미토콘드리아 구조를 포함하는 박테리아 플라스미드와 auxotrophy 마커를 운반하는 핵 2 μ 플라스미드를 획득한 세포의 선택 (그림 1, 5단계)
양성 콜로니는 미토콘드리아22에서 박테리아 플라스미드의 많은 복사본을 유지합니다. 형질전환된 세포는 원래 rho0이기 때문에, 어떤 미토콘드리아 서열도 플라스미드에 존재하는 미토콘드리아 구조체의 번역을 지원하지 않습니다. 따라서 형질전환된 미토콘드리아 유전자는 발현되지 않습니다. 미토콘드리아 플라스미드를 획득한 효모 콜로니를 검출하기 위해 형질전환체를 테스터 균주와 결합해야 합니다. 테스터 균주의 미토콘드리아 게놈에는 관심 유전자의 비기능적 돌연변이 버전이 포함되어 있습니다. 교배 후, 미토콘드리아는 융합하고, 형질전환된 플라스미드에 포함된 미토콘드리아 서열은 테스터 균주에서 돌연변이된 미토콘드리아 유전자와 재결합합니다. 결과적으로, WT 유전자의 회복은 기능을 재구성할 것입니다. 생성된 이배체는 검출 가능한 양성 표현형(일반적으로 호흡기 배지 또는 아르기닌이 부족한 배지에서 성장할 수 있는 능력)을 갖습니다. 미토콘드리아에서 박테리아 플라스미드를 운반하는 양성 세포는 "합성 rho-cell"이라고 불립니다. 도 2D의 구체적인 예에서, COX1ΔC15 구조체(XPM199로 명명됨)를 운반하는 합성 rho-cell은 우라실이 결핍된 매체(이것은 양성 콜로니가 정제된 마스터 플레이트)에 복제 도금되었습니다. 그들은 또한 비기능성 돌연변이 cox1D369N을 포함하는 테스터 균주 L4527 잔디밭에 복제 도금되었습니다. 2박 동안 짝짓기를 한 후, L45와 XPM199의 미토콘드리아 게놈이 재결합되어 기능적인 COX1 유전자가 생성되었습니다. 따라서 이배체는 호흡 매체에서 자랄 수 있는 능력을 회복했습니다. 마스터 플레이트에서 우리는 긍정적 인 식민지를 선택했습니다. 우라실이 결핍된 플레이트에 줄무늬를 표시하고, 순수한 합성 로셀을 얻기 위해 선택적 테스트를 반복했습니다(그림 2E). 테스트 플레이트는 합성 로콜로니를 식별하기 위한 용도로만 사용되며 이러한 플레이트에서 돌연변이를 회수할 수 없다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.

의도된 균주의 미토콘드리아 게놈에 구조체의 통합
이 단계는 cytoduction28,29라는 과정에 의해 달성됩니다(그림 1, 단계 6). 이 접근법에서, 합성 rho-strain (donor strain)는 반대 결합 유형의 의도된 acceptor train에 결합됩니다. 필수 요구사항은 두 개의 짝짓기 균주 중 적어도 하나가 핵융합을 방해하기 위해 kar1-1 돌연변이를 운반하는 것이다(30). 따라서 두 세포의 결합은 이핵 접합체(binucleated zygote)를 생성합니다(그림 3). 부모 세포(공여자와 수용자)의 미토콘드리아 네트워크가 융합되고 미토콘드리아 DNA 분자가 재결합합니다. 이핵화된 접합체는 싹을 틔울 수 있도록 배양/회수되어 반수체 세포를 생성합니다. 이 반수체는 부모 세포 중 하나의 핵 배경을 가지고 있습니다. 유사하게, 반수체는 부모 세포 또는 관심 있는 재조합된 미토콘드리아 DNA에서 미토콘드리아 DNA를 운반할 수 있습니다. 그러나 kar1-1 돌연변이는 100% 효과적이지 않으며 짝짓기28,29 중에 일부 진정한 이배체가 형성됩니다. 합성 rho- 균주(donor, XPM199)는 예에서 kar1-1 대립유전자를 운반했습니다. 선택적 마커로서, 그것은 ade2 대립 유전자를 가지고 있었고, 아데닌에 대한 보조 영양 식물이되었습니다 (그림 4). 수용체 균주는 cox1Δ::ARG8m 구조를 지닌 rho+ 균주인 XPM10이었으며, 여기서 리포터 ARG8m은 미토콘드리아 게놈7의 COX1 코돈을 대체했습니다. 두 세포 배양물의 혼합물을 교합을 허용하기 위해 YPD 플레이트에 방울로 첨가하였다. 3-5 시간 후, 세포는 교미와 관련된 세포 모양 인 shmoos (그림 3B)의 형성을 감지하기 위해 광학 현미경으로 관찰되었습니다. 배양/회수 시간 후, 공여체 세포의 성장을 방지하기 위해 아데닌이 결핍된 배지에 이핵 접합체를 도말했습니다.

관심 미토콘드리아 게놈을 운반하는 반수체 균주의 선택 (그림 1, 7단계)
donor, acceptor 및 diploid cell의 혼합물이 세포 duction 후에 존재합니다. 따라서 이핵형 접합체의 배양/회수 후에는 관심 있는 반수체를 식별하고 정제하기 위해 세포를 다른 선택적 배지에서 성장시켜야 합니다. 선택적 배지는 donor의 유전자형, acceptor 균주 및 의도된 미토콘드리아 구조에 따라 달라집니다. 그러나, 일반적으로, 선택적 배지를 선택하는 이유는 다음과 같다: i) 배양/회복 후, 세포유도 혼합물은 기증자 부모 균주가 성장할 수 없는 선택적 배지에서 성장한다. 그림 4A,B의 특정 예에서, 공여체(합성 rho- strain)는 비기능적 ade2 대립유전자를 운반합니다. 따라서, 세포유도 혼합물은 아데닌이 결핍된 배지 플레이트에서 배양해야 합니다. 이것은 마스터 플레이트입니다. ii) 콜로니가 성장하면 마스터 플레이트는 아데닌이 없는 배지에 다시 복제되고(관심 있는 양성 콜로니가 정제될 새로운 마스터 플레이트를 생성하기 위해) 다음으로 이배체만 자랄 수 있는 배지에 복제됩니다. 이는 이배체 콜로니의 부주의한 추가 정제를 방지하기 위해 필요합니다. 그림 4C의 예시에서, 류신이 결핍된 배지에서는 이배체만 자랄 수 있습니다. iii) 마스터 플레이트는 또한 관심 있는 미토콘드리아 DNA를 통합한 수용체 반수체만 성장하는 매체에 복제됩니다. 그림 4C의 예에서, 반수체는 Cox1ΔC15 단백질이 기능적이기 때문에 에탄올/글리세롤을 탄소원으로 포함하는 호흡 매체에서 성장합니다. 생성된 관심 mtDNA를 함유한 rho+ 균주는 XPM20925로 명명되었습니다. 그림 2 및 그림 4에 사용된 균주는 표 1에 나열되어 있습니다.

