Stem Cell Delivery를 이용한 척수 손상 조합치료제 개발

요약

이 연구에서는 척수 손상 복구를 위해 지방 유래 줄기 세포의 재생 촉진 거동을 조사하고 활용하는 데 사용할 수 있는 신경 모방 복합 하이드로겔을 개발하고 특성화했습니다.

초록

외상성 척수 손상(SCI)은 손상 부위 아래에 영구적인 감각 운동 결핍을 유발합니다. 미국에서 약 25만 명의 사람들에게 영향을 미치고 있으며, 이는 측정할 수 없는 공중 보건 문제를 나타냅니다. 효과적인 치료를 제공하기 위한 연구가 수행되었습니다. 그러나 SCI는 부상 부위의 복잡한 특성으로 인해 여전히 치료가 불가능한 것으로 간주됩니다. 약물 전달, 세포 이식 및 주사 가능한 생체 재료를 포함한 다양한 전략이 조사되지만 한 가지 전략만으로는 재생 효능이 제한됩니다. 이와 같이, 최근 병용 요법은 부상의 다면적인 특징을 표적으로 삼을 수 있는 치료법으로 주목을 받고 있습니다. 세포외 기질(ECM)이 SCI에 대한 세포 이식의 효능을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났습니다. 이를 위해 탈세포화된 척수(dSC)와 좌골신경(dSN)으로 구성된 3D 하이드로겔을 서로 다른 비율로 개발하고 특성화했습니다. dSC 및 dSN의 조직학적 분석은 세포 및 핵 구성 요소의 제거를 확인했으며, 탈세포화 후에도 고유 조직 구조가 유지되었습니다. 그 후, 복합 하이드로겔을 다양한 부피 비율로 만들고 탁도 겔화 역학, 기계적 특성 및 내장된 인간 지방 유래 줄기 세포(hASC) 생존율을 분석했습니다. 하이드로겔(hydrogel)과 탈세포화된 척수 매트릭스(decellularized spinal cord matrices)의 서로 다른 비율 사이에서 기계적 특성의 유의미한 차이는 발견되지 않았습니다. 겔에 내장된 인간 ASC는 14일 배양 기간 동안 생존 가능한 상태를 유지했습니다. 이 연구는 신경 특이적 ECM 및 재생 전 중간엽 줄기 세포를 나타내는 조직 공학 조합 하이드로겔을 생성하는 수단을 제공합니다. 이 플랫폼은 향후 연구를 통해 SCI 이후 신경 재생 전략에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서론

약 296,000명의 사람들이 외상성 SCI로 고통받고 있으며, 매년 미국에서 약 18,000명의 새로운 SCI 사례가 발생하고 ^{있습니다1.} 외상성 SCI는 일반적으로 낙상, 총상, 자동차 사고 및 스포츠 활동으로 인해 발생하며 종종 부상 부위 아래의 감각 운동 기능의 영구적인 상실을 유발합니다. SCI 치료를 위한 평생 예상 비용은 개인당 100만 달러에서 500만 달러 사이이며 기대 수명은 현저히 낮다¹. 그러나 SCI는 여전히 잘 이해되지 않고 있으며 주로 부상 후 복잡한 병태생리학적 결과로 인해 대부분 치료가 불가능합니다². 세포 이식 및 생체 재료 기반 골격을 포함한 다양한 전략이 조사되었습니다. 세포와 생체 물질의 이식이 잠재력을 입증했지만, SCI의 다면적 특성으로 인해 조합 접근법이 더 유익할 수 있음을 시사합니다³. 그 결과, 많은 조합 전략이 조사되어 개별 구성 요소보다 더 나은 치료 효능이 입증되었습니다. 그러나 세포와 약물 전달을 위한 새로운 생체 물질을 제공하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다³.

천연 하이드로겔을 제조하는 한 가지 유망한 접근 방식은 조직 탈세포화(tissue decellularization)입니다. 탈세포화 과정은 이온, 비이온, 물리적 및 조합 방법을 사용하여 ECM 구성 요소를 보존하면서 모든 또는 대부분의 세포 및 핵 물질을 제거합니다. ECM 유래 하이드로겔은 세포 성분의 전부 또는 대부분을 제거함으로써 주입/주입 후 숙주에 대한 면역 반응이 적습니다⁴. 탈세포화된 조직의 품질을 평가하기 위해 측정해야 할 몇 가지 매개변수가 있습니다: 세포/핵 내용물 제거, 기계적 특성 및 ECM 보존. 부작용 면역 반응을 피하기 위해 다음과 같은 기준이 확립되었습니다: 1) mg ECM 건조 중량당 50ng 이중 가닥 DNA(dsDNA) 미만, 2) DNA 단편 길이 200bp 미만, 3) 4'6-디아미디노-2-페누일인돌(DAPI)⁵로 염색된 핵 물질이 거의 또는 전혀 보이지 않습니다. 기계적 특성은 인장, 압축 및/또는 유변학 테스트를 통해 정량화할 수 있으며 원래 조직과 유사해야 합니다⁶. 또한, 단백질 보존은 척수에 대한 라미닌, 글리코사미노글리칸(GAG) 및 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(CSPG)과 같은 탈세포화된 조직의 주요 구성 요소에 초점을 맞춘 단백질체학 또는 정량적 분석으로 평가할 수 있습니다 ^7,8. 검증된 ECM 유래 하이드로겔은 세포 기반 치료를 돕기 위해 다양한 유형의 세포로 재세포화할 수 있습니다⁹.

