재조합 펩타이드 태그 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화를 기반으로 한 세포 내 리보솜 하위 집단의 분리

요약

AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)는 리보솜의 아세포 집단을 표지하고 친화력을 정제하기 위해 개발된 새로운 광유전학 활성화 방법으로, 하위 시퀀싱과 단백질체 분석을 위해 개발되었습니다.

초록

점점 더 많은 증거는 mRNA 번역이 세포 내에서 매우 구획화된 과정이며, 구획 특이적 기능을 가진 단백질이 이상적인 환경에서 적절한 양으로 생성되도록 하는 데 핵심적인 세포 내 수송과 특정 mRNA의 위치 지정이 중요함을 시사합니다. 그러나 이러한 mRNA를 번역하는 리보솜의 세포 내 분리 및 특성 분석은 현재까지 제한적이어서, 번역 기구의 조성이 국소화된 mRNA 번역 조절에 어떻게 기여하는지에 대해서는 많은 부분이 알려져 있지 않습니다.

여기서는 에피토프 태깅, 새로 개발된 광유전학 활성화 분할 비오틴 리게이아제, 친화도 정제를 결합하여 관심 있는 모든 세포 하위 구획에 국한된 리보솜을 빠르고 특이적으로 표지하고 분리하는 AviTag 특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)를 시연합니다. 첫째, CRISPR/Cas9 편집을 통해 AviTag 펩타이드, 담배 에치 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, FLAG 에피토프 태그를 리보솜 단백질에 융합하는 데 사용됩니다. 이 세포주에서 발현된 분리된 비오틴 리게아제는 소기관 표적 도메인과 융합되어 정상 비오틴 농도에서는 비활성 상태입니다. 보충 비오틴과 청색광 조명에 의해 활성화되면, 리가아제는 바로 주변의 AviTagged 리보솜을 비오티닐화하여 스트렙타비딘 코팅된 구슬의 비오티네이티화 리보솜과 관련 단백질 및 mRNA의 친화성 정제를 가능하게 합니다. TEV 프로테아제 절단을 통한 비변성 용출은 RNA 시퀀싱 또는 질량분석법 단백질체학을 통해 코어 리보솜 단백질, 리보솜 연관 단백질, 리보솜 결합 mRNA의 하위 특성 분석에 적합한 샘플을 생성합니다.

이 프로토콜에서는 AviTag를 리보솜 단백질에 융합하고 분열 비오틴 리가아제 효소를 관심 소기관에 표적으로 하는 설계 원리를 검토합니다. 우리는 ALIBi 시스템의 활성화, 세포 용해, 친화성 정제, 샘플 용출을 입증합니다. 마지막으로, 일반적인 결과와 문제 해결 방법에 대해 논의합니다.

서론

특정 세포 아구획에서 생물학적 샘플을 분리하여 세포 내 조직과 운송이 세포 과정에 어떻게 영향을 미치는지 더 잘 조사할 수 있는 도구가 필요합니다. mRNA 번역은 이러한 과정의 대표적인 예로, 점점 더 많은 증거가 번역이 매우 구획화되어 있으며, 특히 많은 mRNA가 암호화된 단백질이 위치한 소기관에 국한되어 있음을 시사합니다^1,2. 그러나 번역 기구의 세포 내 위치 분석에 대해서는 알려진 바가 적습니다. 리보솜은 핵소체와 핵에서 존재를 시작하며, 여기서 리보솜 단백질(RP)과 리보솜 RNA(rRNA)의 조립이 시작됩니다. 이후 세포질로 전달되어 최종 조립 단계를 거치고, 이후 mRNAs를 번역하기 ^{시작합니다.} 전공 번역 부위는 세포질과 소포체; 후자는 세포막 단백질과 세포 결합 소기관 또는 세포외 분비물을 위한 단백질이 합성되는 곳입니다. 최근에 확인된 국소 번역 부위로는 미토콘드리아, 페르옥시좀, 그리고 6,7,8,9,10,11,12 신경 돌기가 있습니다. 흥미롭게도, 리보솜 관련 단백질, 번역 후 변형, rRNA 변형, 그리고 핵심 리보솜 단백질의 비정준적 화학양론과 같은 번역 기계 특성이 특정 mRNA의 번역 조절 메커니즘과 번역 정확도,^{13, 14, 15, 16, 17} 같은 매개변수에 관여한다는 증거도 나타나고 있습니다^{.18, 19, 20}. 예를 들어, 수백 개의 단백질이 리보솜과 상호작용하여 세포 내 리보솜 조성에 차이를 일으킬 수 있다는 점이 확인되었습니다.¹³. 그러나 현재까지 세포 내 리보솜 집단을 분리하는 기술은 제한적이었다; 따라서 번역 기구의 구성이 국소화된 mRNA 번역 조절에 어떻게 기여하는지에 대해서는 많은 부분이 알려지지 않았습니다. 특히 포유류 모델 시스템과 호환되는 세포 내 리보솜 집단을 분리하는 다목적 방법의 등장으로 이러한 번역 기계 특징을 세포 이하 수준에서 탐구할 수 있을 것입니다.

