방법 논문

의인성 손상 요약: 쥐의 요도 협착 모델링을 위한 전기 절제 기술

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/66864

⸱

2024년 10월 11일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Urology, The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging, The Fifth Affiliated Hospital, Sun Yat-Sen University

이 논문에서

요약

이 연구에서는 임상 환경에서 관찰되는 의인성 손상을 효과적으로 시뮬레이션하는 쥐 요도의 전기 절제를 통해 생성된 요도 협착의 새롭고 효율적이며 안정적인 랫트 모델을 제시합니다.

초록

요도 협착(미국)은 비뇨기과에서 흔한 임상 질환으로, 모든 연령대에서 높은 유병률과 이환율을 특징으로 합니다. 요도 확장 및 내부 요도 절개술과 같은 미국의 현재 치료법은 상태를 완전히 해결하지 못하며 높은 재발 및 합병증과 관련이 있습니다.

또한 미국의 발병 기전은 잘 알려져 있지 않습니다. 미국의 발병 기전을 탐색하고 새로운 치료 전략을 개발하기 위해서는 임상 징후를 정확하게 반영하는 표준화된 쥐 모델을 수립하는 것이 중요합니다. 이 연구는 고주파 전기 칼을 사용하여 미국을 쥐로 유도하는 간단하고 반복 가능한 방법을 설명합니다. 이 방법은 4W에서 단극 혼합 절단 모드로 설정된 전기 칼로 세로로 절개하는 것을 포함하며, 이는 심각한 요도 손상을 입힙니다. 조직병리학적 분석은 요로상피의 두꺼워짐, 염증성 침투 및 무질서한 콜라겐 섬유를 보여줍니다. 이 모델은 쥐 요도에서 전기 절제를 통해 의인성 손상을 효과적으로 복제합니다. 요약하면, 이 연구는 임상 시나리오를 밀접하게 모방한 미국의 새롭고 효율적이며 안정적인 쥐 모델을 성공적으로 확립하여 미국의 메커니즘 및 새로운 치료법에 대한 추가 연구를 위한 귀중한 도구를 제공합니다.

서론

요도 협착(미국)은 가장 오래된 비뇨기과 질환 중 하나이며 계속해서 널리 퍼져 있습니다. 최근 데이터에 따르면 남성 100,000명당 229명에서 627명 사이의 미국 감염 사례가 있다고 합니다1. 미국병을 앓고 있는 사람들은 하부 요로 증상2, 통증3, 성기능 장애4 등 다양한 증상을 경험합니다. 요도 절개술, 요도 성형술, 확장5 등 여러 가지 의학적 치료법이 있다. 그러나 이러한 치료법은 출혈, 감염, 요실금과 같은 문제로 인해 복잡해지는 경우가 많아 질병에 대한 부담을 가중시키고 다양한 재발률을 보인다 6,7. 결과적으로, 가장 효과적인 치료 접근법을 식별하는 것은 연구자와 임상의를 참여시키는 중요한 과제로 남아 있습니다.

US는 일반적으로 섬유증으로 인한 전요도의 협착과 요도 점막과 주변 해면체 조직의 cicatrization으로 특징지어진다8. 이 질병이 널리 퍼져 있음에도 불구하고, 미국의 기저에 깔린 원인과 메커니즘은 잘 알려져 있지 않으며, 심층적인 연구를 위한 적절한 동물 모델도 부족합니다. 주로 경요도 수술로 인한 의인성 손상은 현재 미국에서 가장 큰 원인으로 41%를 차지하고 있다9. 따라서 미국 연구를 위한 이상적인 동물 모델은 일반적인 임상 손상을 정확하게 복제하고, 인간과 가까운 게놈 및 단백질체 유사성을 보이며, 효율성과 안정성을 모두 입증해야 합니다. 이러한 모델은 미국의 발병 기전에 대한 심층 조사와 보다 효과적인 치료법 개발을 크게 촉진할 것입니다.

일반적인 임상형의 병원성 과정과 기전을 규명하기 위해 토끼10,11, 개12, 돼지13,14와 같은 대형 동물을 사용하여 전기응고, 전기절제술15, 블레오마이신 주사16와 같은 기술을 사용하여 다양한 동물모델을 개발했다 . 그러나 이러한 모델은 표본 크기 제한과 인간과의 유전적 차이로 인해 종종 문제에 직면합니다. 또한 대형 동물을 사용하는 비용 효율성을 고려해야 합니다. 일상적인 보살핌과 관련된 높은 비용에도 불구하고 대형 동물은 심각한 감염 위험을 수반하므로 광범위한 수술 후 관리와 상당한 비용이 필요합니다. 설치류는 많은 장기 시스템에서 인간과 생리학적, 병리학적 특성을 공유한다는 것이 잘 문서화되어 있습니다. 최근 연구에 따르면 설치류 동물과 인간의 요로 세포 사이의 상동성이 밝혀졌습니다17. 더욱이, 쥐의 구매, 사육 및 수술 후 관리 비용은 대형 동물보다 현저히 낮다18. 결과적으로, 미국의 쥐 모델이 적합한 것으로 간주됩니다. 그러나 쥐에서 이러한 모델의 개발은 부적절하게 설명되었습니다.