효모 유전자 편집 과정, mtDNA 및 COX1ΔC15, URA3 플라스미드, 합성 rho⁻ 균주가 포함된 다이어그램.
그림 2: 미토콘드리아 변형과 양성 rho-cell 선택의 구체적인 예를 설명하는 다이어그램. (A) 미토콘드리아 게놈의 의도된 수정은 Cox1 소단위체(Cox1ΔC15)의 마지막 15개 아미노산에 대한 영역 코딩의 삭제였습니다. (B) WP는 효모 세포를 형질전환시키기 위해 두 개의 플라스미드로 코팅되었습니다. 하나는 2 μ 플라스미드 Yep352로, 핵에서 지시되고 발현되었습니다. 다른 하나는 플라스미드 pXPM61로, COX1ΔC15 대립유전자와 COX1 5' 및 3'-UTR의 395 nt 및 990 nt를 각각 포함합니다. (C) WP는 미토콘드리아 DNA(rho0 균주)가 없는 NAB69 균주로부터 세포에 도입되었습니다. 폭격판으로부터 수득된 형질전환체 콜로니는 핵 플라스미드 YEp352의 보조영양 마커인 우라실이 결핍된 배지에 복제되었습니다. (D) 양성 로-콜로니를 선택하기 위해, -URA 플레이트를 우라실이 결핍된 매체에 복제하였다. 이것은 양성 콜로니를 선택하고 격리하는 마스터 플레이트였습니다. 또한 리치 미디어(YPD)가 있는 플레이트와 테스터 변형의 잔디밭에 복제되었습니다. 교배 동안, 합성 로-미토콘드리아 DNA는 COX1 유전자(D369N)에 돌연변이를 가지고 있는 테스터 균주 L4527로부터의 미토콘드리아 DNA와 재조합되었다. 호흡기에서 자란 이배체에는 변형된 DNA가 포함되어 있었습니다. 해당 콜로니는 마스터 플레이트에서 선택하여 줄무늬를 제거하고 정제했습니다. 모든 복제 도금에서 마스터 플레이트의 양극 콜로니를 식별하는 데 도움이 되도록 플레이트 가장자리에 영구적인 마커(녹색 선)로 표시했습니다. (E) 선택된 양성 콜로니는 우라실이 결핍된 매체에서 줄무늬가 생겼습니다. 이것이 새로운 마스터 플레이트였습니다. D에서와 같이, 합성 로콜로니를 정제하기 위해 두 차례의 테스트를 더 수행했습니다. 약어 : WP = 텅스텐 입자; mtDNA = 미토콘드리아 DNA; -URA/Sorb = 소르비톨을 함유한 우라실 결핍; WT = 와일드 타입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

효모 세포 융합 과정; 다이어그램 및 현미경 이미지; rho+ 전송; 짝짓기 단계; 세포 생물학.
그림 3: 세포유도 절차를 설명하는 다이어그램. (A) 세포유도 중 세포가 짝을 이루는 방법에 대한 일반적인 개요. 세포유도 중에는 공여체 균주와 수용체 균주의 미토콘드리아가 융합되어 두 균주의 미토콘드리아 DNA가 재결합합니다. kar1-1 돌연변이30으로 인해 핵융합이 감소하기 때문에 이중핵 접합체가 형성됩니다. 약간의 배양/회복 시간 후, 의도한 미토콘드리아 돌연변이를 포함하는 이핵 접합체 싹 및 반수체 수용체가 선택됩니다. (B) 세포duction을 통한 합성 rho-strain (donor)와 acceptor train의 교배는 짝짓기 효모의 특징적인 모양인 shmoos(빨간색 화살표)의 형성을 허용합니다. 이미지는 100x 대물렌즈가 있는 광학 현미경으로 촬영했습니다. 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

기증자 XPM199와 수용체 XPM10을 보여주는 효모 유전적 교차 다이어그램으로, DNA 통합을 위한 ADE 마스터 도금 및 재조합 성장 과정을 강조합니다.
그림 4: 미토콘드리아 게놈에 돌연변이 COX1ΔC15 를 통합하기 위한 세포유도의 구체적인 예를 설명하는 다이어그램. (A) 합성 rho- 균주(donor, XPM199)와 관심 균주(acceptor, XPM10)의 액체 배양물을 혼합하여 짝짓기를 하였다. shmoo 형성 후, 혼합물을 2-4 시간 동안 액체 배양액에서 회수 하였다. 다음으로, 세포 유도 혼합물을 공여 세포의 성장을 방지하기 위해 아데닌이 결핍된 배지가 있는 플레이트에 펴 바릅니다. (B) 세포 유도 중 공여자(XPM199)와 수용체(XPM10)의 미토콘드리아 DNA의 재조합 이벤트의 개략도. (C) 마스터 플레이트는 소기관의 DNA(XPM209)에 의도된 미토콘드리아 유전자를 통합한 반수체를 식별하고 정제하기 위해 다른 선택적 매체에 복제되었습니다(XPM209)25. 약어: -ADE = 아데닌 결핍; -LEU = 류신 결핍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

참고: 미토콘드리아 변환 효율은 일반적으로 낮기 때문에 각 구조에 대해 6개의 변환을 수행하는 것이 좋습니다. 상이한 성장 매체의 조성은 표 2에 나타내어져 있다.

