방법 논문

인간의 손에 Culex tarsalis 모기의 프로빙 및 섭취 행동 연구를 위한 AC-DC 전기 침투 검사

DOI:

10.3791/66877

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2024년 11월 29일

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1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AC-DC 전기 침투를 사용하여 사람의 손에 있는 Culex tarsalis 모기의 프로빙 및 섭취 행동을 연구하기 위한 절차가 설명되어 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모기는 인간과 동물의 건강에 부정적인 영향을 미치는 병원체를 전염시킵니다. 모기의 혈액 공급 생물학과 숙주 및 병원체와의 상호 작용에 대한 더 큰 이해는 모기 매개 질병을 통제하기 위한 새로운 표적을 개발하는 데 활용될 수 있습니다. 불행히도, 모기의 탐색(즉, 무는 행동)은 숙주 조직 내부에서 발생하기 때문에 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 AC-DC EPG(Electropenetrography)를 사용하여 사람의 손으로 프로빙 및 섭취할 때 발생하는 전기 신호의 변화를 기록하여 모기 섭식 행동을 간접적으로 시각화하고 정량화하기 위한 비침습적 절차를 설명합니다. 얇은 금선은 접착제를 사용하여 모기에 부착하고 EPG 기기에 연결합니다. 인간 숙주는 손에 기판 전압 프로브를 들고 있습니다. 유선 모기에 의한 숙주 탐사로 전기 회로가 완성되고 전기 신호는 컴퓨터에 "파형"으로 기록된 다음 분석을 위해 측정하고 열거할 수 있습니다. 이 방법론은 Aedes aegypti와 Culex tarsalis 모기의 탐색 및 섭취 행동을 특성화하는 데 사용되었으며 다른 모기 종에 적용할 수 있습니다. EPG는 병원체, 살충제 및 기타 요인이 모기 먹이 행동에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

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모기는 질병 매개체와 성가신 해충으로서의 역할로 인해 전 세계적으로 고통과 경제적 손실을 초래합니다1. 아노펠레스 모기는 매년 전 세계적으로 약 2억 1,900만 건의 발병, 400,000명 이상의 사망2, 120억 달러의 직접 비용3을 유발하는 말라리아를 전염시킵니다. 흰줄숲모기는 거의 전 세계적으로 존재하며 치쿤구니야, 뎅기열, 림프사상충증, 리프트 밸리 열, 황열병, 지카 바이러스의 병원체를 전염시켜 생명을 앗아가고, 의료 시스템을 압도하며, 만성 고통, 평생 이환율 및 장애를 초래하기 때문에 공중 보건의 중요성에서 가장 주목할만한 매개체입니다.4,5. 또한 큘렉스 모기는 말 뇌염, 일본 뇌염, 림프 사상충증, 세인트루이스 뇌염 및 웨스트 나일 열의 병원체를 전염시켜 인간과 동물의 건강에 영향을 미칩니다.3,4.

살충제 기반 접근법을 사용한 매개체 방제는 전 세계적으로 매개체 매개 질병을 통제하는 주요 방법입니다6,7. 그러나 모기 방제에 사용할 수 있는 살충제의 수는 제한되어 있습니다. 또한 많은 종, 특히 흰줄숲모기에서 살충제 내성이 진화하고 있어 매개체 매개 질병과 싸우는 능력에 영향을 미치고 새로운 방제 전략의 필요성을 주도하고 있습니다6,8. 모기 생물학, 모기-숙주-병원체 상호 작용 및 병원체 전파를 조절하는 과정에 대한 더 나은 이해는 벡터 제어를 위한 새로운 도구의 개발을 촉진할 수 있습니다6.

숙주 조직의 탐색 및 섭취 동작은 병원체 전파 및 질병 병리학에 영향을 미칠 수 있습니다9,10,11,12. 예를 들어, 이집트숲모기(Aedes aegypti)가 파열된 혈관 외부에 고인 혈액이 아닌 모세혈관에서 직접 먹이를 먹었을 때 더 많은 미세사상충이 섭취되었습니다13. 따라서 이 주제에 대한 기초 및 응용 연구는 병원체 전파에 대한 모기 방제 전략 및 기타 대책을 개발, 개선 및 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 숙주의 피부 표면 아래에서 발생하는 수수께끼 같은 흡혈 행동에 대한 세부 사항에는 상당한 지식 격차가 존재하는데, 이러한 행동은 종종 살아있는 동물 모델에 대한 침습적 절차를 필요로 하거나 투명한 인공 기질 또는 액체 식단을 사용하기 때문입니다9,11,14,15. 비침습적 전기 침투 검사(EPG, 전기 침투 그래프라고도 함) 기술은 연구자가 숙주 조직 내에서 발생하는 입 부분의 움직임 및 행동을 간접적으로 관찰, 기록 및 정량화할 수 있기 때문에 식물 병원체 전달, 숙주 식물 저항성 및 살충제 작용 방식과 관련된 식물 먹이 곤충의 섭식 행동을 연구하는 데 사용되었습니다10,12.

1950년대 이래로 전자 침투 모니터링 기술이 모기를 포함하여 혈액을 먹는 절지동물에 적용되었습니다16,17,18,19,20. 그러나 파형에 해당하는 생물학적 활성이 검증되지 않았기 때문에 EPG는 혈액을 섭취하는 절지동물에 널리 채택되지 않았습니다21. 또한 초기 기기의 설계 및 전자 장치는 일부 전기 신호의 과도한 강조, 높은 노이즈 대 신호 비율, 파형의 낮은 해상도 및 왜곡, 척추 동물 호스트에 대한 짜증을 초래했습니다12,22. 보다 최근의 기기인 AC-DC EPG 모니터23은 가변 설정과 향상된 신호 처리 기능을 갖추고 있어 실험적 상관 관계 연구에서 혈액을 공급하는 절지동물을 기록하고 파형의 생물학적 기원을 해독하는 데 더 적합합니다10,12.

EPG의 경우 전기 신호는 기판 전압 프로브(즉, 기준 전극)를 통해 호스트에 적용됩니다. 절지동물은 기록 전극에 부착되어 숙주에 배치됩니다. 절지동물이 입 부분(즉, 탐침)을 숙주에 삽입하면 전기 신호는 신호 처리를 위해 AC-DC EPG 모니터로 전달됩니다. 그런 다음 전기 신호는 입 부분의 움직임, 섭취, 타액 분비 및 병원체 획득/접종과 같은 특정 동작에 해당하는 "파형"으로 컴퓨터에 표시됩니다10,12. 그런 다음 서로 다른 계층 수준(패밀리, 유형 및 하위 유형)에서 파형24,25의 지속 시간 및 수와 관련된 순차 및 비순차 응답 변수를 파형의 빈도 및 지속 시간을 기반으로 계산하여 종 내부 및 종 간에 발생하는 공급 거동에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 숙주, 병원체, 살충제 및 환경 조건과 같은10,12.

지금까지 AC-DC EPG 모니터는 Ae. aegypti26 및 Culex tarsalis27 모기는 사람의 손을 먹고 Dermacentor variabilis와 Amblyomma americanum 진드기는 소 송아지를 먹습니다28. 또한 이 기기를 사용하여 병원체 연구를 용이하게 하기 위해 EPG29에 대한 쥐 모델이 최근에 개발되었습니다. 인간의 손은 인간 숙주가 모기 탐색과 다른 행동을 느낄 때 보고할 수 있어 파형과 행동의 상관 관계를 더 쉽게 만들 수 있기 때문에 초기 모기 파형 특성화에 이상적입니다(표 1). 또한, 서로 다른 인간 개체군에 있는 모기들 사이의 섭식 행동의 가소성에 대한 더 나은 이해는 모기와 모기가 전염시키는 병원체에 대한 보다 전문화된 관리 개입의 개발에 기여할 수 있습니다.

표 1: AC-DC EPG를 사용하여 Culex tarsalis에서 기록된 전기 신호를 사람의 손으로 분류하는 데 사용되는 파형 제품군에 대한 설명입니다. 각 파형 제품군에 해당하는 프로빙 단계 및 생물학적 활성. 자세한 내용은 Cooper et al.27 을 참조하십시오. 약어 : AC = 교류, DC = 직류, EPG = 전기 침투계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

모기 생물학 및 숙주-매개체 상호 작용을 연구하기 위해 EPG를 사용하여 모기 생물학 및 숙주-매개체 상호 작용을 연구하는 데 용이하게 하기 위해 AC-DC EPG 모니터를 사용하여 인간의 손에 있는 Cx. tarsalis 모기의 섭식 행동을 정량화하는 방법론이 여기에 제시되어 있습니다. 이러한 프로토콜은 온라인 리소스30에 설명된 기본 AC-DC EPG 절차를 기반으로 하며 사용자가 AC-DC EPG 및 관련 소프트웨어에 대한 기본 작업 지식을 가지고 있다고 가정합니다31. 설명된 절차는 다른 모기 및 숙주 종에 대해 수정할 수 있으며 모기 섭식 행동에 대한 가설 기반 연구를 용이하게 하기 위한 기반을 제공합니다.

