방법 논문

인간의 손에 Culex tarsalis 모기의 프로빙 및 섭취 행동 연구를 위한 AC-DC 전기 침투 검사

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DOI:

10.3791/66877

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2024년 11월 29일

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1Department of Entomology, Kansas State University, 2Department of Pathobiology, Auburn University, 3National Bio and Agro-Defense Facility, USDA Agricultural Research Service

이 논문에서

요약

AC-DC 전기 침투를 사용하여 사람의 손에 있는 Culex tarsalis 모기의 프로빙 및 섭취 행동을 연구하기 위한 절차가 설명되어 있습니다.

초록

모기는 인간과 동물의 건강에 부정적인 영향을 미치는 병원체를 전염시킵니다. 모기의 혈액 공급 생물학과 숙주 및 병원체와의 상호 작용에 대한 더 큰 이해는 모기 매개 질병을 통제하기 위한 새로운 표적을 개발하는 데 활용될 수 있습니다. 불행히도, 모기의 탐색(즉, 무는 행동)은 숙주 조직 내부에서 발생하기 때문에 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 AC-DC EPG(Electropenetrography)를 사용하여 사람의 손으로 프로빙 및 섭취할 때 발생하는 전기 신호의 변화를 기록하여 모기 섭식 행동을 간접적으로 시각화하고 정량화하기 위한 비침습적 절차를 설명합니다. 얇은 금선은 접착제를 사용하여 모기에 부착하고 EPG 기기에 연결합니다. 인간 숙주는 손에 기판 전압 프로브를 들고 있습니다. 유선 모기에 의한 숙주 탐사로 전기 회로가 완성되고 전기 신호는 컴퓨터에 "파형"으로 기록된 다음 분석을 위해 측정하고 열거할 수 있습니다. 이 방법론은 Aedes aegypti와 Culex tarsalis 모기의 탐색 및 섭취 행동을 특성화하는 데 사용되었으며 다른 모기 종에 적용할 수 있습니다. EPG는 병원체, 살충제 및 기타 요인이 모기 먹이 행동에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

모기는 질병 매개체와 성가신 해충으로서의 역할로 인해 전 세계적으로 고통과 경제적 손실을 초래합니다1. 아노펠레스 모기는 매년 전 세계적으로 약 2억 1,900만 건의 발병, 400,000명 이상의 사망2, 120억 달러의 직접 비용3을 유발하는 말라리아를 전염시킵니다. 흰줄숲모기는 거의 전 세계적으로 존재하며 치쿤구니야, 뎅기열, 림프사상충증, 리프트 밸리 열, 황열병, 지카 바이러스의 병원체를 전염시켜 생명을 앗아가고, 의료 시스템을 압도하며, 만성 고통, 평생 이환율 및 장애를 초래하기 때문에 공중 보건의 중요성에서 가장 주목할만한 매개체입니다.4,5. 또한 큘렉스 모기는 말 뇌염, 일본 뇌염, 림프 사상충증, 세인트루이스 뇌염 및 웨스트 나일 열의 병원체를 전염시켜 인간과 동물의 건강에 영향을 미칩니다.3,4.

살충제 기반 접근법을 사용한 매개체 방제는 전 세계적으로 매개체 매개 질병을 통제하는 주요 방법입니다6,7. 그러나 모기 방제에 사용할 수 있는 살충제의 수는 제한되어 있습니다. 또한 많은 종, 특히 흰줄숲모기에서 살충제 내성이 진화하고 있어 매개체 매개 질병과 싸우는 능력에 영향을 미치고 새로운 방제 전략의 필요성을 주도하고 있습니다6,8. 모기 생물학, 모기-숙주-병원체 상호 작용 및 병원체 전파를 조절하는 과정에 대한 더 나은 이해는 벡터 제어를 위한 새로운 도구의 개발을 촉진할 수 있습니다6.

숙주 조직의 탐색 및 섭취 동작은 병원체 전파 및 질병 병리학에 영향을 미칠 수 있습니다9,10,11,12. 예를 들어, 이집트숲모기(Aedes aegypti)가 파열된 혈관 외부에 고인 혈액이 아닌 모세혈관에서 직접 먹이를 먹었을 때 더 많은 미세사상충이 섭취되었습니다13. 따라서 이 주제에 대한 기초 및 응용 연구는 병원체 전파에 대한 모기 방제 전략 및 기타 대책을 개발, 개선 및 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 숙주의 피부 표면 아래에서 발생하는 수수께끼 같은 흡혈 행동에 대한 세부 사항에는 상당한 지식 격차가 존재하는데, 이러한 행동은 종종 살아있는 동물 모델에 대한 침습적 절차를 필요로 하거나 투명한 인공 기질 또는 액체 식단을 사용하기 때문입니다9,11,14,15. 비침습적 전기 침투 검사(EPG, 전기 침투 그래프라고도 함) 기술은 연구자가 숙주 조직 내에서 발생하는 입 부분의 움직임 및 행동을 간접적으로 관찰, 기록 및 정량화할 수 있기 때문에 식물 병원체 전달, 숙주 식물 저항성 및 살충제 작용 방식과 관련된 식물 먹이 곤충의 섭식 행동을 연구하는 데 사용되었습니다10,12.

1950년대 이래로 전자 침투 모니터링 기술이 모기를 포함하여 혈액을 먹는 절지동물에 적용되었습니다16,17,18,19,20. 그러나 파형에 해당하는 생물학적 활성이 검증되지 않았기 때문에 EPG는 혈액을 섭취하는 절지동물에 널리 채택되지 않았습니다21. 또한 초기 기기의 설계 및 전자 장치는 일부 전기 신호의 과도한 강조, 높은 노이즈 대 신호 비율, 파형의 낮은 해상도 및 왜곡, 척추 동물 호스트에 대한 짜증을 초래했습니다12,22. 보다 최근의 기기인 AC-DC EPG 모니터23은 가변 설정과 향상된 신호 처리 기능을 갖추고 있어 실험적 상관 관계 연구에서 혈액을 공급하는 절지동물을 기록하고 파형의 생물학적 기원을 해독하는 데 더 적합합니다10,12.

EPG의 경우 전기 신호는 기판 전압 프로브(즉, 기준 전극)를 통해 호스트에 적용됩니다. 절지동물은 기록 전극에 부착되어 숙주에 배치됩니다. 절지동물이 입 부분(즉, 탐침)을 숙주에 삽입하면 전기 신호는 신호 처리를 위해 AC-DC EPG 모니터로 전달됩니다. 그런 다음 전기 신호는 입 부분의 움직임, 섭취, 타액 분비 및 병원체 획득/접종과 같은 특정 동작에 해당하는 "파형"으로 컴퓨터에 표시됩니다10,12. 그런 다음 서로 다른 계층 수준(패밀리, 유형 및 하위 유형)에서 파형24,25의 지속 시간 및 수와 관련된 순차 및 비순차 응답 변수를 파형의 빈도 및 지속 시간을 기반으로 계산하여 종 내부 및 종 간에 발생하는 공급 거동에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 숙주, 병원체, 살충제 및 환경 조건과 같은10,12.

지금까지 AC-DC EPG 모니터는 Ae. aegypti26 및 Culex tarsalis27 모기는 사람의 손을 먹고 Dermacentor variabilis와 Amblyomma americanum 진드기는 소 송아지를 먹습니다28. 또한 이 기기를 사용하여 병원체 연구를 용이하게 하기 위해 EPG29에 대한 쥐 모델이 최근에 개발되었습니다. 인간의 손은 인간 숙주가 모기 탐색과 다른 행동을 느낄 때 보고할 수 있어 파형과 행동의 상관 관계를 더 쉽게 만들 수 있기 때문에 초기 모기 파형 특성화에 이상적입니다(표 1). 또한, 서로 다른 인간 개체군에 있는 모기들 사이의 섭식 행동의 가소성에 대한 더 나은 이해는 모기와 모기가 전염시키는 병원체에 대한 보다 전문화된 관리 개입의 개발에 기여할 수 있습니다.

표 1: AC-DC EPG를 사용하여 Culex tarsalis에서 기록된 전기 신호를 사람의 손으로 분류하는 데 사용되는 파형 제품군에 대한 설명입니다. 각 파형 제품군에 해당하는 프로빙 단계 및 생물학적 활성. 자세한 내용은 Cooper et al.27 을 참조하십시오. 약어 : AC = 교류, DC = 직류, EPG = 전기 침투계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

모기 생물학 및 숙주-매개체 상호 작용을 연구하기 위해 EPG를 사용하여 모기 생물학 및 숙주-매개체 상호 작용을 연구하는 데 용이하게 하기 위해 AC-DC EPG 모니터를 사용하여 인간의 손에 있는 Cx. tarsalis 모기의 섭식 행동을 정량화하는 방법론이 여기에 제시되어 있습니다. 이러한 프로토콜은 온라인 리소스30에 설명된 기본 AC-DC EPG 절차를 기반으로 하며 사용자가 AC-DC EPG 및 관련 소프트웨어에 대한 기본 작업 지식을 가지고 있다고 가정합니다31. 설명된 절차는 다른 모기 및 숙주 종에 대해 수정할 수 있으며 모기 섭식 행동에 대한 가설 기반 연구를 용이하게 하기 위한 기반을 제공합니다.

