여기에서, 우리는 염소 장에서 히스티딘의 막 수송을 보여주는 저렴하고 재현 가능한 방법을 보고합니다. 이 과정은 나트륨 구배에 의해 활성화된 히스티딘과 나트륨 이온이 장세포막을 가로질러 함께 운반함으로써 발생합니다. 이 방법은 생체 막을 가로지르는 용질 이동을 더 잘 이해하기 위해 경험 학습 교육학을 활용합니다.
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방법 논문
Goat Intestinal Inverted Sacs를 사용한 히스티딘의 막 수송 시연: 학부생을 위한 체험 교육 도구
이 논문에서
요약
초록
히스티딘은 필수 아미노산으로 면역 체계, 폐 환기 및 혈관 순환과 관련된 대사 산물의 전구체이기도 합니다. 식이 히스티딘의 흡수는 주로 장세포의 정점 막에 존재하는 광범위한 중성 아미노산 수송체(B0AT)에 의한 나트륨 결합 중성 아미노산 수송에 의존합니다. 여기에서는 염소 jejunal inverted sacs를 사용하여 내강에서 장 융모 장세포에 의한 히스티딘의 흡수를 보여줍니다. 다양한 농도의 나트륨과 히스티딘에 노출된 jejunal sacs를 분석하여 시간의 함수로 sac 내부의 히스티딘 농도를 측정했습니다. 그 결과 활성 히스티딘 흡수가 나타났습니다. 소금의 농도를 증가시키면 히스티딘의 흡수율이 높아져 염소 장 함낭에서 나트륨과 히스티딘 흡수의 공존을 시사합니다. 이 프로토콜은 적절한 변형을 통해 아미노산 또는 기타 대사 산물의 장 이동성을 시각화하는 데 적용될 수 있습니다. 우리는 이 실험을 학부생들이 막 전달의 개념을 이해하는 데 도움이 될 수 있는 경험적 교육 도구로 제안합니다.
서론
생물학적 세포는 세포내 세포질과 세포외 내용물을 분리하는 막 지질 이중층으로 둘러싸여 있습니다. 멤브레인은 용질(1)의 움직임을 조절하는 반투과성 장벽 역할을 한다. 생체막을 통한 수송은 용질의 투과성 계수에 의해 영향을 받으며, 이는 용질의 농도 및 전하를 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 일반적으로 용질은 세 가지 메커니즘(그림 1)을 사용하여 멤브레인을 통해 이동합니다: 수동 확산(passive diffusion), 촉진 확산(facilitated diffusion) 및 능동 수송(active transport)2. 단순 확산은 용해성, 비전하 및 비극성 용질이 반투과성 멤브레인을 통해 농도 구배를 전달하는 과정입니다(그림 1A). 막 단백질은 더 높은 농도의 지역에서 더 낮은 농도의 영역으로의 용질의 이동을 포함하기 때문에 이 과정을 돕지 않습니다. 확산 속도는 Fick의 법칙3을 기반으로 합니다. 반면에, 촉진 확산은 단백질 의존적 수송으로, 멤브레인은 에너지 소비 없이 선택적 용질만 농도 구배를 통과할 수 있습니다(그림 1B). 이러한 종류의 수송은 구체적이며 포화 역학을 나타내는 데 있어 단순 확산과 다릅니다.
능동적 수송은 농도 구배에 대한 분자의 단백질 의존적 수송, 즉 ATP 또는 이온 구배를 사용하여 낮은 농도 영역에서 더 높은 농도 영역으로의 분자 수송입니다(그림 1C). 수송체가 ATP를 가수분해할 때, 수송체를 1차 능동 수송(primary active transport)이라고 부른다(그림 1C; 왼쪽 패널). 능동 수송의 또 다른 형태는 2차 능동 수송이다(그림 1C, 오른쪽 패널). 2차 능동 수송에서 용질은 전기화학적 구배를 기반으로 이동합니다. 이는 수송 단백질이 이온(일반적으로 Na+)의 이동을 농도 구배 아래로 다른 분자 또는 이온의 이동과 농도 구배에 대한 이동과 결합할 때 발생합니다. 이러한 종류의 용질 이동은 용질과 이온이 모두 같은 방향으로 이동하는 공동 수송(Symport) 또는 용질과 이온이 반대 방향으로 이동하는 교환(Antiport)일 수 있습니다.