이전 연구에서는 쥐 모델에서 US를 유도하기 위해 칼날이나 바늘과 같은 수술 도구를 사용했습니다19. 이 접근법은 요도 주위 혈관을 손상시켜 심각한 출혈을 유발하는 것과 같은 위험과 관련이 있습니다. 이러한 수술 절차의 주관적인 특성으로 인해 기계적 손상의 정도가 가변적일 수 있으며, 모델링을 위한 정량적 기준이 부족하여 후속 치료 연구에서 요도 복원 결과 평가에 영향을 미칠 수 있습니다.

이러한 고려 사항을 감안할 때, 추가적인 미국 쥐 모델을 개발할 필요가 있음이 분명합니다. 쥐에서 효율적이고 비용 효율적이며 안정적인 미국 모델을 확립하기 위해 우리는 연구에 고주파 전기 칼 기계를 사용했습니다. 이 모델은 임상시험을 진행하기 전에 미국의 메커니즘에 대한 추가 조사와 새로운 치료 접근법의 평가를 용이하게 할 것입니다.

프로토콜

이 조사에서는 각각 무게가 400-500g인 6개월 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐 20마리가 사용되었습니다. 모든 동물 시술은 Sun Yat-Sen University의 제5 부속 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(승인 번호: 00349)의 지침에 따라 수행되었습니다. 동물들은 온도와 조명 조건이 조절된 시설에 수용되었습니다. 요도 협착의 근본적인 특징은 요도 내에 흉터가 생기는 것입니다. 일반적으로 손상 후 4주 이내에 발생하는 흉터 형성에 대한 확립된 타임라인을 기반으로 수술 후 4주 표시에서 요도에서 식별 가능한 흉터 조직의 존재를 실험 종점으로 지정했습니다.

1. 수술 기구의 준비

  1. 테프론 코팅 카테터(0.6 x 1mm), 흡수성 봉합사(6-0), 봉합 가위, 조직 집게, 바늘 고정 플라이어, 부드러운 집게, 고주파 전기 수술 장치(그림 1), 고주파 전기 칼, 수술용 전극 고주파 전기 수술 칼 및 항문 전도성 막대 패널을 포함한 고주파 전기 수술 장치(그림 1)를 준비합니다( 참고 자료 참조).
  2. 75% 에탄올이 함유된 알코올 물티슈로 수술 부위를 청소하십시오.
  3. 단극 전기 절단 모드에서 고주파 전기 칼을 사용하기 위한 준비.
    1. 전원 코드를 사용하여 고주파 전기 칼을 접지된 220V 주 전원 공급 장치에 연결합니다.
    2. 멸균된 손으로 제어되는 칼 손잡이와 전도성 막대를 각각의 소켓에 삽입합니다(그림 1C).
      알림: 수술의 안전을 유지하기 위해 모든 전원 케이블이 단단히 연결되어 있는지 확인하십시오.

2. 동물의 준비

  1. 펜토바르비탈 나트륨(60mg/kg)을 주사기에 넣습니다.
  2. 주로 사용하는 손으로 쥐의 꼬리를 잡고 주로 사용하지 않는 손으로 귀와 목의 피부를 잡고 단단히 고정되도록 합니다.
  3. 쥐의 하복부를 노출시키고 75% 에탄올에 적신 면봉을 사용하여 해당 부위를 소독합니다.
  4. 주사기 바늘을 하복부의 복부 정중선 옆으로 약 1-2mm 삽입하여 45° 각도로 복강으로 향하게 합니다.
    알림: 바늘이 복막을 관통할 때 저항력 상실을 느낄 것입니다.
  5. 주사기 플런저를 부드럽게 뒤로 당겨 주사기에 혈액이나 액체가 없는지 확인합니다.
  6. 펜토바르비탈 나트륨을 천천히 주입합니다. 바늘을 빼내고 주사를 완료하고 75 % 에탄올에 담근 면봉으로 부위를 다시 소독합니다.
  7. 쥐의 호흡 리듬을 모니터링하고 뒷발을 꼬집어 반사 신경을 확인합니다.
    참고: 수술을 진행하기 전에 쥐의 호흡이 안정적이고 반사 신경이 없는지 확인하십시오.
  8. 에리스로마이신 연고를 짜내고 면봉을 연고에 적십니다. 면봉으로 연고를 양쪽 눈의 각막에 바르면 시술 중 각막이 건조해지는 것을 방지할 수 있습니다.
  9. 전기 면도기를 사용하여 마취가 확인된 후 하복부와 회음부를 면도합니다.
  10. 면도 부위의 느슨한 수염을 식염수를 적신 티슈로 닦아냅니다.
  11. 요오드포를 적신 거즈 스펀지로 두 번 닦아주면 피부 자극을 최소화할 수 있습니다.
  12. 깊이 마취된 쥐를 37°C로 설정된 가열 패드에 누운 자세로 놓습니다. 의료용 장갑을 착용하여 수술 중 무균 상태를 확인하십시오.