표 2: 일반적인 AC-DC EPG 용어의 정의. 정의는 온라인 리소스30,31 및 과학 문헌32에 제공된 정의를 기반으로 합니다. 약어 : AC = 교류, DC = 직류, EPG = 전기 침투계. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

본 프로토콜(IRB-10729)은 캔자스 주립대학교(Kansas State University)의 인간 대상 연구 기관생명윤리위원회(IRB)27의 승인을 받았으며, 병원균이 없는 모기에게만 사용하는 것을 목적으로 합니다. 인간 지원자들은 연구 참여 및 데이터 공개에 대해 고지된 동의를 하였습니다. 동물, 인간 또는 생물학적 위험 물질을 이용한 모든 작업을 시작하기 전, 모든 절차가 해당 기관의 규제 위원회나 감독자의 검토 및 승인을 받았는지 확인하십시오. 본 프로토콜에 사용된 모든 장비와 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 초기 준비 및 설정

  1. AC-DC EPG 모니터를 설정하십시오.그림 1A), 패러데이 케이지 (그림 1B,C), 그리고 앞서 설명한 소프트웨어30,31 아래에 기술된 수정 사항(단계 1.1.1-1.1.5)을 사용하십시오. 온라인 리소스를 참조하십시오.30 장비 및 소프트웨어 설정과 사용법에 관한 단계별 튜토리얼을 참조하십시오. 하드웨어 관리 및 파형 분석 소프트웨어에서 원하는 설정을 기본값으로 저장하십시오. 다음을 참조하십시오. 표 2 일반적인 AC-DC EPG 용어 목록 및 정의입니다.
    1. 헤드 스테이지 증폭기(head amp)와 기질 전압 프로브를 컨트롤 박스의 채널 1에 연결하십시오.
      참고: AC-DC 모니터는 동시에 4마리의 곤충과 기주를 수용할 수 있으나, 단일 채널에서의 기록 과정만 제시합니다.
    2. 컨트롤 박스의 채널 1(Channel 1)이 켜져 있는지 확인하고, 스위치 인터페이스 박스의 해당 Pre-1 및 Post-1 채널이 켜져 있는지 확인하십시오.
      참고: 사용하지 않는 채널은 꺼진 상태로 유지해야 합니다.
    3. 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하여 DI-710 A/D 보드의 채널 1과 3만 활성화(그 외 채널은 비활성화)하여 정류 전후의 신호를 기록하십시오.
    4. 하드웨어 관리 소프트웨어를 설정하여 보정 전후의 파형을 확인하거나 중첩하여 표시하십시오(예: 보정 전 신호는 1 = 1로, 보정 후 신호는 2 = 3으로 설정).
    5. 하드웨어 관리 소프트웨어에서 샘플링 속도를 채널당 초당 100개 샘플(즉, S/s/CHAN: 100).
  2. 곤충 표본 제작26,27,29,30:
    1. 특정 로진 코어 솔더에 권장되는 온도로 인두기를 예열하십시오.
    2. 와이어 커터-스트리퍼 도구를 사용하여 20 AWG 구리선 롤의 끝부분에서 플라스틱 코팅을 약 6cm 정도 벗겨내되, 내부의 구리선 다발이 절단되거나 흠집이 나지 않도록 주의하십시오.그림 2A). 그 후, 노출된 구리 전선 묶음을 절단하여 개별 가닥으로 풉니다 (그림 2B).
    3. 롱노즈 플라이어를 사용하여 구리선의 한 가닥을 적절한 에스커천 핀(escutcheon pin)의 머리(즉, 평평한 윗부분) 아래쪽 샤프트에 감아, 구리선의 대부분이 핀의 머리 너머로 뻗어나오게 합니다. 와이어의 끝부분을 핀의 머리 위로 접어 와이어를 고정합니다.그림 2C).
      참고: 헤드 앰프의 포트에 딱 맞게 끼워지는 핀을 찾기 위해 에스커천 핀의 적합성을 테스트하십시오(이 작업은 헤드 앰프의 전원을 끄고, 플러그를 뽑은 후, 10으로 설정한 상태에서 수행하십시오).6 옴(Ω)).
    4. 에스커천 핀의 샤프트를 헬핑 핸드 납땜 보조 도구로 고정하여 구리선이 위쪽을 향하게 합니다. 그다음, 에스커천 핀과 구리선의 접합부에 수용성 플럭스를 소량(~0.2cm 크기의 구형) 도포합니다.그림 2D).
      주의: 플럭스는 독성이 있으므로 주의하여 취급해야 합니다.
    5. 납땜용 솔더를 약 10cm 정도 풀어서 곧게 폅니다. 플럭스가 녹고 금속이 가열될 때까지 뜨거운 인두기를 핀의 머리 부분에 몇 초간 댑니다. 그다음, 솔더가 녹아 접합부를 완전히 덮을 때까지 솔더의 끝부분을 인두기 옆의 핀 머리에 눌러 핀과 와이어를 융합시켜 곤충 스텁(insect stub)을 만듭니다.
    6. 곤충의 그루터기가 식는 동안, 스틸 울과 젖은 스펀지로 인두기의 팁을 닦아내십시오.
    7. 냉각되면 헬핑 핸드(helping hands)에서 곤충 스터브를 제거하십시오. 70% 에탄올과 물로 곤충 스터브를 차례로 헹구어 잔류 플럭스를 제거합니다. 구리선을 원하는 길이(~3 cm)로 자릅니다. 그림 2E).
    8. 곤충 스터브가 20~30개 제작될 때까지 단계 1.2.3-1.2.7을 반복하십시오.
  3. 곤충 흡입기 조립하기26,27:
    1. 유리 파스퇴르 피펫의 끝부분을 불꽃에 통과시키며 피펫을 약간씩 회전시킵니다. 피펫의 끝부분이 곤충의 복부를 단단히 감쌀 수 있는 적절한 크기가 될 때까지 이 과정을 반복합니다.
    2. 변형된 파스퇴르 피펫의 넓은 끝부분을 모기장 망으로 덮은 다음, 이를 실험실 흡입기에 연결된 실리콘 튜브에 직접 삽입하고, 접합부를 전기 테이프로 고정하여 곤충 흡입기를 제작합니다.그림 2H).
      참고: 파스퇴르 피펫과 네팅(netting)은 퀵 디스커넥터(quick disconnector)가 장착된 짧은 플라스틱 튜브 조각에 삽입하여 다양한 크기로 쉽게 교체할 수 있습니다(그림 2H).

EEG 기록을 위한 전기생리학 실험실 설정; 증폭기, 컴퓨터, 패러데이 케이지 및 센서 포함.
그림 1인체 손 기록을 위한 AC-DC EPG 모니터 장비 설정. (A) 다음을 포함하는 EPG 구성 요소: (1) 제어 박스, (2) 스위치 인터페이스 박스, (3) 전원 공급 장치, (4) DI-710 A/D 보드, (5) 컴퓨터, (6) 전압 조정기 및 (B) ( 을(를) 포함하는 패러데이 케이지C) 구즈넥 스탠드에 고정된 디지털 현미경 (7), (8) 에어캡 및 에어 필로우, (9) 기질 전압 프로브, 그리고 실험실 스탠드에 장착된 헤드 스테이지 증폭기 (10). 약어: AC = 교류, DC = 직류, EPG = 전기침투도표. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

튜브, 와이어 및 도구를 사용한 카테터 조립 과정; 유체 전달을 위한 실험 설정 도식.
그림 2: 모기 배선을 위한 기록 전극과 배선 과정 중 모기 조작을 위한 곤충 흡입기. (A) 내부의 구리 와이어 번들을 노출시키기 위해 6 cm의 플라스틱 코팅을 제거한 20 AWG 구리 와이어. (B) 구리 와이어 번들의 개별 가닥들. (C) 황동 에스커천 핀의 머리 부분에 감겨 있으며 와이어 끝단이 핀 머리 위로 접힌 구리 와이어 한 가닥. (D) 납땜 준비를 위해 헬핑 핸즈 납땜 보조 도구로 고정한 황동 에스커천 핀과 구리 와이어의 접합부에 도포한 플럭스. (E) 구리 와이어에 납땜된 황동 못으로 제작된 완성된 곤충 스텁. (F) 곤충 스텁의 구리 와이어 끝부분에 금 와이어를 감고 은 접착제로 고정하여 제작한 기록 전극. (G) 기록 전극 끝부분의 금 루프 확대 사진. (H) 변형된 파스퇴르 피펫, 모기장, 플라스틱 튜브, 전기 테이프 및 수형 퀵 디커넥터로 만든 조립된(위) 및 분해된(아래) 곤충 흡입기와 암형 퀵 디커넥터가 장착된 실험실 흡입 튜브(우측 상단). 스케일 바 = 1 cm (A-F), 200 µm (G). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 모기의 배선

