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방법 논문

쥐에서 Supra-Coeliac Aortic Cross Clamping에 의한 내장 허혈-재관류 후 급성 폐 손상 모델

930 조회수

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DOI:

10.3791/66896

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2025년 8월 15일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Vascular Surgery, Rouen University Hospital, 2INSERM U1096, FHU REMOD-VHF, Rouen University Hospital

이 논문에서

요약

이 연구는 쥐에서 개복술을 통한 복강 대동맥 교차 클램핑 중 내장 허혈-재관류 후 급성 폐 손상 모델을 설명합니다. 이를 통해 대동맥 클램핑의 임상적, 생물학적 효과뿐만 아니라 허혈-재관류가 기본 장기 및 원격 폐 손상에 미치는 영향을 조사할 수 있습니다.

초록

복부 대동맥류에 대한 개복 수술은 혈액 순환의 일시적인 중단을 필요로 하여 하류 장기의 허혈-재관류를 유발합니다. 신장, 장간막 및 내장 동맥이 관련될 수 있습니다. 셀리악 상부 대동맥 클램핑 후 허혈-재관류로 인한 원격 폐 손상을 예방하는 데 효과적인 것으로 입증된 치료법은 없습니다. 급성 폐 손상 및 약리학적 치료의 병태생리학적 경로를 연구하기 위해 쥐에서 대동맥 클램핑의 실험 모델이 개발되었습니다.

시술 전에 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 사용한 피하 진통제를 투여합니다. 자발 환기를 통한 전신 마취는 마스크를 통해 할로겐 가스(Isoflurane 2.5%)를 사용하여 유도됩니다. xypho-pubic 개복술은 가열된 테이블에서 수행됩니다(직장 내 온도 모니터링). 위비장 차단과 장은 오른쪽 옆구리로 후퇴하고 간은 상복부로 동원됩니다. 횡격막과 그 기둥은 횡격막 내 통로에서 셀리악 상부 대동맥을 단계별로 방출할 수 있도록 식별됩니다. 횡격막 기둥 사이의 대동맥을 원주 방향으로 제어하기 위해 해부를 부드럽게 수행합니다. 밑에 있는 복강 몸통과 상장간막 동맥을 주의 깊게 식별합니다. 미세혈관 클램프는 내장 동맥 위의 대동맥 폐색에 사용될 수 있습니다. 적절한 클램핑은 소장의 창백함과 관련된 대동맥 박동의 부재로 확인됩니다. 쥐는 허혈 기간 동안 마취된 상태를 유지합니다. 허혈 기간이 끝나면 마이크로클램프를 제거하고 대동맥 박동성과 장 재착색을 확인합니다. 복벽은 봉합사로 닫힌 다음 쥐의 피부를 닫습니다. 재관류 기간이 끝나면 동물은 같은 방식으로 마취됩니다. 채혈 중 방혈에 의해 안락사되고 폐를 채취할 수 있습니다. 폐 손상은 혈액 가스 분석, 폐 중량 측정 및 조직학적 검사를 통해 평가할 수 있습니다. 폐 샘플은 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석에도 활용될 수 있습니다.

서론

대동맥류는 대동맥의 국소적이고 영구적인 확장입니다1. 동맥류의 진행은 상당한 사망률을 초래하는 대량 출혈과 관련된 파열로 향하는 경향이 있습니다2. 따라서 치료의 초점은 이 극적인 합병증을 예방하는 데 있습니다. 대동맥류는 대부분 신장하이며 대동맥 관내인공삽입물로 치료할 수 있습니다. 대동맥-양장골 내이식편은 경피적 접근법을 사용하여 대퇴 동맥을 통해 최소 침습적 방식으로 도입되는 덮힌 분기 스텐트입니다. 이 기술은 대동맥 클램핑이 필요하지 않으며 내장 허혈을 유발하지 않습니다. 국소마취하에 시행할 수 있습니다. 대조적으로, 흉복부 동맥류 및 복합 복부 대동맥류와 같은 보다 광범위한 대동맥류는 혈관내 기술을 사용하여 치료하기가 더 어렵습니다. 이는 동맥류 분절 내에서 신장 동맥, 상장간막 동맥 및 복강 줄기가 침범하기 때문입니다(그림 1). 이러한 주요 내장 동맥은 대동맥 자체 외에도 재건되어야 합니다. 따라서 혈관내 최소 침습적 접근법은 내장 동맥 재건을 위해 천공 및/또는 분지 내이식편을 사용하는 보다 복잡한 절차가 필요합니다. 이러한 내이식편의 주요 한계는 제조 시간이 길기 때문에 종종 몇 달로 인해 응급 치료에 적합하지 않다는 것입니다. 이러한 경우 기존의 개복 수술 수리는 여전히 실현 가능하고 신뢰할 수 있는 옵션입니다.

