이 프로토콜은 배아 착상 과정에 영향을 미치는 관련 분자를 평가하기 위한 간단하고 효율적인 체 외 배아 이식 모델을 수립하기 위한 방법론을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
배아 착상은 성공적인 임신을 위한 첫 번째 단계입니다. 배아 이식을 위한 체외 모델은 기초 생물학 연구, 약물 개발 및 스크리닝에 매우 중요합니다. 이 논문은 배아 착상을 위한 간단하고 빠르며 매우 효율적인 체외 모델을 제시합니다. 이 프로토콜에서는 먼저 마우스 배반포 획득 및 인간 자궁내막 선암 세포(Ishikawa) 착상을 위한 준비를 소개한 다음 마우스 배아와 이시카와 세포에 대한 공동 배양 방법을 소개합니다. 마지막으로, 이 모델을 기반으로 17-β-에스트라디올(E2) 및 프로게스테론(P4)의 다양한 농도가 배아 접착률에 미치는 영향을 평가하기 위한 연구를 수행했습니다. 우리의 발견은 고농도의 E2 가 배아 부착을 현저히 감소시키는 반면, 프로게스테론을 첨가하면 접착 속도를 회복 할 수 있음을 밝혔다. 이 모델은 사이토카인, 약물, 착상 및 자궁내막 수용성을 조절하는 전사 인자와 같은 접착 과정에 관여하는 분자를 평가하고 스크리닝하기 위한 간단하고 빠른 플랫폼을 제공합니다.
서론
성공적인 임신의 초기 단계인 배아 착상은 배아의 생물학적 기초를 이해하고 불임 문제를 해결하는 데 매우 중요합니다. 그러나 윤리적 제약은 인간 임상 배아 샘플을 수집하는 데 상당한 제한을 초래하며, 이는 인간 배아와 임신 초기 자궁 내막 사이의 복잡한 상호 작용에 대한 연구를 방해합니다1. 이러한 복잡한 메커니즘에 대한 심층적인 이해는 기초 생물학 연구, 약물 발견 및 생식 건강을 발전시키는 데 매우 중요합니다.
이전의 in vitro 모델은 단층 인간 자궁내막 상피 세포(RL95-2)2 를 BeWo, JAr 또는 Jeg-33 융모암 세포와 같은 배아 대체물과 공동 배양하는 접착 모델을 사용했습니다. 그럼에도 불구하고 70-100 μm 범위의 스페로이드 크기를 선택하는 것은 더 크거나 작은 세포 응집체가 실험의 정확도를 손상시킬 수 있기 때문에 매우 중요했습니다. 주목할 만한 점은, 각 제제에서 스페로이드의 25%만이 적합한 크기4에 대한 기준을 충족했으며, 배반포의 생리학적 조건과 비교했을 때 유의한 차이가 있었습니다.
또한, 자궁내막과 배반포를 위한 3차원(3D) 배양 시스템은 생리학적으로 더 관련성이높은 환경을 제공하지만5 높은 기술적 전문성, 느린 세포 성장, 높은 자원 및 유지 관리 비용, 표준화의 어려움, 낮은 재현성6을 필요로 한다.
이 프로토콜에서는 대부분의 실험실에서 개발 및 활용할 수 있는 비용 효율적이고 신속한 체외 배아 이식 모델을 제시합니다. 이 방법의 전반적인 목적은 통제된 환경에서 배아와 자궁내막 사이의 상호 작용을 연구하기 위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 플랫폼을 제공하는 것입니다. 이 모델은 체외 배아 착상의 주요 이벤트를 시뮬레이션함으로써 동물 모델과 임상 환경 간의 격차를 해소하여 보다 정확하고 표적화된 연구를 가능하게 하는 것을 목표로 합니다.