  1. 모기 및 실버 글루 준비 (EPG 전날 오후/저녁):
    1. 이전에 설명한 대로 Cx. tarsalis KNWR strain 모기를 사육하고 유지한다27.
    2. 우화 후 5-17일 된 성체 암컷 모기를 8-12시간 동안 금식시켜 탐침률을 높이되, 폐사를 방지하기 위해 물은 제공한다.
    3. 신선한 실버 글루를 준비한다26,27,28,29,30:
      1. 20 mL 비커에 4-8 µm 실버 플레이크 510 mg을 넣는다. 저울의 영점을 잡고 실버 플레이크 위에 독성이 없는 학교용 풀 1,100 mg을 추가한다.
      2. 저울의 영점을 잡고 풀 위에 8-10 µm 실버 플레이크 510 mg을 추가한 다음, 피펫을 사용하여 물 1,000 µL를 넣는다.
      3. 비커에 교반자를 조심스럽게 넣고 교반기에 올린다. 천천히 교반하기 시작하여 점차 '빠름' 설정까지 속도를 높여 4분 동안 교반한다. 모든 성분이 완전히 혼합되었는지 확인한다.
      4. 팁을 잘라낸 전송 피펫을 사용하여 실버 글루를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.
      5. 실버 글루 튜브의 윗부분을 Parafilm으로 감싸고 사용 전까지 벤치탑에 보관한다.
        참고: 실버 글루는 최대 2일 동안 적절한 점도를 유지하지만, 사용 전날 저녁에 신선하게 만드는 것이 권장된다30.
  2. 기록 전극 준비26,27,29,30:
    1. 사용 전 실버 글루를 강하게 보텍싱한다.
    2. 준비된 곤충 스텁과 전극이 연결된 모기를 고정하기 위해 폼 블록을 신선한 플라스틱 랩으로 감싼다.
      참고: 폼은 전극이 연결된 모기들이 서로 닿지 않고 표면에 서 있을 수 있을 만큼 충분히 커야 하며, 보관 상자 안에 들어갈 수 있을 만큼 적당한 크기여야 한다. 주의: 흡혈 후 배출되는 배설물 방울에는 병원체가 포함되어 있을 수 있다. 사용 후 플라스틱 랩/폼 블록을 적절하게 폐기한다.
    3. 면도날로 구리선 끝부분의 상단 1 cm를 모든 면이 반짝일 때까지 긁어내어 변색된 부분(및 곤충 스텁을 재사용하는 경우 오래된 실버 글루)을 제거한다. 각 모기당 하나의 곤충 스텁을 준비하고, 몇 개의 여분을 추가로 준비한다.
    4. 직경 0.025 mm의 금선을 4-5 cm 길이로 자른다. 금선이 찌그러지지 않도록 항상 테이프로 감싼 셀프 클로징 포셉으로 금선을 잡는다.
      참고: 금선은 검은색 배경에서 훨씬 더 잘 보인다.
    5. 금선 끝을 곤충 스텁의 깨끗한 구리선 끝에 맞추고 금선을 구리선 주위로 3번 조심스럽게 감는다.
    6. 해부용 프로브를 사용하여 실버 글루를 도포해 금선을 고정한다. 꼬리 부분이나 느슨한 끝단이 없는지 확인한다. 글루가 마를 때까지 곤충 스텁을 폼에 꽂아둔다.
    7. 곤충 스텁에 부착된 금선을 조심스럽게 쓸어내려 길고 완만한 호 모양으로 매끄럽게 만든다(그림 2F). 금선을 원하는 길이(~2.5-3 cm)로 다듬는다.
    8. 해부 현미경 하에서 정밀 포셉을 사용하여 금선 끝에 금 루프를 만들고, 아래에 설명된 대로 루프를 90° 각도로 구부린다(단계 2.2.8.1-2.2.8.4; 그림 2E,F). 금 루프가 완전히 닫혔는지 확인한다. 곤충 스텁을 다시 폼 블록에 꽂는다.
      1. 비주동손으로 놋쇠 못 부분을 잡아 곤충 스텁을 고정하고, 금선 팁이 현미경 스테이지에 닿게 한다. 주동손으로 정밀 포셉을 사용해 금선의 맨 끝부분을 잡는다.
      2. 정밀 포셉을 사용하여 금선의 팁을 금선이 접착된 곳 근처의 곤충 스텁 구리선 위로 교차시킨다. 정밀 포셉의 끝과 금선을 현미경 스테이지에 내려놓는다.
      3. 금선이 정밀 포셉 끝 주위로 작은 금 루프를 형성할 때까지 곤충 스텁을 조심스럽게 당긴다(너무 세게 당기지 않는다). 금선을 놓고 포셉을 조심스럽게 제거한다.
      4. 비주동손으로 여전히 곤충 스텁을 잡은 상태에서, 포셉이 금선의 목 부분과 수직이 되고 포셉 팁이 금 루프의 중앙에 위치하여 루프의 양쪽을 모두 잡도록 정밀 포셉으로 금 루프를 잡는다. 포셉을 곤충 스텁 반대 방향으로 가볍게 회전시키면서 곤충 스텁을 조심스럽게 당겨 루프가 금선 목에 대해 90° 각도로 굽어지게 한다(그림 2G).
  3. 모기에 기록 전극 부착26,27,29,30 (EPG 당일 아침):
    1. 금식시킨 모기가 모든 움직임을 멈출 때까지 CO2 가스로 마취시킨다. 모기의 복부가 연구자를 향하도록 마취 패드 위에 배를 하늘로 향하게 놓는다.
    2. 해부 현미경 아래에 약 2 cm 길이의 실험용 테이프를 접착면이 아래로 가게 놓는다. 테이프 위에 실버 글루 한 방울(~ 10 µL, 약 0.5 cm 크기)을 떨어뜨린다.
    3. 마취된 모기의 복부를 수정된 파스퇴르 피펫으로 흡입하며, 복부가 제자리에 안착할 정도로만 짧게 흡입한다. 흡입기를 사용하여 모기를 실버 글루 위의 해부 현미경 하단에 유지한다.
      참고: 날개는 수정된 파스퇴르 피펫의 팁 안쪽이나 바깥쪽에 있을 수 있으나, 안쪽에 두는 것이 모기가 떨어지는 것을 방지하는 데 도움이 된다. 날개가 꺾이거나 손상되지 않도록 주의한다.
    4. 신속하게 미뉴티엔 핀에 실버 글루를 묻혀 모기의 전흉판(즉, 흉부의 등면)에 얇게 도포한다. 가능하면 즉시 다음 단계로 진행한다(필요 시 모기를 재마취한다).
      참고: 핀을 앞뒤로 문질러 전흉판의 인분을 제거하면 큐티클의 구멍으로 글루가 더 잘 침투하도록 하는 데 도움이 된다. 모기의 다른 부분에 글루가 묻지 않도록 주의한다.
    5. 기록 전극 끝의 금 루프를 실버 글루에 빠르게 담근 후, 모기의 전흉판 위에 있는 실버 글루 지점에 놓는다. 루프를 앞뒤로 살짝 움직여 전흉판에 밀착되었는지 확인한다. 글루가 마를 때까지(~20-25 s) 전선을 잡고 기다린다.
    6. 전극이 연결된 모기가 깨어났을 때 편안하게 설 수 있는 각도로 곤충 스텁을 폼에 다시 꽂는다. 다음 모기의 전극 연결 작업을 진행한다.
      참고: 각 연결 작업의 품질에 대해 기록을 남기는 것이 좋다.
    7. 원하는 수의 모기에 전극 연결이 완료되면 폼 블록을 보관 상자에 넣는다. 사용 전까지 모기를 일반 사육 조건에서 유지한다.