표 2: 일반적인 AC-DC EPG 용어의 정의. 정의는 온라인 리소스30,31 및 과학 문헌32에 제공된 정의를 기반으로 합니다. 약어 : AC = 교류, DC = 직류, EPG = 전기 침투계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

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이 프로토콜(IRB-10729)은 캔자스 주립 대학의 인간 연구를 위한 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았으며27이며 병원체가 없는 모기에만 사용하도록 고안되었습니다. 인간 자원자들은 연구에 참여하고 데이터를 발표하는 데 정보에 입각한 동의를 했습니다. 동물, 인간 또는 생물학적 위험에 대한 작업을 시작하기 전에 모든 절차가 해당 기관 규제 위원회 또는 감독 개인에 의해 검토되고 승인되었는지 확인하십시오. 이 프로토콜에 사용되는 모든 장비 및 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 초기 준비 및 설정

  1. 아래에 설명된 수정 사항(단계 1.1.1-1.1.5)을 사용하여 AC-DC EPG 모니터(그림 1A), 패러데이 케이지(그림 1B,C) 및 소프트웨어를 앞에서 설명한 대로 설정합니다30,31). 장비 및 소프트웨어 설정 및 사용에 대한 단계별 자습서는 온라인 리소스30을 참조하십시오. 하드웨어 관리 및 파형 검토 소프트웨어에서 원하는 설정을 기본값으로 저장합니다. 일반적인 AC-DC EPG 용어 및 해당 정의 목록은 표 2를 참조하십시오.
    1. 헤드 스테이지 연결 ampliifier(헤드 amp) 및 기판 voltage 프로브를 컨트롤 박스의 채널 1에 연결합니다.
      참고: AC-DC 모니터가 4개의 곤충과 숙주를 동시에 수용할 수 있더라도 단일 채널에서 녹음이 제공됩니다.
    2. 컨트롤 박스의 채널 1이 켜져 있고 스위치 인터페이스 박스의 해당 Pre-1 및 Post-1 채널이 켜져 있는지 확인합니다.
      알림: 사용하지 않는 채널은 꺼진 상태로 유지해야 합니다.
    3. 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하여 DI-1 A/D 보드(다른 보드는 제외)의 채널 3 및 710이 사전 및 사후 정류 신호를 기록할 수 있도록 합니다.
    4. 하드웨어 관리 소프트웨어를 포맷하여 사전 및 사후 정류 파형을 보거나 겹칩니다(예: 사전 신호의 경우 1 = 1, 사후 신호의 경우 2 = 3).
    5. 하드웨어 관리 소프트웨어의 샘플링 속도를 채널당 초당 100개 샘플(즉, S/s/CHAN: 100)로 설정합니다.
  2. 곤충 스텁 생성26,27,29,30:
    1. 납땜 인두를 특정 로진 코어 솔더에 권장되는 온도로 예열합니다.
    2. 와이어 커터 스트리퍼 도구를 사용하여 20AWG 구리선 롤 끝에서 ~6cm 떨어진 플라스틱 코팅을 벗겨내지만 내부의 구리선 번들을 절단하거나 표시하지 마십시오(그림 2A). 그런 다음 노출된 구리선 다발을 잘라내고 개별 가닥으로 풀어냅니다(그림 2B).
    3. 바늘 노즈 플라이어를 사용하여 구리선의 한 가닥을 머리 아래에 있는 적절한 에스컷천 핀의 샤프트에 감습니다(즉, 평평한 상단). 와이어의 꼬리를 핀의 머리 위로 접어 와이어를 제자리에 고정합니다(그림 2C).
      알림: 헤드 포트에 꼭 맞는 핀을 식별하기 위해 에스컷천 핀을 착용 테스트하십시오 amp(꺼져 있고 플러그가 뽑혀 있고 106옴(Ω)으로 설정된 경우).
    4. 도움의 손길 납땜 보조기에 에스컷천 핀의 샤프트를 걸고 구리선이 위쪽을 향하도록 합니다. 그런 다음 에스컷천 핀과 구리선의 접합부에 수용성 플럭스를 약간 두드리십시오(그림 2D).
      주의: 플럭스는 독성이 있으므로 주의해서 다루어야 합니다.
    5. ~10cm의 땜납을 풀고 곧게 펴십시오. 플럭스가 녹고 금속이 뜨거워질 때까지 뜨거운 납땜 인두를 핀 머리에 대고 몇 초 동안 잡습니다. 그런 다음 땜납이 녹아 접합부를 완전히 코팅하고 핀과 와이어를 곤충 스텁에 융합할 때까지 땜납 끝을 납땜 인두 옆의 핀 머리에 누릅니다.
    6. 곤충 스텁이 식는 동안 납땜 인두 끝을 쇠수세미와 젖은 스폰지로 청소하십시오.
    7. 식으면 도움의 손에서 곤충 그루터기를 제거하십시오. 곤충 그루터기를 70% 에탄올로 헹군 다음 물을 주어 잔류 플럭스를 제거합니다. 구리선을 원하는 길이(~3cm, 그림 2E)로 자릅니다.
    8. 20-30개의 곤충 스텁이 구성될 때까지 1.2.3-1.2.7 단계를 반복합니다.
  3. 곤충 흡인기26,27을 조립합니다.
    1. 유리 파스퇴르 피펫의 끝을 화염에 통과시켜 피펫을 약간 회전시킵니다. 피펫 끝이 곤충의 복부에 꼭 맞을 수 있는 적절한 크기가 될 때까지 반복합니다.
    2. 수정 된 파스퇴르 피펫의 큰 끝을 모기장으로 덮은 다음 실험실 흡입기에 연결된 실리콘 튜브에 직접 삽입하고 전기 테이프로 접합부를 고정하여 곤충 흡입기를 형성합니다 (그림 2H).
      참고 : 파스퇴르 피펫과 그물망은 퀵 단로기가 장착 된 짧은 플라스틱 튜브에 삽입하여 다양한 크기 ( 그림 2H)로 쉽게 전환 할 수 있습니다.

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그림 1: 사람의 손에 기록하기 위한 AC-DC EPG 모니터 장비 설정. (A) (1) 컨트롤 박스, (2) 스위치 인터페이스 박스, (3) 전원 공급 장치, (4) DI-710 A/D 보드, (5) 컴퓨터, (6) 전원 레귤레이터 및 (B) (C)를 포함하는 패러데이 케이지를 포함한 EPG의 구성 요소) (7) 구즈넥 스탠드의 디지털 현미경, (8) 버블 랩 및 에어 필로우, (9) 기판 전압 프로브, (10) 실험실 스탠드의 헤드 스테이지 증폭기. 약어: AC = 교류, DC = 직류, EPG = 전기 침투계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 배선 중 모기를 조작하기 위한 모기 배선용 기록 전극 및 곤충 흡인기.(A) 내부의 구리선 다발을 노출시키기 위해 6cm의 플라스틱 코팅이 제거된 20AWG 구리선. (B) 구리선 다발의 개별 가닥. (C) 와이어의 꼬리가 핀의 머리 위로 접힌 황동 에스컷천 핀의 머리를 감싼 구리선 한 가닥. (D) 납땜 준비를 위해 납땜 보조 장치에 의해 유지되는 황동 에스컷천 핀과 구리선의 접합부에 있는 플럭스. (E) 구리선에 납땜된 황동 못으로 만든 완성된 곤충 스터브. (F) 곤충 그루터기의 구리선 끝을 감싼 금선으로 구성되고 은색 접착제로 제자리에 고정된 기록 전극. (G) 기록 전극의 선단에 있는 금 루프의 클로즈업. (H) 변형된 파스퇴르 피펫, 모기장, 플라스틱 튜브, 전기 테이프 및 남성 퀵 디스커넥터로 만든 조립(위) 및 분해된(아래) 곤충 흡인기, 암 퀵 단로기(오른쪽 상단)가 장착된 실험실 흡인기 튜브 옆. 눈금 막대 = 1cm(A-F), 200μm(G). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 모기의 배선