식품 공급원의 식이 아미노산과 단당류는 소장에서 흡수됩니다. 소장은 기능적으로 십이지장(Duodenum), 제주눔(Jejunum), 회장(Ileum)의 세 부분으로 나눌 수 있습니다(그림 2). 용질의 흡수는 소장 전체에서 이루어지며, jejunum과 회장의 근위 끝에서 최대 흡수가 발생합니다. 장 장세포는 분극된 세포이며, 인접한 두 세포를 연결하는 긴밀한 연접은 기저외측과 정점 막 부위라는 두 개의 별개의 막 부위를 생성합니다(그림 2). 분해에 의해 생성된 발광 용질의 흡수는 정점 막 부위4에서 발생합니다.
정점 막의 장 장세포에서의 히스티딘 수송은 나트륨 의존적인 2차 활성 교감의 예입니다. 기저외측 말단에서 장세포로 들어가는 히스티딘은 농도 구배를 따라 간문맥 순환으로 이동합니다. 장내 나트륨의 세포 내 농도는 12mmoles/L1로 유지되며, 이는 기저막에 위치한 Na+ K+ATPase에 의해 세포 밖으로 나트륨을 활발하게 펌핑하기 때문에 세포 외측/발광 농도보다 낮습니다(그림 3). 장세포의 정점 막에서 B0AT와 나트륨 중성 아미노산 수송체 (SNAT) 5는 나트륨 의존성 공동 수송체(5,6)에서 히스티딘뿐만 아니라 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미노산을 운반하는 주요 수송체입니다. 장세포의 기저막에 존재하는 LAT(Large Amino Acid Transporter)1라고 불리는 또 다른 수송 단백질은 류신, 트립토판, 티로신, 페닐알라닌과 같은 큰 중성 아미노산을 세포막을 가로질러운반한다 7.
체험 학습 교육학을 통해 분광 광도법 및 일상적인 생화학 분석과 같은 기술과 통합된 막 수송의 개념을 가르치는 것을 목표로 하기 때문에 개념을 이해하기 쉬운 용어로 보여줄 수 있을 뿐만 아니라 학부생의 참여 학습을 가능하게 하는 방법론을 개발하는 것이 필수적입니다. 현재 학생들이 생화학의 이러한 개념을 배우기 위해 직접 참여할 수 있는 리소스는 제한되어 있습니다. 여기에서는 학부 실험실에서 쉽게 재현할 수 있고 다른 대사 산물의 수송을 평가하는 데에도 적용할 수 있는 염소 장막을 통한 히스티딘 수송을 입증하기 위한 간단한 프로토콜을 보고합니다. 더 중요한 것은 이 방법이 학부 실험실에서 저렴한 재료를 사용하므로 가장 단순한 실험실 환경에서도 체험 학습이 가능하다는 것입니다.
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프로토콜
모든 단계가 포함된 전체 프로토콜은 그림 4의 개략도에 나와 있습니다. 이 방법은 쥐의 내장을 사용한 이전 연구에서 채택된 것이다8. 실험은 기관 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 샘플은 상업 공급업체에서 조달했습니다.
주의: 이 실험 중에는 장갑을 착용하십시오.
1. 거꾸로 된 Jejunum sacs의 준비
- 염소 jejunum을 전처리하고 청소하십시오.
- 갓 희생 된 건강한 염소의 내장을 허가 된 공급 업체에서 조달하십시오.
- 내장을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 충분히 넣어 청소를 위해 완전히 담그도록 합니다.
- 소장과 대장을 분리하고 외부 결합 조직을 가위로 제거하십시오.