SCI 복구를 위해 슈반세포(Schwann cell), 후각 외피 세포(olfactory ensheathing cell), 골수 유래 중간엽 줄기세포(MSC) 및 신경 줄기세포/전구 세포(neuro stem/progenitor cell)와 같은 다양한 세포 유형이 연구되었습니다 10,11,12. 그러나 이러한 세포의 임상적 사용은 윤리적 우려, 인접 세포/조직과의 희박한 통합, 높은 수율을 위한 조직 공급원의 부족, 자가 재생 불능 및/또는 제한된 증식 능력으로 인해 제한적입니다 13,14,15. 이러한 세포 유형과 달리, 인간 지방 유래 MSC(hASC)는 리포흡인을 사용하여 최소 침습적 방식으로 쉽게 분리할 수 있고 많은 수의 세포를 얻을 수 있기 때문에 매력적인 후보입니다¹⁶. 또한, hASC는 신경 보호, 혈관 신생, 상처 치유, 조직 재생 및 면역 억제 가능성이 있는 성장 인자와 사이토카인을 분비할 수 있는 능력을 가지고 있습니다 17,18,19,20,21.

앞서 언급한 바와 같이, 여러 연구가 수행되었고 22,23,24 많은 연구가 이루어졌으며 이를 통해 많은 것을 배웠지만, SCI의 이질적인 특성으로 인해 기능 회복을 촉진하는 효과가 제한되었습니다. 따라서 SCI의 치료 효능을 높이기 위해 조합 접근법이 제안되었습니다. 본 연구에서는 탈세포화된 척수와 좌골신경을 결합하여 3차원(3D) hASC 배양을 위한 복합 하이드로겔을 개발하였다. 조직학적 분석과 DNA 분석을 통해 성공적인 탈세포화가 확인되었으며, 겔화 역학 및 압박 시험을 통해 신경 복합 하이드로겔의 다양한 비율을 특성화했습니다. 신경 복합 하이드로겔에서 hASC의 생존 가능성은 이 하이드로겔이 3D 세포 배양 플랫폼으로 활용될 수 있음을 입증하기 위해 조사되었습니다.

프로토콜

돼지 조직은 상업적으로 입수된 것이었기 때문에 동물 윤리 위원회의 승인이 필요하지 않았다.

1. 돼지 척수의 탈세포화(예상 시간: 5일)

참고: 수정^25,26과 함께 이전에 설정된 프로토콜을 사용하여 탈세포화를 수행합니다. 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 실온의 멸균 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 모든 용액은 병 상단 필터(0.2μm 공극 크기)를 사용하여 오토클레이브 병에 멸균 여과해야 합니다. 37°C에서 수행하는 절차는 인큐베이터 또는 37°C로 설정된 깨끗한 오븐 내에서 수행할 수 있습니다.

1. 탈세포화 용액의 준비
   참고: 모든 용액은 1L로 계산되며, 사용자는 실험 요구 사항에 따라 최종 요구 부피를 조정해야 할 수 있습니다.
   1. 0.05% 트립신/에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 500mL를 인산염 완충 식염수(PBS) 500mL로 희석하여 0.025% 트립신/EDTA를 만듭니다.
   2. 10% 트리톤 X-100 300mL를 PBS 700mL로 희석하여 3% 트리톤 X-100을 만듭니다. 0.56g의 NaCl, 1.31g의 NaH₂PO₄H₂O 및 10.85g의 HNa₂O₄P · 7H₂O를 1 L의 탈 이온수에 혼합하여 100 mM Na / 50 mM phos 완충액을 만듭니다.
   3. 32.4g의 자당을 탈이온수 1L에 섞어 1M 자당을 만듭니다. 탈이온수 40L에 데옥시콜산나트륨(SD) 1g을 섞어 4% SD 용액을 만듭니다. 15% 과초산 6.7mL를 4% 에탄올 993.3mL로 희석합니다.
2. 돼지 척수의 준비
   참고: 척수는 용액 없이 냉동 상태로 배송되었으며 사용할 때까지 -80°C로 유지되었습니다.
   1. 탈세포화하기 전에 냉장고에서 4-24시간 동안 척수를 4°C에서 18-24시간 동안 해동합니다. 멸균 가위를 사용하여 경막을 조심스럽게 제거하십시오.
   2. 척수를 작은 조각(약 1cm 길이)으로 자릅니다. 15mL 튜브에 한 조각을 넣거나 50mL 튜브에 최대 세 조각을 넣습니다.
3. 척수의 탈세포화(Decellularization of spinal cord)
   알림: 각 단계가 끝나면 탈세포화 용액을 큰 비커에 수동으로 부어 폐기합니다. 소형 오토클레이브 가능한 스테인리스강 스트레이너를 사용하여 각 단계에 필요한 조직을 잃지 않고 탈세포화 용액을 폐기할 수 있습니다. 척수는 달리 명시되지 않는 한 83rpm으로 교반되었습니다.
   1. 척수를 탈이온수로 18-24시간 동안 4°C 및 60rpm으로 헹굽니다.
   2. 0.025°C 및 37rpm에서 1시간 동안 30% 트립신/EDTA로 척수를 헹굽니다. 그런 다음 PBS로 척수를 15분, 2회 헹굽니다.
   3. 3% Triton X-100으로 척수를 2시간 동안 헹굽니다. 100mM Na/50mM phos 버퍼로 척수를 15분, 2회 헹굽니다.
   4. 척수를 1M 자당으로 1시간 동안 헹굽니다. 그런 다음 탈이온수로 척수를 1시간 동안 헹굽니다.
   5. 4% SD로 척수를 2시간 동안 헹굽니다. 그런 다음 100mM Na/50mM phos 버퍼로 척수를 15분, 2회 헹굽니다.
   6. 4% 에탄올에 0.1% 과아세트산을 넣고 척수를 4시간 동안 헹굽니다. 그런 다음 PBS로 척수를 1시간 동안 헹굽니다.
   7. 척수를 탈이온수로 1시간, 2회 헹굽니다. 그런 다음 PBS로 척수를 1시간 동안 헹굽니다.
   8. 척수를 0.01mbar 및 -56°C에서 3일 동안 동결건조하고 사용할 때까지 건조하게 보관합니다.