개복 수리에 의한 치료에는 개복술과 내장 상부 클램핑, 즉 일시적인 내장 허혈이 필요합니다. 이러한 흉복부 동맥류를 치료하는 동안 합병증 발생률이 높습니다. 사망률은 5%에서 15%3 사이입니다. 폐 합병증은 60%, 신장 합병증은 40%에서 발생합니다4. 전신 염증 반응과 관련된 이러한 합병증은 다내장 부전으로 진행될 수 있습니다5. 이 이환율은 외과적 공격성, 마취, 진통, 혈역학적 변화, 출혈성 쇼크 및 허혈-재관류 현상을 포함하는 다인성입니다. 외과적 공격성은 접근법에 개흉술, 횡격막 절개술, 요절개술 또는 개복술이 포함되는지 여부에 관계없이 특히 횡격막 기능의 손상과 함께 환기 역학을 수정하여 합병증의 발현에 기여합니다6.

일시적인 내장 허혈 재관류는 소화관, 내장 시스템, 신장 및 하지를 포함한 하류 기관에 영향을 미칩니다7. 폐 합병증은 흉복부 대동맥 수술 후 가장 흔한 부작용입니다. 그들의 기원은 다인성입니다. Supraceliac 대동맥 클램핑은 폐 허혈-재관류를 직접적으로 유발하지 않습니다. 그러나 하류 내장 기관의 허혈-재관류는 주요 전신 염증 반응을 유발합니다. 내장 허혈-재관류와 원격 손상(특히 폐 손상)의 발생 사이의 인과 관계에 대한 가설은 잘 뒷받침됩니다. 폐포-모세혈관막의 중요한 구성 요소인 폐 내피 기능 장애는 급성 폐 손상(ALI) 발병의 중심인 것으로 보입니다. 대규모 전신 염증 반응과 호중구의 활성화는 이 과정에서 중추적인 역할을 합니다.

ALI는 종종 임상 양상보다는 조직학적 기준에 따라 정의됩니다. ALI는 폐 내피 및 상피 장벽의 파괴를 특징으로 하는 급성 염증성 질환을 말합니다. 폐의 기능 단위인 폐포-모세혈관막은 미세혈관 내피, 간질 공간, 폐포 상피의 세 가지 구성 요소로 구성됩니다.

ALI의 특징은 호중구 침윤과 세포독성 전염증성 매개체의 방출에 의해 유발되는 이 장벽의 투과성 증가입니다. 폐포 상피 손상은 I형 및 II형 폐세포를 모두 포함합니다. 폐포 표면의 95%를 덮고 있는 I형 세포는 손상에 매우 취약하며 가스 교환에 중요한 역할을 합니다. 더 많지만 더 작은 영역을 차지하는 유형 II 세포는 계면활성제 생산, 상피 복구 및 이온 수송에 필수적입니다. 손상 후 II형 세포는 재생 능력과 I형 세포로의 분화를 통해 폐포 무결성의 회복에 기여합니다.

여러 세포 사멸 경로는 ALI 동안 상피 손상과 관련이 있으며, 유형 I 세포는 특히 취약합니다. ALI는 일반적으로 내피 기능 장애를 반영하기 위해 미세혈관 투과성 측정 유무에 관계없이 폐부종을 평가하여 평가됩니다.

이 모델의 목적은 그림 2에 표시된 바와 같이 대사 및 기계론적 수준 모두에서 내장 허혈-재관류와 원격 폐 손상 발생 사이의 연관성을 조사하는 것입니다. 이 구체적인 연관성은 부분적으로만 이해되고 있습니다. 우리의 대동맥 클램핑 모델은 쥐의 복부 대동맥류가 없는 건강한 대동맥에 대한 내장 허혈-재관류 시나리오를 나타냅니다. 복강 줄기 위에는 인간이나 쥐의 주요 가지가 없습니다. 이 수준 위의 대동맥은 흉벽을 공급하는 작은 정수리 가지만 생성하는 상두정 대동맥에 해당합니다. 따라서 인간과 쥐 사이에서 이 수준에서 주요 혈관의 혈관 해부학에는 유의미한 차이가 없습니다.

이 모델을 사용하면 광범위한 탐색이 가능합니다. 원격 조직 손상 발생에서 초기 바이오마커를 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 또한, 이 모델을 사용하면 순환 매개체의 억제제 또는 특정 원격 장기 손상의 억제제를 포함한 잠재적인 억제제를 연구할 수 있습니다.