  1. 모기와 은색 접착제를 준비합니다 (EPG 전 오후 / 저녁).
    1. Cx. tarsalis 이전에 설명한 대로 KNWR 균주 모기를 후방27.
    2. 빠른 성체 암컷 모기, 폐하 후 5-17일, 8-12시간 동안 프로빙 속도를 높이지만 폐사를 피하기 위해 물에 접근할 수 있습니다.
    3. 신선한 은색 접착제 준비26,27,28,29,30:
      1. 20mL 비커에 4-8μm 실버 플레이크 510mg을 추가합니다. 저울을 찔러 1,100mg의 무독성 학교 접착제를 은판 위에 있는 비커에 추가합니다.
      2. 저울의 무게를 싣고 접착제 상단의 비커에 8-10μm 실버 플레이크 510mg을 추가한 다음 피펫을 사용하여 1,000μL의 물을 추가합니다.
      3. 비커에 교반 막대를 부드럽게 넣고 교반 플레이트에 놓습니다. 천천히 저어주기 시작하여 점차적으로 '빠르게' 설정까지 올린 다음 4분 동안 저어줍니다. 모든 내용이 통합되었는지 확인하십시오.
      4. 전사 피펫(팁이 절단된 상태)을 사용하여 은 접착제를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      5. 은색 접착제 튜브의 상단을 파라필름으로 감싸고 사용할 때까지 벤치탑에 보관합니다.
        참고: 은 접착제는 최대 2일 동안 올바른 농도를 유지하지만 사용 전 저녁에 새 접착제를 만드는 것이 좋습니다30.
  2. 기록 전극 준비26,27,29,30:
    1. 사용하기 전에 은색 접착제를 세게 소용돌이
      2. 치십시오.
    2. 준비된 곤충 그루터기와 철사 모기를 담기 위해 새 플라스틱 랩으로 폼 블록을 감쌉니다.
      알림: 폼은 유선 모기가 서로 닿지 않고 표면에 서 있을 수 있을 만큼 충분히 커야 하지만 보관 상자 안에 들어갈 수 있을 만큼 작아야 합니다. 주의: 혈액 공급 후 방출되는 배설물 방울에는 병원체가 포함될 수 있습니다. 사용 후에는 플라스틱 랩/폼 블록을 적절하게 폐기하십시오.
    3. 면도날로 구리선의 상단 1cm를 모든 면이 광택이 날 때까지 긁어 구리선 끝의 변색(곤충 스텁을 재사용하는 경우 오래된 은색 접착제)을 제거합니다. 각 모기에 대해 하나의 곤충 그루터기와 몇 가지 추가 곤충을 준비하십시오.
    4. 직경 0.025mm의 금선을 4-5cm 길이의 조각으로 자릅니다. 와이어가 찌그러지지 않도록 항상 테이프로 마스킹된 자동 폐쇄 집게로 와이어를 잡으십시오.
      참고: 금선은 검은색 배경에서 훨씬 쉽게 볼 수 있습니다.
    5. 곤충 스텁의 구리선의 깨끗한 끝을 따라 금선의 끝을 놓고 금선을 구리선에 3x 부드럽게 감습니다.
    6. 해부 프로브를 사용하여 은색 접착제를 바르고 금선을 제자리에 고정합니다. 꼬리나 느슨한 끝이 없는지 확인하십시오. 접착제가 마를 때까지 곤충 스텁을 거품에 넣으십시오.
    7. 곤충 스터브에 부착된 금선을 부드럽게 쓰다듬어 매끄럽고 길고 부드러운 호를 그리며 모양을 만듭니다(그림 2F). 와이어를 원하는 길이(~2.5-3cm)로 자릅니다.
    8. 해부 현미경으로 작업하면서 미세한 집게를 사용하여 금선 끝에 금색 고리를 만들고 아래 설명된 대로 고리를 90° 각도로 구부립니다(단계 2.2.8.1-2.2.8.4; 그림 2E,F). 금색 고리가 완전히 닫혔는지 확인하십시오. 곤충 스텁을 폼 블록에 다시 넣습니다.
      1. 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 금색 와이어 끝이 현미경 스테이지에 닿도록 하여 황동 못으로 곤충 스터브를 잡습니다. 주로 사용하는 손을 사용하여 가는 집게로 금선의 맨 끝을 잡습니다.
      2. 가는 점 집게를 사용하여 금선이 접착된 곳 근처의 곤충 스텁의 구리선 위로 금선의 끝을 교차합니다. 가는 점의 집게와 금선의 끝을 현미경 스테이지에 대고 아래로 터치합니다.
      3. 금선이 가는 집게 끝 주위에 작은 금색 고리를 형성할 때까지 곤충 스텁을 부드럽게 당깁니다(너무 세게 당기지 마십시오). 금선을 풀고 집게를 조심스럽게 제거합니다.
      4. 주로 사용하지 않는 손에 곤충 스터브를 계속 들고 있는 동안 가는 점 집게로 금 고리를 잡고 집게가 철사의 목에 수직이 되고 집게 끝이 금색 고리의 중간에 걸쳐 고리의 양쪽을 잡도록 합니다. 루프가 와이어 목에 대해 90° 각도로 구부러질 때까지 집게를 곤충 스텁에서 멀어지도록 가볍게 돌리면서 곤충 스터브를 부드럽게 당깁니다(그림 2G).
  3. 모기에 기록 전극을 부착합니다.26,27,29,30(EPG 아침):
    1. 모든 움직임이 멈출 때까지 공복 모기를 CO2 가스로 마취합니다. 모기를 마취 패드에 등을 대고 복부가 연구원을 향하도록 놓습니다.
    2. ~2cm 길이의 실험실 테이프를 끈적한 면이 아래로 향하게 하여 해부 현미경 아래에 놓습니다. 테이프에 은 접착제를 0.5cm 방울(~ 10μL) 떨어뜨립니다.
    3. 복부가 제자리에 앉을 수 있을 만큼만 흡입을 사용하여 마취된 모기의 복부를 변형된 파스퇴르 피펫으로 흡인합니다. 흡인기.
      참고 : 날개는 수정 된 파스퇴르 피펫의 끝 부분 내부 또는 바깥에있을 수 있지만 내부에 있으면 모기가 떨어지는 것을 방지하는 데 도움이됩니다. 날개가 구부러지거나 손상되지 않도록 하십시오.
    4. 빠르게 작업하여 은색 접착제에 미세한 핀을 담그고 모기의 앞가슴(즉, 흉부의 등쪽 표면)에 얇은 층을 적용합니다. 가능한 경우 즉시 다음 단계로 진행하십시오(또는 필요한 경우 모기를 다시 마취하십시오).
      알림: 큐티클의 모공이 접착제로 침투할 수 있도록 핀을 앞뒤로 문질러 앞가슴의 비늘을 제거하는 것이 좋습니다. 모기의 다른 부분에 접착제를 묻히지 마십시오.
    5. 녹음 전극 끝에 있는 금색 고리를 은색 접착제에 빠르게 담그고 모기의 앞가슴에 있는 은색 접착제 부분에 놓습니다. 루프를 앞뒤로 흔들어 앞가슴과 같은 높이에 놓이도록 합니다. 접착제가 마를 때까지(~20-25초) 와이어를 잡습니다.
    6. 철사 모기가 깨어났을 때 편안하게 서 있을 수 있는 각도로 폼의 곤충 스텁을 교체하십시오. 다음 mosquito.
      배선을 진행합니다. 알림: 각 배선 작업의 품질에 대해 메모하는 것이 좋습니다.
    7. 원하는 수의 모기가 배선되면 폼 블록을 보관 상자에 넣습니다. 사용할 때까지 모기를 정상적인 사육 조건에서 유지하십시오.