리보솜을 포함한 세포 내 분획을 분리하는 초기 방법은 순차적 용해와 원심분리 원칙에 기반했다^21,22. 일반적으로 이러한 방법은 특정 소기관에 한정되며, 처리 시간이 매우 길어집니다. 더 최근의 방법은 비오틴 리가아제 BirA를 기반으로 하며, 이는 AviTag 펩타이드 기질 10,23,24를 특이적으로 비오티닐화합니다. BirA는 리보솜이 AviTag로 태그된 세포에서 관심 소기관에 유전적으로 국소화될 수 있습니다. 그러나 BirA는 비오틴의 생리학적 농도에서 활성을 보이므로, AviTag 함유 리보솜의 구성적이고 비특이적인 비오티닐화를 피하기 위해 비오틴 고갈 상태에서 세포를 배양해야 합니다^10,24. 이로 인해 비오틴 고갈에 민감한 세포 유형에서는 BirA 사용이 제한됩니다²⁵. 마지막으로, BioID, TurboID, APEX^{26, 27, 28}과 같은 엔지니어링 효소를 이용한 무분별한 비오티닐화 방법이 개발되었습니다. 유도 시, 이 효소들은 효소 반경 내의 라이신 잔기를 공유 변형하는 반응성 비오틴 중간체를 생성합니다. 혼합 비오티닐화 방법은 세포 내 단백질체 지도화에 매우 유용하지만, 국소 리보솜 인근의 단백질을 구분하는 데는 덜 유용한 정보를 제공합니다.

여기서는 최근 개발된 아세포 리보솜 집단을 표지하고 분리하는 방법인 AviTag특이적 위치 제한 조명 증강 비오티닐화(ALIBi)를 시연합니다. 이 방법은 청색광 조명 아래에서 이형이합체화되는 광유전증 강화 자석(eMag) 스위치(그림 1A)와 융합된 설계된 분할 BirA를 활용합니다²⁹; 그리고 FLAG 에피토프, 담배 에치 바이러스(TEV) 프로테아제 절단 부위, 그리고 Rpl31 리보솜 단백질에 융합된 AviTag(FTA)로 구성된 펩타이드 태그(그림 1B). 분할된 효소는 선택된 소기관에 유전적으로 표적화될 수 있으며, 비오틴의 생리학적 농도에서는 비활성 상태이고, 청색광 조명과 보조 비오틴 첨가로 몇 분 내에 재구성될 수 있습니다(그림 1C-E). 이후 세포 용해, 친화력 정제, 그리고 TEV 프로테아제 절단을 통한 비변성 효소 용출을 통해 리보솜과 mRNA 및 리보솜 관련 단백질과 같은 공동 정제 분자가 생성되며, 이는 RNA 시퀀싱 및 질량분석법 단백질체학과 같은 후속 분석 방법에 적합합니다(그림 1A). 따라서 이 방법은 리보솜 조성뿐만 아니라 리보솜이 결합된 mRNA도 밝혀냅니다. 최근 ALIBi의 세포 내림 리보솜 집단을 특성화하는 획기적 적용을 설명한 논문에서, 우리는 분할된 효소를 세포질, 핵소간, 핵, 소포체, 원형질, 미토콘드리아에 성공적으로 표적으로 지정했습니다(표 1)³⁰. 이 세포 내 구획들 간의 번역 기법 비교는 소포체와 미토콘드리아에서의 번역에 관한 새롭고 예상치 못한 발견을 가져왔으며, 핵과 핵소체 내 리보솜 생합성 인자에 대한 향후 연구의 잠재적 단서를 제공했습니다.

이 프로토콜에는 ALIBi 시스템의 형질전환 및 활성화, 세포 용해, 친화성 정제, 샘플 용출의 상세한 시연이 포함되어 있습니다. 또한 웨스턴 블롯을 통한 친화성 정제의 성공 검증 방법과 하류 RNA 시퀀싱 또는 질량분석(MS) 프로테오믹 분석 수행에 대한 권고사항을 논의합니다( 보충 문서 1 참조). 이 프로토콜은 내인성 Rpl31 유전자좌에서 FTA(L31-FTA)와 동형접합하여 Rpl31을 발현하는 마우스 배아 줄기세포(mESCs)를 이용한 실험을 위해 작성되었습니다; 이 세포주는 저자들로부터 요청 시 제공될 수 있습니다. 이 세포주를 생성하는 전략은 보충 파일 1 과 보충 그림 S1 , 보 충 그림 S2에 설명되어 있습니다. 여러 소기관을 표적으로 하는 분할 효소를 암호화하는 플라스미드는 Addgene에서 구할 수 있으며(카탈로그 번호 #235608부터 235643까지). 이 소기관에 분할된 효소를 표적으로 삼는 설계 원리는 보충 파일 1에 설명되어 있습니다. 프로토콜은 각 샘플이 10cm 플레이트에서 배양된 mESC에서 유래한다고 가정합니다. 10cm 규모는 질량분석법 단백질체학에 충분한 물질을 제공하며, 6웰 규모는 서부 블롯이나 RNA 시퀀싱에 충분하다는 것을 발견했습니다.