다른 허혈-재관류 모델은 원격 부상을 연구하는 데 사용됩니다. 대뇌, 장 및 신장 허혈-재관류 모델이 강력하게 대표됩니다 8,9,10. 상장간막동맥(SMA)의 일시적 폐색으로 인한 장 허혈-재관류 후 폐 손상에 대한 광범위한 연구가 있습니다11,12,13. 허혈 및 재관류 기간은 몇 분에서 몇 시간까지 매우 다양합니다14,15. 허혈 기간에 대한 이론적 근거는 원격 부상의 발생으로 이어지는 중요한 반응을 유발하기에 충분한 공격성을 유도하는 것입니다. 허혈 기간이 너무 짧아도 연구된 대사 경로에 상당한 변화를 일으키지 않을 수 있습니다. 재관류 기간과 관련하여 이론적 근거는 원격 손상의 조기 시작과 병태생리학적 변화의 잠재적으로 일시적인 특성에 있습니다. 이상적인 재관류 기간은 대사 장애를 적절하게 특성화하기 위해 너무 빠르거나 너무 늦어서는 안 됩니다.

모델은 주로 설치류입니다. 설치류의 장점으로는 작은 크기, 유지 관리 용이성, 짧은 수명 주기 및 풍부한 유전 자원이 있습니다16. 돼지, 개, 영장류와 같은 대형 동물을 사용하는 것은 정제에 관한 동물 실험의 윤리적 규칙에 부합하는 추가 이점이 없기 때문에 정당화되지 않는 것 같습니다. 또한, 인간과의 해부학적, 생리학적, 유전적 유사성으로 인해 설치류는 중개 연구를 허용합니다16.

SMA 클램핑 모델의 주요 한계 중 하나는 임상 실습에서 장 허혈 기간의 시작을 식별할 수 없다는 것입니다. 이것은 인간의 임상 상황에 대한 외삽을 더 불확실하게 만듭니다. 대조적으로, 복합 대동맥 수술 중에는 서로 다른 장기의 허혈 및 재관류 기간이 명확하게 식별됩니다. 또한, 셀리악 상부 대동맥 클램핑 동안 모든 기본 내장(소화관, 간, 비장, 신장, 골반 장기 및 하지)이 허혈 기간에 있습니다. 이 모든 기관은 허혈-재관류 현상을 겪습니다. 반대로, 특정 장기(장, 신장, 간 등)에 초점을 맞춘 허혈-재관류 모델, 대동맥 클램핑 모델 및 대사 병태생리학을 가진 여러 장기의 허혈-재관류 모델은 덜 연구됩니다. 유사하게, 대동맥 클램핑 후 폐 병변과 같은 원격 손상은 신진대사 측면에서 제대로 연구되지 않았습니다17,18.

기존 대동맥 클램핑 모델은 주로 신장 동맥 아래의 복부 대동맥을 클램핑하는 데 중점을 둡니다. 이 모델의 한계는 내장 허혈-재관류를 유도하지 않는다는 것입니다. 따라서 내장 허혈-재관류와 잠재적인 원격 손상 사이의 연관성을 입증하는 것을 허용하지 않습니다18,19. 게다가, 대동맥 클램핑을 통한 허혈-재관류를 연구할 수 있는 시험관 내 모델이 없기 때문에 생체 내 모델을 사용한 분석이 여전히 필요합니다.

따라서 쥐의 복강 상부 대동맥 클램핑에 대한 이 실험 모델은 원격 폐 손상을 표적으로 하는 병태생리학적 메커니즘 및 약리학적 개입에 대한 포괄적인 조사를 용이하게 합니다.

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프로토콜

이 모델의 생성은 동물 관리 및 실험에 대한 지침과 프랑스 및 유럽 법률을 준수합니다. 이 모델은 프랑스 루앙 노르망디에 있는 지역 대학 윤리 위원회(n°APAFIS: #18974)의 승인을 받은 실험 동물 연구에서 검증되었습니다.