- 10mL 주사기를 사용하여 1x PBS로 소장을 부드럽게 세척하고 소화되지 않은 음식 물질을 제거하여 속이 빈 소장 백을 얻습니다. 효과적인 청소를 위해 이 과정을 세 번 이상 반복하십시오.
알림: 세척하는 동안 과도한 힘이나 바늘을 사용하지 마십시오. 힘을 가하면 장 벽에 구멍이 뚫려 장 세포가 손상될 수 있습니다. - 자를 사용하여 소장의 전체 길이를 측정하여 십이지장(소장의 1/4)과 제주눔(Jejunum)과 회장(Ileum)으로 균등하게 나뉘는 나머지 부분의 세 부분을 얻습니다.
- Jejunum 파트를 이용하여 실험을 진행한다.
- 거꾸로 된 Jejunum을 준비합니다.
- 칼날을 사용하여 결합 조직을 모두 제거하여 jejunum 부분을 청소하십시오.
- jejunum을 12-15cm 길이로 자르고 1x PBS로 세척 한 다음 PBS가 들어있는 페트리 접시에 담습니다.
- 융모 부분이 외부로 노출되도록 유리 막대를 사용하여 제주눔 부분을 반전시킵니다.
주의: 모서리가 날카로운 유리 막대를 사용하지 마십시오. 또한 유리 막대의 직경은 주머니의 직경보다 크지 않아야 합니다.
참고: 이 시점에서 광학 현미경으로 융모를 시각화할 수 있습니다(그림 4). - 반전된 jejunum 부분을 1x PBS로 부드럽게 씻어냅니다.
- 거꾸로 된 jejunum의 측면에서 누출이 있는지 확인하십시오.
- 거꾸로 된 제주눔 부분을 5cm 길이의 주머니로 자릅니다.
- 한쪽 끝을 노끈으로 묶고 주머니를 PBS로 채워 묶인 끝에서 시각적 누출이 있는지 다시 확인합니다.
- 다른 쪽 끝을 묶어 외부 표면에 융모가 있는 빈 거꾸로 된 주머니를 만듭니다.
- 거꾸로 된 주머니를 여과지에 두드려 외부 누출 여부를 다시 확인하십시오.
- 1x PBS에서 역주머니를 평형화합니다.
- 당일에 실험을 진행하거나 4°C에서 1x PBS에 주머니를 밤새 보관합니다.
2. 히스티딘 수송을 위한 실험 설정
- 표 1과 같이 서로 다른 농도의 염화나트륨에 따라 3개의 50mL 튜브로 구성된 2세트를 조립합니다.
- 준비된 장 주머니를 각 세트에 대해 30분, 60분 동안 지정된 튜브에 담그십시오.
- 지정된 시간이 지나면 별도의 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에서 주머니 내부의 용액을 비우고 부피를 측정합니다.
- 2mL 주사기를 사용하여 주머니 내부의 액체를 흡인합니다. 또는 주머니의 한쪽 끝을 풀고 내용물을 새 1.5mL 튜브에 모읍니다.
- 히스티딘 추정을 위해 수집된 샘플의 0.1mL를 분석하고 표준 그래프를 사용하여 농도를 계산합니다.
3. Pauly의 반응을 이용한 히스티딘의 추정
- 히스티딘에 대한 표준 곡선을 준비합니다.
- 히스티딘(5mM)과 물의 원액을 사용하여 표 2 에 표시된 대로 다양한 농도의 히스티딘 용액을 제조합니다.
- 각 튜브에 설판실산(0.5mL)과 질산나트륨(0.5mL)을 추가합니다.
- 실온에서 5분 동안 튜브를 배양한 다음 각 튜브에 탄산나트륨과 에탄올 각각 1mL를 추가합니다.
- 실온(~20°C)에서 20분 동안 튜브를 배양하고 파장 490nm에서 흡광도를 확인합니다.