3. EPG 설정 및 준비 (EPG 전날 아침)

  1. 기기 평형 및 문제 해결을 위해 녹음하기 최소 30분 전에 AC-DC EPG 모니터를 켜십시오(전원 공급 장치의 스위치를 켜서).
    알림: 컨트롤 박스와 스위치 인터페이스 박스에서 사용 중인 채널은 켜진 상태로 둘 수 있습니다.
  2. 컴퓨터를 켜고 하드웨어 관리 소프트웨어를 엽니다.
    참고: 신호가 평평하고 가는 선으로 나타나지 않으면 문제 해결이 필요합니다(토론 섹션 참조).
  3. 터치 test27,30을 수행하여 장비 기능을 확인합니다.
    1. 접지된 상태에서(즉, 맨살로 패러데이 케이지를 만지는 경우) 헤드 앰프의 다이얼을 106 Ω로 돌리고 곤충 스터브의 샤프트를 포트에 삽입합니다.
      알림: 더 높은 입력 저항(Ri) 레벨에서 터치 테스트를 수행하면 헤드 앰프가 손상될 수 있습니다.
    2. 접지된 상태에서 헤드 전환 amp 전원을 켜고 검지와 엄지 손가락 사이에 있는 곤충 스텁의 구리선을 세 번 단단히 잡습니다. EPG가 올바르게 작동하면 화면의 사전 신호와 사후 신호 모두에 세 개의 큰 피크가 나타납니다. 그렇지 않은 경우 문제 해결이 필요합니다(토론 섹션 참조).
  4. 아래 설명된 대로 기기 설정을 Ri 107 Ω, 하드웨어 게인 20-40x, 음의 오프셋, 기본 기준선 및 소프트웨어 게인 8-16x27,30을 사용하여 150mV 교류(AC)로 조정합니다(단계 3.4.1-3.4.3).
    1. 컨트롤 박스의 채널 1에 있는 스위치와 다이얼을 사용하여 전압, 전류 유형, 하드웨어 게인(범위, 게인 및 승수), 오프셋 및 기준선(0)을 설정합니다.
      알림: 적절한 하드웨어 게인 설정은 배선 작업과 은 접착제의 품질에 따라 다르므로 모기에서 모기까지, 그리고 매일 최적의 게인 설정이 달라질 것으로 예상됩니다. 신호가 피크 아웃되거나(표 2에 정의되어 있으며 그림 3A,C에 표시됨) 너무 작아서 시각화할 수 없는 경우 레코딩 중간에 하드웨어 게인을 조정해야 할 수 있습니다. 모든 하드웨어 게인 변경은 녹음에 영구적으로 영향을 미칩니다(그림 3A,C 참조).
    2. 헤드의 다이얼을 사용하여 Ri 레벨을 설정합니다.
    3. 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하여 소프트웨어 게인을 설정하고 조정합니다(예: 사전 또는 사후 신호를 선택한 다음 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 소프트웨어 게인을 높이거나 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 소프트웨어 게인을 낮추십시오).
      알림: 소프트웨어에서 이루어진 게인 변경은 녹음에 영구적으로 영향을 미치지 않습니다.
  5. 하드웨어 관리 소프트웨어에서 새 녹음을 설정하되 다음 섹션의 4.3단계까지 녹음을 시작하지 마십시오.

4. 사람의 손에 EPG26,27 :

  1. 정보에 입각한 동의를 얻은 후(홈 기관의 IRB에서 지정한 대로) 호스트를 한 팔이 안쪽으로 한 개 있는 패러데이 케이지 옆에 앉히고 기판 전압 프로브를 잡고 헤드 amp 아래에 유지하도록 합니다.
    알림: 팔은 버블 랩 또는 이와 유사한 비전도성 기판 위에 편안하게 놓여야 합니다. 손 및 하위 상태 voltage 프로브는 패러데이 케이지 또는 헤드 amp 녹음하는 동안. 손상을 방지하려면 자원 봉사자가 헤드 앰프를 켠 후 만지지 않는 것이 중요합니다. 헤드 앰프를 실수로 만진 경우 위에서 설명한 터치 테스트를 수행하여 기능을 평가하십시오.
  2. 호스트가 제자리에 있으면 헤드 앰프를 옆으로 돌립니다. 보관 상자에서 유선 모기를 제거하고 곤충 스터브의 황동 핀을 헤드의 포트에 삽입하여 기기에 연결합니다. 모기를 매달아 두세요.
    알림: 와이어에서 분리되는 모기를 통제하기 위해 70% 에탄올이 든 스프레이 병을 근처에 두십시오.
  3. 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하여 녹음을 시작합니다. 머리 amp 모기가 편안하게 서서 조사할 수 있도록 손 위에 있습니다.
  4. 헤드 전환 amp 접지된 상태에서 켜십시오. 10분 타이머를 시작합니다. 프로빙 성공을 돕기 위해 필요에 따라 호스트 손 위치를 조정합니다.
    알림: 즉시 탐사하려는 경향이 있는 모기를 사용할 때는 모기를 손에 놓기 전에 헤드 앰프를 켜십시오. 얇은 나무 다울 또는 비전도성 붓 손잡이를 사용하여 곤충 스터브의 구리선을 구부려 모기의 위치를 더 조정할 수 있습니다. 구즈넥 스탠드의 돋보기 또는 디지털 현미경은 특히 행동 상관 관계 연구를 위해 EPG 동안 모기를 관찰하는 데 도움이 될 수 있습니다.
  5. 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하여 숙주 응답, 모기 행동, 게인 변화 등과 관련하여 기록하는 동안 타임스탬프가 지정된 관찰(예: 이벤트 마커)을 수행합니다. 두 신호가 모두 화면에서 명확하게 보이도록 필요에 따라 화면의 신호 위치와 소프트웨어 게인을 조정합니다. 신호가 피크 아웃되거나(그림 3A, C 및 표 2) 소프트웨어 게인이 최대가 되었을 때 파동이 너무 작게 나타나는 경우 하드웨어 게인을 조정합니다. 정류기 폴드오버가 관찰되면 오프셋을 조정합니다(그림 3C, C' 및 표 2). 이러한 조정 방법에 대한 자세한 지침은 소프트웨어 설명서31 및 온라인 리소스30을 참조하십시오.
    1. 화면에서 신호의 위치를 조정하려면 사전 또는 사후 신호를 선택합니다(예:
      1 = 1       또는 2 = 3)을 누른 다음 신호를 화면의 원하는 위치(이상적으로는 화면 중앙 근처에 있지만 겹치지 않음)로 드래그합니다.
    2. 소프트웨어 게인을 조정하려면 3.4.3단계에서 설명한 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하십시오.
    3. 하드웨어 게인을 조정하려면 먼저 채널 1의 게인 다이얼을 오른쪽 또는 왼쪽으로 돌려 게인을 각각 높이거나 낮춥니다. 이러한 조정이 피킹 아웃을 제거하기에 충분하지 않은 경우(게인이 너무 높음; 그림 3A,C) 또는 신호의 세부 사항을 명확하게 시각화할 수 있도록(게인이 너무 낮음) 채널 1 범위 및 승수 스위치를 뒤집어 게인을 추가로 조정하십시오.
      참고: 이벤트 마커를 사용하여 하드웨어 게인이 조정된 시점을 기록하는 것은 파형 데이터 해석을 돕기 위해 권장됩니다.
    4. 오프셋을 조정하려면 컨트롤 박스의 채널 1 오프셋 스위치를 음수로 뒤집은 다음 사전 및 사후 신호의 피크가 컴퓨터 화면에서 같은 방향으로 발생할 때까지 채널 1 오프셋 다이얼을 돌립니다. 오프셋 다이얼을 너무 멀리 돌리면 포스트 신호가 다시 뒤집힙니다.
  6. 모기가 10분(또는 기타 정의된 시점) 이내에 탐색하지 않으면 헤드 앰프를 끕니다. 모기가 시간 표시에서 프로브 중간에 있는 경우 헤드를 끄기 전에 프로브를 완료할 때까지 기다립니다. 숙주가 조심스럽게 손을 떼게 한 다음 곤충 그루터기가 부착된 모기를 제거합니다. 보관 상자에 있는 모기를 교체하십시오.
  7. 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하여 녹음을 중지/닫습니다. 다음 모기에 대해 EPG를 진행합니다(4.2단계).
    참고: 각 모기 후에 파일 이름을 변경하는 것을 잊지 마십시오.
  8. 헤드 끄기 amp 세션 종료 시 전원을 켜고 소프트웨어를 닫습니다.
  9. 참가자 보고 진술서 또는 이와 유사한 것을 승인된 IRB에 명시된 대로 자원자와 함께 검토합니다.
  10. 프로토콜 요구 사항에 따라 모기를 폐기하십시오. 폼 블록에서 플라스틱 랩을 제거하고 적절하게 폐기하십시오.
  11. 모든 데이터 수집이 완료되면 앞에서 설명한 대로 파형을 검토 및 측정하고 데이터를 분석합니다24,25,26,27,29,30. 파형 검토 소프트웨어 사용, 파형을 묘사하는 그림 만들기, 파형 측정, 분석을 위한 데이터 내보내기, 통계 분석 수행 및 일반적인 파형 응답 변수에 대한 자세한 설명에 대한 단계별 자습서는 온라인 리소스30를 참조하십시오.