1. 텅스텐 입자 제조

  1. 마이크로튜브에서 0.7μm 텅스텐 입자(WP, 마이크로캐리어) 30mg을 칭량합니다. 1.5% 에탄올(EtOH) 70mL를 첨가하여 살균합니다. WP를 소용돌이치게 하고 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다.
  2. 실온에서 13,200 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 입자에 1.5mL의 멸균수를 첨가하고 소용돌이치게 한 다음 실온에서 13,200× g 에서 15분 동안 원심분리하여 WP를 세척합니다. 상층액을 버립니다.
  3. 500μL의 멸균 50% 글리세롤을 추가합니다(최종 농도는 WPs/μL 60μg).
    알림: WP는 -20 °C에서 최소 6개월 동안 보관할 수 있습니다. 이 스톡에서 6 회 변형에 필요한 양 (100 μL)을 취하십시오.

2. WPs DNA 코팅

  1. 미토콘드리아 서열을 포함하는 2 μ plasmid 5 μg과 박테리아 plasmid 15 μg을 얼음 위의 마이크로튜브에 추가합니다.
    참고: DNA 코팅에 필요한 시약을 더 희석하지 않도록 최종 부피는 50μL를 초과해서는 안 됩니다.
  2. 100μL의 WP 현탁액과 5초 동안 와류를 추가합니다(WP 6mg).
  3. 1M 스퍼미딘 4μL를 추가합니다. 간단히 말해서 소용돌이.
  4. 100 μL의 얼음처럼 차가운 2.5 M CaCl2 를 넣고 잠시 와류를 넣으십시오. 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 3분마다 믹스를 짧게 소용돌이칩니다.
    알림: CaCl2 용액은 필터 멸균 처리되어 있으며 고압멸균해서는 안 됩니다.
  5. 4°C에서 13,200× g 의 WP를 30초 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. -20°C에서 200μL의 100% EtOH에 입자를 부드럽게 재현탁하여 세척합니다.
  6. 4°C에서 13,200× g 의 WP를 30초 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세탁을 반복하십시오.
  7. 피펫 팁을 사용하여 60-70 μL의 실온 100% EtOH에 WP를 재현탁시킵니다. 소용돌이치지 마십시오.
    참고: 플라스미드의 품질을 보장하기 위해, DNA 코팅은 biolistic transformation과 같은 날에 수행되어야 합니다.

3. 생물학적 재료 준비

  1. 폭격하기 전에 오토클레이브에서 6개의 마크로캐리어 홀더(그림 5)를 멸균하고 완전히 건조시킵니다. 또는 EtOH에 담그고 겸자를 사용하여 화염을 사용하여 살균합니다. 멸균 유리판에 놓습니다.
  2. DNA 침전 중(2.4단계에서 얼음 위에서 10분 배양) 멸균 겸자를 사용하여 6개의 마크로캐리어 홀더 각각에 6개의 마크로캐리어(또는 플라잉 디스크)를 삽입합니다.
    알림: 매크로캐리어를 멸균하지 마십시오.
  3. DNA 코팅된 WP를 피펫과 혼합합니다. 각 매크로캐리어 표면에 10μL의 WP를 추가하고 피펫 팁으로 전체 표면에 분포시킵니다. 필요한 경우 100% EtOH의 몇 마이크로리터를 매크로캐리어 표면에 추가하여 WP가 고르게 퍼지도록 합니다. 현탁액을 실온에서 ~20분 동안 건조시키십시오.

4. 효모 세포 및 충격판의 준비

  1. YPR 배지 2mL에 rho0 수용체 균주를 접종합니다(표 2). 회전하는 바퀴에서 30 °C에서 하룻밤 동안 성장시킵니다.
  2. 배양액 300μL를 신선한 YPR 배지 30mL에 희석합니다. 30 °C 및 200 rpm에서 로터리 셰이커로 2박 동안 배양액이 포화될 때까지 성장시킵니다.
  3. 효모 세포를 600× g 에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 600μL의 YPD 배지에 효모 세포를 재현탁시킵니다(표 2).
  4. 멸균 유리 손잡이를 사용하여 100μL의 효모 세포 현탁액을 고체 폭격 배지 플레이트에 펴 바릅니다.
    NOTE: bombardment medium에는 transformation에 사용될 2 μ plasmid의 selection marker가 없어야 합니다.
  5. 다른 5개의 플레이트에 대해 4.4단계를 반복합니다.
  6. 액체 매체가 플레이트 표면에 완전히 흡수되도록 충격하기 전에 실온에서 1-3시간 동안 배양합니다.

5. 생물학적 형질전환에 의한 합성 rho-균주의 생성

알림: 시작하기 전에 생물학적 장비의 사용 설명서를 반드시 읽으십시오. 참조된 장비의 프로토콜에 대해 설명합니다(재료 표 및 그림 5).

  1. 오염을 방지하기 위해 70% 에탄올로 생물학적 입자 전달 시스템의 챔버를 청소하고 최소 10분 동안 그대로 두십시오. 폭격 직전에 깨끗한 종이 타월로 표면을 닦으십시오.
  2. 헬륨 탱크 밸브를 열어 약 2,000psi를 설정합니다.
  3. 장비의 전원을 켜고 진공 소스를 켭니다.
  4. 집게를 사용하여 매크로캐리어를 매크로캐리어 홀더에 아래를 향하게 놓습니다.
    알림: 장비와 함께 제공되는 정지 화면을 사용하지 마십시오.
  5. 매크로캐리어 위에 매크로캐리어 뚜껑을 나사로 고정합니다. 모든 부품이 함께 마이크로캐리어 발사 시스템을 구성합니다(그림 5).
  6. 마이크로캐리어 발사 시스템을 바닥에서 다섯 번째 레벨의 진공 챔버 내부에 놓습니다.
  7. rho0 변형 잔디를 포함하는 플레이트 중 하나를 챔버 바닥에서 두 번째 레벨에 놓습니다. 접시가 위를 향하고 뚜껑이 없는지 확인하십시오.
  8. 멸균 겸자를 사용하여 고정 캡에 하나의 파열 디스크를 놓습니다. 가속 튜브의 고정 캡을 조입니다. 고정 캡이 꼭 맞는지 확인하십시오.
    알림: 변형 효율이 감소하는 것을 관찰한 결과 설명서에서 제안한 대로 파열된 디스크를 이소프로판올로 처리하지 마십시오.
  9. 진공 챔버의 문을 닫습니다.
  10. VAC/VENT/HOLD 스위치를 VAC 위치에 놓습니다. 25-28 inHg 진공에 도달하면 VAC/VENT/HOLD 스위치를 HOLD 위치로 변경합니다.
    알림: 달성 가능한 진공은 해수면에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 25 inHg에 도달하는 데 성공했습니다.
  11. FIRE 스위치를 눌러 WP를 쏘십시오. 파열 디스크가 파손되어 팝 소리가 날 때 1,300psi에 도달할 때까지 가속 튜브에 압력이 형성될 때까지 기다립니다.
  12. 파열 디스크가 파손된 직후 VAC/VENT/HOLD 스위치를 VENT 위치로 변경하여 FIRE 스위치와 진공을 해제합니다.
  13. 멸균 겸자를 사용하여 플레이트 표면에 있는 파열 디스크의 파편을 조심스럽게 제거하고 플레이트를 뚜껑으로 덮습니다.
  14. 나머지 5개의 플레이트에 대해 절차를 반복하여 각 라운드에 새 파열 디스크와 매크로캐리어를 배치합니다.
  15. 마지막에 헬륨 탱크의 메인 밸브를 닫습니다.
  16. 챔버를 닫고 VAC/VENT/HOLD 스위치를 VAC 위치로 가져와 진공을 만듭니다. FIRE 스위치를 몇 번 눌렀다 놓아 헬륨 압력에서 시스템을 해제합니다. 문을 연 상태에서 반복합니다.
  17. 진공 펌프와 폭격 장비를 끕니다.
  18. 70% EtOH로 전달 시스템을 청소합니다. 매크로캐리어 지지대를 0.1% SDS 용액으로 세척하십시오. 멸균 증류수와 100% EtOH로 헹굽니다.