1. 동물 모델 및 적응

  1. 동물 모델 적응 기간
    참고: 이 모델은 개선 원칙을 준수합니다.
    1. 수술 전에 적응할 수 있도록 일주일 동안 과밀하지 않은 시설에 동물을 수용합니다.
    2. 케이지당 쥐 2마리를 수용하고 물과 음식을 자유롭게 이용할 수 있으며, 숙련된 직원이 매일 점검합니다.
    3. 침구(종이 스트립)의 청결도를 매일 확인하고 필요한 경우 숙련된 직원이 일주일에 두 번 이상 체계적으로 교체하십시오.
    4. 실험자와 매일 접촉하고 12시간 조명 주기에 노출되는 1주일의 적응 기간 후, 절차는 동일한 실험자와 함께 별도의 조용한 방에서 진행됩니다.
  2. 동물 모델 종
    1. 수컷 Wistar 또는 Sprague Dawley 쥐를 사용하여 공인 및 인증된 사육 시설의 내장 허혈-재관류 생리병리학 분석에서 에스트라디올과 같은 호르몬 영향을 피합니다11,20.
    2. 실험군과 그룹당 동물의 수를 미리 결정합니다.
    3. 연령을 선택하고, 6-10 주 된 쥐 (350g)를 사용하는 것이 좋습니다.

2. 마취 및 진통

  1. 무 통
    1. 시술 당일 각 동물의 무게를 잰다.
    2. 진통 목적으로 시술 1시간 전에 쥐의 등 피부 수준에서 부프레노르핀(0.05mg/kg)을 25G 바늘과 2mL 주사기로 피하 투여합니다.
    3. 리도카인 염산염 젤 1%를 복부 피부에 향후 피부 절개 수준으로 바릅니다. 쥐의 통증에 대한 얼굴 표정을 평가하기 위해 척도를 사용하여 수술 후 정기적으로(최소 하루 2회) 통증을 재평가합니다21.
    4. 처음 24시간 동안 8시간마다 부프레노르핀(0.01 내지 0.05 mg/kg)을 체계적으로 피하 주사합니다.
    5. 그 후, National Center for the Replacement, Refinement, and Reduction of Animals in Research의 안면 통증 척도에 따라 부프레노르핀 주사(0.01 내지 0.05 mg/kg)를 투여하고 필요한 경우 8시간마다 반복합니다21.
  2. 전신 마취
    1. 전신 마취에 할로겐화 가스(Isoflurane)를 사용하십시오22.
    2. 유도 단계를 위해 2L/min의 공기 흐름 속도로 2L/min의 이소플루란(5%)이 포함된 환기 챔버를 2분 동안 사용하십시오.
    3. 마취 유지를 위해 수술 내내 2L/min의 기류 속도로 이소플루란(2-2.5%)을 사용한 자발 환기를 위해 쥐를 맞춤형 마스크로 전환합니다.
    4. 마스크를 통해 환기를 할 수 있도록 혀를 구강 밖으로 움직여 상기도를 청소합니다.
    5. 시술 중 마취 깊이를 지속적으로 모니터링하고 필요에 따라 이소플루란 농도를 조정하십시오.

3. 시술 중 쥐 배치

  1. 쥐의 생리적 관절 운동 범위를 존중하면서 접착 테이프를 사용하여 앞다리와 뒷다리를 고정한 상태에서 쥐를 등쪽으로 눕힙니다.
  2. 직장 온도를 모니터링하면서 37°C로 설정된 온열 패드 위에 쥐를 놓습니다.
  3. 다크리오겔을 바르고 눈을 보호하세요. 복부 털을 면도하고 포비돈-요오드 용액으로 복부를 철저히 소독하십시오.