2. 돼지 좌골 신경의 탈세포화(예상 시간: 5일)

참고: 이전에 설정된 프로토콜²⁷을 사용하여 탈세포화를 수행합니다. 모든 절차는 달리 명시되지 않는 한 실온의 멸균 생물 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 모든 용액은 병 상단 필터(0.2μm 공극 크기)를 사용하여 오토클레이브 병에 멸균 여과해야 합니다. 37°C에서 수행하는 절차는 인큐베이터 또는 37°C로 설정된 깨끗한 오븐 내에서 수행할 수 있습니다.

1. 탈세포화 용액의 준비
   참고: 모든 용액은 1L로 계산되며, 사용자는 실험 요구 사항에 따라 최종 요구 부피를 조정해야 할 수 있습니다.
   1. 1L의 탈이온수에 NaCl 1.86g, d NaH₂PO₄H₂O 0.262g 및_{HNa 2}O₄P · 7H₂O 2 O 2.17g을 혼합하여 50 mM Na / 10 mM phos 완충액을 준비합니다.
   2. 50mM Na/10mM phos 완충액 1L에 38.4g의 SB-10을 혼합하여 125mM 설포베타인-10(SB-10) 용액을 준비합니다.
   3. 50mM Na/10mM phos 완충액 1L에 SD 30g과 SB-16 0.24g을 혼합하여 3% SD/0.6mM 설포베타인-16(SB-16) 용액을 준비합니다.
2. 돼지 좌골 신경의 준비
   참고: 좌골 신경은 PBS와 함께 냉동 상태로 배송되었으며 사용할 때까지 -80°C로 유지되었습니다.
   1. 탈세포화 18-24시간 전에 좌골 신경을 4°C의 냉장고에서 해동합니다.
   2. 좌골 신경을 작은 조각(약 1cm 길이)으로 자릅니다. 15mL 튜브에 한 조각을 넣거나 50mL 튜브에 최대 세 조각을 넣습니다.
3. 좌골 신경의 탈세포화(Decellularization of the sciatic nerve)
   참고: 각 단계가 끝나면 탈세포화 용액을 큰 비커에 수동으로 부어 폐기하고, 작은 오토클레이브 가능한 스테인리스강 스트레이너를 사용하여 각 단계에 필요한 조직을 잃지 않고 탈세포화 용액을 폐기할 수 있습니다. 좌골 신경은 달리 명시되지 않는 한 15rpm에서 교반되었습니다.
   1. 탈이온수로 좌골 신경을 7시간 동안 헹굽니다. 그런 다음 125mM Na/10mM phos 완충액에 50mM sulfobetaine-10(SB-10)으로 좌골 신경을 18시간 동안 헹굽니다.
   2. 100mM Na/50mM phos buffer로 좌골 신경을 15분 동안 헹굽니다. 그런 다음 50mM Na/10mM phos 완충액에 3% SD/0.6mM 설포베타인-16(SB-16)으로 좌골 신경을 2시간 동안 헹굽니다.
   3. 100mM Na/50mM phos buffer로 좌골 신경을 15분, 3회 헹굽니다. 그런 다음 50mM Na/10mM phos buffer에서 125mM SB-10으로 좌골 신경을 7시간 동안 헹굽니다.
   4. 100mM Na/50mM phos buffer로 좌골 신경을 15분 동안 헹굽니다. 그런 다음 1.5시간 동안 50mM Na/10mM phos buffer에서 3% SD/0.6mM SB-16으로 좌골 신경을 헹굽니다.
   5. 좌골 신경을 50mM Na/10mM phos 버퍼로 15분, 3회 헹굽니다. 그런 다음 75U/mL의 데옥시리보뉴클레아제(DNase)로 흔들림 없이 3시간 동안 좌골 신경을 헹굽니다.
   6. 좌골 신경을 50mM Na/10mM phos buffer로 1시간, 3회 헹굽니다. 그런 다음 37°C에서 교반 없이 16시간 동안 0.2U/mL의 콘드로이티나제 ABC로 좌골 신경을 헹굽니다.
   7. PBS로 좌골 신경을 3시간, 3회 헹굽니다. 좌골 신경을 0.01mbar 및 -56°C에서 3일 동안 동결건조하고 사용할 때까지 건조하게 보관합니다.

3. 탈세포화된 조직의 분해 및 복합 하이드로겔 제조(예상 시간: 4일)

1. 가위나 균질기를 사용하여 탈세포화된 조직을 자르거나 갈아서 가루로 만듭니다. 도구를 살균하여 121°C에서 45분 동안 오토클레이브를 사용하여 조직을 자르거나 갈아냅니다. 에틸렌 옥사이드 방법도 적용 가능합니다.
2. 15mg/mL 농도의 1mg/mL 펩신을 함유한 0.01N 염산(HCl) 용액에서 조직을 별도로 분해합니다. 탈세포화된 척수와 좌골 신경의 추정 체중은 개당 각각 50-100 mg 및 100-150 mg입니다.
3. 마그네틱 바를 놓고 500rpm 및 4°C에서 최소 4일 동안 저어주어 프리겔 용액을 생성합니다.
4. 좌골 신경과 척수 프리겔을 2:1, 1:1, 1:2의 부피 비율로 혼합합니다. 1N 수산화나트륨(NaOH) 및 HCl을 사용하여 pH 7.4를 조정하고 M199 매체와 1x PBS를 사용하여 원하는 농도로 희석합니다. 37 °C에서 30 분 동안 배양합니다.
   참고: 한 번에 NaOH 1μL를 첨가합니다. M199 매체는 pH가 7.4일 때 연한 분홍색으로 변하기 때문에 pH 지시약으로 사용할 수 있지만 pH 수준을 확인하려면 pH 스트립을 사용해야 합니다.