6. 합성 rho- 콜로니 선택

  1. 30 °C에서 5-7 박 동안 폭격 플레이트를 배양합니다.
    알림: 플레이트에 오염이 있는지 매일 확인하는 것이 중요합니다. 필요한 경우 추가 오염을 방지하기 위해 멸균 주걱으로 오염된 부위를 잘라낼 수 있습니다.
  2. 반대쪽 결합 유형의 테스터 균주를 밤새 YPD 배지 2mL에 접종합니다(그림 2D,E의 특정 예 참조).
  3. YPD 플레이트에 150μL의 테스터 균주 배양액을 접종합니다. 멸균 유리 손잡이를 사용하여 테스터를 플레이트 표면에 고르게 펴 바릅니다. 접시를 최소 5분 동안 건조시키십시오.
  4. 벨벳 복제 패드와 복제기 스탬프를 사용하여 폭격판의 복제품을 만드십시오.
    1. 형질전환된 2 μ plasmid auxotrophy marker에 해당하는 dropout medium plate에 복제합니다. 성장은 30 °C에서 한 번의 하룻밤 배양이 필요합니다. 그 후 4 °C에서 계속 사용할 때까지 보관하십시오. 이 플레이트가 마스터 플레이트입니다.
    2. 6.3단계에서 테스터의 잔디밭이 포함된 YPD 플레이트에 복제합니다. 30°C에서 2박 동안 배양합니다. 그 후, 이 플레이트를 선택적 배지에 복제하여 관심 미토콘드리아 유전자(예: 호흡기 배지 또는 아르기닌이 결핍된 배지)의 존재를 검출하고 30°C에서 밤새 배양합니다. 미토콘드리아에 합성 박테리아 플라스미드를 품고 있는 세포만이 테스터 균주와 교배한 후 선택적 배지에서 자랍니다.
  5. 마스터 플레이트(단계 6.4.1)에서 단계 6.4.2에서 성장한 해당 콜로니를 식별합니다.
    알림: 폭격 플레이트(및 마스터 플레이트)는 변형 콜로니로 붐비기 때문에 테스터의 결합 플레이트에서 관찰된 양성 콜로니를 식별하기 어려울 수 있습니다. 이러한 이유로 영구 마커로 모든 판의 양쪽에 몇 개의 작은 선을 그리는 것이 좋습니다. 복제 스탬프의 링에 비슷한 선을 그립니다. 이 선은 마스터 플레이트에서 양극 콜로니의 방향을 지정하고 위치를 찾는 데 도움이 됩니다( 그림 2D의 예 참조).
  6. 6.4.1단계에서와 같이 마스터 플레이트에서 두 번째 선택적 드롭아웃 플레이트로 줄무늬를 만들어 양극 콜로니를 정제합니다. 30 °C에서 2박 동안 배양합니다.
    참고 : 줄무늬는 순수한 변형을 보장하기 위해 단일 식민지의 성장을 허용하는 것이 중요합니다.
  7. 선택 과정(단계 6.2-6.5)을 반복하여 미토콘드리아에 박테리아 플라스미드가 있는지 확인합니다.
    참고: 일반적으로 이 과정을 두 번 더 반복하여 안정적인 합성 rho-strain 을 선택할 수 있습니다.
  8. 합성 rho-train 이 미토콘드리아에서 플라스미드 DNA를 안정적으로 유지하면 3-5개의 서로 다른 양성 콜로니를 선택하고 2mL의 YPD에 접종합니다. 이 배양액을 사용하여 cryovial stock을 준비하고(600μL의 배양액과 600μL의 50% 글리세롤을 혼합하여 -70°C에서 보존) 세포유도를 통해 플라스미드 염기서열을 관심 mtDNA에 삽입합니다(단계 6.7).
    주의: 합성 rho-strain 으로부터 미토콘드리아에서 형질전환된 플라스미드를 유지하기 위한 선택적 압력이 없기 때문에, 플라스미드는 쉽게 손실될 수 있습니다. 따라서 가능한 한 빨리 세포 유도를 하는 것이 좋습니다.

7. 세포유도에 의해 미토콘드리아 게놈의 표적 부위에 합성 rho-train에 존재하는 구조를 통합합니다.