3. 요도 카테터 삽입 및 부상 절차

  1. 전도성 막대를 쥐의 항문에 삽입하여 고주파 전기 칼 기계를 위한 효과적인 폐쇄 루프 회로를 설정합니다(그림 2A).
  2. 쥐의 요도를 카테터화하여 위치를 잡고 수술의 후처리 단계에서 지지를 제공합니다.
    1. 요로 카테터를 파라핀 오일로 윤활합니다.
    2. 음경 주위의 피부를 짜서 복부에서 돌출시켜 음경을 노출시킵니다.
    3. 요오드포에 적신 거즈 스폰지로 쥐의 음경을 소독하십시오.
    4. 부드러운 집게로 요도 구멍을 부드럽게 열고 윤활된 카테터를 요도에 삽입합니다.
    5. 테플론으로 코팅된 카테터를 요도 수축의 리듬에 따라 요도에 조심스럽게 삽입하십시오. 무리한 삽입을 피하십시오(그림 2B).
    6. 저항이 발생하면 음경을 복부 쪽으로 부드럽게 당겨 음경의 굽힘 각도를 조정하고 소변이 흘러나올 때까지 카테터를 방광으로 계속 전진시킵니다(그림 2C).
    7. 음경이 복부와 약 45° 각도를 이루도록 하여 성공적인 카테터 삽입을 확인합니다(그림 2D).
  3. 고주파 전기 칼 기계를 켜고 고주파 칼 패널의 버튼을 클릭하여 단극 혼합 절단 모드를 선택하고 음경을 층별로 전기 절제하는 다음 단계를 위해 전력을 4W로 설정합니다.
  4. 절개 부위를 카테터에 맞춥니다. 전기수술용 칼 손잡이의 노란색 버튼을 누르고 요도가 노출될 때까지 전기 칼을 사용하여 음경 피부에서 요도 바깥층까지 카테터 표시선을 따라 절개합니다(그림 3A, B).
    알림: 전기 응고를 위한 파란색 버튼이 아닌 전기 절제를 위한 노란색 버튼을 눌렀는지 확인하십시오.
  5. 카테터가 보일 때까지 전기 칼로 요도를 0.5cm 세로로 절개하여 가로 직경이 0.1cm가 되도록 합니다(그림 3C).
  6. 연속 또는 단속 스티치로 흡수성 봉합사(6-0)를 사용하여 상처와 표재성 피부를 층별로 봉합합니다(그림 3D, E).
  7. 요도 카테터를 제거하고 음경의 위치를 변경합니다(그림 3F).
  8. 고주파 전기 칼을 끄고 쥐의 항문에서 전도성 막대를 제거합니다.
  9. 알코올(75% 에탄올) 물티슈로 수술 재료를 세척합니다.

4. 수술 후 관리

  1. 데워진 패드(37°C)에 쥐를 놓고 마취 후 회복을 면밀히 모니터링합니다. 호흡 리듬, 체온, 의식 수준을 포함한 쥐의 신체 상태에 세심한 주의를 기울이십시오.
    알림: 완전한 회복이 관찰될 때까지 쥐를 우리에 다시 넣지 마십시오.
  2. 쥐를 깨끗한 우리에 사육하고 회복 후 매일 통증 관리를 위해 모르핀 스파이크 물(0.4mg/kg)을 물병에 채웁니다.
  3. 수술 후 통증에서 쥐의 완전한 회복을 위해 비스테로이드성 항염증제(예: Carprofen, 0.5mg/kg, 피하 주사)를 투여합니다.

