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방법 논문

살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 측정하기 위한 Split-Luciferase 재조립 분석

2.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66862

⸱

2024년 10월 11일

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Science Education, College of Medicine, Charles R. Drew University of Medicine and Science

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

당사는 살아있는 세포에서 소포체-미토콘드리아 접촉을 모니터링하기 위해 split-luciferase reassembly assay를 확립했습니다. 이 분석을 사용하여 화학적 처리 조건에서 HEK293T 세포에서 이러한 세포 간 결합의 수준을 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다.

초록

소포체(ER)-미토콘드리아 접촉 부위는 Ca2+ 및 지질 항상성 조절, 미토콘드리아 역학, 자가포식 및 미토파고좀 생물 발생, 세포 사멸과 같은 세포 건강 및 항상성에 중요한 역할을 합니다. 정상적인 ER-미토콘드리아 결합을 유지하지 못하는 것은 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 및 유전성 경련성 하반신 마비와 같은 많은 신경 퇴행성 질환과 관련이 있습니다. ER-미토콘드리아 접촉의 조절 장애가 어떻게 세포 사멸로 이어질 수 있는지, 그리고 이러한 접촉을 정상 수준으로 복구하면 신경 퇴행성 상태를 개선할 수 있는지 여부를 조사하는 것은 상당한 의미가 있습니다. 따라서 이러한 접촉의 수준을 측정하는 개선된 분석법은 이러한 질병의 병원성 메커니즘을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 궁극적으로 간단하고 신뢰할 수 있는 분석을 확립하면 새로운 치료 전략의 개발을 촉진할 수 있습니다. 여기에서는 살아있는 세포에서 ER-미토콘드리아 접촉 수준을 정량적으로 측정하기 위한 split-luciferase assay에 대해 설명합니다. 이 분석은 이러한 접촉의 병태생리학적 역할을 연구하고 고처리량 스크리닝에서 조절제를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

ER과 미토콘드리아 사이의 상호 작용은 세포 항상성과 생존에 매우 중요합니다 1,2,3,4. 이전의 증거에 의하면 ER-미토콘드리아 접촉 부위의 모든 유형의 중단 또는 조절 장애는 암뿐만 아니라 여러 신경퇴행성, 대사성 및 심혈관 질환에 기여할 수 있다 5,6,7,8,9,10. 예를 들어, 미토콘드리아로의 Ca2+ 흡수가 비정상적으로 증가하면 알츠하이머병의 일부 모델에서 흔히 볼 수 있는 미토콘드리아 투과성 전이 기공이 열려 세포 사멸을 유발할 수 있습니다 5,11. 마찬가지로, ER-미토콘드리아 접촉이 감소하면 ATP 생성이 감소하고 Ca2+ 섭취가 손상될 수 있으며, 이는 근위축성 측삭 경화증 모델에서 볼 수 있습니다 5,11,12. ER-미토콘드리아 접촉 영역에서 더 많은 연구가 수행됨에 따라 이러한 접촉에 영향을 줄 수 있는 추가적인 질병 관련 단백질 및 유전자가 발견되고 있습니다. ER-미토콘드리아 접촉 부위의 역할을 보여주는 현재의 지식과 증거에도 불구하고, 이러한 접촉이 어떻게 세포 기능의 상실과 궁극적으로 세포 사멸로 이어질 수 있는지 설명하기 위해서는 여전히 많은 연구가 필요합니다.