  1. 두 개의 튜브에 3mL의 YPD 배지를 접종하는데, 하나는 공여 세포(합성 rho- 세포)로, 다른 하나는 수용체 세포(최종 구조가 예상되는 효모 세포)로 접종합니다. 30 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  2. 750 μL의 donor 균주와 250 μL의 수용체 균주를 멸균 마이크로튜브(3:1 비율)에 혼합합니다.
  3. 혼합물을 13,200 × g에서 1 분 동안 원심 분리하십시오. 상층액을 버리십시오. 끝이 잘린 1mL 피펫 팁을 사용하여 세포 펠릿 한 방울을 YPD 플레이트에 놓습니다. 30 °C에서 2-4 시간 동안 배양합니다.
    알림: 교차 오염을 방지하려면 단일 플레이트에 두 개 이상의 셀 현탁액을 넣지 마십시오(예:그림 4A의 파일).
  4. 소량의 세포 혼합물을 취하여 슬라이드의 15μL의 멸균수에 재현탁시키고 커버 슬립을 놓습니다. 광학 현미경으로 40x 또는 100x 대물렌즈로 shmoos가 있는지 확인하십시오. 이 특징적인 모양은 두 가지 결합 유형이 있을 때 나타납니다(그림 3B).
  5. shmoos가 존재하는 경우 2mL의 YPD 배지에 소량(~0.5mm3)의 세포 질량을 재현탁시킵니다. 회전하는 휠에서 30°C에서 2시간 동안 배양하여 이핵 접합체가 회복될 수 있도록 합니다.
  6. 혼합물을 와류시키고 세포 현탁액 10μL를 멸균수 990μL에 희석합니다(1:100 희석). 유리 구슬 또는 멸균 유리 손잡이를 사용하여 수용체 균주(및 산발적인 이배체)만 성장하는 드롭아웃 배지에 세포 희석액 100μL를 펴 바릅니다. 30 °C에서 2-3 박 동안 배양합니다.
  7. 서론에서 설명한 대로 생성된 콜로니를 필요한 선택적 매체에 복제합니다(4단계, 특정 예는 그림 4C 참조).
  8. 양성 콜로니를 식별한 후 동일한 선택적 매체에 다시 스트리크하여 관심 mtDNA를 운반하는 반수체 균주를 정제합니다.
  9. 두 개 이상의 양성 콜로니를 선택하고 30°C의 YPD 배지 2mL에서 밤새 성장시킵니다. 600μL의 50% 글리세롤과 600μL의 포화 YPD 배양물을 혼합하여 극저온 백업을 만듭니다. -70 °C에서 보관하십시오.
  10. 생성 된 균주31,32의 DNA를 분리합니다. 미토콘드리아 돌연변이의 존재를 확인하기 위해 PCR과 염기서열로 원하는 영역을 증폭합니다.
    참고: 각 양성 콜로니는 미토콘드리아 게놈에서 올바른 염기서열을 보장하기 위해 독립적으로 확인해야 하는 기술적 복제입니다.

결과

이 섹션에서는 미토콘드리아 변형의 여러 단계에서 얻은 몇 가지 대표적인 결과를 제시합니다. 그림 6은 폭격 절차를 보여줍니다. 합성 rho-cell은 미토콘드리아 유전자의 암호화 서열을 대체할 리포터 유전자 ARG8m을 가진 박테리아 플라스미드를 운반했습니다(그림 6A). 폭격 후, 플레이트는 우라실(-URA)이 결핍된 매체에 복제되었습니다. 이것이 마스터 플레이트입니다(그림 6B). 성장하는 콜로니는 URA3 보조 영양 마커가 있는 효모 발현 벡터를 가지고 있습니다. 프로토콜 섹션 6에 따르면, 폭격 플레이트는 테스터 균주의 잔디를 포함하는 YPD 매체에도 복제되었습니다. 이 경우, 테스터 균주는 미토콘드리아 게놈(ARG8m-1)1에서 ARG8m 유전자의 결함 있는 대립유전자를 보유하고 있었습니다. 2박의 배양 후, 테스터 잔디와 형질전환 세포가 교배하고 미토콘드리아가 융합되었습니다. 이 플레이트는 아르기닌이 결핍된 배지에서 복제되었습니다. 미토콘드리아 플라스미드를 포함하는 이배체만이 이 선택적 배지에서 성장할 수 있었는데, 이는 합성 rho-균주에 존재하는 ARG8m 유전자가 테스터 균주의 미토콘드리아 게놈에서 결함이 있는 ARG8m-1을 대체했기 때문입니다.

양성 콜로니의 수는 일반적으로 플레이트당 0개에서 20개까지 다양합니다. 본 예에서, 4개의 양성 합성 로콜로니를 얻었고, 이는 우라실이 결핍된 매체에 줄무늬를 만들어 정제하였다. 정화의 첫 번째 라운드에서는 양성 식민지와 함께 많은 음성 식민지가 얻어졌습니다. 그러나, 두세 차례의 정제 후에, 순수한 양성 합성 rho-strain를 얻는 것이 가능하다. 그림 6C에서는 3차례의 정제 및 테스트 후 두 개의 양성 합성 rho-colony를 보여주었습니다. -URA 마스터 플레이트의 대부분의 콜로니는 테스터 프로브에 대해 양수입니다. 흥미롭게도, 양성 콜로니의 모든 세포가 미토콘드리아 플라스미드를 포함하고 있는 것은 아니며, 이는 형질전환된 플라스미드가 콜로니의 집단에서 손실되었음을 나타냅니다. 이 결과는 미토콘드리아 플라스미드를 유지하기 위한 선택적 압력이 없어 불안정하기 때문에 예상된 결과입니다. 그러나, 도 6C에 도시된 것과 같은 합성 로 균주는 다음 단계인 세포유도(cytoduction)(프로토콜 섹션 7)로 진행될 수 있으며, -70°C에서 저장될 스톡을 준비하는데 사용될 수 있다. 도 6D는 또한 합성 로 균주의 제3 정제 라운드를 나타낸다. 그러나, 이 경우, 형질전환체가 실질적으로 미토콘드리아 플라스미드를 유지할 수 없었기 때문에, 이들을 폐기하였다.

우리는 그림 7A에 제시된 양성 합성 rho-colony를 선택하기 위한 한 가지 일반적인 전략을 설명했습니다. 이 경우에, 합성 로-셀에 존재하는 미토콘드리아 구조체는 테스터 균주로부터의 미토콘드리아 DNA와 재결합하기 위한 수백 개의 뉴클레오티드를 가지고 있다(예를 들어, 합성 로--균주 내의 구조체 COX1ΔC15는 테스터의 미토콘드리아 DNA 상의 돌연변이 유전자 cox1D369N과 재결합한다(그림 2D); 또는 돌연변이된 유전자 ARG8 을 가진 합성 rho- 균주에서 cox1Δ::ARG8 m 구조체를 포함한다 테스터의 미토콘드리아 DNA에 있는 m-1(그림 6A). 그러나, 관심있는 양성 합성 rho-cells를 선택하기 위한 테스터 균주의 이용이 불가능한 경우, 이들을 선택하기 위한 간접적인 접근법이 존재한다33. 이 경우, 박테리아 플라스미드는 COX2 또는 COX3 와 같은 미토콘드리아 유전자의 단편도 포함해야 합니다.테스터 균주에는 미토콘드리아 cox2 또는 cox3 유전자의 비기능적 사본이 포함되어 있습니다. 주어진 예에서, 박테리아 플라스미드에 존재하는 cox3 단편의 서열은 테스터의 미토콘드리아에 존재하는 cox3 서열을 보완할 수 있고, 재조합 후 기능적인 COX3 유전자를 제공할 수 있습니다. 테스터 균주와 합성 rho-cell을 교차한 후, 이배체는 합성 rho-cell이 미토콘드리아 내부에 박테리아 플라스미드를 포함하는 경우에만 호흡할 수 있습니다(그림 7B).

