방법 논문

항생제 내성에 대한 포괄적인 평가를 위해 폐수에서 저분자량 DNA 추출 강화

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DOI:

10.3791/66899

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2024년 7월 19일

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1Ashoka University

이 논문에서

요약

여기에서는 저분자량 세포외 DNA의 비율을 향상시켜 환경적 항생제 내성(AMR)을 평가하는 간단한 기술을 제시합니다. 20%-30% PEG 및 1.2M NaCl로 사전 처리하면 게놈 및 수평 전달 AMR 유전자를 모두 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 추가 최적화를 통해 키트가 없는 프로세스에 적합합니다.

초록

환경 감시는 포스트 팬데믹 시대에 공중 보건을 평가하는 중요한 도구로 인식되고 있습니다. 물, 특히 폐수는 환경에서 병원균 부담을 샘플링하기 위한 선택의 원천으로 부상했습니다. 개방형 배수구 및 지역사회 수처리 시설의 폐수는 병원균과 항생제 내성(AMR) 유전자의 저장소이며 인간과 자주 접촉합니다. 물에서 AMR을 추적하는 방법에는 여러 가지가 있지만, 이질적인 샘플에서 높은 수율로 우수한 품질의 DNA를 분리하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이를 보상하기 위해 시료 부피가 커야 하는 경우가 많아 실질적인 제약이 발생합니다. 또한 환경 DNA는 자주 단편화되며 AMR(플라스미드, 파지, 선형 DNA)의 소스는 저분자량 DNA로 구성됩니다. 그러나 선형 및 저분자량 DNA의 고수율 추출 방법에 초점을 맞춘 추출 공정은 거의 없습니다. 여기에서는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 침전 특성을 사용하여 소량의 폐수에서 고수율 선형 DNA를 추출하는 간단한 방법이 보고됩니다. 이 연구는 선형 DNA의 비율을 풍부하게 함으로써 메타게놈 분석을 위해 수집된 물 샘플의 전체 DNA 수율을 증가시키는 사례를 만듭니다. 또한 저분자량 DNA를 강화하면 고분자량 및 세포 내 DNA에 중점을 두어 환경 AMR을 과소 샘플링하는 현재의 문제를 극복할 수 있습니다. 이 방법은 세포외 DNA가 존재하지만 처리장에서 배출되는 폐수와 같이 농도가 낮을 때 특히 유용할 것으로 예상됩니다. 또한 수평적 유전자 전달을 통해 확산되는 AMR 유전자 절편의 환경 샘플링을 강화해야 합니다.

서론

SARS-CoV-2와 그 여파는 전염병 발병을 모니터링하고 예측하는 데 있어 환경 감시의 중요성을 강조했습니다 1,2. 바이러스 팬데믹이 명백하지만, 항생제 내성(AMR)의 증가는 종종 은밀한 팬데믹으로 묘사되며 전 세계적으로 주요 공중 보건 문제를 구성합니다 3,4. 따라서 항생제 내성(AMR)의 진화와 확산을 이해하기 위한 조율된 전략이 시급히 필요합니다. 폐수뿐만 아니라 수역은 병원균과 AMR 5,6,7,8 모두의 저장소 역할을 할 수 있습니다. 따라서 공유된 수원은 인간들 사이에서 질병을 전염시키는 강력한 원인이며, 특히 열악한 위생 상태와 인구 과잉이 밀접한 관련이 있는 저소득 및 중간소득 국가(LMIC)에서는 더욱 그러하다 9,10,11. 수원 검사는 지역 사회 건강을 평가하기 위해 오랫동안 사용되어 왔습니다 12,13,14. 최근 도시 하수 처리장에서 나오는 폐수는 클리닉 1,2,15,16,17,18에서 코로나 사례의 좋은 사전 지표임이 입증되었습니다.

특정 질병을 모니터링하는 것과 비교했을 때, 환경에서 AMR을 감지하고 추적하는 것은 더 복잡한 문제를 제기합니다. 사용 중인 항생제의 수가 많고, 다양한 내성 유전자, 다양한 국소 선택 압력, 박테리아 간의 수평적 유전자 전달로 인해 실제 AMR 부담을 평가하기 어렵고, 일단 평가한 후에는 임상 관찰과 연관시키기가 어렵다 19,20,21,22. 그 결과, 임상 AMR에 대한 공동 감시는 전 세계 여러 기관에서 수행되고 있지만(3,23,24), 환경 AMR 모니터링은 아직 초기 단계에 있으며,이는 19,25,26에서 검토되었습니다.