4. 수술 절차

  1. 수술 절차의 상태
    1. 섬세한 조작을 용이하게 하기 위해 미세 수술 확대경 아래에서 절차를 수행하지만 필수 불가결한 것은 아닙니다.
  2. 베기
    1. 절개 부위의 위쪽 경계에서 검상돌기를 촉진한 후 복부 중앙의 피부를 절개하여 복부 근육의 백선을 드러냅니다.
    2. 복부 근육의 출혈을 방지하기 위해 백선의 복부 근육을 중앙에 절개합니다.
  3. 복강 내 노출
    1. 자체 유지 견인기로 양쪽의 복벽을 유지합니다.
    2. 기형(종양)이 없는지 확인하고 내장, 위, 비장, 간을 복부 오른쪽으로 동원한 다음 복강상대동맥을 노출시킵니다.
    3. 세로로 접은 작은 압축으로 복부 내부의 모든 내장을 최대한 유지하고 따뜻한(37°C) 식염수에 담갔습니다.
    4. 저체온증과 탈수를 방지하기 위해 37°C로 데운 식염수에 적신 압축으로 모든 내장을 덮으십시오.
  4. 주요 복강 내 혈관 식별
    1. 맥동과 횡격막 기둥 사이의 위치로 복강 상부 대동맥을 식별합니다.
    2. 면봉 끝이 있는 어플리케이터와 해부 겸자를 사용하여 부드럽고 조심스럽게 해부하여 횡격막 기둥 사이의 대동맥을 제어하여 가능한 한 무외상적으로 대동맥을 해제합니다.
    3. 해부 및 결찰 겸자와 함께 5-0 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 복강 상부 대동맥을 둘러쌉니다.
    4. 복강 몸통과 밑에 있는 장간막 동맥의 기원을 확인합니다. 이 수술 절차의 지속 시간은 쥐당 10-15분입니다.
    5. 신하 하대정맥의 기본 식별은 후복막의 투명성으로 인해 쉽습니다.
    6. 신하 하대정맥을 전면에서만 방출하여 약리학적 제제를 직접 정맥 투여할 수 있습니다.
  5. 정맥 주사
    1. 이를 위해 주사용 30G 바늘을 사용하고 지혈을 위해 몇 밀리미터의 지혈 압축을 가합니다.
    2. 약리학적 전처리를 수행하는 경우 대동맥 클램핑 전에 주사를 투여하십시오. 컨디셔닝 후 치료의 경우 대동맥 클램핑 중 또는 후에 투여하십시오.
    3. 이 프로토콜은 약리학적 전처리를 연구했으므로 대동맥 클램핑 5분 전에 투여합니다.
  6. 허혈 기간
    1. 전체 40분 허혈 기간 동안 무외상성 미세혈관 클램프로 복강 대동맥을 고정합니다. 클램핑 중 근본적인 대동맥 맥동이 사라지고 내장과 사지가 여러 번 변색되어 클램프의 효과를 확인합니다.
    2. 수분과 열 손실을 제한하기 위해 3개의 간단한 5-0 편조 흡수성 봉합사로 복부를 부분적으로 봉합합니다. 허혈 기간 동안 따뜻한 식염수에 적신 멸균 찜질로 수술 절개 부위를 덮습니다.
  7. 재관류 기간
    1. 허혈 기간이 끝나면 복부를 다시 열고 앞서 설명한 것과 같은 방식으로 대동맥을 노출시킵니다.
    2. 혈관 클램프를 제거하고 기본 대동맥 박동의 재개와 내장 및 사지의 재착색을 확인합니다. 재관류 기간은 마이크로클램프를 제거하는 즉시 시작됩니다.
  8. 복부 폐쇄
    1. 내장을 원래 위치로 되돌리고 백선에 5-0 편조 흡수성 봉합사로 복부를 닫고 5-0 모노필라멘트 흡수성 봉합사로 피부를 봉합합니다.
  9. 동물의 각성
    1. 내장 종괴와 저혈량증의 맥락에 의해 하대정맥이 압박되는 것을 방지하기 위해 쥐를 왼쪽 측면 욕창 위치에 놓습니다. 약 10분 후에 깨어날 때까지 온도를 유지하기 위해 열 램프가 있는 개별 케이지에 쥐를 넣습니다.
  10. 2차 전신마취
    1. 180분의 재관류 기간이 끝나면 유도 단계를 위해 2분 동안 2L/min의 기류량으로 이소플루란(5%)이 있는 환기 챔버를 통해 동일한 가스 마취를 사용하여 쥐를 마취합니다.
    2. 마취 유지를 위해 조직 수집 기간 동안 2L/min의 기류 속도로 이소플루란(2-2.5%)을 사용한 자발 환기를 위해 쥐를 맞춤형 마스크로 전환하십시오.