5. 조직학적 평가

  1. 수술 4주 후, 쥐의 꼬리를 들어 올려 배뇨 반사를 유도합니다. 쥐를 안락사 상자에 넣고 CO2 전달 파이프 밸브를 열고 CO2 과다 복용으로 쥐를 인도적으로 안락사시킵니다.
  2. 쥐가 움직이지 않고 숨을 쉬지 않는 것을 확인하고 동공이 확장되는 것을 관찰한 후 밸브를 끕니다. 안락사가 성공적인지 확인하기 위해 2분 동안 쥐의 신체 상태를 계속 관찰합니다.
  3. 안락사 상자에서 쥐를 꺼냅니다.
  4. 75% 에탄올에 적신 물티슈로 수술 부위와 수술 재료를 청소하십시오.
  5. 복부를 절개하여 방광이 채워지는 상태를 관찰하고 요도 전체를 적출합니다.
  6. 요도를 적출한 후 쥐를 밀봉 백에 넣고 4°C 냉장고에 보관하여 실험실 기술자가 처리할 수 있도록 합니다.
  7. 형태학적으로 미국의 총체적 병리학을 평가하고 조직의 색과 부드러움에 초점을 맞춥니다.
  8. 요도 조직을 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하여 상처 구조와 요로 상피 세포층을 시각화합니다.
    1. 파라핀 제거를 위해 슬라이드를 자일렌에 담그십시오(2 x 5분).
    2. 슬라이드를 에탄올로 순서대로 재수화합니다(100% 1 x 3분, 95% 1 x 3분, 85% 1 x 3분, 75% 1 x 3분).
    3. 슬라이드를 탈이온수로 세척합니다(2분).
    4. 헤마톡실린으로 슬라이드를 염색합니다(10분).
    5. 슬라이드를 탈이온수로 세척합니다(5분).
    6. 분화 용액(40초)으로 샘플을 구별합니다.
    7. 슬라이드를 탈이온수로 세척합니다(2 x 3분).
    8. 에오신 (2 분)으로 슬라이드를 염색합니다.
    9. 슬라이드를 에탄올에 담은 다음 순서(100% 1 x 3초, 95% 1 x 3초, 85% 1 x 3초, 75% 1 x 3초)로 재수화합니다.
    10. 슬라이드를 100% 에탄올에 담그고(1분) 크실렌(2 x 1분)으로 슬라이드를 투명하게 만듭니다.
    11. 중성 발삼을 넣고 커버슬립으로 밀봉합니다.
  9. Masson의 트리크롬 염색을 요도 조직에 바르면 콜라겐 섬유 구조를 강조할 수 있습니다.
    1. 파라핀 제거를 위해 슬라이드를 자일렌에 담그십시오(2 x 5분).
    2. 슬라이드를 에탄올로 순서대로 재수화합니다(100% 1 x 3분, 95% 1 x 3분, 85% 1 x 3분, 75% 1 x 3분).
    3. 슬라이드를 탈이온수로 세척합니다(2분).
    4. Weigert의 철 헤마톡실린 용액으로 슬라이드를 염색합니다(5분).
    5. 슬라이드를 탈이온수로 세척합니다(5분).
    6. Biebrich Scarlet-Acid Fucshin(5분)으로 슬라이드를 염색합니다.
    7. 슬라이드를 탈이온수로 세척합니다(2 x 3분).
    8. 포스포몰리브딕산(Phosphomolybdic Acid) 용액으로 슬라이드를 염색합니다(5분).
    9. 슬라이드를 아닐린 블루 용액에 놓습니다(5분). 용액을 버리십시오.
    10. 슬라이드를 헹구고 알코올을 통해 탈수하고 자일렌으로 세척합니다.
    11. 중성 발삼을 넣고 커버슬립으로 밀봉합니다.
  10. TGF-β 항체를 사용하여 면역형광 염색을 수행하여 요로상피 세포층을 평가합니다.
    1. 압력솥에 적절한 항원 회수 버퍼를 추가합니다. 압력솥을 핫플레이트에 올려놓고 최대 전력으로 켭니다.
    2. 끓어오르면 수돗물에서 압력솥으로 슬라이드를 옮깁니다. 밥솥에 찬물을 끼얹고 슬라이드를 10분 동안 가열합니다.
    3. 압력솥을 끄고 슬라이드를 제거하세요. 슬라이드를 실온으로 식히십시오.
    4. PBS 용액으로 슬라이드를 씻으십시오.
    5. 액체 차단 펜으로 샘플의 여백을 표시하십시오.
    6. PBS와 0.3% Triton X-100을 30분 동안 담급니다.
    7. PBS에서 슬라이드를 부드럽게 저어 세척합니다(2 x 5분).
    8. 실온(60분)에서 PBS에 10% 염소 세럼을 블록합니다.
    9. 차단 버퍼를 흡인하고 4°C에서 1차 항체로 하룻밤 동안 배양합니다.
    10. 1x PBS(3 x 5분)로 슬라이드를 세척합니다.
    11. 항체 희석 완충액에 희석된 형광 표지 2차 항체로 배양합니다.
    12. 1x PBS(3 x 3분)로 슬라이드를 세척합니다.
    13. 슬라이드를 장착하고 밀봉합니다.
  11. 슬라이드 스캐너에서 40x 대물렌즈를 사용하여 염색된 슬라이드를 디지털 방식으로 스캔합니다.
  12. 이미지를 분석하고 참조된 소프트웨어(Table of Materials)를 사용하여 요로상피의 두께를 측정합니다.
    1. 소프트웨어를 엽니다.
    2. 로컬 컴퓨터를 클릭하여 염색된 슬라이드 이미지를 선택합니다.
    3. Measure Distance(거리 측정)를 클릭하여 요로상피의 두께를 측정합니다.
    4. 요로상피의 두께에 대한 데이터를 기록하십시오.

