여기에서, 우리는 염소 장에서 히스티딘의 막 수송을 보여주는 저렴하고 재현 가능한 방법을 보고합니다. 이 과정은 나트륨 구배에 의해 활성화된 히스티딘과 나트륨 이온이 장세포막을 가로질러 함께 운반함으로써 발생합니다. 이 방법은 생체 막을 가로지르는 용질 이동을 더 잘 이해하기 위해 경험 학습 교육학을 활용합니다.
히스티딘은 필수 아미노산으로 면역 체계, 폐 환기 및 혈관 순환과 관련된 대사 산물의 전구체이기도 합니다. 식이 히스티딘의 흡수는 주로 장세포의 정점 막에 존재하는 광범위한 중성 아미노산 수송체(B0AT)에 의한 나트륨 결합 중성 아미노산 수송에 의존합니다. 여기에서는 염소 jejunal inverted sacs를 사용하여 내강에서 장 융모 장세포에 의한 히스티딘의 흡수를 보여줍니다. 다양한 농도의 나트륨과 히스티딘에 노출된 jejunal sacs를 분석하여 시간의 함수로 sac 내부의 히스티딘 농도를 측정했습니다. 그 결과 활성 히스티딘 흡수가 나타났습니다. 소금의 농도를 증가시키면 히스티딘의 흡수율이 높아져 염소 장 함낭에서 나트륨과 히스티딘 흡수의 공존을 시사합니다. 이 프로토콜은 적절한 변형을 통해 아미노산 또는 기타 대사 산물의 장 이동성을 시각화하는 데 적용될 수 있습니다. 우리는 이 실험을 학부생들이 막 전달의 개념을 이해하는 데 도움이 될 수 있는 경험적 교육 도구로 제안합니다.
생물학적 세포는 세포내 세포질과 세포외 내용물을 분리하는 막 지질 이중층으로 둘러싸여 있습니다. 멤브레인은 용질(1)의 움직임을 조절하는 반투과성 장벽 역할을 한다. 생체막을 통한 수송은 용질의 투과성 계수에 의해 영향을 받으며, 이는 용질의 농도 및 전하를 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 일반적으로 용질은 세 가지 메커니즘(그림 1)을 사용하여 멤브레인을 통해 이동합니다: 수동 확산(passive diffusion), 촉진 확산(facilitated diffusion) 및 능동 수송(active transport)2. 단순 확산은 용해성, 비전하 및 비극성 용질이 반투과성 멤브레인을 통해 농도 구배를 전달하는 과정입니다(그림 1A). 막 단백질은 더 높은 농도의 지역에서 더 낮은 농도의 영역으로의 용질의 이동을 포함하기 때문에 이 과정을 돕지 않습니다. 확산 속도는 Fick의 법칙3을 기반으로 합니다. 반면에, 촉진 확산은 단백질 의존적 수송으로, 멤브레인은 에너지 소비 없이 선택적 용질만 농도 구배를 통과할 수 있습니다(그림 1B). 이러한 종류의 수송은 구체적이며 포화 역학을 나타내는 데 있어 단순 확산과 다릅니다.
능동적 수송은 농도 구배에 대한 분자의 단백질 의존적 수송, 즉 ATP 또는 이온 구배를 사용하여 낮은 농도 영역에서 더 높은 농도 영역으로의 분자 수송입니다(그림 1C). 수송체가 ATP를 가수분해할 때, 수송체를 1차 능동 수송(primary active transport)이라고 부른다(그림 1C; 왼쪽 패널). 능동 수송의 또 다른 형태는 2차 능동 수송이다(그림 1C, 오른쪽 패널). 2차 능동 수송에서 용질은 전기화학적 구배를 기반으로 이동합니다. 이는 수송 단백질이 이온(일반적으로 Na+)의 이동을 농도 구배 아래로 다른 분자 또는 이온의 이동과 농도 구배에 대한 이동과 결합할 때 발생합니다. 이러한 종류의 용질 이동은 용질과 이온이 모두 같은 방향으로 이동하는 공동 수송(Symport) 또는 용질과 이온이 반대 방향으로 이동하는 교환(Antiport)일 수 있습니다.