두 막의 근접성, 구조적 형태 및 두 세포 기관 접촉 부위 사이의 거리를 평가하기 위해 다양한 방법이 개발되었습니다 3,4,13. ER-미토콘드리아 결합을 모니터링하는 접근 방식에는 형광 마커 기반 이미징14,15, FRET 리포터 기반 이미징16 및 분할 형광 프로브 기반 이미징17,18이 포함되며 에피형광 및 컨포칼 현미경을 사용합니다. 초고해상도 및 원자 분해능 현미경 검사는 또한 세포 기관 간 접촉을 정확하게 시각화하기 위한 강력한 도구이지만, 고도로 전용 현미경과 기술 전문 지식이 필요하기 때문에 접촉 부위 분석에서의 활용은 여전히 제한적입니다19. 또한 투과 전자 현미경(TEM), 주사 전자 현미경(SEM) 및 전자 단층 촬영(ET) 및 초저온 전자 현미경과 같은 기타 EM 기술은 다른 실험적 접근 방식을 사용하여 탐색할 수 없는 접촉 부위의 고해상도 초구조 이미징을 제공하기 때문에 일반적으로 사용됩니다 20,21,22. 그러나 이러한 EM 기반 방법은 화학적 고정 절차의 영향도 받을 수 있는 매우 낮은 처리량 기술입니다. 보다 최근에는 근접 라벨링 기반 방법을 사용하여 접촉 부위를 검출하고 새로운 접촉 부위 단백질을 식별했습니다. 예를 들어, 근접 결찰 분석(PLA)은 소기관 근접성을 정량화하는 데 사용되었으며(23,24), 아스코르브산 과산화효소(APEX) 분석의 수정된 버전은 새로운 접촉 부위 단백질(25,26)을 식별하는 데 사용되었습니다. 위에서 설명한 이러한 모든 방법은 소기관 간의 접촉을 감지하는 데 강점과 본질적인 한계가 있음을 인식하는 것이 중요합니다. 따라서, 세포 기관 접촉 부위에 대한 철저한 해석을 얻기 위해 다양한 기술의 쌍이 필요합니다.

이전에는 ER-미토콘드리아 멤브레인 접촉 수준(그림 1A)을 모니터링하기 위해 split-Renilla luciferase 8 재조립 분석(split-Rluc assay)을 확립했습니다(그림 1A)24,26,27. 간단히 말해서, Renilla luciferase의 각 분할 절반은 ER 또는 미토콘드리아 표적 서열과 접합됩니다. 함께 transfection하면 효소의 각 분할 절반이 ER 또는 미토콘드리아 막에서 발현됩니다. ER과 미토콘드리아가 서로 가까이 위치하면 분할된 반쪽이 함께 모여 루시페라아제 활성으로 전체 효소를 재구성합니다. split-Rluc 구조체의 경우 초기 템플릿에 대해 pBAD/Myc-His27의 Renilla luciferase 8(Rluc8)을 사용했습니다. 분할 부위(아미노산 91 및 92 사이)는 이전 보고(27)에 기초하여 결정되었다. Rluc8의 N-말단 절반에 대해, Rluc8의 아미노산 1-91에 대한 DNA 서열을 PCR27에 의해 pcDNA3.1 TOPO 벡터에서 FLAG 태그의 3' 말단 및 마우스 AKAP1 미토콘드리아 표적 서열에 융합시켰다. ER을 대상으로 하는 C-말단 절반의 경우, 아미노산 92-311을 암호화하는 DNA 서열을 myc 태그의 5' 말단과 효모 UBC6 ER 국소화 서열에 융합했습니다. 여기에서는 Renilla luciferase의 분할된 반쪽이 동일한 promoter 하에서 단일 벡터(pCAG)로 발현된 후 Thosea asigna 바이러스의 자가 절단 펩타이드 2A 염기서열인 T2A가 두 개의 분할 반쪽 사이에 삽입됨에 따라 두 개의 단편으로 절단되도록 split-Rluc plasmid 구조를 업그레이드했습니다(그림 1B). 플라스미드 DNA 맵 및 서열은 보충 파일 1 및 보충 그림 S1에 제공된다. 이 시스템을 사용하여 ER-미토콘드리아 접촉에 대한 세 가지 화학 물질(액틴 중합에 관여하는 GTPase 억제)의 효과를 측정했습니다. 이 split-Rluc assay는 세포기관 간 접촉 조절제(inter-organelle contact modulators24)에 대한 고처리량 스크리닝을 위한 간단하지만 강력한 분석 시스템입니다.