배아 대체물과 비교했을 때, 마우스 배반포의 사용은 생체 내 배아 착상 과정에 대한 생리학적으로 더 유의미한 표현을 제공한다7. 또한, 인간 자궁내막 선암에서 유래한 이시카와 세포주는 선상피와 자궁내강 상피1의 혼합 특성을 가지고 있어 정상 자궁내막에서 발견되는 것과 유사한 효소, 구조 단백질 및 기능성 스테로이드 수용체를 발현할 수 있어 배아 착상을 위한 생리학적으로 적절한 기질을 제공합니다. 공동 배양 시스템의 단순성과 신속성은 고처리량 스크리닝 및 약물 테스트를 가능하게 합니다 8,9,10. 이 방법은 강력하고 재현 가능한 플랫폼을 제공함으로써 배아 착상과 배아 착상이 인체 건강에 미치는 영향에 대한 이해를 높일 수 있는 기회를 제공합니다.
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프로토콜
마우스 취급 및 실험 연구는 Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies의 Animal Committee에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 안전 절차 보장: 화학 물질이나 생물학적 물질을 취급할 때는 항상 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하십시오.
1. 쥐 배아의 획득
참고: 이 섹션에서는 마우스 배아를 얻는 과정에 대해 설명합니다. 성체 암컷 마우스(생후 6-8주, 하이브리드 C57BL/6 및 DBA/2)는 20-25°C, 40-60% 습도에서 12시간 밝은 상태, 12시간 어두운 표준 환경 조건에서 음식과 물을 추가로 제공하면서 유지했습니다.
- 암컷 마우스에게 10IU의 임신한 암말의 혈청 성선 자극 호르몬(PMSG)을 복강내로 주입한 다음 42-48시간 간격으로 10IU의 인간 융모성 성선 자극 호르몬(HCG)을 주입합니다.
- 각 암컷 쥐를 비슷한 나이의 수컷과 짝짓기하고 다음 날 아침에 질 마개를 확인합니다.
참고: 질 플러그는 질 입구에서 정액이 응고된 후 형성되는 연한 노란색 좌약 덩어리입니다. - CO2 흡입으로 질 플러그가 있는 암컷 쥐를 안락사시킵니다.
- 복부를 열고 여성 생식기를 찾으십시오. 집게로 난관, 난소 및 지방 패드를 늘립니다. 가위로 난관과 난소를 자릅니다. 그런 다음 난관과 자궁을 절릅니다(그림 1).
- 얻어진 난관을 M2 매체로 미리 채워진 35mm 페트리 접시로 옮깁니다.
참고: M2 매체는 인큐베이터(37°C, 5% CO2)에서 30분 동안 예열해야 합니다. - 25G 바늘로 난관의 확대된 양풀에 구멍을 뚫어 적운-접합체 복합체를 풀어주거나 집어냅니다(그림 2).
- 겸자를 사용하여 적운-접합체 복합체를 0.5mg/mL 히알루로니다아제를 함유한 M2 용액으로 옮기고 적운 세포가 해리될 때까지 몇 분 동안 배양합니다(그림 3).
- 계란 이송 피펫을 사용하여 접합체를 수집하고 4mg/mL BSA가 포함된 M2 배지로 세척하여 잔류 히알루로니다아제, 적운 세포 및 불순물을 제거합니다.
2. 마우스 배아의 시험관 내 배양
참고: 이 섹션에서는 접합체에서 배반포로 마우스 배아를 체 외 에서 배양하는 과정에 대해 자세히 설명합니다. KSOM 배양 마이크로드롭은 온도와 가스 평형을 보장하기 위해 24시간 전에 준비해야 합니다.
- 35mm 페트리 접시 바닥에 각각 20μL 부피의 KSOM 배지 12미세방울을 준비합니다. 미세 방울을 3-5mL의 미네랄 오일로 덮고(그림 4) 평형을 위해 5% CO2 가 있는 37°C의 인큐베이터에 Petri 접시를 넣습니다.
