이 프로토콜은 쥐 모델에서 최적화된 2단계 콜라겐분해효소 간 관류 기술을 제시하고 3D 오가노이드의 시험관 장기 배양을 위해 분리된 간세포의 사용을 보여줍니다.
이 논문에서
요약
초록
원발성 간세포는 체외 간 관련 연구에 일반적으로 사용되는 도구입니다. 그러나 이러한 세포의 유지 관리는 배양에서 형태, 생존력 및 기능성의 급속한 손실로 인해 항상 어려운 과제였습니다. 장기 배양에 대한 최근의 접근 방식은 3차원(3D) 오가노이드를 생성하는 것인데, 이는 간의 놀라운 자체 재생 능력을 기반으로 접시의 조직을 재현할 수 있는 시험관 내 도구입니다. 발표된 프로토콜은 1차 성인 간세포(Hep-Org)에서 장기적으로 기능하는 3D 오가노이드를 얻도록 설계되었습니다. 3D 오가노이드 최첨단 도구에는 성인 조직에서 세포를 분리할 수 있는 기능이 필요하며, 이 초기 단계는 고품질 최종 결과를 위해 매우 중요합니다. 1970년대에 도입된 2단계 콜라겐분해효소 관류는 여전히 단일 간세포를 얻기 위한 유효한 절차입니다. 본 논문은 수술 절차의 모든 중요한 단계를 설명하여 쥐 모델에서 1차 간세포 분리 절차를 최적화하는 것을 목표로 합니다. 또한 성공적인 절차의 가능성을 높이고 고품질 결과를 보장하기 위해 PREPARE 지침에 특별한 주의를 기울이고 있습니다. 상세한 프로토콜을 통해 연구자들은 1차 성체 쥐 간세포에서 3D 오가노이드를 확립하기 위한 다운스트림 작업을 가속화하고 최적화할 수 있습니다. 2D 간세포와 비교했을 때, Hep-Org는 15일째에도 여전히 생존 가능하고 활발하게 증식하여 장기적인 잠재력을 보여주었습니다.
서론
원발성 간세포는 체외 간 관련 연구에서 중요하고 널리 사용되는 도구입니다. 그러나 그들의 확장과 유지는 역사적으로 도전적이었으며, 배양에서 며칠 후에 형태와 기능을 잃기 때문에1. 2D 배양은 특히 다각형 모양과 분화된 정점 및 기저막이 있는 편광 구조를 가진 간세포에 대한 제한 조건입니다. 실제로, 간세포가 플레이트에 부착되면 세포 간 및 세포와 세포외 기질(ECM) 간의 상호 작용이 제한된 편평한 세포골격을 유발하여 분극 및 관련 신호 전달 경로를 감소시키기 때문에 정상적인 활동을 방해합니다2.
이 방법의 한계를 우회하기 위해 Dunn과 동료3 는 먼저 콜라겐 이중층을 사용했습니다. "샌드위치 배양법"으로 알려진 이 배양 방법은 기질의 두 층 사이에 일차 간세포를 파종하는 것을 기반으로 합니다. 이 방법은 장기 배양, 다각형 형태학의 유지, 갓 분리한 간세포에 필적하는 전사 활성을 포함하여 많은 장점이 있습니다4. 동일한 원리에 기초한 유사한 방법으로, 밑받침은 마트리겔로 구성되고 콜라겐은 오버레이되는데, 이는 잘 확립된 운하 네트워크(canalicular network)5의 존재를 입증했다.
간세포 성장을 위한 샌드위치 배양법의 신뢰성에도 불구하고, 본 연구는 접시의 조직을 재현하는 데 사용되는 시험관 내 도구인 3D 오가노이드 배양을 설정하고 맞춤형 의학을 향한 잠재적인 다리를 형성하여 질병별 생물학적 통찰력을 생성하고, 분자 표적을 식별하고, 약물을 테스트하고, 바이오뱅크를 구축하고, 장기 칩6과 같은 혁신적인 기술에 대한 새로운 지평을 열 수 있기를 기대합니다. 1차 간세포는 "돔"으로 알려진 반구형 기질 액적에 내장되어 돔 내부의 오가노이드가 견고하게 성장할 수 있도록 하고 배양 배지에서 간세포 성장 인자(HGF) 및 표피 성장 인자(EGF)를 포함한 용해성 인자의 흐름을 보장했습니다. 이러한 성장 인자는 간세포의 생존을 보장하기 위해 신호 전달 경로를 직접 활성화한다7. 간 오가노이드는 일반적으로 배아 단계 또는 성체 쥐, 생쥐, 인간(및 개와 고양이) 간에서 분리된 줄기세포/전구세포에서 얻는다8. 3D 형태가 줄기세포의 성인 간세포로의 분화를 개선하더라도, 이 도구는 여전히 원래의 일차 조직(primary tissue)의 성숙도에는 미치지 못한다9. 이 문제를 극복하기 위해 2018년에 두 개의 다른 그룹 9,10이 동시에 성인 원발성 마우스 간세포(Hep-Orgs라고 함)에서 시작하는 3D 간 오가노이드의 장기 배양을 얻기 위한 프로토콜을 발표했습니다. 그들의 프로토콜은 간 재생의 증식 손상 반응을 요약하여 부분 간절제술 후 발생하는 높은 수준의 염증성 사이토카인을 가진 간세포를 성장시킵니다. 실제로, 위의 연구들은 간세포가 손상 후12 또는 담관세포 증식이 억제될 때 유관 상태로 전환될 수 있음을 보여준다13. 이분화능은 세포 가소성을 허용하며, 이는 오가노이드와 같은 복잡한 구조에 중요합니다. 따라서 이러한 프로토콜은 시험관 내에서 원발성 간세포를 확장할 수 없다는 문제를 극복합니다.