최근 몇 년 동안 환경 AMR을 추적하는 다양한 방법이 5,27에서 보고되었으며 28,29에서 검토되었습니다. 이들 중 대부분의 시작점은 이질적인 환경 샘플에서 양질의 DNA를 추출하는 것인데, 이는 그 자체로 도전입니다. 또한 환경 DNA는 일반적으로 적대적인 환경에 노출되어 단편화됩니다. 단편화된 세포외 DNA는 오랫동안 AMR 유전자의 중요한 저장소로 인식되어 왔으며(30,31,32에서 검토됨), 수평 유전자 전달을 통해 박테리아에 들어오고 나갈 수 있는 추가 잠재력이 있습니다. 따라서 환경에서 AMR 부담을 측정하는 것을 목표로 하는 모든 프로토콜은 선형 및 저분자량 DNA를 가능한 한 잘 샘플링해야 합니다. 놀랍게도, 선형 및 저분자량 DNA의 고수율 추출에 특화된 방법 개발에 대한 초점은 거의 없었습니다: 이 연구는 격차를 해결하는 데 중점을 둡니다.

DNA를 침전시키는 일반적이고 간단한 방법은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 염화나트륨(NaCl)과 같은 염을 결합하는 것입니다.33. PEG는 DNA 단편34,35의 크기 특정 침전을 달성하는 데 사용되는 고분자 군집 제입니다. PEG 농도가 낮을수록 효율적으로 침전될 수 있는 DNA의 분자량이 높아집니다. 많은 연구에서 DNA 및 RNA 1,2(표 1 17,33,36,37,38,39에 요약)의 환경 추출 중에 PEG를 사용하여 최종 단계 33,36,37에서 또는 SARS-CoV-2 15,40과 같이 바이러스 입자 추출을 위해 대규모 물 샘플을 농축했습니다. 현재 연구에서는 이전에 환경 DNA 추출에 사용된 PEG 농도(주로 바이러스 감시 프로토콜에 의해 결정됨)가 저분자량 선형 DNA를 캡처하지 않는 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 짧은 DNA 단편을 샘플링할 수 없으며 AMR 함량을 정확하게 평가하는 데 적합하지 않습니다. 이 연구는 폴리에틸렌 글리콜과 염화나트륨의 특성을 활용하여 저분자량 선형 DNA 단편을 높은 수율로 효과적으로 침전시켜 향후 비용 효율적인 DNA 추출 방법으로 이어질 수 있습니다. 이 방법은 복잡한 자연 샘플에서 단편화된 저분자량 DNA의 비율을 강화하는 데 사용할 수 있으므로 환경 AMR에 대한 보다 정확한 그림을 캡처할 수 있습니다. 조금만 더 정교하게 다듬으면 이 기술은 지방 자치 단체 및 기타 정부 기관에서 최소한의 기술 교육으로 감시 도구로 사용할 수 있는 쉽고 저렴한 응용 프로그램에 적합합니다.

프로토콜

1. 폐수 샘플링

  1. 500mL 폴리프로필렌 비커를 개방형 배수 또는 하수 처리장(STP) 저장소에 담그고 ~300mL의 폐수 샘플을 수집합니다.
  2. ~250mL의 샘플을 250mL 오토클레이브 폴리프로필렌 병에 옮깁니다.
  3. 병의 뚜껑을 조이고 플라스틱 필름으로 밀봉하십시오. 병을 밀폐된 가방에 똑바로 세워 보관하십시오.
  4. 상온에서 밀폐된 용기에 샘플을 똑바로 세워 운반합니다.
  5. DNA 추출을 위해 처리하기 전에 70°C의 열풍 오븐에서 4시간 동안 샘플을 가열 비활성화합니다.