프로토콜

1. mESC 세포 배양

참고: ALIBi 활성화 및 세포 용해 이전에는 mESC를 표준 멸균 기법으로 세포 배양에 사용해야 합니다. 온전한 mESC의 원심분리는 별도의 명시가 없는 한 실온에서 200 × g 에서 3분간 수행해야 합니다. 별도의 명시가 없는 한 사용하기 전에 37°C의 수조에서 미디어를 예열하세요. mESC는 하룻밤 동안 젤라틴화된 신선한 조직 배양 플레이트에 전달되어야 합니다(1.1단계 참조).

1. L31-FTA mESC를 해동하기 전날, 10cm 플레이트 바닥에 0.1% 젤라틴 5mL를 코팅하세요. 37°C에서 하룻밤 배양하세요.
2. mESC 미디어 성분을 결합하고 0.2 μm 필터를 통과시킵니다. 최대 1개월간 4°C에서 보관하세요.
3. 해동 당일에는 녹인 세포를 희석하기 위해 5mL 배지를 데우고, 도금을 위해 10mL 알리코트를 데웁니다.
4. 액체 질소 저장에서 ~5 × 10⁶ L31-FTA mESC가 들어 있는 크라이오비아를 회수합니다. 즉시 37°C 수욕에서 바이알 바닥을 돌려 해동하세요.
5. 5mL 알리코트에서 0.5–1mL의 배지를 바이알 용량이 허용하는 만큼 크라이오비얼 내용물과 부드럽게 섞은 후, 크라이오비얼 내용물을 다시 5mL 매체 알리코트로 옮깁니다.
6. 원심분리로 세포를 펠릿으로 만듭니다. 상정액을 흡인하세요.
7. 세포 펠릿을 10mL 배지 알리코트로 재현탁합니다.
8. 10cm 플레이트에서 젤라틴을 흡인한 후 즉시 세포 현탁액을 플레이트로 옮깁니다. 37°C에서 인큐베이팅하세요.
9. 24시간마다(배출일 제외) 플레이트에서 오래된 배지를 흡인하고 10mL의 신선한 배지로 교체하세요.
10. 콜로니가 70%–80% 합류하면(보통 도금 후 48시간 후), 기존 배지를 흡인하고 10mL Dulbecco's 인산염염수(DPBS)로 두 번 세척합니다.
11. DPBS를 흡인한 후, 플레이트에 0.05% 트립신 2mL를 코팅합니다(표 2). 37°C에서 5분간 배큐하세요.
12. 플레이트에 4mL의 냉 mESC 배지를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다. 즉시 5 또는 10 mL 혈청학적 피펫을 사용해 플레이트 내에서 15회 위아래로 피핑하여 콜로니를 단세포 현탁액으로 분리시킵니다.
13. 서스펜션을 원뿔형 튜브로 옮기세요. 선택적으로, 혈액세포계를 사용해 세포를 세기 위해 알리코트를 제거하세요.
14. 원심분리로 세포를 펠릿으로 만듭니다. 상정액을 흡인하세요.
15. 세포 펠릿을 새로운 배지에 다시 현탁하세요. 5×⁶개의 세포 10개(일반적으로 1:6 통과 비율)를 신선하게 젤라틴화된 10cm 플레이트에 넣고 37 °C에서 배양합니다. 1.9–1.15 단계를 필요에 따라 반복하여 형질전환을 진행할 준비가 됩니다.
16. 냉동 세포 스톡을 만들려면 mESCs를 트립신화합니다(1.10–1.14 단계와 동일). 세포 펠릿을 냉동 배지(5×^{10 6} 세포당 250–500 μL)에 재현탁한 후, 크라이오비얼에 알리코트한 뒤, -80 °C의 세포 냉동 용기에서 하룻밤 천천히 동결한 후 액체 질소 저장으로 옮깁니다.