3D 오가노이드 최첨단 도구에는 성인 조직에서 세포를 분리할 수 있는 기능이 필요하며, 이 초기 단계는 고품질 최종 결과를 위해 매우 중요합니다. 3D 오가노이드 제제는 최근에 개발되고 있는 기술로 간주될 수 있지만(오가노이드 정의는 불과10 년 전에 Lancaster 14와 Huch15 에 의해 만들어졌기 때문에), 2단계 콜라겐분해효소 관류는 1970년대16에 Seglen이 도입한 오래된 절차입니다. 이 분야의 가장 최근 간행물에 초점을 맞추면, Ng17 및 Shen18 의 프로토콜은 쥐에서 절차를 수행하기 위한 황금 표준으로 간주될 수 있는 반면, Cabral19 및 Charni-Natan20 의 프로토콜은 쥐에서 절차를 수행하기 위한 황금 표준으로 간주될 수 있습니다. 연구자들이 3D 오가노이드를 개발하기 위해 최상의 세포외 기질(ECM) 및 성장 인자를 선택하는 데 집중하지만 부적절한 수술 절차, 낮은 간세포 생존율 및 수율 또는 높은 수준의 박테리아 오염과 같은 실패에 부딪히는 것은 드문 일이 아닙니다. 이러한 문제는 다운스트림 실험을 길어지게 하고 다음 실험에 필요한 동물의 수를 증가시킵니다. 반대로, 수술 및 격리 절차가 잘 설정되면 얻을 수 있는 생존 가능한 간세포의 수가 많아 엄청난 수의 오가노이드를 준비할 수 있으므로 동물의 사용을 제한할 수 있습니다. 현재 프로토콜은 주로 상용 솔루션을 사용하고 간에서 최적의 관류 및 소화 단계를 보장하는 정확한 포털 정맥 캐뉼레이션을 최적화하여 이러한 문제를 해결합니다.
동물 연구의 품질, 재현성 및 번역 가능성을 개선하기 위해 우리는 PREPARE 가이드라인: 동물에 대한 연구 계획 및 실험 절차: 우수성을 위한 권장 사항21을 신중하게 고려했습니다. 이러한 보고 지침은 계획을 통해 성공 가능성을 높이려고 하며 Russel and Burch의 3R(교체, 축소 및 개선)을 구현하는 데 중요한 단계를 나타냅니다. PREPARE 가이드라인은 각 개별 연구 프로젝트에 따라 다루어야 하는 15가지 주요 주제를 다룹니다. 프로젝트를 계획하고 준비하는 동안 중점을 둔 주제를 설명합니다.
본 연구는 연구자들이 다운스트림 작업을 가속화하고 최적화할 수 있도록 쥐 모델에서 수술의 중요한 단계를 철저하고 상세하며 결과적인 프로토콜로 설명하는 것을 목표로 합니다. 처음에 이러한 프로토콜에 접근했을 때 박테리아 오염, 낮은 간 소화 효율, 낮은 원발성 간세포 수율, 낮은 간세포 생존율 등의 문제를 경험했으며, 이는 기술의 성공에 쉽게 영향을 미칠 수 있습니다. 중요한 특징을 다루고 해결하는 방법을 보여주는 이 프로토콜은 원발성 쥐 간세포 분리 절차를 최적화했습니다. 쥐의 간 관류와 그에 따른 1차 성체 간세포 분리는 다양한 응용 분야에 대한 주요 예비 단계입니다. 특히, 이 프로토콜은 고품질의 고생존력이 높은 성인 간세포의 양호한 수율을 필요로 하는 모든 시술에 적합합니다. 프로토콜 결과는 간 생리학 및 병리학을 연구하기 위한 시험관 내 모델을 확립하는 데 적합합니다.
프로토콜
모든 절차와 동물 사육은 이탈리아 법률 및 유럽 공동체 지침의 지침에 따라 수행되었습니다. 실험 프로토콜은 법령 26/2014의 art.31에 따라 지역 동물 보호 위원회와 이탈리아 보건부(허가 번호 321/2022-PR)의 승인을 받았습니다.
1. 동물 시술 준비
참고: 매체 및 완충액 조성에 대해서는 표 1 을 참조하고 상업적 세부 사항에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
- 수조를 42°C로 데운 다음 관류 완충액과 1x PBS를 약 20분 동안 수조에 넣습니다.
참고: 효소 민감성으로 인해 Digestion buffer는 Perfusion 절차가 성공적으로 시작된 경우에만 예열됩니다. 관류 절차 중에는 수조에서 용액을 유지하십시오. - William의 완전한 매체와 PBS + 3% P/S를 얼음 위에 놓습니다.