figure-protocol-3
그림 3: 피크 아웃, 컨트롤 박스 게인 변경, 하위 배선으로 인한 불분명한 전압 변화, 정류기 폴드오버 및 잡음으로 인한 최적화되지 않은 녹음의 예. (A) 피킹 아웃(파란색 수평 화살표) 및 후속 컨트롤 박스 게인으로 인해 왜곡된 Culex tarsalis 모기의 파형은 100x에서 80x에서 40x, 60x에서 40x에서 20x(주황색 수직 화살표)로 변경, (B) 불분명한 전압 변화 및 (C) 사전(빨간색) 신호와 비교하여 사후(검은색) 신호에서 정류기 접힘(파형 J 참조, 패널 C'에 표시된 클로즈업), 라인 노이즈(사전 정류(빨간색) 신호에서만 볼 수 있는 11Hz 사인파, 패널 C'에 표시된 클로즈업), 피킹 아웃(파란색 수평 화살표) 및 500x에서 200x(주황색 수직 화살표)로 컨트롤 박스 게인 변경. 파형 이름은 각 패널의 맨 위에 표시됩니다. 패널 C의 오른쪽 하단 모서리에 있는 보라색 화살표는 헤드 amp 프로브가 완료된 후 꺼졌고 또 다른 예를 제공합니다.amp정류기 접기의 le. 패널 C의 정류 전 신호와 관련된 빨간색 수평선은 이벤트 마커가 타임스탬프가 찍힌 메모를 기록하는 데 사용된 시기를 나타냅니다. Ri 레벨, 적용된 신호, 시간 척도 및 소프트웨어 이득은 (A) 107 Ω, 150 mV DC, 13.2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV DC, 4.4 s/div, 128x; 및 (C) 107 Ω, 150 mV AC, 7.4 s/div, 2x; (C') 0.2 s/div, 8x. 약어: AC = 교류, DC = 직류, Ri = 입력 저항, mV = 밀리볼트, Ω = 옴, s/div = 부문당 초. 이 그림은 Cooper et al.27의 데이터로 작성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

사람의 손에 묻은 Cx. tarsalis 모기의 피를 먹는 AC-DC EPG 기록(그림 4)은 분석 및 게시에 적합한 해석 가능한 파형을 생성했습니다27. 해석 가능한 파형에는 파형 검토 소프트웨어에서 압축(표 2에 정의됨) 및 소프트웨어 게인을 조정한 경우 파형 제품군(표 1 및 그림 4), 유형 및 하위 유형으로 분류할 수 있는 고유하고 구별 가능한 반복 패턴이 포함되어 있습니다27,31. Ae. aegypti feeding on human hands26에서 이전에 설명된 모든 파형 제품군(J, K, L, M, N) 및 유형(L1, L2, M1, M2)은 Cx. tarsalis가 인간의 손을 먹고 살면서 생성된 파형에서 확인되어 여기에 설명된 방법의 유효성을 검증했습니다. 또한 세 가지 새로운 파형 유형(M3, N1, N2)과 L1, L2, M1 및 M2의 수많은 하위 유형이 식별되었습니다27. 또한 마우스부에서 마우스부를 빼낼 때 베이스라인으로 다시 전압이 떨어지는 파형 제품군 W27로 명명했습니다.

여기에 설명된 절차를 따르면서 기기 설정(전류 유형 및 Ri 수준)을 체계적으로 변경하면 Cx를 기록하기 위한 최적의 설정을 결정할 수 있었습니다.사람의 손에서 먹이가 되는 tarsalis, 각 파형의 전기적 기원, 모기당 완전 및 불완전 프로브의 평균 지속 시간(초), 곤충당 파형 지속 시간(초)의 통계적 비교(WDI), 곤충당 파형 이벤트 수(NWEI) 및 설정 전반의 곤충당 이벤트당 파형 지속 시간(초)27. 또한 모기는 서로 다른 파형 동안 중단되고 해부되어 어떤 파형이 혈액 섭취와 상관관계가 있는지 확인했습니다27. 유사한 방법론을 사용하여 Ae. aegypti에 대해 유사한 조사가 수행되었습니다26.

EPG의 민감하고 복잡한 특성으로 인해 모든 녹음이 그림 4. 피킹 아웃(그림 3A,C), 하드웨어 게인 변경(그림 3A,C), 하위 배선 작업(그림 3B), 파형 J의 정류기 폴드오버(그림 3C,C') 및 전기 노이즈(그림 3C,C')는 때때로 파형을 왜곡하고 마스킹하여 출판물 품질 수치에 사용하기에 부적합하게 만들고 채점 및 분석을 어렵게 만들었습니다. 따라서 배선 기술을 완성하고, 게인 및 전압 설정을 최적화하고, 오프셋을 조정하고, 전기 노이즈를 제어하기 위해 프런트 엔드 노력을 기울이는 것이 좋습니다. 흥미롭게도, 정류기 폴드오버는 Cx. tarsalis(그림 3C,C')에 대한 파형 제품군 J에서만 관찰되었으며 다른 종의 모기(Ae. aegypti 및 Culex quinquefasciatus)를 사용했을 때에도 오프셋이 처음 조정된 후에는 재발하지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한 문제 해결을 통해 그림 3(패널 C 및 C')에 표시된 제어되지 않은 전기 잡음이 결함이 있는 패러데이 케이지에서 비롯된 것으로 밝혀졌습니다. 결함이 있는 패러데이 케이지에서 녹음한 내용은 여전히 사용할 수 있었지만 개선된 패러데이 케이지가 구축되었을 때 소음 문제가 해결되었습니다(그림 1B).

모든 예방 조치와 프런트 엔드 최적화를 취했음에도 불구하고 모기에 대한 전극 부착 품질의 약간의 변화 및 신호를 왜곡하고 신호 대 잡음비를 주기적으로 변경하는 기타 알 수 없는 요인으로 인해 신호가 가시 범위 내에 있고 각 파형의 피크 분해능이 파형 식별 및 특성화에 충분한지 확인하기 위해 녹음 중간에 하드웨어 게인을 조정해야 했습니다. 안타깝게도 레코딩 중간에 하드웨어 게인을 조정하면 급격한 전압 이동(그림 3A, C)이 발생하여 파형이 게시에는 적합하지 않지만 측정 및 분석에는 여전히 사용할 수 있습니다(전체 또는 일부).

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그림 4: 250mV AC의 인가 신호를 사용하여 107 Ω의 Ri로 기록된 인간 손의 Culex tarsalis 프로브의 대표 파형. 패밀리 레벨(NP, J, K, L, M, W) 파형 이름은 각 패널의 맨 위에 표시됩니다. 아래쪽 패널은 패널 A에서 선택한 영역의 확대를 보여줍니다. 삽입된 패널은 표시된 영역의 확대를 보여줍니다. 시간 척도 및 소프트웨어 이득은 (A) 7.0 s/div,16x; (B) 1.0 s/div, 64x; (B') 0.2 s/div, 64x; (C) 1.0 s/div, 64x; (C') 0.2 s/div, 32x; (D) 1.0 s/div, 64x; (D') 0.2 s/div, 64x. 약어: AC = 교류, Ri = 입력 저항, mV = 밀리볼트, Ω = 옴, s/div = 부문당 초. 이 그림은 Cooper et al.27의 데이터로 작성되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AC-DC EPG를 사용할 때, 하드웨어 및 소프트웨어 작동(30 )에 대한 기본적인 이해를 갖고 장비의 손상을 방지하기 위해 여기에 설명된 프로토콜을 주의 깊게 따르는 것이 중요합니다. 특히 패러데이 케이지에 접지되지 않는 한 헤드 앰프가 켜져 있을 때 만지지 마십시오. 패러데이 케이지에서 가능한 한 멀리 녹음하는 것이 좋습니다30. 과도한 주변 전기 노이즈가 있는 환경에서 녹음하지 않는 한 해석 가능한 파형을 얻기 위해 케이지 도어를 반드시 닫을 필요는 없습니다. 패러데이 새장에는 전동이 있을 수 없습니다. 패러데이 케이지 자체가 제대로 작동하려면 헤드 앰프를 통해서만 전기적으로 접지되어야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이는 패러데이 케이지에 의해 포착된 전기가 실험실 스탠드, 헤드 앰프의 금속 케이스, 코드를 따라 컨트롤 박스로 흐르도록 하기 위해 스탠드의 한쪽 발에서 페인트를 샌딩한 상태에서 헤드 앰프를 금속 실험실 스탠드에 연결함으로써 수행됩니다. 전원 공급 장치를 통해 적절하게 접지된 벽 콘센트로, 건물 접지(30)를 통해 지구로 들어갑니다. 멀티미터를 사용하여 다양한 지점 사이의 저항률(전도도의 역수)을 측정하여 케이지 내부 구성 요소 간의 연결 품질을 확인할 수 있습니다. 무선 AM 라디오를 패러데이 케이지 내부에 배치하여 도어가 닫힐 때 소리가 크게 감소(또는 이상적으로 제거)되는지 확인하여 패러데이 케이지가 공기 중 전기 신호를 적절하게 캡처하고 있는지 확인할 수도 있습니다(E. Backus per. Comm.).