결과

이 연구에서 설명한 프로토콜은 쥐에서 안정적인 요도 협착을 성공적으로 확립하고 높은 재현성을 입증했습니다. 평균 작업 시간은 20분이었으며 절차 중에 기술적인 문제가 발생하지 않았습니다. 요도 표본은 시술 후 4주 후에 성공적으로 채취되었습니다.

실험군에서 쥐의 방광은 방광이 비어 있는 대조군과 대조적으로 과팽창 징후를 보였습니다(그림 4). 이러한 관찰은 실험 모델링에 따라 쥐의 배뇨 기능에 상당한 손상이 있음을 나타냅니다.

수술 4주 후, 상처 부위는 요도 표면에서 튀어나온 밀랍 같은 흰색 흉터 조직으로 발전했으며 (그림 5B), 대조군의 요도 부분은 매끄럽고 옅은 붉은색으로 보였습니다 (그림 5A)).

요도 단면의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색을 통한 조직학적 검사에서 상당한 요로상피 비후와 림프구 응집이 확인되었습니다. 또한, Masson 염색은 무질서한 콜라겐 섬유를 동반한 과형성 및 메타형성 요도 상피 조직의 뚜렷한 붉은 영역을 확인했으며(Masson 염색에 대한 자세한 이미지는 보충 그림 S1 참조), 평활근 및 콜라겐 섬유의 구조에 이상이 있음을 나타냅니다(그림 6).

냉동 절편의 면역형광 분석은 수술 후 요도 조직에서 TGF-β이 증가한 것으로 나타났으며(그림 7), 이는 요도 구조의 형성이 TGF-β의 발현 증가와 관련이 있음을 시사합니다.

figure-results-1
그림 1: 미국 모델을 수립하는 데 사용된 주요 도구. (A) 테프론 코팅 카테터(0.6 x 1mm); (B) 흡수성 봉합사(6-0), 조직 집게, 바늘 고정 플라이어 및 부드러운 집게(왼쪽에서 오른쪽으로); (C) 고주파 전기 수술 펜 및 항문 전도성 막대; (D) 고주파 전기 칼의 패널. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 수술 준비. (A) 쥐의 하반부를 면도하고 항문 전도 막대를 연결합니다. (B-D) 요도 내에 요도 카테터가 배치된 것을 설명하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 전기 절제 과정. (A) 음경 피부에 0.8cm의 세로 절개가 생성되었음을 보여줍니다. (B) 요도의 노출; (C) 요도 내의 카테터가 보일 때까지 요도 벽의 모든 층을 통한 전기 절단을 자세히 설명합니다. (디,이) 요도 카테터의 제거와 음경의 재배치를 묘사합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 해부학적 조건에서 쥐의 방광 충전 상태. (A) 대조군에 있는 쥐의 빈 방광을 특징으로 합니다. (B)는 실험군의 쥐에서 과도하게 채워진 방광을 보여줍니다. 방광은 빨간색 파선 윤곽선 내에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 절제된 요도 샘플의 거시적 소견. (A) 정상 요도 조직. (B) 요도 흉터 조직. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 요도 샘플의 조직학 결과. (A) H&E로 염색된 대조군의 요도 조직(원래 배율, 100배). (B) 100x 원래 배율에서 요도 종괴의 Masson의 삼색 염색. (C) 정상 요로상피의 두께가 85.9μm인 확대 및 측정 데이터. 스케일 바 = 20 μm. (D) 원래 배율의 100배에서 실험 그룹의 요도 조직의 H&E 염색을 보여줍니다. (E) 실험군의 요도 조직에 대한 Masson의 삼색 염색을 역시 100배 배율로 묘사합니다. 스케일 바 = 100 μm. (F) 요도 흉터의 확대 및 두꺼워진 요로상피-231.2 μm의 측정 데이터. 눈금 막대 = 20μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 절제된 요도 샘플에 대한 면역조직화학 소견. TGF-β 항체 라벨링은 요로상피 세포를 강조합니다. 녹색 형광은 항체가 세포에 결합할 때 방출됩니다. (에이씨) 실험군의 요로상피 세포에서 더 높은 신호 강도(D-F)에 비해 대조군의 요로상피 세포에서 더 낮은 신호 강도를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: 요도 샘플의 Masson 염색 전체 이미지. (A) 대조군의 Masson 염색; (B) 실험군의 Masson 염색. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