- 연동 펌프를 준비하고 튜브를 관류 완충액으로 채워진 유리병 및 버블 트랩과 연결합니다.
- 펌프를 프라이밍하는 동안 공기를 제거하고 잔류 에탄올(낮은 펌프 속도)을 세척하기 위해 튜브에 따뜻한 관류 버퍼를 채우십시오. 이 단계는 올바른 펌프 작동과 튜브 누출 가능성을 확인하는 데에도 중요합니다.
2. 간세포 분리를 위한 준비
- 동물 실험 중에는 페트리 접시 100mm, 세포 여과기 100μm, 스크레이퍼 크기 M, 대형 핀셋, 얼음용 비커, 얼음용 트레이와 같은 기구를 자외선에 노출시키십시오.
3. 초기 동물 시술 및 마취
- 마취제 혼합물의 복강 내 주사로 성인 쥐(체중 250-350g, 생후 10-12주)를 마취합니다(자일라진의 최종 농도: 22.5mg/kg, 케타민의 경우 112.5mg/kg, 약 최종 부피: 0.8-1.0mL).
- 쥐가 더 이상 유해한 자극에 반응하지 않을 때까지 발가락을 꼬집어 마취 깊이를 모니터링하십시오. 보통 5분 정도 걸립니다. 마취량은 시술 중 고통이나 고통의 위험을 최소화하는 깊은 수술 마취를 보장합니다
참고: Exsanguination은 이 실험에 사용된 쥐 안락사의 두 번째 방법이며, 동물이 효과적으로 안락사되었음을 보장합니다. - 복부를 면도하고 70% 에탄올로 청소하여 수술 중 박테리아 오염을 줄입니다.
참고: 이 수술은 생존이 불가능한 수술이므로 완전 무균이 유지되지 않습니다. - 쥐를 해부 트레이 중앙에 놓고 바늘을 사용하여 팔다리를 고정합니다.
- 하복부 중앙에서 흉곽까지 피부와 근육을 U자형으로 절개하고 피부를 고정한 후 머리까지 접어 창자를 노출시킵니다.
- 장을 동물의 왼쪽으로 조심스럽게 이동하여 복강 밖으로 빼내고 간문맥과 대정맥을 노출시킵니다.
- 펜치를 사용하여 문맥 아래에 면사를 흐르게 하고 정맥 자체를 둘러싸고 있는 1cm의 매듭을 준비합니다.
참고: 검은색 스레드는 시각화하기가 더 쉽습니다. - 100x PBS(총 부피 300μL)에 용해된 100-150IU의 헤파린을 대정맥에 주입하여 혈액 응고를 방지합니다.
4. Cannulation와 간 관류
- 저속 속도(1mL/분 유량 미만)로 펌프를 켭니다.
- 18G의 혈관 주사를 정맥에 대해 평평한 각도로 실 높이의 문맥에 삽입합니다.
- 캐뉼라를 정맥에 남겨 두기 위해 내부 바늘을 수동으로 제거합니다. 혈액이 그 안에 흐르고 플러그를 채우고 다음 단계에서 갇힌 기포를 피합니다.
- 관류 버퍼가 튜브에 흐르는 동안 Luer Lock 커넥터를 사용하여 C 버튼을 눌러 캐뉼라를 출구 끝에 연결합니다.
- 이 시점에서 정맥에 들어가기 전에 정맥 내부의 카테터 주위와 카테터 주위의 매듭을 묶어 튜브를 올바른 위치에 고정합니다.
- 피가 빠져나갈 수 있도록 대정맥을 자릅니다. 간이 2-3초 안에 빠르게(초) 붓고 표백되기 시작하는지 확인하십시오. 이는 관류 완충액이 간을 통해 올바르게 흐르고 있음을 확인합니다.
참고: 일부 엽이 빨갛게 남아 있으면 혈관 카테터가 너무 깊게 삽입된 것입니다. 붉은 반점만 있는 경우 간을 가볍게 두드리면 특정 지점의 관류에 도움이 될 수 있습니다. 열린 복부에 PBS 1개를 부어 혈액을 이동시키고 누출 여부를 확인합니다. - 펌프 유량을 10mL/분으로 천천히 늘리고 혈액에서 간을 청소할 수 있도록 최소 10분 동안 유지합니다.
- 관류 중에는 면봉으로 대정맥에 10초 간격으로 압력을 가합니다: 간이 클램핑 시 부풀어 오르고 방출 시 이완되도록 합니다. 주기적으로(5-10회) 압력을 반복하고 간이 붓고 이완되는지 확인합니다.
참고: 이 단계는 관류를 시각적으로 검증하기 위한 중요한 체크포인트 역할을 합니다. 이는 높은 간세포 활력을 보장하고 최종 수율을 극대화하는 데 필수적이었습니다. 이 과정을 적극적으로 확인함으로써 완충액은 간 혈관의 모든 부분에 효과적으로 도달할 수 있으며, 이는 수동적 혈액 청소만으로는 달성할 수 없습니다.
5. 간 소화
- 관류 후에는 흐름을 중단하지 않고 튜브의 기포를 피하지 않고 예열된 소화 버퍼로 전환하십시오.