3. EPG 설정 및 준비 (EPG 전날 아침)

  1. 기기 평형 도달 및 문제 해결 시간을 확보하기 위해, 녹화 시작 최소 30분 전에 (전원 공급 장치의 스위치를 켜서) AC-DC EPG 모니터를 켭니다.
    참고: 컨트롤 박스와 스위치 인터페이스 박스에서 사용 중인 채널은 켜진 상태로 두어도 됩니다.
  2. 컴퓨터를 켜고 하드웨어 관리 소프트웨어를 실행하십시오.
    참고: 신호가 평평한 직선으로 나타나지 않는 경우, 문제 해결이 필요합니다(토론 섹션 참조).
  3. 촉각 테스트를 수행하십시오.27,30 장비 기능 확인을 위해:
    1. 접지 상태에서(즉, 맨살이 패러데이 케이지에 닿은 상태로), 다음의 다이얼을 돌리십시오. 헤드 앰프 ~로 / ~까지 / ~에게 106 Ω 그리고 곤충 다리 절편의 축을 포트에 삽입하십시오.
      주의: 더 높은 입력 저항(Ri) 수준에서 터치 테스트를 수행하면 헤드 앰프가 손상될 수 있습니다.
    2. 접지 상태에서 헤드 앰프(head amp)를 켜고, 검지와 엄지손가락으로 곤충 스터브(insect stub)의 구리선을 세 번 꽉 잡으십시오. EPG가 정상적으로 작동한다면, 화면의 사전 신호(pre-signal)와 사후 신호(post-signal) 모두에서 세 개의 큰 피크(peak)가 나타날 것입니다. 그렇지 않은 경우에는 문제 해결 과정이 필요합니다(토론 섹션 참조).
  4. 기기 설정을 다음과 같이 조정하십시오. 150 mV 교류 (교류)와 함께 10의 Ri7 Ω, a 20-40배의 하드웨어 게인, a 음의 오프셋, a 기초선(baseline) 수치및 하나의 소프트웨어 게인 ~의 8-16배율27,30아래에 기술된 바와 같이(단계 3.4.1-3.4.3) 수행합니다.
    1. 컨트롤 박스의 채널 1에 있는 스위치와 다이얼을 사용하여 전압, 전류 유형, 하드웨어 게인(범위, 게인 및 배수), 오프셋 및 베이스라인(제로)을 설정하십시오.
      참고: 적절한 하드웨어 게인 설정은 배선 작업 및 은 접착제의 품질에 따라 달라지므로, 모기 개체별 또는 일자별로 최적 게인 설정값에 차이가 있을 수 있습니다. 신호 피크가 발생할 경우(다음과 같이 정의됨) 녹화 도중에 하드웨어 게인을 조정해야 할 수도 있습니다. 표 2 및 ~에 나타낸 바와 같이 그림 3A,C) 또는 시각화하기에 너무 작습니다. 하드웨어 게인 변경 사항은 녹화물에 영구적으로 영향을 미칩니다(다음에 표시됨) 그림 3A,C).
    2. 헤드 앰프의 다이얼을 사용하여 Ri 레벨을 설정하십시오.
    3. 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하여 소프트웨어 게인을 설정 및 조정하십시오 (예: pre 또는 post 신호를 선택한 다음, 좌클릭하여 소프트웨어 게인을 높이거나 우클릭하여 소프트웨어 게인을 낮춤).
      참고: 소프트웨어에서 변경한 게인(gain) 설정은 녹화물에 영구적으로 영향을 미치지 않습니다.
  5. 하드웨어 관리 소프트웨어에서 새로운 녹화 설정을 수행하되, 다음 섹션의 4.3단계 전까지는 녹화를 시작하지 마십시오.

4. 사람 손의 EPG26,27 :

  1. (소속 기관의 IRB에서 규정한 바에 따라) 고지된 동의를 얻은 후, 피험자를 패러데이 케이지(Faraday cage) 옆에 앉히고 한쪽 팔을 케이지 내부로 넣어 기판 전압 프로브를 잡게 하며, 이를 헤드 앰프(head amp) 아래에 유지하도록 합니다.
    참고: 팔은 에어캡이나 이와 유사한 비전도성 기질 위에 편안하게 놓여 있어야 합니다. 기록 중에는 손과 기질 전압 프로브가 패러데이 케이지(Faraday cage)나 헤드 앰프(head amp)에 닿지 않도록 해야 합니다. 손상을 방지하기 위해, 전원이 켜진 후에는 자원봉사자가 헤드 앰프를 만지지 않는 것이 매우 중요합니다. 실수로 헤드 앰프를 만진 경우, 위에서 설명한 터치 테스트를 수행하여 기능 정상 여부를 확인하십시오.
  2. 숙주를 위치시킨 후, 헤드 앰프를 옆으로 돌립니다. 보관 상자에서 유선 모기를 꺼내 곤충 스터브의 황동 핀을 헤드 앰프의 포트에 삽입하여 기기에 연결합니다. 모기는 매달린 상태로 둡니다.
    참고: 와이어에서 떨어지는 모기를 제어할 수 있도록 70% 에탄올 분무기를 가까이 두십시오.
  3. 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하여 기록을 시작하십시오. 모기가 편하게 서서 탐침질을 할 수 있도록 헤드 앰프를 손 위에 배치하십시오.
  4. 접지된 상태에서 헤드 앰프(head amp) 전원을 켭니다. 10분 타이머를 시작합니다. 프로빙 성공을 돕기 위해 필요에 따라 호스트 손의 위치를 조정합니다.
    참고: 즉시 흡혈을 시도하는 경향이 있는 모기를 사용할 때는 모기를 손 위에 놓기 전에 헤드 앰프(head amp)를 먼저 켜십시오. 곤충 스터브(insect stub)의 구리선을 구부려 모기의 위치를 추가로 조정하려면 얇은 나무 다보나 비전도성 붓 자루를 사용할 수 있습니다. EPG 측정 중, 특히 행동 상관관계 연구를 수행할 때는 확대경이나 구즈넥 스탠드가 장착된 디지털 현미경을 사용하여 모기를 관찰하는 것이 도움이 됩니다.
  5. 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하여 녹화 중 숙주 반응, 모기 행동, 이득(gain) 변경 등에 관한 타임스탬프 관찰 기록(예: 이벤트 마커)을 작성하십시오. 다음을 조정하십시오. 신호의 위치 화면에 표시되는 그리고 그 소프트웨어 게인 두 신호가 모두 화면에 명확하게 보이도록 필요에 따라 조정하십시오. 다음을 조정하십시오. 하드웨어 게인 신호가 포화될 경우(그림 3A,C 그리고 표 2) 또는 소프트웨어 게인을 최대로 설정했음에도 파형이 너무 작게 나타나는 경우. 다음을 조정하십시오. 오프셋 정류기 폴도버(rectifier foldover)가 관찰되면 (그림 3C,C' 및 표 2). 소프트웨어 매뉴얼을 참조하십시오.31 및 온라인 리소스30 이러한 조정을 수행하는 방법에 대한 자세한 지침을 참고하십시오.
    1. 조절하기 위해 신호의 위치 화면에서 다음을 선택하십시오. pre 또는 사후 신호 (예: ~에 의해) 클릭하여 
      1 = 1       또는 2 = 3) 그리고 나서 신호를 끌어오십시오 화면의 원하는 위치로(가급적 화면 중앙 근처에 배치하되 서로 겹치지 않게 함).
    2. 조정하기 위해 소프트웨어 게인3.4.3단계에서 설명한 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하십시오.
    3. 조절하기 위해 하드웨어 게인, 우선 다음을 돌려 시작하십시오. 채널 1의 게인 다이얼 각각 게인을 높이거나 낮추기 위해 오른쪽 또는 왼쪽으로 조절하십시오. 만약 해당 조절만으로 피킹 현상(게인이 너무 높음)을 제거하기에 충분하지 않은 경우, 그림 3A,C) 또는 신호의 세부 사항이 명확하게 시각화되지 않도록(게인이 너무 낮음) 하여, 다음을 반전시키십시오. 채널 1 범위 및 배수 스위치 이득(gain)을 추가로 조정하기 위해.
      참고: 파형 데이터 해석을 돕기 위해 하드웨어 게인(gain) 조정 시점을 기록하는 이벤트 마커를 사용하는 것이 권장됩니다.
    4. ~을 조정하기 위해 오프셋, 뒤집으십시오. 채널 1 오프셋 스위치 제어 박스의 (부분)으로 하여 음성그 다음, ~을 돌려 채널 1 오프셋 다이얼 컴퓨터 화면에서 사전 및 사후 신호의 피크가 동일한 방향으로 나타날 때까지 조절하십시오. 오프셋 다이얼(Offset Dial)을 너무 많이 돌리면 사후 신호가 다시 반전됩니다.
  6. 모기가 10분(또는 정의된 다른 시간대) 이내에 흡혈 시도를 하지 않으면 헤드 앰프(head amp)의 전원을 끕니다. 지정된 시간에 모기가 흡혈 중인 경우에는 흡혈을 마칠 때까지 기다린 후 헤드 앰프의 전원을 끕니다. 호스트가 조심스럽게 손을 떼게 한 다음, 부착된 곤충 스텁(insect stub)과 함께 모기를 제거합니다. 모기를 보관함에 다시 넣습니다.
  7. 하드웨어 관리 소프트웨어를 사용하여 녹화를 중지/종료하십시오. 다음 모기에 대해 EPG를 진행하십시오(단계 4.2).
    참고: 각 모기마다 파일 이름을 변경해야 함을 기억하십시오.
  8. 세션 종료 후 헤드 앰프와 전원 공급 장치를 끄고 소프트웨어를 종료하십시오.
  9. 승인된 IRB에 명시된 대로 자원봉사자와 함께 참가자 디브리핑 설명서(Participant Debriefing Statement) 또는 이와 유사한 서류를 검토하십시오.
  10. 프로토콜 요구 사항에 따라 모기를 폐기하십시오. 폼 블록에서 플라스틱 랩을 제거하고 적절하게 폐기하십시오.
  11. 모든 데이터 수집이 완료되면, 이전 설명과 같이 파형을 검토 및 측정하고 데이터를 분석하십시오.24,25,26,27,29,30온라인 자료를 참조하십시오.30 파형 검토 소프트웨어 사용법, 파형 묘사 그림 작성법, 파형 측정법, 분석을 위한 데이터 내보내기 방법, 통계 분석 수행 방법 및 일반적인 파형 반응 변수에 대한 상세 설명이 포함된 단계별 튜토리얼을 제공합니다.