2. 형질전환

참고: mESC가 통과 준비가 된 날에 형질전환을 수행하십시오. 플라스미드는 트랜스펙션 후 3-5시간쯤 발현을 시작할 수 있습니다. 발현 후에는 어두운 환경에서 세포를 다루고 37°C 이하 온도에 노출되는 것을 최소화하여 조기 활성화를 방지할 것을 권장합니다. 이전 연구에서 자석 광유전학적 도메인은 청색광 조명뿐 아니라 추운³¹ 노출 시 이합체가 된다는 것을 보여주었습니다. 접시는 전용 인큐베이터에 보관하거나, 공유 인큐베이터의 선반을 알루미늄 호일로 빛을 차단하세요. 인큐베이터 밖에서 감방을 다룰 때는 미리 모든 조명과 창문을 끄거나 차단하고, 빨간 조명 헤드램프를 사용해 시야를 확인하세요. 인큐베이터 문을 필요 이상으로 오래 열어두지 마세요. 한 번에 소량씩 접시판을 인큐베이터에서 꺼내고, 접시 면을 보온된 표면(즉, 깨끗한 스티로폼 박스 뚜껑)에 올려놓아 실온 작업면과의 접촉을 최소화하세요. 사용 전에 미디어를 완전히 데우세요. 발광 현미경으로 판을 검사하지 마십시오.

1. 형질전환 전날에는 10cm 플레이트를 젤라틴화하세요.
2. 형질전환 당일에는 플레이트에서 젤라틴을 흡입하고 7.5mL 배지를 37°C에서 예열합니다. 환원 혈청 배지를 37°C에서 예열하여 세포 재현용을 합니다.
3. 18.75 μL 형질전환 시약을 환원 혈청 배지 250 μL에 희석합니다. 살짝 두드려 섞고 실온에서 5분간 배양하세요.
4. N-및 C-단편을 암호화하는 두 플라스미드를 공동 발현할 경우, 각 플라스미드 3.75 μg을 환원 혈청 배지 250 μL에 첨가합니다. 만약 하나의 플라스미드(즉, GFP 음성 대조군 또는 전체 길이 BirA 양성 대조군)만 발현한다면, 대신 단일 플라스미드 7.5 μg를 첨가합니다.
5. 플라스미드/환원혈청 배지 혼합물을 형질전환 시약/환원혈청 배지 혼합물에 넣고 탭/반전하여 혼합합니다. 상온에서 15분간 배양하세요.
6. 그동안 트립신화 및 mESC를 pellet(단계 1.10–1.14)로 진행하세요. 펠릿을 가열한 환원 혈청 배지에 10 ×^{10 6} cells/mL 농도로 재현탁합니다.
7. 플라스미드/형질전환 시약/환원혈청 배지 혼합물에 7.5 × 10⁶ (750 μL) 재현탁 세포를 첨가합니다. 튜브를 뒤집어 섞으세요. RT에서 10분간 배양하며, 가끔 튜브를 뒤집어 세포를 유지하세요.
8. 튜브를 잠시 뒤집어 mESC/플라스미드/형질전환 시약/환원혈청 배양지를 가열된 배지가 포함된 플레이트에 추가합니다. 세포가 고르게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 흔들어 주세요.
9. 37 °C에서 3–5시간 동안 배양하여 세포가 이 시간 내에 부착되도록 합니다.
   참고: 이제부터는 빛과 37°C 이하의 온도에 노출되지 않도록 주의할 것을 권장합니다.
10. 옛 매체를 부드럽게 흡입하세요. 신선한 데운 배지를 넣고, 세포가 빠지지 않도록 플레이트 옆면을 피펫으로 내려가세요. 37°C에서 부화 재개.
11. 형질전환 후 24시간 후에 활성화/용해가 발생하면 섹션 3으로 진행하세요. 형질전환 후 48시간에 활성화/용해할 계획이라면, 형질전환 세포를 도판 후 ~24시간 후에 배지를 변경하세요.

3. ALIBi 활성화 및 세포 용해

참고: 용출 시작 단계(5.4단계)까지 어둠 속에서 세포/샘플을 계속 다루세요. 세포를 얼음 위에서 냉각한 후(단계 3.15), 샘플을 차갑게 보관하고 용출 시작 전까지 냉각된 시약만 사용하세요. 작업하는 표면, 장비, 시약, 플라스틱이 RNAse 프리 상태인지 확인하려면 갓 개봉한 제품을 사용하고, 단단한 표면은 RNAse 제염용액과 70% 에탄올로 닦거나 헹구세요. 샘플이나 장비를 다룰 때는 장갑을 착용하세요. MS 단백질체학용 샘플의 경우, 작업 공간을 먼지 없이 유지하여 케라틴 오염을 최소화해야 합니다; 맨살을 가리고 긴 머리를 묶으세요.