참고: 일시적으로 흐름을 줄이면 이 단계를 수행하는 데 도움이 될 수 있습니다. 분해 완충액에는 페놀 레드(phenol red)가 포함되어 있어 관류 완충액에서 분해 완충액으로의 전환을 시각화할 수 있습니다. - 펌프 속도를 20mL/분으로 높이고 주기적으로 면봉으로 눌러 간 부종과 이완을 촉진합니다.
- 이 단계(약 15분 지속)가 끝나면 간이 점점 흐물흐물해지는지 확인하십시오. 이 시점에서 바늘을 제거 할 수 있으며 펌프가 멈춥니다.
- 간 캡슐은 소화 후 약해지기 때문에 간을 부드럽고 조심스럽게 절개하십시오: 간엽 사이의 중심 결합 조직을 겸자로 잡습니다. 다른 장기와의 모든 연결을 끊고 간을 들어 올립니다.
- 간을 세척하여 미리 냉각된 PBS + 3% P/S 용액에 몇 초 동안 담그십시오. 그런 다음 미리 냉각된 William의 완전한 배지 함유 튜브에 넣습니다.
참고: 출혈과 사망은 대정맥을 통한 관류를 보장합니다. 동물의 사망 여부는 간을 이식하는 순간 기흉이 유발되어 횡격막이 완전히 절개된 상태에서 발생하며, 검사 결과 호흡과 심장 박동이 더 이상 기능을 하지 않는 것으로 확인되었습니다.
6. 간세포 정제
- 생물학적 후드 아래에서 간을 얼음이 가득 찬 트레이 위에 100mL의 차가운 William's Complete 배지 15mL와 함께 페트리 접시에 옮깁니다.
- 스크레이퍼로 장기를 세게 눌러 배지의 세포를 방출합니다.
참고: 소화 단계가 올바르게 실행되면 세포 방출이 쉬워야 하며 간에 많은 압력이 필요하지 않아야 합니다. 간을 조각으로 자르지 마십시오. 그대로 두십시오. 간을 배지에 담근 상태로 유지하면 세포 방출이 향상됩니다. - 배지 함유 세포를 수집하고 100μm 필터로 여과하면서 멸균 원추형 튜브로 옮깁니다. 여과를 통해 결합 조직과 소화되지 않은 조직 조각을 제거할 수 있습니다.
- 페트리 접시의 으깬 간에 약 15mL의 차가운 William's Complete 배지를 붓으면 더 많은 세포가 방출됩니다. 6.2단계와 6.3단계를 반복합니다.
- 모든 셀이 해제될 때까지 포인트 6.4를 한 번 이상 반복합니다. 필요한 경우 매체를 더 많은 원뿔형 튜브로 나누고 여러 개의 100μm 필터를 사용합니다.
참고: 간세포가 방출된 후 여과하기 전에는 간세포의 존재로 인해 배지가 불투명하게 보여야 합니다. 남아 있는 간은 섬유질로 보여야 하며 폐기됩니다. - 간세포가 포함된 여과된 배지를 50 x g 에서 저속 브레이크로 4°C에서 3분 동안 원심분리합니다.
참고: 간세포는 다른 간세포보다 밀도가 높습니다. 원심분리력이 낮기 때문에 간세포만 펠릿에 있고 다른 세포는 상층액에 남아 있습니다. - 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 버리십시오. 약 40mL의 얼음처럼 차가운 William's complete medium을 튜브에 부드럽게 넣고 세포 펠릿을 재현탁시키기 위해 2-3회 위아래로 천천히 피펫팅합니다.
알림: 셀 펠릿은 셀 손상을 방지하기 위해 조심스럽게 재현탁해야 합니다. - 50 x g 에서 4 °C에서 3분 동안 원심분리합니다.
참고: 첫 번째 시도의 경우 두 번째 원심분리 후 다음 단계로 진행하기 전에 1:10 trypan blue 분석으로 생존 가능한 세포를 계산합니다. 이렇게 하면 모든 셀이 죽은 경우 미디어와 시간 낭비를 방지할 수 있습니다. - 상층액을 버리고 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 William의 완전한 배지 25mL에 재현탁시킵니다.
- 25mL의 90% 밀도 그래디언트 용액을 튜브에 넣고 부드럽게 섞습니다.
참고: 밀도 구배 용액은 밀도를 기준으로 생존 가능한 간세포를 죽은 간세포 및 세포 파편에서 분리합니다. - 200 x g 에서 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다. 생존 가능한 간세포에 해당하는 튜브 하단에 눈에 보이는 펠릿을 얻어야 하고 죽은 간세포로 구성된 구배 상단에 투명한 층을 얻어야 합니다.
알림: 펠릿이 전혀 없으면 용액을 휘젓고 다시 혼합하고 원심분리를 반복하십시오. - 그래디언트 상단에서 죽은 세포층을 흡인하고 펠릿과 함께 배지의 1-2mL를 남겨 둡니다.
- 펠릿을 William의 완전한 배지 30-40mL에 재현탁시킵니다.
참고: 전체 절차에는 25mL의 혈청학적 피펫만 사용하십시오. 더 작은 보어 피펫은 간세포 생존율을 감소시킬 수 있습니다. 모든 단계는 +4°C를 유지하기 위해 얼음 위에서 수행해야 합니다. - 200 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한 다음 상층액을 흡입합니다.