5. 샘플링

  1. 혈액 샘플
    1. 23G 바늘과 5mL 주사기를 사용하여 신장 정맥 아래의 하대정맥에 직접 천공하여 혈액 샘플을 수집합니다.
    2. 작은 지혈 압축을 적용하여 천자 후 지혈을 달성합니다.
    3. 단일 실온 테스트 카드에서 가스 및 표준 혈액 분석을 위해 총 혈액의 작은 부분(100μL)을 사용합니다.
    4. 남은 전혈을 4mL EDTA 튜브에 모아 +4°C에서 10분 동안 1,000×g으로 원심분리합니다.
    5. 액체 질소의 냉동 튜브에서 혈장을 동결하고 분석할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
  2. 조직 샘플
    1. 조직 샘플링
      1. 동물의 안락사 중에 조직 샘플(폐, 장, 신장, 간 및 심장)을 수집합니다. 앞서 언급한 것과 동일한 프로토콜에 따라 이소플루란으로 전신 마취 후 출혈로 이어지는 혈액 샘플링에 의한 안락사를 수행합니다.
      2. 열린 복부를 통해 각 조직 50mg을 채취합니다: 왼쪽 신장의 상극, 왼쪽 간엽 및 맹장 1cm 앞의 원위 소장.
      3. 그런 다음 심장과 폐를 식별하기 위해 신속하게 정중 흉골 절개술을 수행합니다.
      4. 인대에서 왼쪽 폐를 풀어 조직학적 분석을 위해 완전히 제거합니다. 인대에서 오른쪽 다엽 폐를 분리합니다. 핵산 및 단백질 분석을 위해 전엽을 분리하고 나머지는 37°C의 생리학적 혈청이 담긴 컵에 몇 분 동안 보관한 후 중량 측정을 수행합니다.
      5. 대동맥, 폐동맥 및 양쪽 대정맥의 섹션이 있는 전체 블록으로 심장을 추출합니다. 핵산 및 단백질 분석을 위해 좌심실의 일부를 샘플링하고 나머지는 37°C에서 생리학적 혈청이 담긴 컵에 몇 분 동안 보관한 후 중량 측정을 수행합니다.
    2. 핵산 분석
      1. 핵산 분석을 위해 조직 50g을 즉시 수집합니다. 액체 질소에 동결한 다음 분석할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
      2. 제조업체의 프로토콜에 따라 고품질 총 RNA를 분리하기 위해 즉시 사용 가능한 시약으로 총 RNA를 추출합니다.
      3. 분광 광도계로 RNA 농도와 순도를 결정합니다. 2μL의 샘플을 사용하여 RNA 농도를 측정하고 2μL의 RNase가 없는 물을 빈 기준으로 사용합니다. 260nm에서 흡광도를 사용하여 RNA 농도를 결정합니다.
        참고: 허용 가능한 RNA 순도는 1.7에서 2.0 사이의 260/280 및 260/230 흡광도비로 정의되었습니다.
      4. 역전사를 위해 각 RNA 샘플 1μg을 사용합니다.
      5. 즉시 사용 가능한 핫 스타트 반응 혼합물을 사용하여 실시간 온라인 검출 기능이 통합된 신속한 플레이트 기반 열 블록 사이클러에서 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 통해 전염증성 사이토카인(IL-1베타, TNF-알파, IL-6) 및 내부 참조(베타2-마이크로글로불린)의 mRNA 수준을 측정합니다(프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다).
      6. 2-ΔΔCT 방법을 사용하여 상대 mRNA 수준을 계산합니다.
    3. 단백질 분석
      1. 단백질 분석을 위해 50 mg의 조직을 50 개의 2.8 mm 산화 지르코늄 세라믹 비드가 들어 있는 2 mL 용해 튜브에 넣습니다. 이 용해 튜브에는 프로테아제 억제제 정제 및 포스파타제 억제제 정제가 포함된 1mL의 방사성 면역침전 분석(RIPA) 용해 완충액이 포함되어 있습니다.
      2. 실험실 튜브 밀에서 균질화하여 샘플에서 단백질을 추출하고 5초 검사를 3회 반복한 후 10초의 휴식 기간을 거칩니다.
      3. 샘플을 +4°C에서 10분 동안 10,000g에서 원심분리하고 분석할 때까지 상청액을 -20°C의 냉동튜브에 보관합니다.
      4. Bradford 기반 분석법 단백질 분석으로 단백질 농도를 측정하고 샘플을 -80°C로 유지합니다.
      5. SDS-PAGE를 사용하여 각 샘플에서 동일한 양의 단백질을 분리합니다.
      6. 분리된 단백질을 0.2μm 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮깁니다.
      7. 5% TBS-Tween 탈지 분유로 1시간 동안 차단한 후 선택한 특정 단백질에 대한 1차 항체와 함께 멤브레인을 배양합니다. 예를 들어, 헤파라나제를 탐색하기 위해, 인간 헤파라나제에 대한 토끼 다클론 1차 항체 (희석 1:2000) 및 대조군 단백질을 GAPDH로 사용하고, GAPDH에 대한 염소 단클론 1차 항체 (희석 1:5000)를 4°C에서 밤새 사용한다.
      8. TBST-Tween 0.1% 완충액으로 블롯을 세 번 세척합니다.
      9. 실온(RT)에서 1차 항체에 대한 HRP 접합 2차 항체와 함께 차단 용액에서 1시간 동안 배양합니다. 예를 들어, 헤파라나제를 탐색하기 위해 토끼 2차 항체 (희석 1:5000)에 대해 염소를 사용하고 GAPDH를 탐색하기 위해 염소 2차 항체 (희석 1:10000)에 대해 토끼를 사용합니다.
      10. 향상된 화학발광(ECL) 검출 시스템을 사용하여 면역 복합체를 검출합니다.
      11. 전용 소프트웨어를 사용하여 멤브레인을 분석하여 GAPDH를 내부 대조군으로 사용하여 표적 밴드의 밀도 측정 값을 결정합니다. 헤파라나제(50kDa)에 해당하는 밴드의 밀도 분석을 수행하고 이를 GAPDH 단백질 밴드(35kDa)로 정규화하여 상대 신호 강도를 결정합니다.
    4. 조직학적 분석
      1. 조직학적 분석을 위해 왼쪽 단엽 폐를 문부에 채취한 다음 16G 카테터를 사용하여 왼쪽 주 기관지를 통해 냉동 보존 용액을 주입합니다. 액체 질소에 얼린 후 -80°C에서 보관합니다.
    5. 중량 측정 분석
      1. 핵산 및 단백질 분석을 위한 샘플 후, 심장과 우측 다소엽 폐의 나머지 부분을 70°C의 오븐에서 건조시켜 습윤/건조 중량 비율로 조직 부종을 추정할 수 있도록 합니다.