1. 원심분리기를 4°C로 미리 냉각하세요.
2. 조명을 끈 상태에서, 변환된 플레이트를 임시 37°C 인큐베이터로 옮겨 트랜스빌리미네이터를 넣은 후 메인 인큐베이터의 온도 변화에 노출되지 않도록 합니다.
3. 블루라이트 트랜스빌리네이터를 70% 에탄올로 닦고 전원에 연결하세요. 트랜스일루미네이터를 메인 인큐베이터에 놓고 인큐베이터 조건이 다시 평형을 맞출 때까지 기다리면서 세팅을 계속하세요.
4. 비오틴과 시로헥시마이드(CHX)를 투여할 배지를 37 °C로 예열합니다(10cm 플레이트당 10 mL의 배지). 보충 비오틴 없이 대조군 샘플을 검사할 경우, 별도의 알리쿼트를 따로 데워 CHX만 투여하세요.
   참고: 일부 완충 성분은 사용 전날 혼합하여 4°C에서 하룻밤 보관할 수 있습니다( 표 2 참조). 웨스턴 블롯 또는 MS 프로테오믹스를 위한 실험과 RNA 시퀀싱을 위한 실험에는 서로 다른 용해 및 워시 버퍼 레시피가 사용되었다는 점에 유의하라.
5. DPBS 알리코트를 냉각해서 CHX(10cm 플레이트당 20mL)를 투여하세요.
6. RNAse 제거 완충제, 소금 세척, 용해 완충제, 세척 완충제를 준비합니다( 표 2 참조). 글리세롤과 Triton X-100과 같은 밀도가 높거나 점성이 높은 성분이 포함된 버퍼의 경우, 완성된 버퍼를 피펫으로 사용해 균일하게 혼합되도록 합니다. 사용 전에 버퍼를 얼음 위에 올려 냉각하세요.
   참고: 구슬 세척 단계에서는 현재 버퍼에 넣은 비즈가 담긴 튜브를 포켓 원심분리기에서 잠시 돌려 바닥의 내용물을 수집하세요. 튜브를 자석 거치대에 1분 정도 넣거나 비즈가 완전히 이동할 때까지 보관하세요. 비드 펠릿을 만지지 않고 상정액을 흡입하세요. 비드 펠릿이 마르지 않고 다음 완충제를 추가하세요. 비드 펠릿을 다시 매달려야 피펫을 부드럽게 하거나 닫힌 튜브를 손가락 사이로 굴려 자석 거치대에 대고 고정하면 자석이 빠르게 여러 방향으로 비즈를 끌어당깁니다. 마지막으로, 튜브 내부 벽이 세척되도록 재현달린 비즈를 여러 번 뒤집어 보세요.
7. 스트렙타비딘 비즈 기본 병을 부드럽게 피펫팅하거나 흔들어 다시 현지하세요. 10cm mESC 플레이트당 단백질 저결합 튜브에 450 μL 비즈를 옮깁니다.
8. 위의 비드 세척 주의사항에 따라 비드 저장 버퍼를 버리고 900 μL RNAse 제거 버퍼로 비즈를 2회 세척합니다.
   참고: 지체 없이 다음 단계로 진행하세요; RNAse 제거 완충제에 오래 머무르면 구슬의 결합 능력이 감소할 수 있습니다.
9. 비즈를 900μL 소금 세척액으로 1번 세척하세요.
10. 900 μL Wash I Buffer로 비즈를 2번 세척하세요. 두 번째 세척 단계에서 비즈를 재현탁한 후, 4°C 온도에서 활성화와 세포 용해를 수행하며 비즈를 보관합니다.
11. 가열된 배지에 적합한 비율에 따라 비오틴(최종 농도 50 μM 농도; 50 mM 스톡 1:1,000 희석액)과 CHX(최종 농도 100 μg/mL; 100 mg/mL 희석액 1:1,000 희석액)를 첨가합니다. 사용 전까지 37°C에서 유지하세요.