시간에 따른 신호 진폭의 일시적 변화를 보여주는 전기생리학적 데이터 차트.
그림 3: 피킹 아웃(peaking out), 컨트롤 박스 이득(gain) 변화, 불량한 배선으로 인한 불분명한 전압 변화, 정류기 폴드오버(rectifier foldover) 및 노이즈로 인해 발생한 최적화되지 않은 기록의 예시. 사람의 손에서 완전히 흡혈한 Culex tarsalis 모기에서 얻은 파형으로, (A) 피킹 아웃(파란색 수평 화살표) 및 이에 따른 컨트롤 박스 이득의 100x에서 80x, 40x, 60x, 40x, 20x로의 변화(주황색 수직 화살표), (B) 불분명한 전압 변화, 그리고 (C) 사전(빨간색) 신호 대비 사후(검은색) 신호의 정류기 폴드오버(파형 J 참조, 패널 C'의 확대도), 라인 노이즈(사전 정류(빨간색) 신호에서만 보이는 11 Hz 사인파, 패널 C'의 확대도), 피킹 아웃(파란색 수평 화살표), 그리고 500x에서 200x로의 컨트롤 박스 이득 변화(주황색 수직 화살표)에 의해 왜곡된 모습. 각 패널 상단에 파형 이름이 표시되어 있음. 패널 C의 오른쪽 하단에 있는 보라색 화살표는 프로브 완료 후 헤드 앰프(head amp)가 꺼진 시점을 나타내며, 이는 정류기 폴드오버의 또 다른 예시임. 패널 C의 사전 정류 신호와 관련된 빨간색 수평선은 타임스탬프 노트를 기록하기 위해 이벤트 마커(Event Markers)가 사용된 시점을 나타냄. Ri 레벨, 인가 신호, 시간 척도 및 소프트웨어 이득은 (A) 107 Ω, 150 mV DC, 13.2 s/div, 8x; (B) 107 Ω, 150 mV DC, 4.4 s/div, 128x; (C) 107 Ω, 150 mV AC, 7.4 s/div, 2x; (C') 0.2 s/div, 8x임. 약어: AC = 교류, DC = 직류, Ri = 입력 저항, mV = 밀리볼트, Ω = 옴, s/div = 분할당 초. 이 그림은 Cooper 외27의 데이터를 바탕으로 작성됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하십시오.

결과

~의 AC-DC EPG 기록 *Cx. tarsalis* 인간의 손에 대한 모기의 흡혈 (그림 4분석 및 출판에 적합한 해석 가능한 파형이 생성되었습니다27해석 가능한 파형에는 파형군(waveform families)으로 분류될 수 있는 뚜렷하고 구별 가능한 반복 패턴이 포함되어 있었습니다.표 1 및 그림 4), 압축(다음과 같이 정의됨) 시의 유형 및 하위 유형을 표 2) 및 소프트웨어 이득은 파형 검토 소프트웨어에서 조정되었습니다.27,31이전에 설명된 모든 파형 군(J, K, L, M, N) 및 유형(L1, L2, M1, M2)은 *Ae. aegypti* 사람의 손으로 먹이 주기26 ~에 의해 생성된 파형에서 확인되었다 *Cx. tarsalis* 사람의 손으로 먹이를 주는 행위를 통해 여기에 설명된 방법들의 타당성을 검증하였습니다. 또한, 세 가지 새로운 파형 유형(M3, N1, N2) 및 L1, L2, M1, M2의 수많은 하위 유형이 확인되었습니다.27또한, 구강 부위가 숙주로부터 제거될 때 전압이 기저선으로 되돌아오는 현상을 파형군(waveform family)이라 명명하였다. W27.

여기에 설명된 절차를 따르면서 기기 설정(전류 유형 및 Ri 수준)을 체계적으로 변경함으로써, 인간의 손에서 Cx. tarsalis의 흡혈을 기록하기 위한 최적의 설정, 각 파형의 전기적 기원, 모기 한 마리당 완전 및 불완전 탐색의 평균 지속 시간(초)을 결정할 수 있었으며, 설정 간의 곤충당 파형 지속 시간(WDI, 초), 곤충당 파형 이벤트 수(NWEI) 및 곤충당 이벤트당 파형 지속 시간(WDEI, 초)에 대한 통계적 비교를 수행할 수 있었습니다27. 또한 모기가 서로 다른 파형을 나타내는 동안 실험을 중단시키고 해부하여 어떤 파형이 혈액 섭취와 상관관계가 있는지 확인하였습니다27. 유사한 조사가 Ae. aegypti를 대상으로 비교 가능한 방법론을 사용하여 수행되었습니다26.

EPG의 민감하고 복잡한 특성으로 인해, 모든 기록이 그림 4에 제시된 것만큼 깨끗하지는 않았습니다. 피크 현상(그림 3A,C), 하드웨어 게인 변경(그림 3A,C), 미흡한 배선 작업(그림 3B), 파형 J에서의 정류기 폴드오버(rectifier foldover)(그림 3C,C'), 그리고 전기적 노이즈(그림 3C,C')가 때때로 파형을 왜곡하거나 가려, 출판 품질의 그림으로 사용하기에 부적합하게 만들고 채점 및 분석을 어렵게 했습니다. 따라서 배선 기술을 숙달하고, 게인과 전압 설정을 최적화하며, 오프셋을 조정하고, 전기적 노이즈를 제어하는 사전 노력이 권장됩니다. 흥미롭게도, 정류기 폴드오버는 Cx. tarsalis의 파형군 J에서만 관찰되었으며(그림 3C,C'), 오프셋을 처음에 조정한 후에는 다른 모기 종(Ae. aegypti 및 Culex quinquefasciatus)을 사용했을 때에도 다시 발생하지 않았습니다(데이터 미제시). 또한, 문제 해결 과정에서 그림 3(패널 C 및 C')에 나타난 제어되지 않은 전기적 노이즈가 결함이 있는 파라데이 케이지로 인해 발생했음을 확인했습니다. 결함이 있는 파라데이 케이지에서 이루어진 기록들도 여전히 사용 가능했지만, 개선된 파라데이 케이지를 제작함으로써 노이즈 문제가 해결되었습니다(그림 1B).

모든 예방 조치와 프런트엔드 최적화를 수행했음에도 불구하고, 모기으로의 전극 부착 품질의 미세한 차이 및 신호를 왜곡하고 신호 대 잡음비를 변화시키는 기타 알려지지 않은 요인들로 인해, 신호가 가시 범위 내에 있고 각 파형의 피크 해상도가 파형 식별 및 특성 분석에 충분하도록 기록 도중 하드웨어 게인을 조정해야 하는 경우가 주기적으로 발생했습니다. 불행하게도, 기록 도중 하드웨어 게인을 조정하면 급격한 전압 변화가 발생할 수 있습니다.그림 3A, C), 이로 인해 파형이 출판용으로는 부적절해졌으나, 측정 및 분석용으로는 (전체 또는 일부가) 여전히 사용 가능합니다.

힘 분석을 보여주는 정적 평형 도표; ΣFx=0, ΣFy=0 방정식을 강조하는 그래프.
그림 4a의 대표 파형 Culex tarsalis Ri가 10으로 기록된 사람의 손 위에 놓인 프로브7 250 mV AC의 인가 신호를 사용하여 Ω. 각 패널의 상단에 가족 수준(NP, J, K, L, M, W)의 파형 이름이 표시되어 있습니다. 하단 패널은 해당 패널 내 선택된 영역의 확대 이미지를 보여줍니다. A삽입된 패널은 표시된 영역의 확대도를 보여줍니다. 시간 척도와 소프트웨어 게인은 (A) 7.0 s/div, 16x; (B) 1.0초/칸, 64배; (B') 0.2 s/div, 64배; (C) 1.0 s/div, 64x; (C') 0.2 s/div, 32x; (D) 1.0 s/div, 64배; (D') 0.2 s/div, 64배. 약어: AC = 교류, Ri = 입력 저항, mV = 밀리볼트, Ω = 옴, s/div = 칸당 초. 이 그림은 Cooper 등의 데이터를 사용하여 작성되었습니다.27. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