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프로토콜

1. 세포 유지 관리 및 파종(1일차)

  1. 37°C의 가습 인큐베이터에서 5%CO2로 10% 소 태아 혈청(FBS)(100mm 배양 접시에 포함)이 포함된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)을 포함하는 세포 배양 배지의 HEK293T 세포를 유지합니다.
  2. 시작하기 전에 현미경으로 관찰하여 플레이트의 밀도를 확인하십시오. 세포가 약 80-90%의 밀도에 도달하면 배지를 제거하고 10mL의 Dulbecco's phosphate-buffered saline(DPBS)으로 세척하여 6웰 배양 플레이트에서 세포를 파종할 준비를 합니다.
  3. 배양 접시에서 DPBS를 제거하고 세포를 0.05% 트립신-EDTA 페놀 레드 1mL로 처리합니다. 3분 동안 배양한 다음 인큐베이터에서 플레이트를 꺼내고 9mL의 배양 배지(10% FBS가 있는 DMEM)를 추가하여 트립신 반응을 중지합니다. 플레이트에 아직 붙어 있는 세포가 제거되었는지 확인하기 위해 천천히 위아래로 피펫팅합니다. 세포 현탁액을 50mL 튜브로 옮깁니다.
  4. 300× g 에서 실온에서 5분 동안 원심분리합니다. 배지를 제거하고 1mL의 새 배지(DMEM + 10% FBS)로 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
  5. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
    1. 튜브를 부드럽게 소용돌이쳐 세포가 고르게 분포되도록 합니다. 즉시 세포 현탁액 10μL를 꺼내 1.7mL 미세 원심분리 튜브에 넣습니다. 동일한 튜브에 90μL의 매체를 추가합니다.
    2. 세포와 배지를 부드럽게 혼합한 후 세포 현탁액을 취하고 커버슬립 아래에 부드럽게 피펫팅하여 혈구계의 각 챔버에 10μL를 적용합니다.
    3. 10x 대물렌즈를 사용하여 현미경으로 혈구계의 격자선에 초점을 맞춥니다. 초점이 맞춰지면 손 계산 카운터를 사용하여 16개의 사각형(4 x 4 사각형)으로 구성된 한 세트의 셀 수를 계산합니다. 16개의 사각형으로 구성된 4세트가 모두 계산될 때까지 반복합니다.
    4. 평균 세포 수(16개의 모서리 사각형 각각에서)를 취하고 105를 곱하여 총 세포 수/mL를 계산합니다.
      알림: 혈구계를 사용하여 세포를 계수하는 대신 제조업체의 지침에 따라 자동 세포 카운터를 사용할 수 있습니다.
  6. 세포 계수가 완료되면 7.5 × 105 세포/웰 밀도의 6-웰 플레이트에 2mL의 배지/웰로 세포를 플레이트할 준비를 합니다. 50mL 튜브에 13mL의 배지와 함께 필요한 부피의 세포를 추가합니다. 희석된 세포 현탁액 2mL를 6개의 웰 각각에 분주합니다.
    1. 도금하기 전에 C1V1 = C2V2를 사용하여 7.5 × 105 셀 / 웰에 필요한 셀 수를 계산하십시오. 여기서 C1은 초기 셀 수(셀 수/mL), V1은 초기 셀 현탁액에서 필요한 부피, C2는 원하는 목표 셀 밀도(셀 수/mL)입니다. V2 는 세포 파종에 필요한 최종 부피입니다.
  7. 분주 후 플레이트의 모든 면을 가볍게 두드려 세포를 펼친 다음 37°C의 가습 인큐베이터에 밤새 5%CO2 로 넣습니다.

2. 폴리에틸렌이민(PEI) 매개 세포 transfection 및 transfection 후 세포 seeding(2일차)