4. 탈세포화(decellularization) 검증

1. 헤마톡실린 및 에오신 염색(H&E; 예상 시간: 8일)
   알림: 각 헹굼 단계 후에 용액을 큰 비커에 수동으로 부어 폐기합니다.
   1. 신선하고 탈세포화된 척수와 좌골 신경을 3.7% 포름알데히드에서 4°C에서 18시간 동안 고정합니다. 15mL 튜브에 한 조각을 넣습니다.
   2. 포름 알데히드를 제거하고 조직을 10 % 자당에 1 일 동안 놓습니다. 10% 자당을 제거하고 조직을 30% 자당에 6일 동안 놓습니다.
   3. 적절한 크기의 크라이오몰드를 최적 절단 온도(OCT)로 절반 정도 채웁니다. 탈세포화된 조직을 놓고 OCT로 덮은 다음 1일 동안 OCT를 흡수하도록 합니다.
   4. 1일 후 -80°C에서 밤새 조직을 동결합니다. 저온 유지 장치를 사용하여 10μm 두께의 조직을 동결 절편합니다.
   5. 1x PBS로 5분, 2회 헹굽니다. 그런 다음 수돗물로 5분 동안 헹굽니다.
   6. 헤마톡실린 용액으로 1분 동안 염색합니다. 수돗물로 1분, 3회 헹굽니다.
   7. 에오신 용액으로 1분 동안 염색합니다. 95% 에탄올로 1분, 2회, 100% 에탄올로 1분, 3회 헹굽니다.
   8. 자일렌으로 1분, 2분, 1분 동안 헹굽니다. 슬라이드를 5분 동안 말리십시오.
   9. 면봉을 사용하여 디부틸프탈레이트 폴리스티렌 크실렌(DPX) 마운트 용액 3-4방울을 슬라이드에 떨어뜨립니다. DPX로 덮인 슬라이드 위에 커버슬립을 놓습니다. 슬라이드를 밤새 말리십시오.
2. DNA 분석 (예상 시간: 1시간)
   1. 탈세포화된 조직과 동결건조된 조직의 무게를 측정합니다. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 키트를 사용하여 DNA를 분리하고 정량화합니다.

5. 복합 하이드로겔의 특성화

1. 겔화 탁도 시험(예상 시간: 1시간)
   1. 얼음 위의 96웰 플레이트의 각 웰에 100μL의 프리겔 용액을 놓습니다. 플레이트 리더를 사용하여 45분 동안 2분마다 405nm에서 흡광도를 판독합니다.
   2. 다음 방정식을 사용하여 정규화된 흡광도를 계산합니다.
      (흡광도 - 흡광도_초기) / (흡광도_최대 - 흡광도_초기)
   3. 곡선의 기울기와 50% 및 95% 겔화(t_1/2 및 t₉₅)를 달성하는 데 걸리는 시간을 계산합니다.
2. 압축 시험(예상 시간: 하이드로겔당 1분)
   1. 직경 8mm, 높이 2mm의 12mg/mL 농도로 복합 하이드로겔을 제작합니다.
   2. 레오미터를 사용하여 스테인리스강 평행판 사이에 250N의 하중을 가하여 시료 높이/분의 10%의 변형률로 시료를 압축합니다. 레오미터 판독값을 제공하는 소프트웨어는 하이드로겔이 파손될 때까지 힘을 가하고 변형률을 측정하여 응력-변형률 곡선을 제공합니다.
   3. 응력-변형률 곡선의 선형 영역의 기울기에서 Young의 계수를 계산합니다.

6. 신경 복합 하이드로겔에서 인간 ASC의 3차원 배양

1. 3차원(3D) 플랫폼 준비(예상 시간: 3시간)
   1. SU-8 포토레지스트가 있는 실리콘 웨이퍼를 에칭하여 깊이 200μm, 직경 4mm의 원형 패턴을 생성합니다.
   2. 폴리디메틸실록산(PDMS) 염기와 경화제를 10:1의 비율로 혼합합니다. 혼합물을 실리콘 웨이퍼에 붓고 20분 동안 그대로 두어 PDMS 베이스와 경화제를 혼합할 때 발생하는 모든 기포를 제거합니다.
   3. 오븐에 넣고 70 ° C에서 2 시간 동안 경화시킵니다. 경화된 PDMS 시트를 탈형하고 8mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 펀칭하여 PDMS 마이크로웰을 만듭니다.
   4. 96웰 플레이트에 마이크로웰을 배치하고 웰 플레이트를 공기 플라즈마 클리너에 넣어 PDMS 마이크로웰을 멸균합니다.
   5. 1% 폴리에틸렌이민(PEI) 및 0.1% 글루타르알데히드(GA)를 각각 10분 및 20분 동안 사용하여 PDMS 마이크로웰을 기능화합니다. 마이크로웰을 증류수로 2x 세척합니다.
2. hASC 준비(예상 시간: 7일)
   1. hASC 성장 배지(hASCs 소 태아 혈청(FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신(Pen-strep)이 보충된 기저 배지)에서 합류할 때까지 2-5개의 계대 배양 세포. Passage and calculate the number of cells by using hemacytometer or cell counter(혈구계) 또는 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
3. ASC 함유 신경 복합 하이드로겔(예상 시간: 2시간)
   1. 좌골 신경과 척수 프리겔을 2:1, 1:1, 1:2의 부피 비율로 혼합하고, 좌골 신경 프리겔을 혼합하지 않고 척수 전용 하이드로겔을 준비합니다.
   2. M199 배지를 추가하고 1N, NaOH 및 HCl을 사용하여 pH 7.4를 조정합니다.1 x 10⁶ cells/mL의 밀도로 프리겔의 성장 배지와 함께 hASC를 재현탁합니다.
      참고: M199 및 세포 현탁액의 양은 프리겔의 10%여야 합니다.
   3. 1x PBS를 사용하여 프리겔을 12mg/mL로 희석합니다. 프리겔을 마이크로웰에 놓고 30분 동안 배양합니다. hASC 성장 배지에서 ASC 함유 하이드로겔 배양.
4. 세포 생존율 검사(예상 시간: 하루 4시간)
   1. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 시약을 사용하여 생존력 테스트 용액을 준비합니다.
   2. 1일, 4일, 7일, 14일에 미디어를 흡인합니다. 웰에 시약을 추가하고 제조업체의 지침에 따라 37°C에서 3시간 동안 배양합니다.
   3. 플레이트 리더를 사용하여 560/590 nm의 여기/방출에서 형광을 판독합니다. 다음 방정식을 사용하여 백분율 차이를 계산합니다.
      [(형광_샘플-형광_블랭크)/형광_블랭크] × 100