7. 간세포 배양 및 RNA 수집
- 세포 계수를 위해 적절한 양의 매체를 추가합니다. 1:10 트리판 블루로 세포 생존율을 계산합니다.
- 2D 간세포 배양
- 500,000 세포/웰 농도의 6웰 접시에 세포를 미리 따뜻하게 된 William's complete medium이 있는 콜라겐 코팅 세포 플레이트에 플레이트합니다.
- 37°C에서 95% 공기, 5% CO2 가 있는 가습 인큐베이터에 세포 배양을 넣습니다.
- 4시간 후 매체를 미리 데워진 새 William's Complete 매체로 교체합니다.
- 인큐베이터에 세포를 보관하십시오. 매일 매체를 교체하십시오.
- 도금 전(0일) 및 배양 1-3일차에 RNA 추출을 위한 시약에서 일차 간세포를 수집합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA를 추출하고 RT-qPCR에 의한 간 마커 유전자 평가를 위해 cDNA에 역전사합니다. 프라이머 목록은 표 2에 제시되어 있습니다.
- 3D 장기 간세포 배양의 경우:
- 20 μL에 1,000-10,000 세포의 농도로 차가운 순수 매트릭스에 세포를 재현탁시킵니다.
참고: 매트릭스 버블을 만들지 마십시오. - 사전 냉각된 피펫 팁을 사용하여 매트릭스 함유 세포 방울을 사전 가열된 세포 배양 플레이트에 플레이트합니다.
- 플레이트를 거꾸로 뒤집어 세포 배양 인큐베이터에 20-30분 동안 그대로 둡니다.
- 그것을 켜고 미리 데워진 3D 장기 간세포 배지 및 특정 배양 배지를 Peng의 작업22에 따라 추가합니다. 인큐베이터에 세포를 보관하십시오.
- 2-3일마다 3D 장기 간세포 배지를 교체합니다.
- 적어도 14일의 배양 후, 매트릭스 및 생존 가능한 Hep-Orgs에서 분리된 Hep-Orgs는 Trypan blue 및 EdU 증식 분석에 의해 평가되고 Peng의 연구에 따라 통과됩니다.
- 20 μL에 1,000-10,000 세포의 농도로 차가운 순수 매트릭스에 세포를 재현탁시킵니다.
결과
설정 절차(단계 6.13)가 끝날 때 약 300g의 쥐의 간에서 분리할 때마다 최대 1 x 108 세포의 세포 수율을 얻었습니다. 78%와 97% 사이의 세포 생존율은 Trypan blue 계수에 의해 확립되었습니다.
이전 연구 1,18,19에서 이미 설명한 바와 같이, 배양 시 원발성 간세포는 형태, 간 특이적 기능을 잃고 며칠 내에 죽습니다.
문헌23,24에서 1차 성인 간세포는 빠르게 직육면체-육각형 형태를 잃고 며칠 내에 "섬유아세포와 같은" 모양으로 변한 후 죽는다는 것이 잘 알려져 있습니다. 그림 1은 다양한 단계를 보여줍니다: 콜라겐 코팅된 플레이트에 도금한 후 4시간이 지나면 간세포가 표면에 부착되어 직육면체 형태를 보여주는 전형적인 단층으로 퍼져있고, 세포의 가장자리가 정의되고, 세포 사이의 접합부가 선형이며, 세포 표면이 매끄럽게 보입니다(그림 1A). 1일째에는 1차 간세포가 전형적인 육각형 모양을 얻고 지질 방울이 보이기 시작합니다(그림 1B). 2-3일째에는 지질 방울이 증가하고(그림 1C-1D), 4-5일째에는 세포에 액틴 스트레스 섬유가 축적됩니다(그림 1E-F). 또한 1일째부터 5일째까지 1차 2D 배양에서 생존 가능한 세포의 비율을 평가하고 0일째에 도금하기 전의 생존력과 비교했습니다(그림 2). 배양 첫날에 이미 생존율이 급격히 감소하여 1일차에 49.5%(SD 12.7)에 도달하고 2일차에 45.2%(SD 18.2), 3일차에 33.5%(SD 0.77)로 낮아지는 것을 관찰할 수 있습니다. 4일째에 생존 가능한 세포의 비율은 이미 16.9%(SD 5.4)인 반면 5일째에는 9.1%(SD 0.38)에 이릅니다. 그러므로, 형태학의 손실은 2D 배양에서 성인 간세포의 급속한 점진적인 세포 사멸을 동반한다는 것이 명백합니다.
분리된 간세포는 도금 전(0일)에 RT-qPCR로 평가한 간 마커 유전자(ABCD3, ALB, KRT18, PCK1, SERPIN, TDO2)의 높은 mRNA 발현을 보여주었습니다(그림 3). 분석된 모든 유전자는 배양에서 1일째에 이미 배양 시간 의존적 발현 감소를 보여줍니다. mRNA 발현 수준은 이 시간 동안 일차 간세포의 기능 및 생존력 손실을 강조합니다.