  1. 인큐베이터에서 6-웰 플레이트를 제거하고 각 웰에서 기존 배양 배지를 흡인합니다. 웰당 2mL의 신선한 배지를 추가합니다.
  2. TE 완충액(pH 8.0)에 용해된 split-Rluc plasmid DNA(pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry)로 세포를 transfection합니다.
    1. 각 웰에 대해 1.7mL 미세 원심분리기 튜브의 DMEM 200μL에 DNA(750ng)와 PEI(DNA/PEI 비율 = 1:3)를 혼합합니다. 레벨 8에서 DNA/PEI를 약 2초 동안 빠르게 소용돌이쳐 서로 잘 섞여 복합체를 형성하도록 합니다. 그런 다음 미니 원심분리기에서 짧게(<3초) 회전시킵니다.
    2. DNA/PEI 혼합물을 실온에서 15분 동안 배양한 다음 혼합물을 세포가 들어 있는 6웰 플레이트의 배양 배지 표면에 떨어뜨려 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 두드리고(혼합물이 고르게 분포되도록) 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% CO2 로 6시간 동안 배양합니다.
  3. 배양하는 동안 먼저 각 웰에 70μL의 PDL(DPBS에서 50μg/mL)을 추가하고 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% CO2 로 최소 1시간 동안 배양하여 Poly-D-Lysine(PDL) 코팅된 96웰 플레이트를 준비합니다. PDL 용액을 제거한 다음 각 웰을 100μL의 DPBS로 2번 세척합니다. 두 번째 세척이 끝나면 나머지 DPBS가 모두 제거되었는지 확인합니다.
  4. transfection 후 6시간이 지나면 PDL 코팅된 96웰 플레이트에서 transfection된 세포를 seed할 준비를 합니다.
    1. 인큐베이터에서 transfection된 세포가 들어 있는 6웰 플레이트를 꺼내고 배지를 흡인한 다음 각 웰을 2mL의 DPBS로 세척합니다. DPBS를 제거한 후 350μL의 0.05% 트립신-EDTA 페놀 레드를 넣고 1-2분 동안 배양합니다. 트립신 반응을 중지하려면 각 웰에 1.7mL의 배지를 추가합니다.
    2. 세포를 배지와 함께 50mL 튜브로 옮긴 후 탁상용 원심분리기에서 300× g 으로 5분 동안 튜브를 회전시킵니다. 배지를 흡입하고 1mL의 새 배지로 세포 펠릿을 재현탁시킵니다. 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다(1.5단계에서 설명한 대로).
  5. 100 μL의 배양 배지에 4 × 104 cells/well의 밀도로 PDL 코팅된 96웰 플레이트에 세포를 시드합니다. 이를 위해 50mL 튜브에 적절한 양의 매체(총 부피 12mL)와 함께 필요한 세포 부피(계산은 아래 참조)를 추가합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 100μL의 희석된 셀 현탁액을 96웰 각각에 분주합니다. 37 ° C의 가습 인큐베이터에서 5 % CO2 로 18 시간 동안 세포를 배양합니다.
    1. C1V1 = C2V2를 사용하여 4 × 104 세포/웰에 필요한 세포 수를 계산합니다. 여기서 C1은 초기 세포 수(세포 수/mL), V1은 초기 세포 현탁액에서 필요한 부피, C2는 원하는 목표 세포 밀도(세포 수/mL), V2는 세포 파종에 필요한 최종 부피입니다.

3. 살아있는 세포의 화학적 처리 및 루시페라아제 분석(3일차)