그림 8 은 세포유도 과정을 예시합니다. donor 및 acceptor 균주는 각각 류신(leucine)과 아데닌 보조영양(adenine auxotrophy)을 가지고 있습니다. 따라서, 세포유도 후, 혼합물을 류신이 결핍된 배지에 도말하여 공여자 세포의 성장을 방지했습니다. 이것은 마스터 플레이트입니다. 이 시점에서는 수용체 균주의 핵 배경을 가진 반수체와 산발적인 이배체만 자랍니다. 이배체를 배제하기 위해, 마스터 플레이트는 이배체만 자랄 수 있는 아데닌이 없는 배지에 복제되었습니다. 이 예에서, 세포유도 후 생성된 미토콘드리아 DNA는 돌연변이를 일으키고, 의도된 반수체는 에탄올/글리세롤의 호흡 매체에서 성장할 수 없습니다. 따라서 마스터 플레이트는 테스터 변형의 잔디가 있는 YPD 플레이트에 복제해야 합니다. positive respiring diploids의 위치는 마스터 플레이트에서 어떤 콜로니를 정화해야 하는지를 나타냅니다. 최종적인 순수한 변형을 얻기 위해 두 차례의 정제가 필요합니다. 미토콘드리아 통합은 일반적으로 주변 관심 영역의 PCR 증폭 및 염기서열분석에 의해 확증됩니다.

마지막으로, 유전자는 미토콘드리아 게놈의 특정 유전자좌에 삽입될 수 있습니다. 예를 들어, 리포터 유전자는 미토콘드리아 유전자의 코딩 서열의 3' 말단에 삽입되거나 미토콘드리아 유전자의 코딩 영역을 대체할 수 있습니다(그림 9A). 그러나 유전자는 미토콘드리아 게놈의 비암호화 영역 내의 이소성 부위에도 삽입될 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 부위는 COX2 유전자의 시작 코돈의 295 nt 상류입니다. 이 비코딩 영역에서의 변경은 무해하다13. 이소성 부위에서 유전자를 성공적으로 발현하려면 미토콘드리아 프로모터와 종결인자가 옆에 있어야 합니다. COX2 플랭크 서열은 COX2 가 가장 짧은 5' 및 3' 미번역 서열(5' UTR의 73 nt 및 3' UTR의 119 nt)을 가진 미토콘드리아 유전자이기 때문에 가장 최적입니다(그림 9B). 이러한 구축을 위해, 박테리아 플라스미드는 다음과 같은 특성을 갖는다: 주형은 COX2 코딩 영역을 포함하는 플라스미드로서, 정지 코돈의 1120 nt 하류와 AUG 시작 코돈의 670 nt 상류를 가지며, pXPM5025로 명명되었다. 관심있는 유전자는 COX2 5'-UTR의 73 nt 및 COX2 3'-UTR의 119 nt에 의해 측면에 위치하도록 설계된다. 그 후, 앞서 지적한 바와 같이, 비코딩 영역인 COX2 AUG 스타트 코돈의 상류 295nt에 삽입하였다(도 9B). 이 플라스미드와 결과적으로 생성된 미토콘드리아 게놈에서 COX2 5' 및 3' UTR이 복제됩니다. 이 플라스미드의 충격 후, 합성 rho- 세포는 COX2 영역(cox2-62 대립유전자)의 광범위한 결실이 있는 수용체 균주와 세포 유도를 위해 결합됩니다1. 세포유도 중에는 합성 rho- 균주의 미토콘드리아 플라스미드가 수용체의 미토콘드리아 DNA와 재결합합니다. 생성된 미토콘드리아 게놈은 이소성 구조와 WT COX2 유전자를 가지고 있습니다. 따라서 양성 콜로니는 호흡 배지에서 자랄 수 있습니다(그림 9B).

마이크로캐리어 발사 시스템 다이어그램, 헬륨 압력 설정, 샘플 플레이트, 가속 튜브.
그림 5: 고속 미세발사체 폭격 장비의 개략도. 우리 연구실은 Biolistic-PDS-1000/He Particle Delivery System(Table of Materials)을 사용합니다. 약어 : WP = 텅스텐 입자. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

합성 mtDNA에서 ARG 유전자 기능을 보여주는 효모 형질전환 다이어그램 및 페트리 접시 결과.
그림 6: 고속 미세발사체 변환 플레이트의 예. (A,B) 폭격 후, 플레이트는 30 °C에서 5-7 박 동안 배양되었습니다. 오염 물질이 커지면(파란색 화살표로 표시) 멸균 주걱으로 제거할 수 있습니다. selection marker medium(이 경우 -URA)에서 plate를 복제한 후, master plate는 tester strain에 결합하여 미토콘드리아 플라스미드의 존재 여부도 테스트했습니다. 이 경우, 테스터 균주는 비기능적 대립유전자 ARG8m-1 1을 갖는다. 2 박 동안 짝짓기하고 아르기닌이 결핍 된 배지 (-ARG)에서 플레이트를 복제 한 후 4 개의 양성 콜로니가 발생했습니다 (빨간색 화살표로 표시). (C) 양성 합성 로콜 로니를 -URA 배지에 재줄무늬 추출하여 정제하고, 복제 테스트를 앞서 설명한 대로 수행했습니다. 이 판들은 세 번째 정화의 단계를 나타냅니다. (D) 일부 양성 합성 로콜 로니는 미토콘드리아 구조를 잃었다. 약어: mtDNA = 미토콘드리아 DNA; -URA = 우라실 부족; -ARG = 아르기닌 결핍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