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결과

이 프로토콜은 마취 및 수술 중 동물 손실이 최소화되고(5% 미만) 안전하고 급성 폐 손상 유도에 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 이소플루란을 사용한 마취는 자일라진 마취와 결합된 케타민보다 안전했으며(약 15% 손실), 빠른 각성 및 더 나은 쥐 회복을 보였습니다(데이터는 표시되지 않음). 마취된 모든 동물은 이 방법으로 안전하고 효과적인 대동맥 클램핑을 받을 수 있었습니다. 효과적인 대동맥 클램핑을 가진 모든 동물(100%)은 각각 40분 및 3시간 동안 지속되는 허혈 및 재관류 기간을 생존했습니다.

이 프로토콜에 따라 혈액 샘플 분석이 성공적으로 수행되었습니다. 65마리의 쥐를 대상으로 한 이 연구에서 수집된 평균 혈액량은 4.5mL ± 1.2mL였습니다. ELISA 및 Multiplex에 의한 기체 측정 분석과 생화학적 혈장 분석을 모두 허용했습니다. 혈액 가스 분석의 성공률은 100%였습니다. 회수된 혈장의 평균 부피는 750μL였습니다. 혈액 가스 분석에서는 suprac...

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토론

대동맥 교차 클램핑의 이 수술 모델은 내장 허혈-재관류 후 급성 폐 손상에 대한 조직 기반 및 혈장 기반 모두에서 포괄적인 분석을 허용할 수 있다는 이점을 제공합니다. 또한 사전 또는 사후 컨디셔닝에서 복강내, 경장 또는 정맥 투여로 약리학적 분자를 테스트할 수 있는 기회를 제공합니다.

중요한 단계 중 하나는 수술 중 상부 대동맥 클램핑으로 남아 있습니다. 마스터하면 이 단계를 빠르게 수행할 수 있습니다. 이 기술에 대한 학습 곡선은 가파르며, 안전하고 효과적인 외과적 접근법을 얻기 위해 일반적으로 3개 미만의 절차가 필요합니다. 미세한 곡선 기구(예: 해부 및 결찰 겸자)를 사용하면 절차가 크게 쉬워집니다. 또한 모노필라멘트 봉합사를 사용하면 주변 조직에 대한 부착을 방지하고 외상이 적습니다.

하대정맥에 정맥 투여하는 것도 상당한 출혈 위험이 있는 절차입니다. 지혈 압...