분리된 간세포를 3D 매트릭스 액적에 도말하고 시간이 지남에 따라 3D 오가노이드 세포 구조를 추적했습니다. 배양 1일차에는 단일 간세포가 기질 액적에 부유합니다(그림 4A). 세포 농도는 간세포가 성장할 수 있는 충분한 공간을 제공하기 위해 의도적으로 낮게 유지됩니다. 또한 이를 통해 오가노이드 성장을 시각적으로 추적할 수 있습니다. 원발성 간세포는 배양 후 처음 며칠 동안 세포 분열을 보였습니다(그림 4C). 또한, 0일째에는 Hep-Orgs가 30μm로 측정된 반면, 2일째에는 Hep-Orgs의 크기가 거의 두 배로 증가하여 15일째까지 유지된 크기 성장을 강조했습니다(1일차 33.08μm, 2일차 64.86μm, 5일차 45.06μm, 7일차 55.19μm, 10일차 51.93μm, Fay 15일 62.90μm). Hep-Orgs 형태와 관련하여, 1일차에는 둥근 모양이었지만 다음 날에는 "포도 송이 모양"(간 오가노이드의 전형)에 도달했습니다.
3D 매트릭스에 도팅된 간세포는 몇 주 동안 배양에서 활성 상태로 유지되어 Trypan blue assay를 사용하여 15일 후 23%±10%의 생존율을 보여줍니다(그림 4B, 첫 번째 줄). 쥐 Hep-Orgs의 증식을 검증하기 위해 15일째에 EdU 테스트를 수행했습니다(그림 4D). 그럼에도 불구하고 Hoechst 염색은 Hep-Orgs보다 많은 수의 단일 세포를 보여주었으며, EdU 통합이 낮더라도(9% ± 7%) 간세포(녹색 세포)의 증식 활성이 존재했습니다(그림 4B, 두 번째 줄).
그림 1: 시간 경과에 따른 콜라겐 코팅 플레이트의 원발성 간세포 2D 배양. 도금 후 4시간, (B) 1일차, (C) 2일차, (D) 3일차, (E) 4일차, (F) 5일차에 (A) 위상차 현미경을 사용하여 20x 배율로 이미지를 촬영했습니다. 50μm에 해당하는 눈금이 각 그림에 보고됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 콜라겐 코팅 플레이트의 2D 배양에서 생존 가능한 일차 세포. 그래프는 100%로 간주되는 0일에 도금된 생존 세포와 비교하여 1일차부터 5일차까지의 생존 가능한 세포의 백분율을 보여줍니다. 결과는 3가지 다른 실험의 단일 반복실험, 평균 및 SD로 보고됩니다(* p-값 ≤ 0.05; ** p-값 ≤ 0.005). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 원발성 간세포에서 RT-qPCR로 측정한 간 마커의 mRNA 발현. 결과는 β-Actin 및/또는 GAPDH(하우스키핑 유전자)에서 정규화되었으며 0일에 도금 전에 수집된 1차 간세포에 대해 1로 간주되는 것으로 발현됩니다. 결과는 최소 3개의 다른 실험에서 평균 ± SD로 보고됩니다(**+ p-값 ≤ 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 시간 경과에 따른 기질 액적의 3D 간세포 배양. (A) 장기 Hep-Orgs를 위해 매트릭스 액적에 도금된 분리된 간세포: 그림에서 매트릭스 액적은 웰 표면에서 볼 수 있습니다(빨간색 원 = 하나의 액적). (B) 통과 전 15일째에 Trypan blue에 의한 생존 가능한 세포 및 EdU에 의한 증식 세포의 비율. EdU 양성 세포 정량화는 ImageJ2 소프트웨어에 의해 수행되었습니다. 결과는 최소 3개의 다른 실험에 대한 평균±SD로 백분율로 보고됩니다. (C) 3D 배양에서 다양한 성장 일수(1일, 2일, 5일, 7일, 10일, 15일)에서 쥐 Hep-Orgs 3D 배양의 위상차 이미지. 사진 확대 20X. 50μm에 해당하는 눈금이 각 그림에 보고됩니다. (D) 15일째에 쥐 Hep-Orgs의 EdU 통합 분석. 사진 확대 20X. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 버퍼 및 미디어 구성. 이 표는 프로토콜에 사용된 모든 완충액 및 셀 매체의 이름과 성분(최종 농도 포함)을 보고합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: 쥐 프라이머 목록. 이 표는 RT-qPCR 실험에 사용되는 프라이머 목록을 보고합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
토론
3D 오가노이드는 개인 맞춤형 의학의 최전선이며 장기적인 간세포 배양을 가능하게 합니다. 이 혁신적인 기술의 품질은 생존 가능한 1차 간세포의 우수한 수율과 우수한 성능의 간 관류 및 간세포 분리를 필요로 합니다. 이 오래된 절차는 여전히 널리 사용됩니다. 그러나 도전적일 수 있는 다양한 단계로 구성됩니다. 시술에 접근하면서 우리는 박테리아 오염, 낮은 간 소화 효율, 낮은 원발성 간세포 수율, 낮은 간세포 생존율과 같은 중요한 문제를 경험했으며, 이 모든 것이 기술의 성공에 쉽게 영향을 미칠 수 있습니다. 황금 표준 프로토콜17,18에서 시작하여 일반적인 문제를 극복하는 방법을 강조하고, 1차 쥐 간세포 분리에서 가장 중요한 단계를 명확히 하고, 쥐 모델에서 기술의 성공에 쉽게 영향을 미칠 수 있는 흩어져 있는 팁을 요약합니다. 간 관류 절차는 매우 까다롭고 작업자의 정확한 전문 지식이 필요하지만 원발성 간세포의 수율, 무결성, 생존력 및 기능 측면에서 고품질 결과를 보장합니다. 이러한 기능은 후속 단계에 필수적입니다.