12. CHX(최종 농도 100 μg/mL; 100 mg/mL 1:1,000 희석액)를 DPBS의 콜드 알리코트에 첨가하고 사용 전까지 냉각 상태로 보관합니다.
    참고: 다음 두 단계는 보조 비오틴과 청색광 조명을 통한 ALIBi 활성화를 설명합니다. 이상적인 활성화 기간은 하류 분석에 적합한 리보솜 비오티닐화를 충분히 얻을 수 있을 만큼 길지만, 시공간적 해상도를 유지할 만큼 짧아야 합니다. 이상적인 활성화 시간은 세포 유형, 실험 규모, 분열 효소의 발현 수준, 관심 소기관 근처 리보솜 풍부도, 분석 기법의 민감도와 같은 매개변수에 따라 달라질 수 있습니다. 우리는 15분을 시작점으로 권장하며, 이는 대표적인 결과(그림 2)와 첨부된 작업에서 사용한 활성화 시간인³⁰분입니다.
13. 형질전환된 배지에서 흡입 배지를 사용하세요. 즉시 CHX ± 비오틴이 포함된 따뜻한 배지 10mL를 플레이트에 추가하세요.
14. 음성 대조판이 불이 붙지 않게 하려면 어두운 인큐베이터에 넣으세요. 플레이트를 조명하려면, 트랜스빌리미네이터 바로 위에 올려놓고 트랜스일루미네이터를 켜고 15분간 큐베이팅합니다.
15. 조명이 완료되면 즉시 각 플레이트당 10mL의 차가운 DPBS + CHX로 2회 세척하세요. 세척 사이와 세탁 후에는 접시를 얼음 위에 올려두세요. 두 번째 세척을 흡인한 후 플레이트를 기울이고 잔류 DPBS를 흡입하세요.
16. 각 플레이트를 얼음 위에 최대한 평평하게 유지한 후, 얼음 냉각 용해 버퍼 2mL를 추가하여 분해 단계로 진행합니다. 접시판을 얼음 위에 5분간 배양하고, 그 기간 동안 2–3번 배양판을 두드려 세포를 분리합니다.
    참고: 호일 아래와 얼음 위에 어둡게 보관할 경우, 이 기간 동안 플레이트를 세포 배양 구역 밖의 어두운 공간으로 옮길 수 있습니다.
17. 남은 세포는 마이크로피펫으로 플레이트 표면에서 위아래로 파핑하며 기포 형성을 방지한 뒤, 냉각되고 표지된 단백질 저결합 튜브로 전이합니다.
    참고: 선택 사항: 핵과 핵소체처럼 용해가 어려운 일부 소기관의 경우 초음파 검사가 도움이 될 수 있습니다.
18. 용해가 어려운 소기관의 경우, 실험 내 모든 샘플을 4 °C(출력 3와트 설정)에서 45초간 초음파 처리합니다. 초음파 설계에서 개방된 샘플 튜브에 프로브를 삽입해야 한다면, 처음에는 플레이트에서 더 큰 튜브로 용해물을 옮겨 초음파 검사 중 넘침을 방지합니다; 그 후 2mL 튜브로 옮깁니다.
19. 용해물을 얼음 위에 15분간 배양하세요.
20. 용해액을 17,000 g × 4°C에서 3분간 원심분리합니다. 상청액(정액화된 용해액)을 세포 잔해 펠릿을 건드리지 않고 차가운 단백질 저결합 튜브로 옮깁니다.
    참고: RNA-seq 분석을 의도한 경우, 정화된 용해액의 알리코트를 총 RNA 분획으로 수집할 수 있습니다(자세한 내용은 보충 파일 1, "RNA 시퀀싱 권고" 1.1 단계 참조).
    참고: 모든 샘플에서 세포 양, 형질전환/배양 조건, 용해 조건이 균일하다면, 일반적으로 샘플 간 용해액 농도가 유사하다고 가정하여 총 단백질 농도를 정량하지 않고 진행합니다. 이로 인해 활성화와 친화성 정화 사이의 경과 시간이 최소화됩니다.