결과

탈세포화된 조직은 약간의 변형을 가하여 이전에 확립된 프로토콜을 사용하여 제조하였다 ^26,27. 탈세포화, 동결건조 및 소화 후 SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 비율의 신경 복합 하이드로겔과 척수 전용 하이드로겔을 제조했습니다(그림 1). 핵 성분의 제거는 H&E 염색에 의해 확인되었습니다(그림 2A). 탈세포화를 정량적으로 평가하기 위해 ECM 내에서 잔류 DNA를 측정했습니다. 신선한 경막의 dsDNA 함량은 132.6 ± 21.3 ng dsDNA/mg 건조 조직인 반면, 신선 및 탈세포화된 척수 실질은 각각 22.6 ± 8.3 ng dsDNA/mg 건조 조직과 23.74 ± 6.69 ng dsDNA/mg 건조 조직을 함유하고 있습니다(그림 2B). 그것은 경막이 탈세포화(decellularization) 전에 제거되어야 한다는 것을 나타냈다. 신선 및 탈세포화된 좌골 신경의 dsDNA 양은 각각 222.5 ± 42.65 및 0.63 ng dsDNA/mg 건조 조직이었습니다(그림 2C).

신경 복합 하이드로겔의 겔화 동역학을 평가하여 겔화 속도(S)와 최종 탁도(t_1/2 및 t₉₅)의 50% 및 95%에 도달하는 시간을 측정했습니다. 겔화 역학은 모든 하이드로겔 그룹에 대해 시그모이드 모양을 보여주었습니다(그림 3A). 모든 하이드로겔 그룹에서 겔화 속도(S)는 서로 크게 다르지 않았습니다. 최종 탁도의 절반인 t_1/2에 도달하는 데 필요한 시간은 SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 및 척수 전용 하이드로겔의 경우 각각 11.32± 0.57분, 13.33± 0.6분, 15.7± 0.92분, 17.23± 1.13분이었습니다. 최종 탁도의 95%인 t₉₅에 도달하는 데 필요한 시간은 SN:SC= 2:1, 1:1, 1:2 및 척수 전용 하이드로겔의 경우 각각 13.8± 0.83분, 15.53± 0.83분, 18.38± 0.79분, 19.62± 1.27이었다. 이러한 결과는 좌골 신경 함량이 더 높은 하이드로겔이 정상 상태에 더 빨리 도달하고 좌골 신경 ECM이 하이드로겔 조립을 촉진할 수 있음을 나타냅니다. 압박 시험 결과는 척수 함량이 더 많은 하이드로겔이 강성을 증가시키는 경향을 보여주었습니다. 그럼에도 불구하고, 복합 하이드로겔의 모든 상이한 비율에서 유의하게 다르지 않았습니다(그림 3B).

마지막으로, 모든 하이드로겔 그룹에서 hASC의 세포 생존력을 결정하기 위해 그림 4와 같이 미세 가공 PDMS 마이크로웰을 사용하여 3D 배양을 설정했습니다. 14일 배양 기간 동안 ASC 생존력은 상업적으로 이용 가능한 세포 배양 배지 기반 비색 및 형광 대사 분석을 사용하여 측정되었으며, 판독값과의 백분율 차이는 1일차, 4일차, 7일차 및 14일차의 4가지 시점에서 계산되었습니다(그림 5). 백분율 차이의 값은 시점이 증가함에 따라 증가했으며, 척수만 있는 하이드로겔의 값은 1일, 4일, 14일에 나머지 그룹보다 낮았습니다. 종합하면, 이러한 데이터는 세포 증식 및 세포 대사 활성의 증가로 인해 배양 기간에 따라 hASC 생존율이 증가했음을 시사합니다.