- 철저한 세척을 위해 전사 피펫을 사용하여 마우스 배아를 M2 배지에서 KSOM 배지로 옮깁니다.
알림: 이 단계에는 37°C 가열이 있는 실체현미경이 필요합니다.tag이자형. 인큐베이터 외부에서 배아를 처리하는 시간을 최소화합니다. - 세척된 배아를 준비된 KSOM 미세 방울에 넣고 37°C에서 5% CO2 로 4일 동안 배양합니다.
참고: 적절한 영양을 보장하기 위해 20μL 마이크로드롭당 5-10개의 배아를 배양하십시오. - 배반포의 크기(100-130 μm), 내부 세포 질량(내부 세포 질량은 모두 압축된 많은 세포로 구성됨), 영양세포 세포의 수(응집력이 있고 함께 포장된 많은 세포로 구성된 영양피피), 팽창 정도(배반포가 배아의 80-100%를 차지함)에 따라 유리한 배반포를 선택합니다.
3. 자궁내막 세포의 준비
- 생물 안전 캐비닛 내부에서 피펫을 사용하여 2% 젤라틴 1mL를 흡인하고 12웰 배양 플레이트에 분주합니다. 젤라틴으로 바닥이 완전히 덮이도록 플레이트를 부드럽게 회전시킵니다. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다. 그런 다음 여분의 젤라틴을 흡인하고 접시 바닥이 완전히 건조되도록 합니다.
- 코팅 과정이 완료된 후 DMEM/F12(자세한 내용은 재료 표 참조), 1mM 피루브산 나트륨, 2mM L-글루타민, 100μg/mL 스트렙토마이신 및 100IU/mL 페니실린으로 인간 자궁내막 선암 세포(Ishikawa)를 배양하고 젤라틴 코팅된 12웰 플레이트(2 × 105cells/well)에 파종하고 24시간 동안 배양합니다.
4. 배아 부착
- 공동 배양을 위해 이전 단계에서 준비한 Ishikawa 세포가 들어 있는 12웰 플레이트의 각 웰에 5-15개의 신선한 배반포를 부드럽게 넣습니다(그림 5).
- 48시간 배양 후 현미경으로 배아를 관찰하여 부착 상태를 평가합니다. 배아 부착을 관찰하려면 플레이트를 빠르게 세 번 움직입니다. 부착되지 않은 배아는 Ishikawa 세포의 표면 위에서 떠다니거나 구르는 운동을 보일 것입니다.
- 수학식 1을 이용하여 배아 착상률을 계산하고; 배아 접착률을 사용하여 착상 효과를 나타냅니다.
배아 착상률 = (부착 배아 / 착상 된 총 배아 수) × 100 % (1)
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결과
보조생식술의 과정에서, 조절된 난소 과자극술(COH)은 중요한 단계이며, 이로 인해 환자의 에스트로겐 수치가 자연 주기에 비해 10-20배 이상 현저히 상승한다11. 이러한 맥락을 감안하여, 우리는 높은 혈청 에스트로겐 농도가 신선한 배아 이식 중 배아 착상에 영향을 미치는지 물었다. 이러한 배아 착상 모델에 기초하여, 다양한 농도의E2 및 P4가 배아 착상율에 미치는 영향을 연구하였다12. 결핍 처리 후, 이시카와 세포를E2 (0, 0.1, 1, 10, 및 100nM) 또는E2 및 P4(0-0, 100-0, 100-10 및 100-100nM)의 조합으로 48시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 세포를 젤라틴으로 코팅된 12웰 플레이트로 옮기고 각 웰에 5-15개의 배반포를 첨가했습니다. 각 그룹은 3회 복제되었으며 이식 속도는 48시간 후에 결정되었습니다.