은 접착제의 적절하고 표준화된 준비와 기록 전극을 곤충에 부착하는 것은 사용 가능한 기록을 얻는 데 중요합니다. 곤충 큐티클은 절연체이며 은 접착제가 큐티클의 기공에 적절하게 침투하여 곤충 내부에서 전두엽(30) 표면의 금선으로 전기가 이동하는 경로를 만들지 않으면 커패시터 역할을 합니다. 각 EPG 세션 전에 동시에 은색 접착제를 준비하고 튜브에서 새 은색 접착제로 작업하고 배선 절차 중에 격렬하게 소용돌이치는 은색 접착제로 자주 교체하십시오. 금색 고리가 흉부에 닿아 전체 고리가 큐티클과 접촉하고 한쪽으로 기울어지지 않거나 은색 접착제와 비늘의 두꺼운 층으로 분리되어 강력한 전기 연결을 형성하고 모기가 전선에서 분리되고 탈출하는 것을 방지합니다.

여기에 설명된 프로토콜은 다양한 모기 종으로 작업할 때 최적화되어야 합니다. 주어진 절지동물에 대한 기록을 위한 최적의 EPG 설정(Ri 레벨, 전압, 전류 유형 및 하드웨어 이득)은 실험적으로 결정되어야 합니다12,30. 그러나 오프셋이 조정되면 유사한 모기로 작업할 때 다시 조정할 필요가 없습니다. Ae. aegypti26 및 Cx. tarsalis27. 추가 종에 대한 파형 라이브러리(표 2에 정의됨)는 모기에 대한 EPG의 채택을 용이하게 할 것입니다. 또한 모기 종과 마취 선택에 따라 수혈 행동이 차등적으로 영향을 받을 수 있으므로 관심 모기에 대한 마취를 최적화하는 것이 필요합니다. 예를 들어, Cx. tarsalis는 CO2로 15분 마취 후 4시간의 회복 기간이 필요한 반면, Ae. aegypti의 경우 얼음으로 15분 마취 후 15분의 회복 기간으로 충분합니다. 그러나 Culex tarsalis는 추위에 노출되면 쓰러지기 어렵기 때문에 긴 회복 기간에도 불구하고 CO2가 주로 사용됩니다.

AC-DC EPG 모니터는 온라인 리소스(30,31)를 검토하거나 숙련된 사용자와 함께 교육한 후 쉽게 사용할 수 있지만 몇 가지 문제 해결이 필요합니다. 처음에 저자의 모기 탐침 EPG 기록에는 Wayadande와 동료들이 관찰하거나 보고하지 않은 사전 신호에 예상치 못한 11Hz 부호파가 있었습니다26. E. Backus와의 협의에 따르면 패러데이 케이지가 간섭하는 접지 루프 때문에 문제가 되었을 가능성이 높습니다. 아래 표(그림 1B)에서 분리하기 위해 고무 다리로 지지되는 대형 알루미늄 바닥판에 볼트로 고정된 알루미늄 프레임에 연결된 전도성이 높은 구리 스크린으로 구성된 새로운 패러데이 케이지는 11Hz 노이즈 신호를 해결했습니다(그림 3C,C'). 또한 때때로 EPG 전원 공급 장치를 처음 켤 때 정류 전 및 정류 후 신호가 직선적이고 매끄럽고 가는 선 대신 두껍고 흐릿한 선으로 나타납니다. 이것은 일반적으로 기기를 끄고 모든 코드 연결을 확인하여 해결되었습니다. 실패하면 일반적으로 1-3분 동안 기기의 플러그를 뽑는 것이 도움이 되었습니다. 매우 드물게 작동 중에 사전 및 사후 신호가 두껍고 흐릿해지는데, 이는 기기를 끄고 다른 콘센트에 연결하거나 전압 조정기 및 전원 컨디셔너를 사용하여 EPG를 벽에 연결하기 전에 연결하여 해결되었습니다. 이상적으로는 EPG 모니터용 전용 라인이 EPG30과 동일한 전기 회로에 연결된 냉장고 및 기타 장비에서 발생하는 라인 노이즈를 제거합니다.

현재 EPG를 사용하여 모기를 연구하는 데에는 두 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 첫째, 어떤 프로빙 동작이 파형에 해당하는지 확인하기 위해 수행된 상관 관계 연구는 거의 없습니다. 각 파형 패밀리(표 1)와 일부 파형 유형(M1 및 M2) 동안 무슨 일이 일어나고 있는지에 대한 강력한 가설이 있지만, 혈액 섭취가 파형 패밀리 M26,27과 상관관계가 있다는 점을 제외하고는 실험적으로 확인된 가설은 거의 없습니다. 가장 중요한 것은 많은 병원체가 타액으로 전달되기 때문에 타액 분비 사건에 해당하는 파형을 식별해야 한다는 것입니다. EPG 파형과 모기의 생물학적 활동의 상관관계는 치료 그룹 간의 파형 지속 시간 및 수의 유의미한 차이를 의미 있게 해석하는 데 필요합니다. 둘째, EPG 중 프로빙 및 섭취 비율은 예상보다 훨씬 낮을 수 있습니다27. 모기를 짧은 전선에 개별적으로 묶어 숙주에게 직접 배치하면 탐침 및 섭취 행동에 영향을 미칠 수 있는 장거리 숙주 찾기 및 사회적 먹이 행동을 방지할 수 있습니다. 올바르게 배선된 곤충은 정상적으로 걷고 날 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 모기는 종종 전선을 당기고 때로는 엉키거나 부자연스러운 각도로 자신을 잡고 있는데, 이는 전선이 있는 것이 모기의 행동에 어느 정도 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 저자는 EPG 동안 탐침률을 향상시키기 위한 많은 전략을 테스트했으며, 모기를 밤새 금식시키고, 노인을 사용하고, 손에 놓기 직전에 사람의 호흡에 노출시키고, 사람의 타액을 손에 바르는 것이 가장 효과적이었고, 모기가 조사하기에 이상적인 위치에 있는지 확인하기 위해 손의 위치를 지속적으로 미세하게 조정하는 숙주를 사용했습니다27.

이러한 한계에도 불구하고 AC-DC EPG는 프로빙 및 섭취 행동을 연구하기 위한 다른 접근 방식에 비해 많은 이점을 가지고 있습니다. 혈액 공급 중 탐침 및 섭취 행동과 타액 분비물을 정량화하도록 설계된 BiteOScope11, flyPAD15 및 자동 생체 재료 플랫폼14와 같은 시스템은 정상적인 숙주 조직 시스템과 숙주 단서가 부족한 투명한 인공 기질 및 유동 식단을 활용합니다. 이러한 합성 플랫폼은 많은 실험 목적에 유용하지만 AC-DC EPG의 분명한 장점은 자연 숙주 시스템 내에서 이러한 절지동물 행동과 관심 변수를 연구할 수 있다는 것입니다. 또한, AC-DC EPG 시스템의 사용자 정의 적응성은 다른 EPG 기기(22,33) 및 EPG 유사 전자 모니터링 장치(16,21)에 비해 추가적인 이점을 제공하며, 이들은 최대 양의 정보로 파형을 획득하고 광범위한 숙주 및 절지동물(22)에 대한 악영향을 최소화하는 데 필요한 조정 가능한 Ri 레벨, 전류 유형 및 전압 레벨을 갖지 않으며, 23. 근전도(EMG) 기술은 혈액 수유를 연구하는 데에도 사용됩니다. 그러나 전기 회로는 일반적으로 절지동물만 포함하고 기록 전극에 가장 가까운 근육 전위만 기록되므로 파형은 세포 파열, 탐침 위치 및 활동, 입 부분을 통한 스트리밍 전위와 같은 숙주-곤충 인터페이스에서 발생하는 자세한 활동에 대한 정보를 제공하지 않습니다28,34. 생체 내 현미경 기술은 살아있는 숙주 조직에서 상세한 입 부분 움직임 및 활동을 직접 시각화하는 데 사용할 수 있지만 이러한 기술은 살아있는 동물 모델에 대한 침습적 절차를 포함합니다9. AC-DC EPG 모니터만이 침습적 절차 없이 살아있는 불투명 숙주 조직에서 발생하는 프로빙, 섭취 및 타액 분비 행동에 대한 매우 자세한 정보를 실시간으로 제공할 수 있으며 다양한 절지동물에 사용하도록 조정할 수 있습니다10,12.