박테리아 플라스미드 통합 과정 다이어그램; mtDNA로의 유전자 전달; 유전 공학 개념.
그림 7: 폭격 후 양성 합성 rho-colony 를 선택하는 방법을 보여주는 다이어그램. (A) 박테리아 플라스미드는 미토콘드리아 유전자의 비기능적 돌연변이 버전을 포함하고 있습니다. 검출을 위해, 합성 로콜 로니는 미토콘드리아 DNA에서 동일한 유전자의 다른 비기능적 돌연변이를 포함하는 테스터 균주와 결합됩니다. 교배 후 돌연변이 mtDNA는 재결합하고 기능적 유전자는 보완에 의해 회복될 수 있습니다. 여기서, 이배체는 합성 rho-strain 또는 테스터가 성장할 수 없는 선택적인 매체에서 성장합니다. (B) 이 경우, 플라스미드는 미토콘드리아 유전자의 추가 서열(즉, COX3 조각)을 포함한다. 형질전환 후, 합성 rho- 균주는 테스터 균주에서 COX3 돌연변이를 보완하는 능력에 의해 선택되므로, 이배체만이 선택적 배지(즉, 호흡 배지)에서 성장할 수 있습니다. 이 방법은 관심 유전자에 대한 테스터 균주를 사용할 수 없는 경우에 유용합니다. 이 경우 양성 합성 rho-colony 의 검출은 간접적입니다. 약어: mtDNA = 미토콘드리아 DNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

페트리 접시 실험; 세포유도 과정; 효모 성장 관찰; 유전적 전달 평가.
그림 8: 미토콘드리아 DNA의 표적 자리에 구조를 통합하기 위한 세포유도의 예. 짝짓기 및 회수 후, 혼합 세포와 이중핵 접합체를 류신이 결핍된 배지에 도말했습니다. 이 경우, 공여체 균주가 leu2,3-112 대립유전자를 가지고 있기 때문에 이 배지는 공여체 성장을 방지합니다. 이 플레이트는 동일한 배지(마스터 플레이트), 이배체만 성장할 수 있는 배지(-ADE) 및 의도된 돌연변이가 있는 수용체가 성장할 수 있는 배지(빨간색 화살표)에서 복제되었습니다. 이 경우 공여체 세포와 수용체 세포 모두 호흡기 배지에서 성장할 수 없습니다. 테스터 균주의 잔디와 짝을 이룬 후 생성된 이배체만이 호흡 매체에서 자랄 수 있습니다. 이 호흡하는 이배체 콜로니는 마스터 플레이트에서 양성 콜로니를 선택하고 정화하는 데 도움이 됩니다. 약어: -LEU = 류신 결핍; -ADE = 아데닌 결핍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

합성 rho 기증체에서 mtDNA 수용체 과정으로의 미토콘드리아 유전자 전달 다이어그램.
그림 9: 돌연변이된 미토콘드리아 구조(합성 rho-strain에 존재)를 acceptor strain에 통합하는 방법을 보여주는 다이어그램. (A) 이 예에서, 수용체 균주는 관심 유전자에서 코돈을 대체하는 ARG8m 리포터 유전자를 운반합니다. 합성 rho-DNA에는 이 유전자의 돌연변이 버전이 포함되어 있습니다. 플라스미드와 미토콘드리아 DNA는 5' 및 3' 측면 영역을 통해 재결합하고, ARG8m 리포터는 관심 유전자의 돌연변이 염기서열로 대체됩니다. (B) 외래 유전자는 미토콘드리아 게놈 7,13,36의 특정 영역에 외부적으로 삽입될 수 있습니다. 이 예에서는, 유전자는 COX2 유전자의 상류 위치 295 nt 에 소개될 수 있다. 이것은 mtDNA의 비암호화 영역입니다. 관심있는 외국 유전자는 COX2 5 ' UTR 및 3' UTR의 73 nt 및 119 nt에 의해 각각 측면에 있습니다. 이 구조는 COX2 유전자와 5' 및 3' UTR 영역의 670nt 및 1120nt를 포함하는 플라스미드에 삽입됩니다. 합성 rho-strain (donor)는 미토콘드리아에서 이 구조를 운반합니다. 이 경우, 수용체 균주(XPM13)7는 cox2 유전자(대립유전자 cox2-62)1의 현저한 결실을 갖는다. 세포유도 후 공여체와 수용체의 미토콘드리아 DNA가 재결합합니다. COX2 유전자가 복원되고, 관심 유전자가 이소성 부위(COX2 유전자의 상류 295 nt)에 삽입된다. 약어: mtDNA = 미토콘드리아 DNA; NT = 뉴클레오티드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

효모 균주유전자 형참고 문헌
낮69Mata, ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho0)1
NB71 시리즈Matα, ade2-101, ura3-52, leu2-delta, arg8-delta::URA3, kar1-1, (cox3Δ:ARG8m-1)1
XPM10bMatα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG, ura3-52 (rho+ , cox1∆::ARG8m)7
XPM209 시리즈Matα, lys2, arg8::hisG, ura3-52, leu2-3, 112, (rho+, ΔΣai, COX1ΔC15)26
XPM199 시리즈Mata,ade2-101, arg8-delta::hisG, ura3-52, kar1-1 (rho-, pXPM61)26
XPM13 (경험치13)Matα, lys2, leu2-3,112, arg8::hisG,ura3-52, his3-deltaHindIII (rho+,cox2-62, cox1∆::ARG8m)7
패45Matα, ade1, op1 (rho+, cox1-D369N)28

표 1: 생물학적 변형 및 세포 유도에 사용되는 효모 균주 예.

성장 미디어구성 요소
YPD (영문)포도당 2%, 박토펩톤 2%, 효모 추출물 1%
YPR (영문)라피노스 2%, 박토펩톤 2%, 효모 추출물 1%
YPEG*글리세롤 3%, 에탄올 3%*1, 박토펩톤 2%, 효모 추출물 1%
드롭아웃 미디어2 % 포도당, 6.8 % 효모 질소베이스, (NH4) 2SO4, 드롭 아웃 아미노산 믹스 * 2
폭격 미디어5 % 포도당, 6.8 % 효모 질소베이스, (NH4) 2SO4, 1M 소르비톨, 드롭 아웃 아미노산 믹스 * 2,3.
*1 고압멸균 후 매체가 따뜻할 때 에탄올을 첨가하십시오.
*2 아미노산 혼합물의 양은 사용 가능한 재고 또는 제조업체에서 표시한 양에 따라 다를 수 있습니다.
*3 분쇄 매체의 경우 효모 균주에 따라 필요에 따라 아미노산과 질소 염기를 추가합니다. selection에 사용된 2μL plasmid의 auxotrophy에 대해 구성이 특이적인지 확인하십시오.