미국은 상당한 경제적 영향을 미치는 상당한 보건의료 부담을 안고 있으며, 이는 심리적, 신체적 웰빙에 부정적인 영향을 미친다20. 미국을 완전히 치료할 뿐만 아니라 재발을 효과적으로 예방할 수 있는 치료법이 여전히 필요합니다.

이 연구에서는 쥐 모델을 활용하여 환자의 요도 손상을 모방하는 간단하고 재현 가능한 방법을 개발했으며, 그 다음에는 경요도 수술로 인한 요도 손상이 뒤따랐습니다. 쥐는 비용 효율적이고, 다루기 쉬우며, 반복성을 제공하고, 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하기 때문에 동물 모델로 선호됩니다. 본 연구에서 사용된 쥐 모델은 다른 모델에 비해 몇 가지 장점이 있습니다: 다양한 오믹스 분석에 일반적으로 사용되며 관리하기 쉽습니다. 또한, 설치류와 인간 사이의 요로 상피 세포의 유전자 발현의 유사성은 쥐 미국 모델을 심층 조사에 특히 적합하게 만듭니다21.

그림 7에서 볼 수 있듯이, TGF-β는 대조군과 실험군 모두에서 요도의 전체 원에서 발현되었으며, 실험군에서 TGF-β의 발현은 대조군보다 현저히 높았습니다. 이전 연구에서는 상주하는 요로상피 세포가 손상 후 근섬유아세포로 표현형 전환을 사실상 겪는다고 기록했으며, 그 과정은 주로 TGF-β에 의해 주도되며, 이는 ECM(세포외 기질) 생산, 면역 조절, 세포 증식, 이동 및 분화를 조절하여 흉터 형성에 상당한 영향을 미칩니다22,23. 본 연구의 결과는 TGF-β의 과발현이 요도 흉터 형성을 촉진할 수 있으며, TGF-β의 분비는 상처 표면의 상주 세포에만 국한되지 않고 요도 전체의 참여를 필요로 한다는 것을 시사한다.

수컷 쥐 요도의 작은 직경과 곡률은 모델링 후 요역동학의 변화를 감지하는 데 어려움을 줍니다. 수컷 쥐의 소변 기능을 평가하는 방법에 대한 연구는 부족합니다. 본 연구에서는 간접 방법을 사용하여 수술 후 4주 동안의 방광 충전 상태를 평가하여 비뇨기 기능의 변화를 관찰했습니다. 배뇨 반사를 자극한 결과, 절개된 쥐의 복부를 관찰한 결과, 실험군은 지속적인 방광 충만감을 보였으며, 이는 모델링 후 배뇨 기능에 상당한 손상이 있음을 나타냅니다. 이러한 결과는 요도 협착증 환자가 경험하는 배뇨 곤란의 임상 증상과 일치한다24. 그러나 수컷 쥐의 배뇨 빈도, 평균 배뇨량, 배뇨 효율과 같은 소변 매개변수에 대한 생리학적 연구를 수행하는 방법을 개발하는 것은 여전히 과제로 남아 있습니다.

고주파 전기 칼의 모드 및 전원 설정 선택은 수술 절차에서 부상 정도에 큰 영향을 미칩니다. 본 연구는 쥐를 대상으로 미국 모델을 개발하기 위해 적절한 수준의 부상을 보장하는 수술 기법과 4W의 고주파 전기칼의 적절한 정도를 소개한다. 미국 쥐 모델에서 가장 일반적인 방법은 바늘이나 메스로 절개하는 것입니다25. 그러나 메스를 사용하면 표면이 매끄럽고 쥐 요도의 직경이 작기 때문에 의도치 않게 주변 혈관을 손상시킬 수 있기 때문에 지속적인 출혈의 가능성이 높아지는 경향이 있습니다.

고주파 나이프는 조직에 안정적이고 조정 가능한 전류를 적용하여 동시 지혈을 제공하여 절차의 안정성과 편의성을 향상시킴으로써 상당한 이점을 제공합니다. 또한 전력 설정의 제어 가능성으로 인해 가해진 피해를 정량화할 수 있습니다.