이것은 모기 배선, 곤충 흡인기 구성 및 인간 숙주에 대한 EPG를 수행하기 위한 첫 번째 세부 단계별 절차입니다. 이러한 프로토콜은 인간 숙주를 먹는 모기에 대한 AC-DC EPG의 채택을 촉진할 것으로 예상됩니다. AC-DC EPG를 사용하는 향후 연구 노력의 예에는 혈액 섭취 전 프로빙 행동의 고정관념적 시퀀스 식별, 입 부분을 통한 혈류 조사, 절지동물 종/발달 단계 내 및 간 수식 가소성 비교를 포함하여 혈액 공급 및 숙주 조직 손상의 기본 메커니즘에 대한 연구가 포함될 수 있습니다10 26. EPG는 또한 살충제, 사료 방지제 및 구충제의 효과를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다12. AC-DC EPG를 사용하여 인간 손의 모기를 연구하기 위해 여기에 제시된 절차는 이러한 연구를 가속화하고 모기 혈액 먹이체 생물학에 대한 새로운 통찰력을 가능하게 할 것입니다.

공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다. 이 간행물에서 상표명 또는 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부의 추천 또는 보증을 의미하지 않습니다. 이 보고서의 결론은 저자의 결론이며 반드시 USDA의 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모기 배선 절차를 개척한 오클라호마 주립 대학의 Astri Wayadande 교수와 캘리포니아 팔리어에 있는 USDA-ARS의 Elaine Backus 박사, EPG 장비 문제 해결에 도움을 준 플로리다주 게인즈빌에 있는 EPG Technologies Inc.의 Andrew Dowell에게 감사드립니다. 또한 모기를 제공한 캔자스주 맨해튼에 있는 USDA-ARS 곤충병원의 더스틴 스완슨(Dustin Swanson) 박사와 윌리엄 야넬(William Yarnell) 씨, 그리고 절차적 비디오 촬영에 도움을 준 캔자스주 맨해튼에 있는 캔자스 주립대학교의 미리암 루힌다(Miriam Ruhinda) 씨에게 감사드립니다. 이 작업은 캔자스 주립 대학의 IEMC(Integrated Molecular Entomology Core)에 대한 액세스로 가능했습니다. 이 연구는 USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement(#58-3022-0-002) 및 Hatch Multistate Project(NE1943)의 지원을 받았습니다. 이 원고는 미국 캔자스주 맨해튼에 소재한 캔자스 주립대학교 캔자스 농업실험소의 기고 번호 24-194-J입니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Instrumentation
AC-DC 4채널 전기 침투 그래프EPG Technologies, Inc.EPG의 경우 전원 공급 장치, 제어 상자, 스위치 인터페이스 상자, 4개의 헤드 스테이지 증폭기, 4개의 기판 전압 프로브 및 관련 코드 포함
Amazon.comEPG
DI-710 데이터 수집 하드웨어(AD 보드)DATAQ Instruments Inc.아날로그 EPG 신호를 디지털화하여 컴퓨터에서 시각화 할 수 있습니다
디밍이 가능한 LED 돋보기, 대형 5X 핸즈프리 돋보기 (조명과 스탠드) 독서 취미 공예 재봉 워크 벤치EPG 중 행동 관찰을위한 Amazon.com; EPG 중에만 플러그를 뽑거나 소음이 발생할 수 있습니다
EPG
Dino-Lite Flex-arm 데스크탑 스탠드Dino-LiteMS22B카메라 고정 및 조작용
Eisco Steel Retort 베이스 스탠드 및 로드 세트Fisher ScientificS41740헤드 스테이지 앰프 고정 및 패러데이 케이지 접지용(금속으로 제작되어야 함)
EPG 온라인 워크샵UF IFAS 확장https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022일명, EPG (기기 설정, 데이터 수집 및 분석, 패러데이 건설,은 접착제 준비, 곤충 스텁 건설 등) 학습을위한 "온라인 리소스"
Furman P-1800 AR 파워 레귤레이터/파워 컨디셔너노이즈 감소를 위한Amazon.com
호스트와 패러데이 케이지 사이의 장벽으로 사용하기 위한소형 버블 쿠셔닝 랩Amazon.com
Troemner Talboys Labjaws 레귤러 클램프 홀더Fisher Scientific02-217-121헤드 스테이지 앰프 고정 및 패러데이 케이지 접지용(금속으로 만들어져야 하며 플라스틱으로 코팅되지 않아야 함)
EPG 및 통계 분석을 위한Windows 컴퓨터Best Buy
Software
Backus 2.0 데이터 분석 SAS 프로그램 UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/파형 데이터의 통계 분석용
Ebert 1.0 File Manipulator 및 Error Checker SAS 프로그램UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/파형 데이터의 통계 분석을 위한 파일 준비용
SAS 버전 9.4SAS Institute, Inc.파형 데이터의 통계 분석용
WinDaq Lite DATAQ 인스트루먼트 Inc.EPG 데이터를 기록하고 검토하기 위해  WinDaq 하드웨어 관리자 소프트웨어(AKA, "하드웨어 관리 소프트웨어") 및 WinDaq 파형 브라우저 소프트웨어(AKA, "파형 검토 소프트웨어")가 포함되어 있습니다. Windows 컴퓨터에서만 사용할 수 있습니다. 
Faraday Cage
Aluminum screen frameHome Depot MSCF5167for  Faraday cage
Aluminum Sheet, 0.125 (1/8) 두께 3003-H14Metals DepotS318Faraday cage Corner
braces의 기본, 1" Home Depot339547패러데이 케이지의 벽을 위한
플랫 헤드 필립스 기계 나사, #6-32 x 1"데이 케이지 구조를 위한Home Depot459999
플랫 와셔, #6 패러데이 케이지 건설을 위한Home Depot638977
Fluke 15B+ 디지털 멀티미터는 전기 애플리케이션용이며 최대 1000V 및 10A의 AC/DC 전압 및 전류 측정을 측정하며 패러데이 케이지
휴대용 라디오 AM FM, Goodes 트랜지스터 라디오와 라우드 스피커, 헤드폰 잭, 장거리 수신을 위한 2AA 배터리 작동 라디오, 실내, 실외 및 비상 사용을 위한 포켓 라디오Amazon.comFaraday Cage
Pure 구리 스크린을 테스트하기 위한 것, 16 x 16 메시와 0.11 와이어 직경, 36" x 12'MetroScreenworks를 위한   패러데이 케이지의 벽
라운드 헤드 콤보 기계 나사, #6-32 x 3/4"Home Depot528466패러데이 케이지 건설용
모래 종이, 1/2" by 1", 150 GritHome Depot19036-20-CC실험실 스탠드 바닥의 페인트를 제거하기 위한
스크린 프레임 모서리, 5/16" Home DepotWCORN516 for  패러데이 케이지
벽 스크린 스플라인, 0.14" Home Depot3034719패러데이 케이지의 벽
Insect Stubs
Brass Escutcheon PinsHome Depot801294곤충 스텁을 건설하기 위한 것   
구리선, 곤충Amazon.com   
Harris 수용성 독감 Home Depot355398곤충 스텁 와이어를 납땜 코팅하고 강력한 연결을 형성하는 데 도움이 됩니다
바늘 모양의 플라이어곤충 스텁을 만들 때 와이어를 구부리기 위한Home Depot
Pro's Kit 900-015 Helping Hands 납땜 보조기Amazon.com납땜 중 에스커천 핀을 잡기 위한
솔더링(로진 코어 포함),Home Depot296497곤충 스텁을 만들기 위해   
곤충 스텁을 만들 때 구리선을 벗겨내고 절단하기 위한와이어 커터 스트리퍼 도구Home Depot
YIHUA 928D-III 납땜 인두, 110W 고출력, 완전 디지털 디스플레이 납땜 인두Amazon.com곤충 스텁 건설을 위한 것; 청소를 위한 스탠드, 스폰지, 스틸 울이 함께 제공됩니다
Insect Aspirator