  1. 1.7mL 미세분리 튜브에 50μM Rhosin(DMSO의 50mM 스톡), 25μM Ehop-016(DMSO의 25mM 스톡) 및 50μM ZCL278(DMSO의 50mM 스톡)의 3가지 새로운 용액을 각 스톡 용액(50mM Rhosin, 25mM Ehop-016 및 50mL ZCL278, 모두 DMSO에 포함)을 필요한 양(50μL/웰 × 웰 수)으로 1:1,000으로 희석하여 준비합니다. 각 용액에 1:2,000으로 희석된 Renilla luciferase용 생세포 기질(DMSO의 50mM 스톡)을 최종 농도 25μM로 추가합니다. 0.5, 5 및 50 μM ZCL278 용액을 만들려면 배양 배지에서 초기 50 μM ZCL278을 사용하여 연속 희석을 수행합니다.
    참고: 화학적 배양 시간이 1-1.5시간 미만으로 필요한 경우 세포를 각 화학 물질로 처리하기 전에 1-1.5시간 동안 살아있는 세포 기질( Renilla luciferase의 경우)로 사전 배양할 수 있습니다. 당사는 화학 물질과 살아있는 세포 기질을 동시에 추가하여 고처리량 약물 스크리닝을 위한 프로토콜을 최적화합니다.
  2. 형질주입된 세포가 들어 있는 96웰 플레이트의 각 웰에서 배지를 제거하고 각 웰에 50μL의 화학물질 및 기판 배지 혼합물을 추가합니다.
  3. 세포를 1시간, 2시간 또는 5시간 동안 배양한 후 배양기에서 배양판을 꺼내 발광 플레이트 리더에 로드하고 발광을 측정합니다.
    1. 시작하기 전에 플레이트 리더가 켜져 있는지 확인하십시오. 마이크로플레이트 리더 소프트웨어에 액세스하고 New Session(새 세션)을 클릭하여 새 파일을 만듭니다. Incubator를 클릭하고 온도 옵션을 선택한 다음 37 °C를 입력하여 플레이트 리더의 온도를 37 °C로 설정합니다. 플레이트 레이아웃(Plate Layout)에서 알 수 없음(Unknown) 옵션을 선택하고 클릭하고 끌어서 측정할 웰을 지정합니다.
    2. 프로토콜에서 발광을 클릭하고 기본 설정을 유지합니다. 설정이 완료되면 뚜껑을 닫은 플레이트를 플레이트 리더에 로드하고 Run Plate In(플레이트 인 실행)을 선택합니다. 시작을 클릭하면 파일 저장 창이 나타납니다. 파일 이름을 바꾸고 저장을 클릭하여 바탕 화면에 파일을 저장합니다.
      알림: 발광은 라이브 셀 기판을 추가한 후에도 >24시간 동안 계속 생성됩니다.
  4. 판독이 완료되면 플레이트 리더에서 플레이트를 제거한 다음 플레이트 인 실행을 클릭하여 리더를 다시 끼웁니다. 완료되면 다음 판독 할 때까지 플레이트를 가습 인큐베이터 (37 °C, 5 % CO2)에 다시 놓습니다.
  5. 완료되면 발광 데이터를 그래프 프로그램으로 전송하여 각 변수(예: 화학 물질 또는 농도)(x축)에 대한 상대 발광 단위(RLU)(y축)를 플롯하고 데이터를 분석합니다.

4. 다른 방법을 사용한 split-Rluc 분석의 검증.

  1. 근접 결찰 분석(PLA), 투과 전자 현미경 및 미토콘드리아 칼슘 흡수 모니터링과 같은 다른 분석을 수행하여 이전에 설명한 대로 split-Rluc 분석에서 얻은 결과를 검증합니다24.

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결과

우리는 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 특정 GTPase를 억제하는 것으로 알려진 세 가지 화합물을 추가할 때 ER-미토콘드리아 접촉 수준을 측정했습니다. CDC42, RHO 및 RAC는 활성화될 때 액틴 중합(28)을 촉진하고 각각 ZCL278, Rhosin 및 Ehop-016에 의해 억제되는 GTPase입니다(24). split-Rluc로 형질주입된 HEK293T 세포를 DMSO(대조군), ZCL278(50μM), Rhosin(50μM) 또는 Ehop-016(25μM)으로 처리하고 1시간, 2시간, 5시간 동안 배양했습니다. 플레이트 리더를 사용하여 정의된 시점에서 split-Rluc 활성을 측정했습니다(그림 2).

로신(RHO GTPase inhibitor) 처리된 세포는 처리한 1시간, 2시간, 5시간...