AC-DC EPG를 사용할 때, 하드웨어 및 소프트웨어 작동(30 )에 대한 기본적인 이해를 갖고 장비의 손상을 방지하기 위해 여기에 설명된 프로토콜을 주의 깊게 따르는 것이 중요합니다. 특히 패러데이 케이지에 접지되지 않는 한 헤드 앰프가 켜져 있을 때 만지지 마십시오. 패러데이 케이지에서 가능한 한 멀리 녹음하는 것이 좋습니다30. 과도한 주변 전기 노이즈가 있는 환경에서 녹음하지 않는 한 해석 가능한 파형을 얻기 위해 케이지 도어를 반드시 닫을 필요는 없습니다. 패러데이 새장에는 전동이 있을 수 없습니다. 패러데이 케이지 자체가 제대로 작동하려면 헤드 앰프를 통해서만 전기적으로 접지되어야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이는 패러데이 케이지에 의해 포착된 전기가 실험실 스탠드, 헤드 앰프의 금속 케이스, 코드를 따라 컨트롤 박스로 흐르도록 하기 위해 스탠드의 한쪽 발에서 페인트를 샌딩한 상태에서 헤드 앰프를 금속 실험실 스탠드에 연결함으로써 수행됩니다. 전원 공급 장치를 통해 적절하게 접지된 벽 콘센트로, 건물 접지(30)를 통해 지구로 들어갑니다. 멀티미터를 사용하여 다양한 지점 사이의 저항률(전도도의 역수)을 측정하여 케이지 내부 구성 요소 간의 연결 품질을 확인할 수 있습니다. 무선 AM 라디오를 패러데이 케이지 내부에 배치하여 도어가 닫힐 때 소리가 크게 감소(또는 이상적으로 제거)되는지 확인하여 패러데이 케이지가 공기 중 전기 신호를 적절하게 캡처하고 있는지 확인할 수도 있습니다(E. Backus per. Comm.).

은 접착제의 적절하고 표준화된 준비와 기록 전극을 곤충에 부착하는 것은 사용 가능한 기록을 얻는 데 중요합니다. 곤충 큐티클은 절연체이며 은 접착제가 큐티클의 기공에 적절하게 침투하여 곤충 내부에서 전두엽(30) 표면의 금선으로 전기가 이동하는 경로를 만들지 않으면 커패시터 역할을 합니다. 각 EPG 세션 전에 동시에 은색 접착제를 준비하고 튜브에서 새 은색 접착제로 작업하고 배선 절차 중에 격렬하게 소용돌이치는 은색 접착제로 자주 교체하십시오. 금색 고리가 흉부에 닿아 전체 고리가 큐티클과 접촉하고 한쪽으로 기울어지지 않거나 은색 접착제와 비늘의 두꺼운 층으로 분리되어 강력한 전기 연결을 형성하고 모기가 전선에서 분리되고 탈출하는 것을 방지합니다.

여기에 설명된 프로토콜은 다양한 모기 종으로 작업할 때 최적화되어야 합니다. 주어진 절지동물에 대한 기록을 위한 최적의 EPG 설정(Ri 레벨, 전압, 전류 유형 및 하드웨어 이득)은 실험적으로 결정되어야 합니다12,30. 그러나 오프셋이 조정되면 유사한 모기로 작업할 때 다시 조정할 필요가 없습니다. Ae. aegypti26 및 Cx. tarsalis27. 추가 종에 대한 파형 라이브러리(표 2에 정의됨)는 모기에 대한 EPG의 채택을 용이하게 할 것입니다. 또한 모기 종과 마취 선택에 따라 수혈 행동이 차등적으로 영향을 받을 수 있으므로 관심 모기에 대한 마취를 최적화하는 것이 필요합니다. 예를 들어, Cx. tarsalis는 CO2로 15분 마취 후 4시간의 회복 기간이 필요한 반면, Ae. aegypti의 경우 얼음으로 15분 마취 후 15분의 회복 기간으로 충분합니다. 그러나 Culex tarsalis는 추위에 노출되면 쓰러지기 어렵기 때문에 긴 회복 기간에도 불구하고 CO2가 주로 사용됩니다.

AC-DC EPG 모니터는 온라인 리소스(30,31)를 검토하거나 숙련된 사용자와 함께 교육한 후 쉽게 사용할 수 있지만 몇 가지 문제 해결이 필요합니다. 처음에 저자의 모기 탐침 EPG 기록에는 Wayadande와 동료들이 관찰하거나 보고하지 않은 사전 신호에 예상치 못한 11Hz 부호파가 있었습니다26. E. Backus와의 협의에 따르면 패러데이 케이지가 간섭하는 접지 루프 때문에 문제가 되었을 가능성이 높습니다. 아래 표(그림 1B)에서 분리하기 위해 고무 다리로 지지되는 대형 알루미늄 바닥판에 볼트로 고정된 알루미늄 프레임에 연결된 전도성이 높은 구리 스크린으로 구성된 새로운 패러데이 케이지는 11Hz 노이즈 신호를 해결했습니다(그림 3C,C'). 또한 때때로 EPG 전원 공급 장치를 처음 켤 때 정류 전 및 정류 후 신호가 직선적이고 매끄럽고 가는 선 대신 두껍고 흐릿한 선으로 나타납니다. 이것은 일반적으로 기기를 끄고 모든 코드 연결을 확인하여 해결되었습니다. 실패하면 일반적으로 1-3분 동안 기기의 플러그를 뽑는 것이 도움이 되었습니다. 매우 드물게 작동 중에 사전 및 사후 신호가 두껍고 흐릿해지는데, 이는 기기를 끄고 다른 콘센트에 연결하거나 전압 조정기 및 전원 컨디셔너를 사용하여 EPG를 벽에 연결하기 전에 연결하여 해결되었습니다. 이상적으로는 EPG 모니터용 전용 라인이 EPG30과 동일한 전기 회로에 연결된 냉장고 및 기타 장비에서 발생하는 라인 노이즈를 제거합니다.

현재 EPG를 사용하여 모기를 연구하는 데에는 두 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 첫째, 어떤 프로빙 동작이 파형에 해당하는지 확인하기 위해 수행된 상관 관계 연구는 거의 없습니다. 각 파형 패밀리(표 1)와 일부 파형 유형(M1 및 M2) 동안 무슨 일이 일어나고 있는지에 대한 강력한 가설이 있지만, 혈액 섭취가 파형 패밀리 M26,27과 상관관계가 있다는 점을 제외하고는 실험적으로 확인된 가설은 거의 없습니다. 가장 중요한 것은 많은 병원체가 타액으로 전달되기 때문에 타액 분비 사건에 해당하는 파형을 식별해야 한다는 것입니다. EPG 파형과 모기의 생물학적 활동의 상관관계는 치료 그룹 간의 파형 지속 시간 및 수의 유의미한 차이를 의미 있게 해석하는 데 필요합니다. 둘째, EPG 중 프로빙 및 섭취 비율은 예상보다 훨씬 낮을 수 있습니다27. 모기를 짧은 전선에 개별적으로 묶어 숙주에게 직접 배치하면 탐침 및 섭취 행동에 영향을 미칠 수 있는 장거리 숙주 찾기 및 사회적 먹이 행동을 방지할 수 있습니다. 올바르게 배선된 곤충은 정상적으로 걷고 날 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 모기는 종종 전선을 당기고 때로는 엉키거나 부자연스러운 각도로 자신을 잡고 있는데, 이는 전선이 있는 것이 모기의 행동에 어느 정도 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 저자는 EPG 동안 탐침률을 향상시키기 위한 많은 전략을 테스트했으며, 모기를 밤새 금식시키고, 노인을 사용하고, 손에 놓기 직전에 사람의 호흡에 노출시키고, 사람의 타액을 손에 바르는 것이 가장 효과적이었고, 모기가 조사하기에 이상적인 위치에 있는지 확인하기 위해 손의 위치를 지속적으로 미세하게 조정하는 숙주를 사용했습니다27.

이러한 한계에도 불구하고 AC-DC EPG는 프로빙 및 섭취 행동을 연구하기 위한 다른 접근 방식에 비해 많은 이점을 가지고 있습니다. 혈액 공급 중 탐침 및 섭취 행동과 타액 분비물을 정량화하도록 설계된 BiteOScope11, flyPAD15 및 자동 생체 재료 플랫폼14와 같은 시스템은 정상적인 숙주 조직 시스템과 숙주 단서가 부족한 투명한 인공 기질 및 유동 식단을 활용합니다. 이러한 합성 플랫폼은 많은 실험 목적에 유용하지만 AC-DC EPG의 분명한 장점은 자연 숙주 시스템 내에서 이러한 절지동물 행동과 관심 변수를 연구할 수 있다는 것입니다. 또한, AC-DC EPG 시스템의 사용자 정의 적응성은 다른 EPG 기기(22,33) 및 EPG 유사 전자 모니터링 장치(16,21)에 비해 추가적인 이점을 제공하며, 이들은 최대 양의 정보로 파형을 획득하고 광범위한 숙주 및 절지동물(22)에 대한 악영향을 최소화하는 데 필요한 조정 가능한 Ri 레벨, 전류 유형 및 전압 레벨을 갖지 않으며, 23. 근전도(EMG) 기술은 혈액 수유를 연구하는 데에도 사용됩니다. 그러나 전기 회로는 일반적으로 절지동물만 포함하고 기록 전극에 가장 가까운 근육 전위만 기록되므로 파형은 세포 파열, 탐침 위치 및 활동, 입 부분을 통한 스트리밍 전위와 같은 숙주-곤충 인터페이스에서 발생하는 자세한 활동에 대한 정보를 제공하지 않습니다28,34. 생체 내 현미경 기술은 살아있는 숙주 조직에서 상세한 입 부분 움직임 및 활동을 직접 시각화하는 데 사용할 수 있지만 이러한 기술은 살아있는 동물 모델에 대한 침습적 절차를 포함합니다9. AC-DC EPG 모니터만이 침습적 절차 없이 살아있는 불투명 숙주 조직에서 발생하는 프로빙, 섭취 및 타액 분비 행동에 대한 매우 자세한 정보를 실시간으로 제공할 수 있으며 다양한 절지동물에 사용하도록 조정할 수 있습니다10,12.