그림 1: 신경 복합 하이드로겔의 제조. 돼지 척수와 좌골 신경을 탈세포화, 동결건조, 소화하여 프리겔 용액을 얻었습니다. 좌골 신경과 척수 프리겔 용액을 2:1, 1:1, 1:2의 비율로 혼합하고, 척수만 있는 프리겔도 제조하였다. 모든 프리겔 용액을 37°C에서 배양하여 신경 복합 하이드로겔을 생성했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 탈세포화(decellularization) 검증. (A) 신선하고 탈세포화된 돼지 척수 및 좌골 신경의 H&E 염색. 화살표는 조직에 세포가 있음을 나타냅니다. 스케일 바 = 광시야 이미지의 경우 1mm, 확대 이미지의 경우 500μm(200μm는 탈세포화된 좌골 신경 이미지 확대의 경우에만 해당). (B) 신선한 경막, 실질 및 탈세포화된 척수의 DNA 분석(각각 n=10, 16, 6). (C) 신선 및 탈세포화된 좌골 신경의 DNA 분석(각각 n=8 및 3). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 통계 분석은 (B)에 대한 Tukey의 사후 검정과 (C)에 대한 t-검정을 사용하는 일원 분산 분석을 통해 수행되었습니다. 약어: ns = 중요하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 신경 복합 하이드로겔의 특성. (A) 신경 복합 하이드로겔의 정규화된 흡광도(n = 5). (B) 탈세포화된 척수 및 신경 복합 하이드로겔의 영 계수(n = 탈세포화된 척수에 대해 각각 4, 각 복합 하이드로겔 그룹에 대해 3). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 통계 분석은 Tukey의 사후 검정을 사용한 일원 ANOVA를 통해 수행되었습니다. 약어: ns = 중요하지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 3D 배양의 개략도. (A) PDMS 마이크로웰은 SU-8 코팅된 실리콘 웨이퍼에 제작되었습니다. 각 마이크로웰은 8mm 생검 펀치를 사용하여 펀칭했습니다. (B) 탈세포화된 척수와 좌골 신경을 다른 비율로 조정하고, pH를 7.4로 조정하고, hASC로 재현탁하고, 프리겔을 마이크로웰에 올려놓고, 37^°C에서 30분 동안 배양합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 세포 생존율 분석. 1일, 4일, 7일, 14일에 신경 복합 하이드로겔에서 배양된 hASC의 백분율 차이(n = 3). 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 통계 분석은 Tukey의 사후 검정을 사용한 일원 ANOVA를 통해 수행되었습니다. * p<0.05; ** p<0.01; 피<0.005; 피<0.001; NS: 중요하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

SCI의 병태생리학은 복잡하고 다면적이라고 널리 알려져 있습니다. 세포 이식, 약물 전달 및 생체 재료와 같은 단일 치료법이 각각 SCI에 대한 귀중한 통찰력을 제공했지만, SCI의 복잡한 특성으로 인해 개별적인 효능이 제한될 수 있습니다 28,29,30,31. 이에 따라 효과적인 조합치료제를 개발하기 위한 노력이 증가하고 있다. 이 연구에서 기술된 신경 복합 하이드로겔은 세포 또는 약물에 대한 효과적인 전달 매개체 역할을 할 수 있습니다. 세포와 관련하여 ASC는 세포 이식을 위한 유망한 후보 중 하나입니다. ASC는 인터루킨-10(IL-10) 및 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β)와 같은 면역조절 인자뿐만 아니라 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 신경교 유래 신경 영양 인자(GDNF) 및 신경 영양 호르몬-3(NT-3)과 같은 신경 영양 인자를 분비하여 체외에서 배근 신경절 신경돌기 증가 및 생체 내 기능 회복을 유도합니다 17,19,32,33^{, 34}. 수용액으로 전달된 ASC는 쥐와 인간에서 SCI 후 기능 회복을 촉진했습니다. 그러나 ASC의 이주, 분화, 생존 및 분화를 매개하는 데 어려움이 있는 것으로 나타났습니다 35,36,37. 또한, 이식된 ASC의 종양 형성 가능성에 대한 상충되는 보고가 있습니다. 일부 연구에서는 ASC가 다양한 유형의 암의 증식 및 전이에 기여할 수 있다고 밝혔지만, 다른 연구에서는 항종양 발생 가능성도 보여주었습니다 ^38,39,40,41 따라서 신경 복합 하이드로겔에서 ASC의 장기적인 안전성 프로파일은 향후 조사가 필요합니다. 여기에서 탈세포화된 척수와 좌골 신경은 SCI 복구를 위해 별도로 연구되었습니다.

탈세포화된 척수를 SCI의 랫트 모델에 주입하고 병변으로의 축삭 성장을 자극하고 기능 회복을 높였습니다. 그러나 급격한 악화로 인해 낭종이 형성되었고, 치료 4-8주 후 회복이 감소했다^{4, 42}. 무세포 탈세포화된 좌골 신경 하이드로겔을 SCI 쥐에 주입하여 신경 재생을 촉진했지만, 급격한 분해로 인해 하이드로겔의 효능은 제한적이었다²⁴. 따라서 탈세포화된 조직을 사용하는 조합적 접근이 최근 주목을 받고 있습니다. 탈세포화된 척수 하이드로겔은 신경줄기세포/전구세포의 증식, 이동 및 뉴런으로의 분화를 촉진하는 것으로 보고되었다⁴. 또한 N1E-115 신경모세포종 세포에서 3D 신경돌기 분양을 촉진했는데, 이는 탈세포화된 척수 하이드로겔이 축삭 재생을 촉진하는 매력적인 골격이 될 수 있음을 나타냅니다²⁶. 탈세포화된 좌골 신경은 슈반 캡슐화(Schwann encapsulation)로 연구되었으며 SCI⁴³ 이후 신경 이식편으로서의 잠재력을 보여주었습니다. 종합하면, 탈세포화된 척수와 좌골 신경의 조합은 축삭 재생과 조직 복원을 모두 촉진할 것으로 예상됩니다. 현재 연구에는 ASC가 함유된 신경 하이드로겔의 치료 효과 평가도 포함되지 않습니다. 따라서 in vitro 및 in vivo 연구를 통해 플랫폼의 pro-angiogenic 및 neurotrophic 효과와 같은 재생 가능성을 평가하는 것이 필수적입니다. 또한 신경 복합 하이드로겔은 슈반 세포, 후각 줄기 세포 및 신경 줄기 세포와 같은 다른 세포 유형을 캡슐화하는 데 쉽게 적용하여 세포 이식의 치료 효능을 향상시킬 수 있습니다. SCI의 여러 단계에서 신경 복합 하이드로겔 내 다양한 세포 유형의 안전성과 효능을 조사하는 것은 흥미로울 것입니다.