- 흡광도 대 히스티딘 농도의 표준 곡선을 플로팅합니다.
참고: 이 히스티딘 검사는 디아조 화합물을 형성하는 히스티딘의 특성을 기반으로 합니다(그림 5).
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결과
장 융모에 의한 히스티딘이 역낭의 내강으로 흡수됨으로써 히스티딘의 장 이동성을 입증하기 위한 실험적 워크플로우는 그림 4, 표 1 및 표 2에 설명되어 있습니다. 세 가지 독립적인 실험 설정이 수행되었으며 대표 데이터가 그림 6에 나와 있습니다.
주어진 실험 조건에서 Pauly의 반응을 사용한 히스티딘 추정은 300μM까지 Lambert Beer의 법칙을 따랐습니다(그림 6A). 히스티딘에 대한 이 검사는 시약의 아미노산과 디아조늄 이온 사이의 결합에 의존합니다. Pauly의 시약에는 농축된 염산에 용해된 설판실산이 있습니다. 이 산은 질산나트륨과 HCl의 존재 하에 디아조트화(diazotization)를 거칩니다. 디아조늄 염 p-페닐디아조설포네이트는 알칼리성...
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토론
멤브레인 수송은 기초 또는 응용의 모든 주요 생물 과학 분야의 학부생에게 가르치는 가장 기본적인 개념 중 하나입니다. 전통적으로 멤브레인을 가로지르는 움직임은 방사성 동위원소로 표지된 대사 산물을 사용하여 시각화되었습니다. 그러나 이러한 방법은 매우 위험하며 교육 또는 학습에 적합하지 않습니다. 체험 학습은 이러한 복잡한 개념을 이해하는 데 가장 적합한 교육 기법이지만, 인프라 부족, 값비싼 형광 기반 염료/대사 산물, 그리고 가장 중요한 동물 해부 실험 금지로 인해 더욱 복잡해지는 과제입니다. 따라서 학부 실험실 환경에서 안전할 뿐만 아니라 저렴하고 실현 가능한 도구와 대체 방법을 개발할 필요가 있습니다. 여기에서 학부생을 위해 막 전달을 가르치는 새로운 방법이 개발되었습니다. 보고된 프로토콜은 Agar et al. 19548에서 적응된 것으로, 염소 장 세포를 가로지르는 히스티딘의 단방향 활성 막 수송을 보여줍니다. 이 연...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이익이나 기타 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 델리 대학교 스리 벤카테스와라 대학(Sri Venkateswara College)의 생화학과(Department of Biochemistry)의 지원을 받았습니다. 저자들은 실험실 직원들의 지원에 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 | TARSONS | 500020 | |
| 10mL 테스트 튜브 | BOROSIL | 9800U04 | |
| 50mL 멸균 팔콘 튜브 | TARSONS | 546041 | |
| 500mL 비커 | BOROSIL | 10044977 | |
| 500mL 코니컬 플라스크 | BOROSIL | 691467 | |
| D-글루코스 | SRL | 42738 | |
| 디지털 분광 광도계 | SYSTRONICS | 2710 | |
| 에탄올 | EMSURE | 1009831000 | |
| Finpipettes | THERMOFISHER | 4642090 | |
| 유리 교반기 막대 | BOROSIL | 9850107 | |
| L-Histidine | SRL | 17849 | |
| NaCl | SRL | 41721 | |
| 니트릴 장갑 | KIMTECH | 112-4847 | |
| 페트리 디쉬 | TARSONS | 460090 | |
| 인산염 완충 식염수 (ph 7.4) | SRL | 95131 | |
| 피펫 팁 | ABDOS | P10102 | |
| 탄산나트륨 | SRL | 89382 | |
| 질산나트륨 | SRL | 44618 | |
| 소듐 포스페이트 이염기성 (무수) | SRL | 53046 | |
| 소듐 포스페이트 모노베이직 (무수) | SRL | 22249 | |
| 설파닐산 | SRL | 15354 |
참고문헌
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