Accuris ASPIRE 실험실 흡인기Accuris 기기V0020; 휴대용 진공 컨트롤러, 미세 팁(40mm) 스테인리스 스틸 어댑터, 피펫 팁 어댑터가 포함되어 있습니다.
Chemglass Life Sciences 파스퇴르 피펫, 5 3/4" 길이의Fisher ScientificNC0230004모
기를 배선할 때 곤충 흡인기로 사용됩니다.수정된 파스퇴르 피펫을 진공 라인에 부착하기위한홈 디포
모기가 진공 펌프로 흡인되는 것을 방지하기위한10 x 10cm 정사각형Joann Fabrics16651622
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914다양한 변형 파스퇴르 피펫 간 빠르고 쉬운 전환용
Thermo Scientific Nalgene HDPE Quick Disconnect(3/8 - 7/16 in. 신분증)다양한 수정된 파스퇴르 피펫 간의 빠르고 쉬운 전환을 위한Fisher Scientific15-315B
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Multi Purpose White GlueAmazon.comfor silver glue preparation
Silver Flake 99.9% pure,  4-8 µ mThermoFisher786.09은 접착제 준비용
Silver Flake 99.95% 순수, 8-10 µ mInframat Advanced Materials47MR-12F은 접착제 준비<
u>Insect Anesthesia
CO2 버블러 키트, 1000 mL, #9 고무 스토퍼FlyStuff59-181플라이패드 Flypad를 사용하여 곤충 건조를 방지합니다
프레임, 표준 크기FlyStuff59-118모기가 플라이패드에서 떨어지는 것을 방지하기 위한
것입니다. Flystation BrushFlyStuff59-205는 플라이 패드 작업 시 정전기를 줄이기 위한
것입니다. 플라이패드  표준 크기FlyStuff59-114일명 "마취 패드" 모기 마취용
깔때기(직경 4인치)Amazon.com플라이패드로 옮기기 전에 모기 컵에 가스를 주입하기 위한
Plexi 유리 또는 평평한 플라스틱 뚜껑(크기에 맞게 절단)Home DepotMC-27모기가 깨어나
기 시작하면 플라이패드를 덮기 위한 것입니다.플라이패드와 퍼널 사이의 가스를 전환하기 위한Amazon.com
CO<2 조절기FlyStuff59-142COsub>2 tank"에서 가스의 흐름을 조절하기 위한
T” 플라이패드와 퍼널을 CO2 탱크FlyStuff59-123
, 투명 깔때기와 플라이 패드를 CO의 조절기에 연결하기위한FlyStuff59-124C
Insect Wiring< / strong>< / em>< / u>
Black 카드 스톡, (65Lb, 176 g / m 2< / sup >) 8.5 "x 11"Michael's Stores Inc.금선을 쉽게 시각화할 수 있도록327826
검은색 구조용 종이 사각형 3.5" x 4.0"선을 쉽게 시각화할스테이플,금
면봉,식 모기를 위한Amazon.com
크래프트 폼 #12 블록,Joann Fabric and Craft Store와이어 모기를 잡기 위한1941079
Deflecto Ribbon 디스펜서,금선 보관용Amazon.com
깃털 무게 곤충학 집게곤충 조작을 위한Fisher ScientificS72110
미세 집게(Dumont의 FST: #5 91150-20, Inox-Electronic)기를 배선할 때 금 고리를 만들기 위한Fine Science Tools91150-20
미세 포인트 페인트 브러시Amazon.com배선 및 EPG 중 모기를 조작하기 위해; EPG
Fine-tip 표준 전사 피펫, 좁은, 은접착제 준비용Thomas Scientific7761D21
금선, 99.99% 순수, 0.025mm 두께GoodfellowAU005121모기 배선용
Minutien 핀, 팁 0.2mm, 1cmFisher ScientificNC9681411모기에 접착제를 바르는 데
종이컵 강성 종이 튜브     
곤충 배선 중 미세 핀을 잡기 위한핀 바이스Fisher Scientific50-996-811
이 있는 플라스틱 보관 상자(7인치 x 9인치 x 14인치)Amazon.com유선 모기 운반용
플렉시 유리 또는 평평한 플라스틱 뚜껑(크기에 맞게 절단)Home DepotMC-27모기가 깨어나기 시작하면 플라이 패드를 덮기 위한
폐쇄 집게Fisher Scientific08-906금 와이어 고정 및 조작
Compressed Gas
COsub2 gas tankMatheson Gas플라이패드로 모기 마
Common Lab Items
생물학적 위험 일회용 오토클레이브 백, 8 1/2" x 11"피셔 사이언티픽03-410-591혈액 공급 모기
처리를 위한 분젠 버너 또는 프로판 토치 파스퇴르 피펫 수정을 위한Amazon.com
실험실 테이프Daigger 소모품라벨링, 은 접착제 준비 및 겸자 마스킹
일회용 피펫 팁, 1000 &마이크로; L피셔 사이언티픽 은 접착제를 만들 때 물을 분취하기 위해
, 해부 현미경Leica Microsystems, 모기를 배선하기 위해
, 해부 프로브, Fisher ScientificNC9109673젓기 위해  그리고 은 접착제를 바르기 위해
, 삼각 플라스크, 1000 mLFisher Scientific 플라이패드 사용 중 곤충 건조를 방지하기 위해
에탄올, 70% 한 모기를 복구하는Fisher Scientific04-355-122
유리 페트리 접시Fisher Scientific08-747B는 얼음 장갑으로 모기를 마취시키는 데 사용됩니다
보호를 위한Fisher Scientific
Kimwipes KimTech Science 브랜드의 섬세한 작업 와이퍼 Fisher Scientific06-666모기 분쇄
실험실 코트Fisher Scientific의 개인 보호를 위한
LiBa 스프레이 병, 리필 가능한 빈 스프레이 병(알코올 세척 안전)Amazon.com탈출한 모기를 복구하기 위한
자석 스티어 바, 2cm 길이의Fisher Scientific 은 접착제
기계적 단일 채널 피펫, 1000 µ를 혼합하기 위해; L피셔 사이언티픽 13-690-032만들 때 물을 분취하는
, 1.5 mLFisher Scientific 780420은 접착제
파라 필름 M Fisher Scientific50-998-944은 접착제 튜브 밀봉
플라스틱 랩Amazon.com폼 블록
Pyrex 20 mL 비커Fisher Scientific 07-250-051은 접착제
세미 마이크로 밸런스혼합 Fisher Scientific 10-919-370무게를 측정하기 위한 접착제와 은 플레이크
Sharpie 펜, 라벨링을 위한점 Amazon.com
단일 가장자리 면도날전자 현미경 과학71980곤충 스텁 청소를 위한
표준 일회용 전송 피펫Fisher Scientific 은 접착제를 저장 튜브로 옮기기 위한133-711-7mL
교반 플레이트Fisher Scientific 은 접착제
혼합용 타이머/스톱워치시간을 측정하는
Fisher Scientific 은 접착제 준비
유틸리티 가위Fisher Scientific08-945금 와이어
절단 용 Vortex 믹서Fisher Scientific 은 접착제 혼합용
Study Organisms
Culex tarsalis 모기대상으로 사용
Dino-Lite Edge Digital Microscope (250x 배율) Dino-Lite AF4915ZT 라인 , 패러, 테스트에 Amazon.com 저항, 연속성, 다이오드 및 커패시턴스 기능을 제공합니다. 스텁 건설을 위한 20 AWG . , ,, , , 곤충 흡인기에 흡입을 적용하기 위한 은 상업용 전기 컬러 비닐 전기 테이프 모기장 유틸리티 패브릭, 은 .은 단일 위치 및 조절 가능한 개방 (다양한 1/8"에서 1/2") 차단튜빙에 연결하기 위한 1/8in ID 튜빙 용 피팅, 금수 있도록 956221 색 모기를 쉽게 시각화하기 위한 단, , 투명 모5.8mL 의 사용하는 경우 금식 모기를 위한 뚜껑 자동 , 취분젠 버너 또는 프로판 토치 컬러EF9763R을 만들기 위해, 를 사용하기 위해를 탈출데 사용되는 . 개인 용 은 접착제 마이크로 원심분리기 튜브를 경우를 덮기 위해 세밀한   숙주가 각 곤충 초순수(18MΩ) 물에 노출되는 Fisher Scientific 연구

참고문헌

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