복합 하이드로겔을 만드는 데 중요한 단계 중 하나는 적절한 양의 조직, 특히 척수를 준비하는 것입니다. 탈세포화된 척수의 수율은 프로토콜(50-100 mg 척수 조각 및 100-150 mg 좌골 신경 조각)에 명시된 바와 같이 상당히 낮습니다. 따라서 생쥐나 쥐와 같은 작은 동물에서 척수를 적출하거나 얻는 것은 권장되지 않습니다. 적어도 토끼와 같은 중간 크기의 동물은 상당한 양의 척수 매트릭스를 얻는 것으로 제안됩니다. 또한 조직을 추가하면 pH가 필요한 펩신 활성화 범위(약 1.5-2) 이상으로 이동할 수 있으므로 탈세포화된 조직을 소화할 때 pH를 확인하는 것이 중요합니다. 척수 탈세포화를 위한 교반 시간은 현재 프로토콜에서 교반 속도가 더 느리기 때문에 이전에 확립된 방법⁽²⁶ )보다 더 깁니다. 이 프로토콜에 사용된 로테이터는 최대 83rpm을 제공하는 반면, 이전에 설정된 방법에서는 최대 200rpm이 사용되었습니다. 따라서 모든 세포 파편을 철저히 세척하기 위해 교반 시간을 두 번 늘렸습니다. 모든 탈세포화 용액이 조직에 침투하여 모든 세포 및 핵 내용물을 세척할 수 있도록 하려면 사용자 측에서 조직학 또는 DNA 분석을 사용하여 교반 시간과 속도를 최적화해야 합니다. 조직과 탈세포화 용액 사이의 비율은 최소 1:15[w/v]로 제안됩니다. 이전에 확립된 프로토콜(²⁶ )에서 탈세포화된 조직을 실온에서 소화/교반하였고; 그러나, 이 프로토콜에서는, 4°C 및 500rpm에서 교반 플레이트에 마그네틱 바를 4일 동안 분해하였다. 교반 플레이트 모터는 열을 발생시켜 프리겔 용액에 도입할 수 있습니다. 따라서 저온에서 소화하거나 온도 조절이 가능한 교반 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.

DNA 분석(그림 2B)에서 알 수 있듯이, 경막(dura mater) 내에서 상당한 양의 DNA가 발견될 수 있기 때문에 척수의 경막을 제거하는 것이 중요합니다. 척수 실질과 달리 경막은 섬유질 조직으로 구성되어 있습니다. 따라서 이전에 문서화된 바와 같이 다른 탈세포화 방법을 활용해야 합니다 ^44,45. 탈세포화된 조직의 H&E 염색 및 DNA 분석은 탈세포화 과정의 효과를 검증하는 데 활용되었습니다. 성공적인 탈세포화의 목표를 달성하기 위해서는 다음 기준이 충족되어야 합니다: 1. 50ng dsDNA/mg ECM 건조 중량 미만, 2. DNA 단편 길이 200bp 미만, 3. 조직 절편 또는 H&E에 핵 물질이 부족함⁵. 탈세포화 후 H&E 염색에 대한 정성적 분석은 핵 염색이 부족한 것으로 나타났으며, 이는 세포의 성공적인 제거를 시사합니다. 또한, 콜라겐 및 기타 기질 단백질과 같은 ECM의 성분이 유지되었고, 탈세포화 후 염색 강도가 감소하여 세포 물질의 제거를 반영했습니다. 탈세포화 후 DNA 함량은 mg ECM 건조 중량당 좌골 신경에서 0.63ng, 척수에서 23.74 ± 6.69ng로 in vivo 적용에 대한 허용 임계값 미만이었습니다.

복합 하이드로겔의 유변학적 측정은 압축력이 높은 레오미터 또는 인장 테스터를 사용하여 이 연구에서 생성된 신경 복합 하이드로겔과 같은 부드러운 물질의 기계적 특성을 분석하는 데 사용할 수 없으므로 신중하게 설계해야 합니다. 샘플이 인장 시험기에 잡히면 찢어지거나 찢어지게 되며, 높은 힘으로 압축하면 분석하기에 충분히 민감한 데이터가 제공되지 않습니다. 본 연구에서는 압축력이 250 N인 레오미터를 사용하였으며, 사용자의 목적에 부합하는 유사하거나 적절한 힘을 가진 장치를 찾는 것이 좋다. 대안으로, 진동 전단 측정과 같은 다양한 유변학적 측정이 저장 및 손실 탄성률을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 탈세포화 후 감소된 기계적 특성은 이 연구의 한계입니다. 모든 하이드로겔 그룹의 Young's modulus는 탈세포화된 척수의 계수와 유사하지만 신선한 척수와는 크게 다릅니다(데이터는 표시되지 않음). 상대적으로 부드러운 물질에서 배양된 신경 줄기세포와 MSC는 각각 신경 분화 및 β-III 튜불린 발현이 증가한 것으로 나타났습니다^46,47. 그러나, 탈세포화된 물질을 알긴산염, 폴리(에틸렌 글리콜), 제니핀, 글루타르알데히드 ^48,49,50,51과 같은 다른 물질로 강화하거나 가교결합시키는 것이 가능하다. 하이드로겔의 기계적 특성을 향상시키기 위한 이러한 전략이 세포 거동이나 생존력에 영향을 미치지 않도록 하기 위해 최적화가 필요합니다.