이것은 모기 배선, 곤충 흡인기 구성 및 인간 숙주에 대한 EPG를 수행하기 위한 첫 번째 세부 단계별 절차입니다. 이러한 프로토콜은 인간 숙주를 먹는 모기에 대한 AC-DC EPG의 채택을 촉진할 것으로 예상됩니다. AC-DC EPG를 사용하는 향후 연구 노력의 예에는 혈액 섭취 전 프로빙 행동의 고정관념적 시퀀스 식별, 입 부분을 통한 혈류 조사, 절지동물 종/발달 단계 내 및 간 수식 가소성 비교를 포함하여 혈액 공급 및 숙주 조직 손상의 기본 메커니즘에 대한 연구가 포함될 수 있습니다10 26. EPG는 또한 살충제, 사료 방지제 및 구충제의 효과를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다12. AC-DC EPG를 사용하여 인간 손의 모기를 연구하기 위해 여기에 제시된 절차는 이러한 연구를 가속화하고 모기 혈액 먹이체 생물학에 대한 새로운 통찰력을 가능하게 할 것입니다.

공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다. 이 간행물에서 상표명 또는 상업용 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하기 위한 목적으로만 사용되며 미국 농무부의 추천 또는 보증을 의미하지 않습니다. 이 보고서의 결론은 저자의 결론이며 반드시 USDA의 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

감사의 글

모기 배선 절차를 개척한 오클라호마 주립 대학의 Astri Wayadande 교수와 캘리포니아 팔리어에 있는 USDA-ARS의 Elaine Backus 박사, EPG 장비 문제 해결에 도움을 준 플로리다주 게인즈빌에 있는 EPG Technologies Inc.의 Andrew Dowell에게 감사드립니다. 또한 모기를 제공한 캔자스주 맨해튼에 있는 USDA-ARS 곤충병원의 더스틴 스완슨(Dustin Swanson) 박사와 윌리엄 야넬(William Yarnell) 씨, 그리고 절차적 비디오 촬영에 도움을 준 캔자스주 맨해튼에 있는 캔자스 주립대학교의 미리암 루힌다(Miriam Ruhinda) 씨에게 감사드립니다. 이 작업은 캔자스 주립 대학의 IEMC(Integrated Molecular Entomology Core)에 대한 액세스로 가능했습니다. 이 연구는 USDA Research, Education, and Economics Workforce Development Agreement(#58-3022-0-002) 및 Hatch Multistate Project(NE1943)의 지원을 받았습니다. 이 원고는 미국 캔자스주 맨해튼에 소재한 캔자스 주립대학교 캔자스 농업실험소의 기고 번호 24-194-J입니다.