이상적인 실험 프로토콜은 균일한 크기와 깊이의 요도 상처를 일관되게 생성하는 것입니다. 본 연구에서는 요도 손상을 유도하기 위해 단극 혼합 절단 모드를 선택하였다. 주로 액체 성분의 휘발, 건조, 조직의 응고, 조직 파열 없이 혈관 밀봉을 유발하는 전기 응고 모드와 달리 절단 모드는 음경 조직을 층별로 정밀하게 절개할 수 있습니다. 전기응고법은 미국 토끼 모델에서 일반적으로 사용되어 왔으며 라듐에서 음경을 분리하고 다른 수술 기구로 절개하는 것과 같은 추가 단계가 필요하지만(26), 단극 혼합 절단 모드는 포피를 직접 절개하여 요도를 노출시킬 수 있습니다. 이 방법은 운영 효율성을 높이고 실험 동물에 대한 외상을 최소화합니다.

이전 연구의 출력 설정은 일반적으로 실험 동물의 무게와 전자 칼과 조직 사이의 접촉 면적에 따라 달라지기 때문에 자세히 지정되지 않았습니다. 이 연구에서 실험 대상은 체중이 400g에서 500g 사이인 6개월 된 SD 쥐였습니다. 이러한 조건의 경우 최적의 전력 설정은 절개 부위의 크기와 깊이를 정밀하게 제어할 수 있는 4-7W 사이로 결정되었습니다. 작업자는 US rat 모델을 개발하기 위해 고주파 나이프를 처음 사용할 때 더 낮은 전력 설정으로 시작하여 필요에 따라 조정하여 다양한 조건에 가장 적합한 값을 찾는 것이 좋습니다.

또한, 한 가지 중요한 단계는 수술 전에 쥐의 요도를 카테터로 삽입하는 것입니다. 카테터가 방광에 올바르게 삽입되면 성공적인 카테터 삽입이 확인됩니다. 카테터는 임시 골격 역할을 하지만 요도의 위치를 유지하고 수술 부위를 식별하는 데 도움이 되어야 합니다. 수컷 쥐의 요도는 직경이 상대적으로 작고 포피와 음경 조직 사이의 공간이 제한되어 있어 실수로 카테터를 잘못된 구멍에 삽입하기 쉬워 후속 절차가 복잡해질 수 있습니다. 소변이 흘러나올 때 카테터의 올바른 위치가 확인되어 방광 내에 안전하게 있음을 나타냅니다. 또한 카테터가 삽입된 음경은 요도 내 안정성을 높이고 수술 절차를 용이하게 하기 위해 45° 각도로 위치해야 합니다.

결론적으로, 이 연구는 쥐에서 미국 모델을 만드는 새롭고 매우 효과적이며 비용 효율적인 방법을 보여줍니다. 이 방법은 단순성, 높은 성공률 및 안정성이 특징이며, 요도 협착에 대한 광범위한 혁신적인 치료법을 조사하는 데 유용한 도구를 제공합니다.

공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 광둥성 자연과학재단(No.2019A1515012116 및 No.2022A1515012559)의 보조금으로 지원되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
흡수성 봉합사 (6-0)KERONG COMPANYKR2230814
동물 수술 패드제공 Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical ImagingNA
CaseViewer 2.43DHISTECH Ltd.
CarprofenSigma-AldrichMFCD00079028
CoraLite488-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)ProteintechSA00013-2
H& E 스테인 키트Abcamab150669
  고주파 전기 수술 장치Beijing Taktvoll Technology CompanyES-100v
Masson 염색 키트MerckHT15
바늘 고정 플라이어RWD Life ScienceS15001-11
파라핀 오일NA부드러운
집게RWD Life ScienceF13019-12
펜토바르비탈나트륨광둥성 생물의학 이미징 핵심 연구소NA
Sprague– Dawley ratGuangdong Medical Laboratory Animal CenterGDMLAC-035
봉합사 가위RWD Life ScienceS15001-11
테프론 코팅 카테터 (0.6 mm x 1 mm)DGZF 신소재 회사NA
TGF Beta 1 Polyclonal 항체Proteintech21898-1-AP
조직 가위RWD Life ScienceS13029-14