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공개 사항

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2 & 마이크로; m 니트로셀룰로오스 멤브레인 Trans-Blot 터보 전사 팩바이오 래드16201500.2 & 마이크로; M 니트로셀룰로오스 멤브레인 프리컷
1cc 루어 슬립 주사기 바늘 없음테루모MDSS01SE1cc 루어 슬립 주사기 바늘 없음
2cc 루어 슬립 주사기 (바늘 없음)벡톤 딘킨슨2cc 루어 슬립 주사기 (바늘 없음)
4 mL EDTA 튜브 BD K3 13 mm x75 mmBD 진공 테이너BD3688605 mL EDTA 튜브 BD K3 13 mm x 75 mm
5-0 꼰 봉합사 / Vicryl 5-0 (Ethicon) 또는 Novosyn (B. Braun)Ethicon - 존슨앤존슨V7970EVicryl 5-0 바늘 테이퍼 포인트 1/2 원 13mm 길이 45cm
5-0 모노필라멘트 흡수성 봉합사 / Monocryil PoliglecaproneEthicon - 존슨앤존슨Y493G바늘 3/8 원 길이 18in
5cc 루어 슬립 주사기 바늘 없음테루모SS-05LE1 시리즈5cc 루어 슬립 주사기 바늘 없음
무외상성 미세혈관 클램프/정맥용 일회용 혈관 클램프AROSurgicalTKF-1-20g쥐 대동맥을 고정하기 위한 정맥 사용을 위한 무외상성 미세혈관 클램프
BD 마이크로랜스 3 23G x 1 0.6 x 25mmBD 진공 테이너300800BD 마이크로랜스 3 23G x 1 0.6 x 25mm
BD 마이크로랜스 3 25G x 5/8 0.5 x 16mmBD 진공 테이너300600BD 마이크로랜스 3 25G x 5/8 0.5 x 16mm
BD 마이크로랜스 3 30G x 1/2 0.3 x 13mmBD 진공 테이너304000BD 마이크로랜스 3 30G x 1/2 0.3 x 13mm
베타-악틴 인비트로젠미국 칼즈배드15G5A11/E2
Bradford 기반 방법 단백질 분석Biorad, Marnes-la-Coquette, 프랑스5000201
부프레노르핀부프레노르핀
원심분리기 시그마 3-30Sigma, 독일10375, 10376, 10377, 10378, 10379, 91276, 109014에펜도르프용 원심분리기
cOmplete 미니로슈11836153001프로테아제 억제제 칵테일 25정
면봉
다크리오겔 /  안구 젤 Lubrithal 10gDechra 수의학 제품코드  ACL7376464안구 젤 Lubrithal 10g
일회용 메스파라마운트PDSS11일회용 메스 블레이드 n° 11
전기 소작덴트RMedEMB/87400고온의 지혈 펜
향상된 ECL 감지 시스템Biorad, Hercules, 캘리포니아, 미국1705060S
피셔브랜드 비드 밀 24피셔 사이언티픽15515799사용  분자 추출 전 생물학적 샘플의 분쇄, 용해 및 균질화
거즈 면봉 라핀.010106거즈 면봉 
ImageLabTM 소프트웨어바이오라드USB 드라이브 또는 라이센스
이소플루란 5%이소플루란 5%
리도카인 프릴로카인 젤 5% Aguettant, 리옹, 프랑스리도카인 프릴로카인 젤 5% 
LightCycler 480 기기로슈, Bâ le, 스위스5015243001열 순환기
윤활 젤리 멸균 K-Y 82 g레킷 벤키저윤활 젤리 멸균 K-Y 82 g
나노드롭 2000TermoScientific, 월섬, 매사추세츠, 미국ND-2000 시리즈분광 광도계
Peha Pince 해부학하르트만991063해부학적 플라이어
포스스톱로슈4906837001포스파타제 억제제 20정 
석고/접착 테이프아나포레135320수술용 접착 테이프/석고
포비온-요오드 용액 / Vé 티&이큐트; dine 솔루션Vé 토퀴놀외용 방부액
Precellys 용해 키트 튜브 경조직 균질화 CK28, BertinCK28Precellys 용해 키트 튜브 
프롤&에그레이브; ne 프롤리프로필렌 봉합사Ethicon - 존슨앤존슨7472H프롤&에그레이브; ne 5-0 니들 테이퍼 컷 3/8 원 13mm 길이 75cm
Safe-Lock 튜브 1.5mL에펜도르프.0030120086Safe-Lock 튜브 1.5cc 색상 없음 원심분리용 1000 튜브
Safe-Lock 튜브 2mL에펜도르프.0030120094Safe-Lock 튜브 2.0cc 색상 없음 원심분리용 1000 튜브
세이프락 튜브 5mL에펜도르프.0030119401Safe-Lock 튜브 5.0cc 색상 없음 원심분리용 200 튜브
식염수 NaCl 0,9%Aguettant, 리옹, 프랑스600502식염수 0.9% 500mL
SDS-페이지시그마-알리히
Surflash IV 카테터 16 g테루모SR*FF1651
서지셀Ethicon - 존슨앤존슨지혈 흡수성 면봉
봉합사 세트 n° 12하르트만4701762접착 약자, 시저, 애드슨 플라이어, 바늘 홀더가 포함된 봉합사 멸균 세트
SYBR 그린 키트 라이트 사이클러 480 SYBR 그린 I 마스터로슈4707516001SYBR 그린
TBST-트윈 0.1% 완충액 시그마-알리히
테스트 카드 Epoc 24 카드 13 매개변수지멘스-헬시니어스
티슈 TEK사쿠라 파인텍냉동 보존 솔루션 
TRIzol 시약 InvitrogenThermo Fisher Scientific, 미국 캘리포니아주 칼즈배드15596026트리졸 시약

참고문헌

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