프로젝트를 계획하는 동안 PREPARE 지침 체크리스트21을 신중하게 고려했습니다. 과거의 문헌에 특별한 주의를 기울였으며, 다른 이전 작품들을 비교하고 일부 저자와 연락을 취했다(PREPARE 가이드라인 체크리스트 _topic A1). 오가노이드 도구 자체는 세포가 최대 7개월 동안 배양에서 증식할 수 있기 때문에 동물 수를 줄이는 중요한 방법입니다(PREPARE 지침 체크리스트 _topic A3). 동물 시설 직원과의 대화를 통해 절차에 도움을 제공하고 잉여 실험 동물의 사용을 피하는 데 기여한 경험 많은 기술자를 선택했습니다(PREPARE 지침 체크리스트 _topic B5). 간 관류를 수행하는 데 필요한 적절한 연동 펌프를 얻었다(PREPARE 가이드라인 체크리스트 _topic B6).
Ng17 과 Shen18 의 출판물은 쥐에서의 절차를 설명하는 가장 최근의 것들이다. 이전 프로토콜에서 다루지 않은 현재 프로토콜에서 다루는 주요 질문은 상업적 솔루션의 사용과 최적의 관류 및 소화 단계를 보장하는 정확한 문맥 캐뉼레이션의 최적화와 관련이 있습니다. Shen18 및 Ng17 의 프로토콜은 집에서 만든 용액을 사용했지만, 당사의 프로토콜은 완충액 준비의 변동성을 줄이기 위해 상업용 관류 및 분해 용액을 기반으로 합니다. 소화 효소 농도가 과도하게 높아지면 간세포에 공격적으로 작용하여 세포의 질과 생존력에 영향을 미칠 수 있다25. 상용 솔루션의 사용은 프로토콜의 재현성을 개선하고 표준화를 보장하는 데 매우 중요합니다. 또한, Ng17 에 의해 수행되는 프로토콜은 소화 단계 전에 간을 제거해야 하기 때문에 어려울 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 두 단계가 모두 수행될 때까지 간을 제거하지 않고 간의 관류 및 소화를 기반으로 하며, 이는 절차를 단순화합니다. 세포 수율과 세포 생존력 측면에서 우리 프로토콜의 결과는 이전 연구와 비슷합니다.
시술 전후에 관류 튜브의 세척 및 소독과 수술 시작 전 피부 소독은 박테리아 오염을 제한하는 데 매우 중요합니다. 또한, 에탄올 세척 후 튜브를 완전히 건조하고 매체로 세척하는 것은 세포 생존율을 높이는 데 중요합니다. 실제로, 간에 에탄올을 한 번 주사해도 시술 중에 세포가 사멸될 수 있습니다.
주입된 용액의 온도도 중요하지만, 콜라겐 분해 효소의 온도에 대한 민감성도 고려해야 합니다. 이러한 이유로 수술 절차를 시작하기 전에 관류 완충액을 42°C로 사전 예열하고 소화 완충액은 관류 단계 중에만 가온 수조에 넣었습니다. 카테터 상류의 튜브에 기포 트랩을 추가하면 빠져나간 기포가 카테터에 도달하는 것을 방지할 수 있을 뿐만 아니라 관류 용액이 소진될 때 공기가 간으로 들어가는 것을 방지할 수 있습니다17.
완충액 조성, 관류 압력 및 유속은 적절한 범위17 내에 있어야 합니다. 우리는 낮은 압력과 낮은 유속으로 인해 낮은 수율이 발생하고 완충액이 작은 용기에 도달할 수 없기 때문에 세포 생존율에 부정적인 영향을 미친다는 것을 경험했습니다. 반면에 유속이 너무 높아서 Glisson의 캡슐을 손상되지 않게 유지할 수 없어야 합니다. 세포 접착의 무결성을 위해서는 Ca2+ 18이 필요하기 때문에 관류 완충액은 EDTA를 함유한 Ca2+가 없는 용액으로 세포 사이의 칼슘 함유 다리를 공격하므로 간에서 칼슘을 제거하고 혈액을 씻어내는 데 필수적입니다. 10mL/min의 유속으로 8-15분의 관류 시간은 EDTA, Ca2+-free 용액이 모든 세포에 도달할 수 있도록 하는 데 중요합니다. 최적이 아닌 관류는 소화 감소로 이어질 수 있습니다.