참고문헌

  1. Rourke, K. F., et al. Canadian Urological Association guideline on male urethral stricture. Cuaj-Can Urol Assoc. 14 (10), 305-316 (2020).
  2. Cotter, K. J., et al. Prevalence of post-micturition incontinence before and after anterior urethroplasty. J Urol. 200 (4), 843-847 (2018).
  3. Bertrand, L. A., et al. Lower urinary tract pain and anterior urethral stricture disease: Prevalence and effects of urethral reconstruction. J Urol. 193 (1), 184-189 (2015).
  4. Mondal, S., Bandyopadhyay, A., Mandal, M. M., Pal, D. K. Erectile dysfunction in anterior urethral strictures after urethroplasty with reference to vascular parameters. Med J Armed Forces India. 72 (4), 344-349 (2016).
  5. Campos-Juanatey, F., et al. European association of urology guidelines on urethral stricture disease (part 2): Diagnosis, perioperative management, and follow-up in males. Eur Urol. 80 (2), 201-212 (2021).
  6. Hoy, N. Y., Chapman, D. W., Dean, N., Rourke, K. F. Incidence and predictors of complications due to urethral stricture in patients awaiting urethroplasty. J Urol. 199 (3), 754-759 (2018).
  7. Anger, J. T., Buckley, J. C., Santucci, R. A., Elliott, S. P., Saigal, C. S. Trends in stricture management among male medicare beneficiaries: Underuse of urethroplasty. Urology. 77 (2), 481-485 (2011).
  8. Milenkovic, U., Albersen, M., Castiglione, F. The mechanisms and potential of stem cell therapy for penile fibrosis. Nat Rev Urol. 16 (2), 79-97 (2018).
  9. European Association of Urology. EAU guidelines on urethral-strictures. , Available from: https://uroweb.org/guidelines/urethral-strictures (2023).
  10. Faydacı, G., et al. Comparison of two experimental models for urethral stricture in the anterior urethra of the male rabbit. Urology. 80 (1), 225.e7-225.e11 (2012).
  11. Yang, M., et al. Urine-microenvironment-initiated composite hydrogel patch reconfiguration propels scarless memory repair and reinvigoration of the urethra. Adv Mater. 34 (14), 210952(2022).
  12. Orabi, H., Aboushwareb, T., Zhang, Y., Yoo, J. J., Atala, A. Cell-seeded tubularized scaffolds for reconstruction of long urethral defects: A preclinical study. Eur Urol. 63 (3), 531-538 (2013).
  13. Sievert, K. -D., et al. Introducing a large animal model to create urethral stricture similar to human stricture disease: A comparative experimental microscopic study. J Urol. 187 (3), 1101-1109 (2012).
  14. Sievert, K. -D., et al. Urethroplasty performed with an autologous urothelium-vegetated collagen fleece to treat urethral stricture in the minipig model. World J Urol. 38 (9), 2123-2131 (2019).
  15. Hu, W. -F., Li, C. -L., Zhang, H. -P., Li, T. -T., Zeng, X. -Y. An experimental model of urethral stricture in rabbits using holmium laser under urethroscopic direct visualization. Urol Int. 93 (1), 108-112 (2014).
  16. Hua, X., et al. An experimental model of anterior urethral stricture in rabbits with local injections of bleomycin. Urology. 116, 230.e9-230.e15 (2018).
  17. Strittmatter, F., et al. Expression of fatty acid amide hydrolase (faah) in human, mouse, and rat urinary bladder and effects of faah inhibition on bladder function in awake rats. Eur Urol. 61 (1), 98-106 (2012).
  18. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  19. Castiglione, F., et al. Adipose-derived stem cells counteract urethral stricture formation in rats. Eur Urol. 70 (6), 1032-1041 (2016).
  20. Cheng, X., et al. The changing trend in clinical characteristics and outcomes of male patients with urethral stricture over the past 10 years in China. Front Public Health. 9 (794451), 1-8 (2021).
  21. Yu, Z., et al. Single-cell transcriptomic map of the human and mouse bladders. J Am Soc Nephrol. 30 (11), 2159-2176 (2019).
  22. Lichtman, M. K., Otero-Vinas, M., Falanga, V. Transforming growth factor beta (tgf-β) isoforms in wound healing and fibrosis. Wound Repair Regen. 24 (2), 215-222 (2016).
  23. Tatler, A. L., Jenkins, G. Tgf-β activation and lung fibrosis. Proc Am Thorac Soc. 9 (3), 130-136 (2012).
  24. Palminteri, E., et al. Contemporary urethral stricture characteristics in the developed world. Urology. 81 (1), 191-197 (2013).
  25. Hedlund, P., Streng, T., Lee, T., Andersson, K. -E. Effects of tolterodine on afferent neurotransmission in normal and resiniferatoxin treated conscious rats. J Urol. 178 (1), 326-331 (2007).
  26. Yao, H. -J., et al. Three new experimental models of anterior urethral stricture in rabbits. Transl Androl Urol. 11 (6), 761-772 (2022).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

동영상 곧 제공

관련 논문