4. 친화성 정화

1. 마그네틱 랙을 이용해 세척된 스트렙타비딘 구슬을 펠릿으로 뿌리세요. 워시 I 버퍼를 흡입하세요.
2. 세척된 구슬이 담긴 튜브에 1,200 μL 정액 용해액을 옮깁니다. 피펫으로 부드럽게 비즈를 다시 현지하세요. 정화된 용해액의 남은 온도를 -80°C에 저장합니다.
3. 용해액과 함께 구슬과 함께 4°C에서 어두운 환경에서 튜브 회전기에서 1시간 동안 배양합니다.
4. 이 배양 기간 동안 TEV 용출 버퍼를 준비합니다(표 2).

5. 용출

1. 3절의 구슬 세척 노트에 따라 구슬을 자기 선반에 펠릿으로 뿌리고 상원액을 차가운 단백질 저결합 튜브로 옮깁니다. 상청액은 -80°C에 보관하세요.
2. 워시 비즈를 2번 사용해 900 μL Wash I 버퍼를 사용하세요.
3. 워시 비즈는 900 μL Wash II 버퍼로 1회 세척합니다.
   참고: 이 단계가 완료되면 샘플을 더 이상 어둠 속에서 다룰 필요가 없습니다.
4. 비드에 450 μL TEV 용출 버퍼를 추가하세요.
5. 튜브 회전기에서 TEV 용출 완충제에 1시간 동안 배양합니다. 소량의 TEV 용출 완충제를 사용하는 소규모 실험의 경우, 튜브를 셰이커 위에서 1,000–2,000rpm 사이에서 인큐베이팅하세요.
6. 자기 선반에 비즈를 펠릿으로 뿌리세요. 유루이트를 단백질 결합이 낮은 튜브로 옮깁니다. 프로테오믹스 분석이나 웨스턴 블롯을 의도한 경우, 유루액트는 -80 °C에 보관하세요. RNA-seq 분석을 의도한 경우, 용출물 저장 지침은 보충 파일 1 "RNA 시퀀싱 권고" 1.2단계를 참조하십시오.
7. 선택사항: 친화도 정제가 상당한 rRNA/mRNA를 얻었는지(리보솜이 분리되었음을 나타내는) 예비적으로 확인하기 위해, TEV 용출 버퍼를 블랭크로 사용하여 마이크로볼륨 분광광도계에서 용출물을 분석합니다.
   참고: 활성화된 시스템을 포함한 세포에서 추출한 용출액은 분할 효소, 청색광/비오틴, 또는 L31-FTA가 없는 세포에서 추출된 것보다 260nm에서 더 높은 흡수율을 보여야 합니다.

6. 서부 얼룩

참고: 용해액과 플로우스루 샘플이 라엠리 버퍼에서 변성될 때까지는 빛 노출을 피하는 것을 권장합니다. 우리는 프리캐스트 젤, 상업적으로 구할 수 있는 전이 버퍼 및 러닝 버퍼, 그리고 반건식 전사 시스템( 재료표 참조)을 사용합니다. SDS-PAGE와 웨스턴 블롯은 아래에 별도 명시가 없는 한 제조사의 지침에 따라 수행됩니다.

1. 용해액, 플로우스루 및/또는 용출 샘플에 6개의 라엠리 버퍼를 첨가하여 최종 농도인 1개의 라엠리 버퍼를 만듭니다. 히트 블록이나 열사이클러에서 95 °C에서 10분간 가열하세요. 튜브 뚜껑이나 벽에 결로가 생기면 튜브를 잠시 회전시키세요.
2. 수조 제조사의 지침에 따라 젤 탱크에 버퍼가 있는 젤을 설치하세요. 샘플과 사다리를 싣세요.
3. 젤을 125V에서 45분에서 75분 동안 돌려서 염료 전면이 젤 바닥에 가까워질 때까지 유지하세요. 그동안 PBST 및 차단 버퍼를 준비하세요(표 2).
4. 전사 시스템 제조사의 지침에 따라 반건식 전이도를 수행하세요.
   참고: 모든 멤브레인 세척/인큐베이션 단계에서는 멤브레인이 완전히 잠기도록 하고, 멤브레인 트레이를 오비탈 또는 틸팅 록커 위에 올려놓으세요. 10 x 15 cm 트레이의 경우 25–50 mL의 완충액이 필요합니다.
5. 막을 이식 스택에서 분리하고 다음 단계로 바로 넘어가서 막이 건조하지 않도록 하세요.
   참고: 선택 사항: 막의 건조한 부위는 특히 스트렙타비딘-고추냉이 과산화효소처럼 짧은 인큐베이션을 가진 프로브의 경우 고르지 않은 차단이나 프로브 결합을 초래할 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해 이식 후 멤브레인을 100% 메탄올에 30초간 다시 적시고, 그 후 5분간 물에 적셔둡니다. 이 측정은 전송 후 건조된 PVDF 막을 재적시 하는 일반적인 권고사항과 유사하다^32,33.
6. 멤브레인을 PBST로 3회 10분간 실온에서 세척하세요.
7. 표 3에 명시된 조건에 따라 각 웨스턴 블롯 프로브에 대해 차단, 세척, 프로브 배양, 2차 항체 배양을 수행합니다.
8. 6.7단계의 최종 세척 후에는 제조사 지침에 따라 ECL 기판 성분을 혼합하고 멤브레인에 고르게 코팅하세요. 화학발광 겔 이미징 시스템에 이미지를 캡처하세요.

결과

서부 블롯(프로토콜 6절)은 실험의 성공 여부를 예비로 평가하는 가장 빠른 방법입니다. 막을 스트렙타비딘-HRP로 탐침할 때, 시스템의 모든 구성 요소가 존재하는 세포에서 나온 용해액은 비오티닐화된 L31-FTA에 해당하는 밴드를 포함해야 합니다(그림 2A, 레인 20). 전체 길이 BirA를 양성 대조군으로 형질전환한 세포에서는 동일한 밴드가 보통 더 높은 강도로 존재해야 합니다(그림 2A, 1–4번 레인). 이 밴드는 하나 이상의 시스템 부품이 누락된 샘플에서는 더 희미하거나 없어야 합니다(그림 2A, 다른 모든 라인). 포유류 세포는 70–80 및 120–130 kDa^범위의 여러 내인성 비오틴화 카복실라제 단백질을 포함