콜라겐 매트릭스를 소화하는 콜라겐 분해 효소는 Ca2 +에 의존하기 때문에 소화 완충액에는 Ca2 +가 포함되어 있습니다. 분해 완충액의 유속은 최소 20mL/분으로 유지되어야 하며 시간은 콜라겐분해효소 용량에 따라 다릅니다. 우리가 사용하는 특정 분해 완충액의 경우, 300mL 용액의 최종 부피를 위해 15분을 관류해야 합니다. 소화가 불완전하면 세포 간 접합이 유지되고 연속적인 기계적 압력으로 세포가 손상되어 생존력이 감소합니다. 유속을 천천히 증가시키면 세포에 대한 관류의 스트레스 영향을 줄이는 데 기여합니다. 수술 중 우리는 일시적인 하대정맥 조임과 그에 따른 간 부종에 초점을 맞췄습니다: 이 통로는 소화 효율과 세포 회복을 모두 크게 향상시켰습니다. 소화가 끝나면 간은 연한 갈색이고 부드러워 보여야 합니다. 간 절제가 완료됨에 따라 PBS +3% P/S에서 분리된 간을 세척하면 세균 제목이 줄어들고 절차의 다음 부분에서 오염을 방지하는 데 도움이 됩니다.
생물학적 후드 아래의 간세포 분리 단계의 경우, 25mL 혈청학적 피펫을 사용하면 더 작은 보어 피펫에 의한 간세포 생존율 감소를 방지할 수 있습니다. 우리는 1차 간세포 수율을 높이기 위해 선택적 단계를 추가했는데, 이는 윌리엄의 완전한 배지를 부서진 간 위에 붓고 후드 아래에서 긁어내는 단계를 반복하는 것입니다. 이 단계는 분리된 간에서 세포 방출 배지를 여과한 후 수행되며 페트리를 청소하고 간 캡슐에서 더 많은 세포를 회수하는 데 도움이 됩니다. 필터를 통해 간세포를 이동시키기 위해 고압을 가해야 하는 경우 세포 생존율이 낮아집니다19.
간세포를 2일 이상 2D로 배양할 수 없었기 때문에 대안적인 장기 배양 모델을 찾게 되었습니다. 장기간 간세포를 배양하는 데 적합한 모델은 성인 Hep-Org입니다. 2D 간세포와 비교했을 때, Hep-Orgs는 15일째에 여전히 생존 가능하고 활발하게 증식하는 것으로 나타났으며, 이는 장기적인 잠재력을 입증했습니다.
쥐의 간 관류와 그에 따른 1차 성체 간세포 분리는 다양한 응용 분야에 대한 주요 예비 단계입니다. 절차에는 많은 단계와 변수가 포함되기 때문에 재현성이 기술의 한계가 될 수 있지만 절차의 시각적 설명에 주의를 기울이면 높은 성공률로 방법을 복제하는 데 도움이 됩니다. 중요한 단계를 지적하고 이를 해결하는 방법을 보여주는 이 프로토콜은 간 생리학 및 병리학을 연구하기 위해 Hep-Orgs 세대로서 시험관 내 모델을 확립하는 데 적합한 원발성 쥐 간세포 분리 절차와 결과를 최적화합니다.
공개 사항
모든 저자는 모든 이해 상충을 공개했습니다.
감사의 글
EdU 증식 분석을 수행하는 데 도움을 주신 트리에스테 대학교 소렌티노 연구소의 Davide Selvestrel 박사와 Giovanni Sorrentino 교수님께 감사드립니다. 이 작업은 Banca d'Italia 임시 보조금과 교내 FIF 보조금의 지원을 받았습니다.
재료
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| A83-01- ALK5 억제제 IV | 트윈 헬릭스 | T3031 | |
| B27 | Thermofisher Scientific | 0080085SA | |
| CFX Connect Real-Time PCR 검출 시스템 | Bio-Rad | ||
| CHIR99021 | Twin Helix | T2310 | |
| Click EdU Alexa 488 이미징 키트 | Thermofisher Scientific | C10499 | |
| 콜라겐, 타입 I, 쥐 꼬리 | Merck | C3867-1VL | |
| Dexamethasone의 용액 | 머크 | D4902 | |
| EGF | 머크 | E9644 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Euroclone | ECS0180L | |
| GELTREX LDEV FREE RGF BME | Thermofisher Scientific | A1413202 | |
| Heparin Sodium 25000 IU/5 ml | B. Braun Melsungen AG | B01AB01 | |
| HGF | Peprotech | 100-39시간 | |
| 인슐린-트랜스페린-셀레늄 용액 100x | Thermofisher Scientific | 41400045 | |
| L-글루타민 솔루션 | 유로클론 | ECB3000D | |
| 간 소화 매체 | 써모피셔 사이언티픽 | 17703-034 | |
| 간 관류 매체 | Thermofisher Scientific | 17701038 | |
| N2 보충제 | Thermofisher Scientific | 17502048 | |
| N-아세틸시스테인 | Merck | A9165 | |
| 니코틴아미드 | Merck | N-0636 | |
| 비필수 아미노산 | Merck | M7145 | |
| Normocin | Aurogene | Ant-nr-1 | |
| PBS buffer 1X | PanReac AppliChem | A0964,9050 | |
| Penicillin-streptomycin solution 100x | Euroclone | ECB3001D | |
| Percoll | Santa Cruz | sc-296039A | |
| 연동 펌프 | 이스마텍&트레이드; | MS-4/12 Reglo 디지털 펌프 | |
| TNFa | Peprotech | 300-01A | |
| TRI 시약 | Merck | T9424 | |
| 튜빙 | 이스마텍&트레이드; | ID.2,79mm | |
| 윌리엄스의 E 매체, 글루타민 없음 | Thermofisher Scientific | 31415029 | |
| Y27632 | 트윈 헬릭스 | T1725 |
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