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Instrumentation
AC-DC 4채널 전기 침투 그래프EPG Technologies, Inc.EPG의 경우 전원 공급 장치, 제어 상자, 스위치 인터페이스 상자, 4개의 헤드 스테이지 증폭기, 4개의 기판 전압 프로브 및 관련 코드 포함
Amazon.comEPG
DI-710 데이터 수집 하드웨어(AD 보드)DATAQ Instruments Inc.아날로그 EPG 신호를 디지털화하여 컴퓨터에서 시각화 할 수 있습니다
디밍이 가능한 LED 돋보기, 대형 5X 핸즈프리 돋보기 (조명과 스탠드) 독서 취미 공예 재봉 워크 벤치EPG 중 행동 관찰을위한 Amazon.com; EPG 중에만 플러그를 뽑거나 소음이 발생할 수 있습니다
EPG
Dino-Lite Flex-arm 데스크탑 스탠드Dino-LiteMS22B카메라 고정 및 조작용
Eisco Steel Retort 베이스 스탠드 및 로드 세트Fisher ScientificS41740헤드 스테이지 앰프 고정 및 패러데이 케이지 접지용(금속으로 제작되어야 함)
EPG 온라인 워크샵UF IFAS 확장https://ifas-crec-entomology.catalog.instructure.com/courses/epg-workshop-2022일명, EPG (기기 설정, 데이터 수집 및 분석, 패러데이 건설,은 접착제 준비, 곤충 스텁 건설 등) 학습을위한 "온라인 리소스"
Furman P-1800 AR 파워 레귤레이터/파워 컨디셔너노이즈 감소를 위한Amazon.com
호스트와 패러데이 케이지 사이의 장벽으로 사용하기 위한소형 버블 쿠셔닝 랩Amazon.com
Troemner Talboys Labjaws 레귤러 클램프 홀더Fisher Scientific02-217-121헤드 스테이지 앰프 고정 및 패러데이 케이지 접지용(금속으로 만들어져야 하며 플라스틱으로 코팅되지 않아야 함)
EPG 및 통계 분석을 위한Windows 컴퓨터Best Buy
Software
Backus 2.0 데이터 분석 SAS 프로그램 UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/파형 데이터의 통계 분석용
Ebert 1.0 File Manipulator 및 Error Checker SAS 프로그램UF IFAS Extensionhttps://crec.ifas.ufl.edu/extension/epg/data-analysis/파형 데이터의 통계 분석을 위한 파일 준비용
SAS 버전 9.4SAS Institute, Inc.파형 데이터의 통계 분석용
WinDaq Lite DATAQ 인스트루먼트 Inc.EPG 데이터를 기록하고 검토하기 위해  WinDaq 하드웨어 관리자 소프트웨어(AKA, "하드웨어 관리 소프트웨어") 및 WinDaq 파형 브라우저 소프트웨어(AKA, "파형 검토 소프트웨어")가 포함되어 있습니다. Windows 컴퓨터에서만 사용할 수 있습니다. 
Faraday Cage
Aluminum screen frameHome Depot MSCF5167for  Faraday cage
Aluminum Sheet, 0.125 (1/8) 두께 3003-H14Metals DepotS318Faraday cage Corner
braces의 기본, 1" Home Depot339547패러데이 케이지의 벽을 위한
플랫 헤드 필립스 기계 나사, #6-32 x 1"데이 케이지 구조를 위한Home Depot459999
플랫 와셔, #6 패러데이 케이지 건설을 위한Home Depot638977
Fluke 15B+ 디지털 멀티미터는 전기 애플리케이션용이며 최대 1000V 및 10A의 AC/DC 전압 및 전류 측정을 측정하며 패러데이 케이지
휴대용 라디오 AM FM, Goodes 트랜지스터 라디오와 라우드 스피커, 헤드폰 잭, 장거리 수신을 위한 2AA 배터리 작동 라디오, 실내, 실외 및 비상 사용을 위한 포켓 라디오Amazon.comFaraday Cage
Pure 구리 스크린을 테스트하기 위한 것, 16 x 16 메시와 0.11 와이어 직경, 36" x 12'MetroScreenworks를 위한   패러데이 케이지의 벽
라운드 헤드 콤보 기계 나사, #6-32 x 3/4"Home Depot528466패러데이 케이지 건설용
모래 종이, 1/2" by 1", 150 GritHome Depot19036-20-CC실험실 스탠드 바닥의 페인트를 제거하기 위한
스크린 프레임 모서리, 5/16" Home DepotWCORN516 for  패러데이 케이지
벽 스크린 스플라인, 0.14" Home Depot3034719패러데이 케이지의 벽
Insect Stubs
Brass Escutcheon PinsHome Depot801294곤충 스텁을 건설하기 위한 것   
구리선, 곤충Amazon.com   
Harris 수용성 독감 Home Depot355398곤충 스텁 와이어를 납땜 코팅하고 강력한 연결을 형성하는 데 도움이 됩니다
바늘 모양의 플라이어곤충 스텁을 만들 때 와이어를 구부리기 위한Home Depot
Pro's Kit 900-015 Helping Hands 납땜 보조기Amazon.com납땜 중 에스커천 핀을 잡기 위한
솔더링(로진 코어 포함),Home Depot296497곤충 스텁을 만들기 위해   
곤충 스텁을 만들 때 구리선을 벗겨내고 절단하기 위한와이어 커터 스트리퍼 도구Home Depot
YIHUA 928D-III 납땜 인두, 110W 고출력, 완전 디지털 디스플레이 납땜 인두Amazon.com곤충 스텁 건설을 위한 것; 청소를 위한 스탠드, 스폰지, 스틸 울이 함께 제공됩니다
Insect Aspirator
Accuris ASPIRE 실험실 흡인기Accuris 기기V0020; 휴대용 진공 컨트롤러, 미세 팁(40mm) 스테인리스 스틸 어댑터, 피펫 팁 어댑터가 포함되어 있습니다.
Chemglass Life Sciences 파스퇴르 피펫, 5 3/4" 길이의Fisher ScientificNC0230004모
기를 배선할 때 곤충 흡인기로 사용됩니다.수정된 파스퇴르 피펫을 진공 라인에 부착하기위한홈 디포
모기가 진공 펌프로 흡인되는 것을 방지하기위한10 x 10cm 정사각형Joann Fabrics16651622
Saint Gobain Performance Plastics Tube Tygon 1/4 x 7/16Fisher Scientific50-206-8914다양한 변형 파스퇴르 피펫 간 빠르고 쉬운 전환용
Thermo Scientific Nalgene HDPE Quick Disconnect(3/8 - 7/16 in. 신분증)다양한 수정된 파스퇴르 피펫 간의 빠르고 쉬운 전환을 위한Fisher Scientific15-315B
Silver Glue 
Elmer's Glue-All Multi Purpose White GlueAmazon.comfor silver glue preparation
Silver Flake 99.9% pure,  4-8 µ mThermoFisher786.09은 접착제 준비용
Silver Flake 99.95% 순수, 8-10 µ mInframat Advanced Materials47MR-12F은 접착제 준비<
u>Insect Anesthesia
CO2 버블러 키트, 1000 mL, #9 고무 스토퍼FlyStuff59-181플라이패드 Flypad를 사용하여 곤충 건조를 방지합니다
프레임, 표준 크기FlyStuff59-118모기가 플라이패드에서 떨어지는 것을 방지하기 위한
것입니다. Flystation BrushFlyStuff59-205는 플라이 패드 작업 시 정전기를 줄이기 위한
것입니다. 플라이패드  표준 크기FlyStuff59-114일명 "마취 패드" 모기 마취용
깔때기(직경 4인치)Amazon.com플라이패드로 옮기기 전에 모기 컵에 가스를 주입하기 위한
Plexi 유리 또는 평평한 플라스틱 뚜껑(크기에 맞게 절단)Home DepotMC-27모기가 깨어나
기 시작하면 플라이패드를 덮기 위한 것입니다.플라이패드와 퍼널 사이의 가스를 전환하기 위한Amazon.com
CO<2 조절기FlyStuff59-142COsub>2 tank"에서 가스의 흐름을 조절하기 위한
T” 플라이패드와 퍼널을 CO2 탱크FlyStuff59-123
, 투명 깔때기와 플라이 패드를 CO의 조절기에 연결하기위한FlyStuff59-124C
Insect Wiring< / strong>< / em>< / u>
Black 카드 스톡, (65Lb, 176 g / m 2< / sup >) 8.5 "x 11"Michael's Stores Inc.금선을 쉽게 시각화할 수 있도록327826
검은색 구조용 종이 사각형 3.5" x 4.0"선을 쉽게 시각화할스테이플,금
면봉,식 모기를 위한Amazon.com
크래프트 폼 #12 블록,Joann Fabric and Craft Store와이어 모기를 잡기 위한1941079
Deflecto Ribbon 디스펜서,금선 보관용Amazon.com
깃털 무게 곤충학 집게곤충 조작을 위한Fisher ScientificS72110
미세 집게(Dumont의 FST: #5 91150-20, Inox-Electronic)기를 배선할 때 금 고리를 만들기 위한Fine Science Tools91150-20
미세 포인트 페인트 브러시Amazon.com배선 및 EPG 중 모기를 조작하기 위해; EPG
Fine-tip 표준 전사 피펫, 좁은, 은접착제 준비용Thomas Scientific7761D21
금선, 99.99% 순수, 0.025mm 두께GoodfellowAU005121모기 배선용
Minutien 핀, 팁 0.2mm, 1cmFisher ScientificNC9681411모기에 접착제를 바르는 데
종이컵 강성 종이 튜브     
곤충 배선 중 미세 핀을 잡기 위한핀 바이스Fisher Scientific50-996-811
이 있는 플라스틱 보관 상자(7인치 x 9인치 x 14인치)Amazon.com유선 모기 운반용
플렉시 유리 또는 평평한 플라스틱 뚜껑(크기에 맞게 절단)Home DepotMC-27모기가 깨어나기 시작하면 플라이 패드를 덮기 위한
폐쇄 집게Fisher Scientific08-906금 와이어 고정 및 조작
Compressed Gas
COsub2 gas tankMatheson Gas플라이패드로 모기 마
Common Lab Items
생물학적 위험 일회용 오토클레이브 백, 8 1/2" x 11"피셔 사이언티픽03-410-591혈액 공급 모기
처리를 위한 분젠 버너 또는 프로판 토치 파스퇴르 피펫 수정을 위한Amazon.com
실험실 테이프Daigger 소모품라벨링, 은 접착제 준비 및 겸자 마스킹
일회용 피펫 팁, 1000 &마이크로; L피셔 사이언티픽 은 접착제를 만들 때 물을 분취하기 위해
, 해부 현미경Leica Microsystems, 모기를 배선하기 위해
, 해부 프로브, Fisher ScientificNC9109673젓기 위해  그리고 은 접착제를 바르기 위해
, 삼각 플라스크, 1000 mLFisher Scientific 플라이패드 사용 중 곤충 건조를 방지하기 위해
에탄올, 70% 한 모기를 복구하는Fisher Scientific04-355-122
유리 페트리 접시Fisher Scientific08-747B는 얼음 장갑으로 모기를 마취시키는 데 사용됩니다
보호를 위한Fisher Scientific
Kimwipes KimTech Science 브랜드의 섬세한 작업 와이퍼 Fisher Scientific06-666모기 분쇄
실험실 코트Fisher Scientific의 개인 보호를 위한
LiBa 스프레이 병, 리필 가능한 빈 스프레이 병(알코올 세척 안전)Amazon.com탈출한 모기를 복구하기 위한
자석 스티어 바, 2cm 길이의Fisher Scientific 은 접착제
기계적 단일 채널 피펫, 1000 µ를 혼합하기 위해; L피셔 사이언티픽 13-690-032만들 때 물을 분취하는
, 1.5 mLFisher Scientific 780420은 접착제
파라 필름 M Fisher Scientific50-998-944은 접착제 튜브 밀봉
플라스틱 랩Amazon.com폼 블록
Pyrex 20 mL 비커Fisher Scientific 07-250-051은 접착제
세미 마이크로 밸런스혼합 Fisher Scientific 10-919-370무게를 측정하기 위한 접착제와 은 플레이크
Sharpie 펜, 라벨링을 위한점 Amazon.com
단일 가장자리 면도날전자 현미경 과학71980곤충 스텁 청소를 위한
표준 일회용 전송 피펫Fisher Scientific 은 접착제를 저장 튜브로 옮기기 위한133-711-7mL
교반 플레이트Fisher Scientific 은 접착제
혼합용 타이머/스톱워치시간을 측정하는
Fisher Scientific 은 접착제 준비
유틸리티 가위Fisher Scientific08-945금 와이어
절단 용 Vortex 믹서Fisher Scientific 은 접착제 혼합용
Study Organisms
Culex tarsalis 모기대상으로 사용
Dino-Lite Edge Digital Microscope (250x 배율) Dino-Lite AF4915ZT 라인 , 패러, 테스트에 Amazon.com 저항, 연속성, 다이오드 및 커패시턴스 기능을 제공합니다. 스텁 건설을 위한 20 AWG . , ,, , , 곤충 흡인기에 흡입을 적용하기 위한 은 상업용 전기 컬러 비닐 전기 테이프 모기장 유틸리티 패브릭, 은 .은 단일 위치 및 조절 가능한 개방 (다양한 1/8"에서 1/2") 차단튜빙에 연결하기 위한 1/8in ID 튜빙 용 피팅, 금수 있도록 956221 색 모기를 쉽게 시각화하기 위한 단, , 투명 모5.8mL 의 사용하는 경우 금식 모기를 위한 뚜껑 자동 , 취분젠 버너 또는 프로판 토치 컬러EF9763R을 만들기 위해, 를 사용하기 위해를 탈출데 사용되는 . 개인 용 은 접착제 마이크로 원심분리기 튜브를 경우를 덮기 위해 세밀한   숙주가 각 곤충 초순수(18MΩ) 물에 노출되는 Fisher Scientific 연구

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