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토론
배아 이식을 위해 제안된 체외 모델의 단순성과 신속성은 초기 단계의 약물 스크리닝 및 기타 연구 응용 분야에 놀라운 이점을 제공합니다. Ishikawa 세포주의 고처리량 특성과 결합된 간단한 프로토콜은 특히 약물 발견의 초기 단계에서 대규모 스크리닝에 이상적인 후보입니다. Liang13은 TAGLN2 knockdown이 영양 세포의 침입 능력을 감소시킨다는 것을 발견했습니다. Green14는 인슐린 유사 성장 인자가 마우스 배아-이시카와 세포 시스템을 기반으로 마우스 배반포의 접착 능력을 향상시킨다는 것을 입증했습니다. 이 모델은 약물 후보의 신속한 평가를 가능하게 할 뿐만 아니라 배아 착상에 중요한 역할을 하는 사이토카인 및 전사 인자와 같은 다른 분자의 연구를 용이하게 합니다15,16. 생식 생물학에서 배아 착상의 중요한...
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공개 사항
저자는 선언할 재정적 또는 기타 이해 관계의 충돌이 없습니다.
감사의 글
본 연구는 중국국가자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 82171603), 상하이시 보건위원회(Shanghai Municipal Health Commission, 202140341), 상하이시 과학기술위원회(Science and Technology Commission of Shanghai Municipality, 23JC1403803), NHC 및 상하이 중점연구소 혁신 촉진 프로그램(Innovation Promotion Program of NHC and Shanghai Key Labs, SIBPT, RC2023-02)의 지원을 받았다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 17-β-estradiol | SIGMA | 3301 | 가장 강력한 포유류 에스트로겐 호르몬 |
| BD Falcon | BD | 353001 | 세균 페트리 접시 35 x 10 mm 스타일 w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile |
| Biosafety Cabinet | ESCO | class  BSC | 무균 작업, 배양 접시 만들기, 분취 시약 등 |
| CO2 인큐베이터 | Thermo | 8000DH | 배아 배 |
| 양 플레이트 | Corning | 3506 | 세포 배양 |
| DMEM/F12 | Gibco | 1133032 | DMEM/F12 (1x), 액체 1:1, L-글루타민 및 15mM HEPES 완충액 함유 |
| 소 태아 혈청 | Gibco | 10099141 | 태아 소 혈청, 자격, 호주 원산지 |
| 젤라틴 | SIGMA | G9391 | 타입 B, 분말, BioReagent, 세포 배양에 적합 |
| HCG | Nanjing Aibei | M2520 | 살균 시약, 복강내 주사, 50 IU/mL |
| Hyaluronidase | SIGMA | V900833 | 시약 등급, 분말 |
| KSOM | Merck | MR-020P-D | (1x), 분말, 페놀 레드 없음, 5 x 10 mL |
| L-글루타 | Gibco | 25030081 | L-글루타민-200 mM (100x), 액체 |
| M2 | Merck | MR-015-D | EmbryoMax M2 매체 (1x), 액체, 페놀 레드 |
| 미네랄 오일 포함 | SIGMA | M8410 | 미네랄 오일은 다양한 분자 생물학 응용 분야에서 증발 및 교차 오염을 제어하기 위한 커버 레이어로 사용하기에 적합합니다 |
| 페니실린-스트렙토마이신, 액체 | Gibco | 15140122 | 10,000 단위 페니실린(염기) 및 10,000 단위 스트렙토마이신(염기), 0.85% 식염수에서 페니실린 G(나트륨 염) 및 스트렙토마이신 황산염 활용 |
| PMSG | 난징 아이베이 | M2620 | 살균 시약, 복강 내 주사, 50 IU / mL |
| 프로게스테론 | SIGMA | 5341 | 스테로이드 호르몬 월경 주기의 후반부에 황체에서 분비되는 |
| 루브산 나트륨 | Gibco | 11360070 | 피루브산 나트륨은 포도당 실체 현미경 Olympus SZX7 외에 탄소원으로 세포 배양 배지에 일반적으로 첨가됩니다 |
| 배아 채취 및 배아 발달 관찰 |
참고문헌
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