식품 공급원의 식이 아미노산과 단당류는 소장에서 흡수됩니다. 소장은 기능적으로 십이지장(Duodenum), 제주눔(Jejunum), 회장(Ileum)의 세 부분으로 나눌 수 있습니다(그림 2). 용질의 흡수는 소장 전체에서 이루어지며, jejunum과 회장의 근위 끝에서 최대 흡수가 발생합니다. 장 장세포는 분극된 세포이며, 인접한 두 세포를 연결하는 긴밀한 연접은 기저외측과 정점 막 부위라는 두 개의 별개의 막 부위를 생성합니다(그림 2). 분해에 의해 생성된 발광 용질의 흡수는 정점 막 부위4에서 발생합니다.
정점 막의 장 장세포에서의 히스티딘 수송은 나트륨 의존적인 2차 활성 교감의 예입니다. 기저외측 말단에서 장세포로 들어가는 히스티딘은 농도 구배를 따라 간문맥 순환으로 이동합니다. 장내 나트륨의 세포 내 농도는 12mmoles/L1로 유지되며, 이는 기저막에 위치한 Na+ K+ATPase에 의해 세포 밖으로 나트륨을 활발하게 펌핑하기 때문에 세포 외측/발광 농도보다 낮습니다(그림 3). 장세포의 정점 막에서 B0AT와 나트륨 중성 아미노산 수송체 (SNAT) 5는 나트륨 의존성 공동 수송체(5,6)에서 히스티딘뿐만 아니라 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미노산을 운반하는 주요 수송체입니다. 장세포의 기저막에 존재하는 LAT(Large Amino Acid Transporter)1라고 불리는 또 다른 수송 단백질은 류신, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌과 같은 큰 중성 아미노산을 세포막을 가로질러운반한다 7.
체험 학습 교육학을 통해 분광 광도법 및 일상적인 생화학 분석과 같은 기술과 통합된 막 수송의 개념을 가르치는 것을 목표로 하기 때문에 개념을 이해하기 쉬운 용어로 보여줄 수 있을 뿐만 아니라 학부생의 참여 학습을 가능하게 하는 방법론을 개발하는 것이 필수적입니다. 현재 학생들이 생화학의 이러한 개념을 배우기 위해 직접 참여할 수 있는 리소스는 제한되어 있습니다. 여기에서는 학부 실험실에서 쉽게 재현할 수 있고 다른 대사 산물의 수송을 평가하는 데에도 적용할 수 있는 염소 장막을 통한 히스티딘 수송을 입증하기 위한 간단한 프로토콜을 보고합니다. 더 중요한 것은 이 방법이 학부 실험실에서 저렴한 재료를 사용하므로 가장 단순한 실험실 환경에서도 체험 학습이 가능하다는 것입니다.
멤브레인 수송은 기초 또는 응용의 모든 주요 생물 과학 분야의 학부생에게 가르치는 가장 기본적인 개념 중 하나입니다. 전통적으로 멤브레인을 가로지르는 움직임은 방사성 동위원소로 표지된 대사 산물을 사용하여 시각화되었습니다. 그러나 이러한 방법은 매우 위험하며 교육 또는 학습에 적합하지 않습니다. 체험 학습은 이러한 복잡한 개념을 이해하는 데 가장 적?…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 델리 대학교 스리 벤카테스와라 대학(Sri Venkateswara College)의 생화학과(Department of Biochemistry)의 지원을 받았습니다. 저자들은 실험실 직원들의 지원에 감사를 표합니다.
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | TARSONS | 500020 | |
10 mL Test Tubes | BOROSIL | 9800U04 | |
50 mL Sterile Falcon Tubes | TARSONS | 546041 | |
500 mL Beaker | BOROSIL | 10044977 | |
500 mL Conical Flask | BOROSIL | 691467 | |
D-Glucose | SRL | 42738 | |
Digital Spectrophotometer | SYSTRONICS | 2710 | |
Ethanol | EMSURE | 1009831000 | |
Finpipettes | THERMOFISHER | 4642090 | |
Glass Stirrer Rod | BOROSIL | 9850107 | |
L-Histidine | SRL | 17849 | |
NaCl | SRL | 41721 | |
Nitrile Gloves | KIMTECH | 112-4847 | |
Petri Dish | TARSONS | 460090 | |
Phosphate Buffered Saline (ph 7.4) | SRL | 95131 | |
Pipette Tips | ABDOS | P10102 | |
Sodium Carbonate | SRL | 89382 | |
Sodium Nitrate | SRL | 44618 | |
Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous) | SRL | 53046 | |
Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) | SRL | 22249 | |
Sulphanilic Acid | SRL | 15354 |