토론

ALIBi는 기존 세포 내 번역 연구 기법에 비해 여러 장점을 제공하며, 리보솜 생물학 및 그 외 분야에서의 미래 응용 가능성을 지닙니다. 이 프로토콜은 순차적 용해 및 원심분리와 비슷하거나 더 짧은 시간이 ^{소요되며,} 국소화 펩타이드 서열로 유전적으로 표적화할 수 있는 모든 세포 내 구획에 적용 가능할 수 있습니다. 지속적으로 활성화된 BirA^10,24와 비교할 때, 이 방법은 비오틴 고갈된 배지에서 세포를 배양할 필요가 없습니다. 이전에 보고된 태아 소 혈청 내 비오틴 농도는 0.04 μM에서 0.2 μM 사이이며^{, 25,42,43};

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
-80 °C 저장			세포 배양용
물에 0.1% 젤라틴	MilliporeSigma	ES-006-B	세포 배양용
0.2 µm 필터 유닛	Fisher	04-977-158	세포 배양용
0.5% trypsin-EDTA (10X)	ThermoFisher	15400-054	세포 배양용
1 M MgCl2	ThermoFisher	AM9010	용해 및 친화성 정제용
1 M Tris pH 7.5	ThermoFisher	15567027	용해 및 친화성 정제용
1 M Tris pH 8	ThermoFisher	AM9855G	옵션: 내인성 리보솜 단백질 로커스에 FTA 삽입용
1.5 및 2 mL 미세원심분리관, 오토클레이브			형질주입용
1.5, 2 mL 및 5 mL 단백질 저결합 미세원심분리관	Eppendorf	022431081, 022431102, 0030108302	용해 및 친화성 정제용
10 cm 조직 배양 판			세포 배양용
10 M NaOH	MilliporeSigma	72068-100ML	용해 및 친화성 정제용
10x Tris/glycine/SDS 런닝 버퍼 농축액	Bio-Rad	1610772	웨스턴 블롯용
37 °C 조직 배양 인큐베이터 x 2			세포 배양용. 하나는 세포 배양 및 형질주입 세포의 조명을 위한 주요 인큐베이터로 사용되며, 일시적인 공간은 ALIBi 활성화 당일 2차 인큐베이터에서 형질주입 세포를 수용하기 위해 필요합니다. 주요 인큐베이터에서 트랜스일루미네이터를 설치하는 동안.
37 °C 수조			세포 배양용
5 M NaCl	ThermoFisher	AM9010	용해 및 친화성 정제용
50 mM 비오틴	ThermoFisher	B20656	용해 및 친화성 정제용
6x Laemmli 버퍼	FIsher	50-196-784	웨스턴 블롯용
70% 에탄올			소독용
아세토니트릴	Fisher	A955	옵션: 질량 분석기 샘플 준비용
AcTEV 프로테아제 키트	ThermoFisher	12575015	용해 및 친화성 정제용
ALIBi C-fragment 플라스미드	Addgene	#235615, 235636 – 235641	형질주입용 미디-프레핑 규모 필요
ALIBi N-fragment 플라스미드	Addgene	#235614, 235635, 235642, 235643	형질주입용 미디-프레핑 규모 필요
알루미늄 호일			용해 및 친화성 정제용
암모늄 비카보네이트	MilliporeSigma	5.3305	옵션: 질량 분석기 샘플 준비용
anti-FLAG 항체	MilliporeSigma	F3165	웨스턴 블롯용
anti-GAPDH 항체	Cell Signaling	5174	웨스턴 블롯용
anti-mouse 이차 항체	GE Healthcare	NA931V	웨스턴 블롯용
anti-rabbit 이차 항체	GE Healthcare	NA934V	웨스턴 블롯용
anti-Rpl12 항체	Abcam	ab175219	웨스턴 블롯용
anti-Rpl31 항체	Abcam	ab103991	웨스턴 블롯용
anti-Rpl5 항체	ProteinTech	15430-1-AP	웨스턴 블롯용
anti-V5 항체	ThermoFisher	R960-25	웨스턴 블롯용
Apyrase	NEB	M0398L	용해 및 친화성 정제용
베타-머캅토에탄올 (55 mM)	ThermoFisher	21985-023	세포 배양용
청색 광 트랜스일루미네이터	Clare Research Chemical	DR46B (소형) 또는 DR196 (대형)	용해 및 친화성 정제용
소성 알부민 (BSA)	Fisher	BP1600-100	웨스턴 블롯용
C18 팁 (OMIX C18 팁)	Agilent	A57003100	옵션: 질량 분석기 샘플 준비용
세포 동결 용기			세포 배양용
15 mL 및/또는 50 mL 원추형 튜브용 원��