신경 복합 하이드로겔의 배치 간 변동성은 부분적으로 동물의 연령, 성별, 체중 및 종의 차이로 인해 관찰될 수 있습니다. 같은 종류의 동물을 통제되고 일관되게 사용하면 변동성을 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 서로 다른 동물의 조직 샘플을 통합하면 배치 간의 변동성을 줄이는 데도 도움이 될 수 있습니다⁵². 이 연구를 임상 응용 분야로 전환하는 데 있어 잠재적인 과제 중 하나는 확장성입니다. 척수 탈세포화의 낮은 수율은 많은 양의 탈세포화된 조직의 생산을 방해할 것입니다. 더 많은 조직을 생성하기 위해 새로운 방법을 개발/최적화해야 하며, 또는 경막을 함께 탈세포화하여 탈세포화 후 수율을 높일 수 있습니다. 또 다른 잠재적인 문제는 규제 허가입니다. 미국에서는 FDA가 세포 기반 치료제의 규제 승인을 담당하고 있다⁵³. 대한민국 규제당국은 무릎 연골 결손 치료를 위해 동종 제대혈 유래 MSC와 히알루론산 하이드로겔 4%로 구성된 MSC 기반 제품인 카티스템(CARTISTEM)의 시장 진입을 승인했다⁵⁴. 이와 같은 선례 사례는 안전성 및 효율성 데이터를 제공하여 규제 검토 프로세스를 간소화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3-(데실디메틸암모니오) 프로판 설폰산염 내부 염	시그마-올드리치	D4266	좌골신경 탈세포화 시 사용, SB-10
3-(N,N-디메틸팜미티람모니오) 프로판 설폰산염	시그마-올드리치	H6883	좌골신경 탈세포화 시 사용, SB-16
알라마블루 시약	피셔 사이언티브	DAL1100	AlamaBlue 셀 비아빌리타 테스트 중 사용
콘드로이티나제 ABC	시그마-올드리치	C3667	좌골신경 탈세포화 시 사용
크라이오스탯	라이카	CM1860
디옥시리보뉴클레이스	시그마-올드리치	D4263	좌골신경 탈세포화 시 사용
인산이나트륨 인산염 헵타하이드레이트	VWR	BDH9296	100 mM Na/50 mM 인료 완충제 및 50 mM Na/10 mM 인료 완충제 화학
DNeasy 혈액 및 티슈 키트	치아겐	69506	DNA 분석 중 사용
조직학용 Dpx 마운트 및 슬라이드 장착 배지	시그마-올드리치	6522	Used during H& E 염색
이오신	시그마-올드리치	HT110216	Used during H& E 염색
에탄올	VWR	89125-172
포름알데히드	시그마-올드리치	252549	Used during H& E 염색
글루타알데히드 (GA)	시그마-올드리치	G6257	PDMS 표면 기능화 과정에서 사용
hASC 성장 배지	론자	PT-4505	태아 소 혈청과 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 hASC 배양에 사용됨
헤마톡실린	VWR	26041-06	Used during H& E 염색
인간 지방유래 줄기세포	론자	PT-5006
염산(HCl)	시그마-올드리치	320331	탈세포화된 조직을 소화하고 프리겔 용액을 조정하는 데 사용됩니다
M199 미디어	시그마-올드리치	M0650	프리겔을 원하는 농도로 희석하는 데 사용됩니다
최적 절단 온도 화합물	티슈-텍	4583
펩신	시그마-올드리치	P7000	탈세포화된 조직을 소화하는 데 사용됩니다
과초산(과초산)	랩 앨리	PAA1001	척수 탈세포화 시 사용
인산염 완충 식염수 (PBS)	VWR	97062-948
번호판 인식기	바이오텍 인스트루먼츠	시너지 MX
폴리에틸레네이민 (PEI)	시그마-올드리치	181978	PDMS 표면 기능화 과정에서 사용
돼지 좌골신경	티슈 소스 LLC		식별 정보도 추적 가능성도 없는 살아있는 돼지들
돼지 척수	티슈 소스 LLC		식별 정보도 추적 가능성도 없는 살아있는 돼지들
QuantiFluor dsDNA 시스템	프로메가	E2670	DNA 성분 분석에 사용됨
리오미터	TA 악기	DHR 2
튼튼한 회전자	글라스코	099A RD4512	척수 탈세포화 시 사용
염화나트륨(NaCl)	VWR	BDH9286	100 mM Na/50 mM 인료 완충제 및 50 mM Na/10 mM 인료 완충제 화학
디옥시콜레이트 나트륨	시그마-올드리치	D6750
이수소인산나트륨 일수화물	VWR	BDH9298	100 mM Na/50 mM 인료 완충제 및 50 mM Na/10 mM 인료 완충제 화학
수산화나트륨 용액(NaOH)	시그마-올드리치	415443	프리겔 용액 조정에 사용됩니다
SU-8	카야쿠 보조 재료	SU8-100	실리콘 웨이퍼 코팅에 사용됩니다
자당	시그마-올드리치	S8501	척수 탈세포화 시 사용
실가르드 184 실리콘 엘라스토머 키트	다우	1317318	폴리디메틸질록산(PDMS) 염기제 및 경화제
트리톤 X-100	시그마-올드리치	X100	척수 탈세포화 시 사용
트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드	써모피셔	25300062	hASC 작업 및 척수 탈세포화 시 사용
튜브 리볼버 로테이터	써모피셔	88881001	좌골신경 탈세포화 시 사용
자일렌	VWR	MK866816	Used during H& E 염색