표 2: 이 프로토콜에 사용된 효모 성장 배지.

토론

본 연구는 효모 S. cerevisiae 에서 미토콘드리아를 성공적으로 변형시키는 방법을 설명했습니다. 고속 미세 발사체 충격에서 의도 된 효모 균주의 정제까지의 과정은 합성 rho-train 의 정제 횟수에 따라 8 ~ 12 주가 소요됩니다. 이 방법의 중요한 단계 중 일부는 다음과 같습니다. 첫째, 미토콘드리아 유전자 구조에서 돌연변이 부위 주변에 추가되는 측면 영역이 클수록 표적 돌연변이의 성공적인 통합 확률이 높아집니다. 측면 영역의 최소 크기는 ~100nt입니다. 그러나 돌연변이의 각 측면에 500개 이상의 NT를 사용하는 것이 좋습니다. 둘째, 형질전환 후 합성 rho-colony를 선택할 때 3-4 라운드 이상의 정제를 수행하지 않는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 미토콘드리아에 플라스미드를 유지하기 위한 선택적 압력이 없기 때문에 결국 미토콘드리아 구조가 손실될 위험이 높습니다. 셋째, 사용자나 장비에 해를 끼치지 않도록 절차를 시작하기 전에 폭격기의 설명서를 주의 깊게 읽어야 합니다. 이 장비는 섬세하고 고압과 진공을 사용합니다.

이 절차의 한 가지 제한 사항은 지금까지 효모와 녹조류 C. reinhardtii 만이 이 방법으로 미토콘드리아를 변형시킬 수 있는 후보라는 것입니다. 다른 유기체의 미토콘드리아 게놈에 부위 지정 돌연변이를 도입할 수 있다면 의미가 있을 것입니다. 또 다른 제한 사항은 동일한 세션에서 많은 다른 구문을 변환하기가 어렵다는 것입니다. 각 구성에 대해 6가지 변형을 수행하는 것이 권장되며, 각 변환은 테스트, 선택 및 정제되어야 합니다. 그 결과 50개 이상의 배지 플레이트가 생성되어 단일 미토콘드리아 돌연변이의 순수한 로콜 로니를 얻을 수 있습니다.

이러한 한계에도 불구하고 효모 미토콘드리아 게놈을 조작할 수 있는 능력은 호흡기 복합체 생물 발생의 많은 경로를 이해하는 데 크게 기여했습니다. 이 접근법은 미토콘드리아 번역 1,7,36,37을 모니터링 및 정량화하기 위해 리포터 유전자를 도입하고, 미토콘드리아 유전자38을 중단하고, 호흡기 복합체(39)의 조립 샤페론을 식별하고, 결합된 미토콘드리아 번역및 조립 7,11,12,36의 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 사용할 수 있습니다, 돌연변이된 미토콘드리아 유전자40의 발현을 추적할 때 억제 인자를 찾습니다. 지금까지 포유류에서 미토콘드리아 게놈을 조작하기 위한 특정 접근 방식이 이전에 보고되었지만41 이러한 유기체에 대해 미토콘드리아 DNA를 변형시키는 광범위한 방법은 존재하지 않습니다.

공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 출판물은 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 to XP-M]의 지원을 받았습니다. UPD는 CONAHCYT 펠로우(CVU:883299)입니다. 광학 현미경 이미지에 대한 기술적 도움을 주신 Ariann Mendoza-Martínez 박사님께 감사드립니다. Biorender 라이선스: DU26OMVLUU(그림 2); BK26TH9GXH(그림 3); GD26TH80R5(그림 4); PU26THARYD(그림 7); ML26THAIFG(그림 9).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mL 피펫 팁AxygenT-1000-B
1.5 mL 마이크로튜브AxygenMCT-150-C
10 μ L 피펫 팁AxygenT-10-C
15 mL 원뿔형 바닥 튜브 액시젠SCT-25ML-25-S
200 & L 피펫 팁AxygenT-200-Y
50 mL 원뿔형 바닥  튜브AxygenSCT-50ML-25-S
AfiIINew England BioLabsR0520S
AgaroseSeaKem50004
분석 저울OHAUSARA520
오토클레이브TOMYES-315
Bacto 한천BD214010
Bacto 펩톤BD211677
Biolisitic 매크로캐리어 홀더 BIO-RAD1652322
분젠 버너VWR89038-528
염화칼슘Fisher ScientificC79-500
CSM -ADEFormediumDCS0049
CSM -ARGFormediumDCS0059
CSM -LEUFormediumDCS0099
CSM -URAFormedium
문화 유리 플라스크KIMAX KIMBLE25615
문화 유리 튜브Pyrex9820
덱스트로스BD215520
에탄올JT 베이커 9000
펜치Millipore620006
유리 구슬SigmaZ265926
유리 핸들SigmaS4647
GlycerolJT BAKER2136-01
헬륨 탱크 등급 5 (99.99 %)--
HSTaq  KitPCR BIO
MicrocentrifugueEppendorf022620100
NdeINew England BioLabsR0111L
오비탈 쉐이커New Brunswick ScientificNB-G25
PCR 튜브AxygenPCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery SystemBIO-RAD165-2257
페트리 접시 (100X10)BD252777
QIAprep 스핀 MiniprepQiagen27106
RaffinoseFormediumRAF03
복제 플래터SciencewareZ363391
파열 디스크 1350 PsiBIO-RAD1652330
소르비톨시그마S7547
SpermidineSigmaS0266
T4 DNA LigaseThermo ScientificEL0011
조직 배양 회전자Thermo Scientific88882015
텅스텐 마이크로 캐리어 M10BIO-RAD1652266
100L / min 용량의 진공 펌프-
벨벳 패드Bel-ArtH37848-0002
소용돌이 Scientifc IndustriesSI-0236
목재 애플리케이터 스틱PROMA1820060
효모 추출물BD212750
효모 질소 염기 아미노산 없음BD291920
DCS0169

참고문헌

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