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토론

우리는 ER-미토콘드리아 커플링의 수준을 정량화하기 위해 split-Renilla luciferase 8 reassembly assay(split-Rluc assay)를 사용했습니다. 이 연구에서는 루시페라아제의 각 분할 절반이 동일한 양으로 발현되도록 하기 위해 각 split-Rluc 구성 요소(MitoRlucN 및 RlucCER)와 Thosea asigna 바이러스의 자체 절단 펩타이드 2A 서열을 인코딩하는 단일 벡터 pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry를 생성하여 원래의 split-Rluc construct24를 수정했습니다. 레닐라 루시페라제(R...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자들은 원고에 대한 비판적 검토를 해준 Dr. Jeffrey Golden (Cedars-Sinai Medical Center)에게 감사를 표했다. 이 연구는 미국 국립신경질환 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disease and Stroke, NINDS, R01NS113516)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.7 mL SafeSeal 마이크로 원심분리기 튜브Sorenson16070
6-웰 플레이트 TC TreatedUSA ScientificCC7682-7506
10 mL 피펫 팁 OneTipUSA Scientific1110-3700
10 μ L 피펫 팁 OneTipUSA Scientific1110-3700
20-200 μ L 베벨 팁 OneTipUSA Scientific1111-1210
50 mL 폴리프로필렌 원추형 튜브Falcon352070
96-Well Flipper 마이크로튜브 랙ThermoFisher Scientific8770-11
96-웰 플레이트 TC 처리 USA ScientificCC7682-7596
100 mm x 20 mm TC 처리 접시USA ScientificCC7682-3394
1250 μ L 팁OneTip USA Scientific1112-1720
원심분리기 5910  Ri - 냉장 원심분리기Eppendorf5943000131
Dimethyl sulfoxide, 무수, ≥ 99.9%Sigma-Aldrich276855-100ML
DMEM, 고포도ThermoFisher Scientific11965092
DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음ThermoFisher Scientific14190144
EHop 016Bio-Techne Tocris6248DMSO에 용해; -70°C에서 보관 & C
EnduRen Live Cell SubstratePromegaE6481-70 °에서 부분 표본 저장; C
에펜도르프 2-20 μ L 피펫Eppendorf3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μ L 피펫Eppendorf3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µ L 피펫Eppendorf3123000020
Eppendorf Research plus 12채널Eppendorf3125000028
Eppendorf Research plus 200 μ L 피펫Eppendorf 
태아 소 혈청, 인증, USDA 승인 지역ThermoFisher Scientific10437028
Forma Steri-Cycle CO2  인큐베이터, 184 L, 광택 스테인리스강ThermoFisher Scientific381
핸드 탈리 카운터Sigma-AldrichHS6594
HEK 293T 셀ATCCCRL-3216
혈구계 - Neubauer Bright Line, 이중 계수 챔버LW ScientificCTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE 버퍼ThermoFisher Scientific8019005
현미경ZeissAxiovert 25 CFL
미니 원심분리기벤치마크 ScientificC1012
50ml 원뿔형, 15ml 원뿔형 및 마이크로 원심분리기 튜브용 멀티 튜브 랙Boekel Scientific120008
PEI MAX - 트랜스펙션 등급 선형 폴리에틸렌이민 염산염(MW 40,000)Polysciences24765-100MG
Pipet-Aid XPUSA Scientific4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP6407-5MG
Rhosin hydrochlorideBio-Techne Tocris5003DMSO에 용해; -70°C에서 보관; C
트립신-EDTA(0.05%), 페놀 레드ThermoFisher Scientific25300054
Varioskan LUX 멀티모드 마이크로플레이트 리더ThermoFisher ScientificVL0000D0
VortexThermoFisher Scientific2215365레벨 8
VWR 진공 흡인 시스템VWR75870-734
ZCL 278Bio-Techne Tocris4794DMSO에 용해; -70 °에 저장; 씨
당 3123000055

참고문헌

  1. Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs. Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).
  2. Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport. Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).
  3. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).
  4. Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology. Cell. 187 (2), 257-270 (2024).
  5. Paillusson, S., et al. There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases. Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).
  6. Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes. Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).
  7. Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained. Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).
  8. Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases. Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).
  9. Rieusset, J. The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update. Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).
  10. Bouguerra, M. D., Lalli, E. ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).
  11. Tepikin, A. V. Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective. Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).
  12. Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. A computational model of motor neuron degeneration. Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).
  13. Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches. Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).
  14. Rizzuto, R., et al. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).
  15. Valm, A. M., et al. Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome. Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).
  16. Csordás, G., et al. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).
  17. Cieri, D., et al. SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition. Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).
  18. Kakimoto, Y., et al. Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system. Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).
  19. Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions. Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).
  20. Csordas, G., et al. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).
  21. de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).
  22. Kremer, A., et al. Developing 3D SEM in a broad biological context. J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).
  23. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  24. Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts. Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).
  25. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).
  26. Cho, I. -T., et al. Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts. J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).
  27. Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts. Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).
  28. Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function. Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).

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