2. 폐수 샘플에서 DNA 추출

  1. 폐수 샘플이 냉각되면 샘플을 최대 속도로 소용돌이치고 파편/슬러지가 가라앉도록 합니다.
  2. 50mL 원심분리기 튜브에 폐수 27.5mL를 디캔팅하고 PEG-8000 13.5g(최종 농도 30%)과 NaCl 3g(최종 농도 1.2M)을 넣고 완전히 녹을 때까지 잘 섞는다.
  3. 4 °C에서 하룻밤 동안(~16-18시간) 샘플을 배양합니다.
  4. 4°C에서 15,500 x g 으로 30분 동안 샘플을 원심분리합니다.
  5. 상층액을 버립니다.
    알림: 30%의 PEG-8000은 점성이 높으며 상층액을 버리는 동안 펠릿이 빠질 수 있습니다. 상층액은 펠릿이 손실되지 않도록 천천히 조심스럽게 디캔팅해야 합니다. 2.6 - 2.23 단계는 키트 지침에 따라 토양 DNA 추출 키트를 사용하여 약간의 수정을 가하여 수행합니다.
  6. 펠릿을 키트의 용해 용액 800μL에 용해시키고 용액을 혼합된 지르코늄 비드 튜브에 추가합니다.
    알림: 더 많은 양을 처리하는 경우 원하는 수의 튜브에서 펠릿을 합동하십시오. 예를 들어, 160mL의 시료를 처리하는 경우; PEG 및 NaCl이 있는 폐수를 포함하는 4개의 50mL 튜브가 있습니다. 4°C에서 15,500 x g 으로 30분 동안 4개의 튜브를 모두 원심분리한 후 4개의 튜브 모두에서 상층액을 버립니다. 각각에 200μL의 CD1 용액을 첨가하고 펠릿을 다시 현탁시킨 다음 하나의 비드 튜브에 함께 합칩니다.
  7. 비드 튜브를 소용돌이에 수평으로 고정합니다. 20-30분 동안 최대 속도로 튜브를 소용돌이칩니다.
    참고: 장기간의 소용돌이는 샘플의 완전한 용해 및 균질화를 보장하여 DNA 수율을 향상시킵니다.
  8. 8,000 x g 에서 15초 동안 튜브를 회전시켜 바닥에 비드를 가라앉히고 거품을 제거한 다음 튜브에서 상층액을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 완전히 옮깁니다. 일부 비드는 이 단계에서 옮겨질 수도 있습니다.
  9. 상층액을 15,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
  10. 상층액을 깨끗한 2mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 상층액에는 여전히 일부 부유 입자가 포함될 수 있습니다.
  11. 200μL의 침전제 용액과 와류를 5초 동안 최대 속도로 추가합니다. 4 °C에서 5 분 동안 배양합니다.
    참고: 4°C에서 배양하면 DNA가 용액에 남아 있는 동안 단백질과 세포 파편의 침전 효율이 증가합니다. 추출된 DNA의 수율과 품질을 크게 저하시키지 않고 이 단계에서 프로토콜을 최대 2시간 동안 일시 중지할 수 있습니다.
  12. 15,000 x g 에서 실온(RT)에서 1분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 피하고 투명한 상층액을 깨끗한 2mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  13. 상층액 700μL당 600μL의 결합 완충액을 추가하고 5초 동안 최대 속도로 와류를 추가합니다.
  14. 700μL의 용해물을 실리카 스핀 컬럼에 로드하고 2분 동안 배양한 다음 15,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
    참고: 실리카 컬럼에서 용해물을 배양하면 DNA와 컬럼의 결합이 향상되어 DNA 수율이 향상됩니다.
  15. 플로우 스루를 버리고 모든 용해물이 스핀 컬럼을 통과할 때까지 2.14단계를 반복합니다.
  16. 스핀 컬럼을 깨끗한 2mL 수집 튜브에 조심스럽게 넣습니다. 스핀 컬럼에 플로우스루가 튀지 않도록 하십시오.
  17. 스핀 컬럼에 500μL의 세척 버퍼를 추가하고 스핀 컬럼을 15,000 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다.
  18. 플로우 스루(flow-through)를 폐기하고 스핀 컬럼을 동일한 2mL 수집 튜브에 다시 넣습니다.
  19. 스핀 컬럼에 500μL의 에탄올 세척 완충액을 추가합니다. 15,000 x g 에서 1분 동안 원심분리기
  20. 플로우 스루(flow-through)를 버리고 스핀 컬럼을 새 2mL 수집 튜브에 넣습니다.
  21. 16,000 x g 에서 2분 동안 원심분리하여 잔류 에탄올을 제거합니다. 스핀 컬럼을 새 1.5mL 튜브에 넣습니다.
  22. 100μL의 용출 완충액(55°C로 예열)을 흰색 필터 멤브레인 중앙에 추가하고 5분 동안 배양합니다.
    참고: 가열된 용출 완충액은 멤브레인에서의 배양과 함께 DNA, 특히 고분자량 DNA의 용출 효율을 높입니다.
  23. 15,000 x g 에서 1분 동안 원심분리기 스핀 컬럼을 버립니다.
  24. 용리된 DNA에 10μL의 3M NaCl(DNA 용리액 1/10 부피)과 250 μL의 냉각 절대 에탄올(DNA 용리액 2.5 부피)을 추가합니다. 반전하여 잘 섞고 내용물을 8,000 x g 에서 15초 동안 회전시킵니다.
  25. DNA-에탄올 혼합물을 -20°C에서 최소 1시간 동안 배양합니다.
    참고: DNA-에탄올 혼합물의 배양은 추출된 DNA의 수율이나 품질을 크게 저하시키지 않고 16시간까지 늘릴 수 있습니다.
  26. 4°C에서 19,000 x g 으로 30분 동안 원심분리기 디캔테이션으로 상층액을 버립니다.
  27. 펠릿에 500μL의 냉각된 70% 에탄올을 추가합니다.
  28. 4°C에서 19,000 x g 으로 15분 동안 원심분리기 디캔테이션으로 상층액을 버립니다.
  29. 튜브를 뒤집어 티슈 페이퍼에 부드럽게 두드려 모세관 작용으로 잔류 에탄올을 제거합니다.
  30. 모든 에탄올이 증발할 때까지 37°C에서 5-10분 동안 가열 블록에서 튜브를 열어 두어 DNA 펠릿을 완전히 건조시킵니다.
  31. DNA 펠릿을 30-50 μL의 오토클레이브 이중 증류수(ddH2O)에 다시 현탁시킵니다. 37 °C에서 5-10 분 동안 배양합니다.
  32. 8,000 x g 에서 15초 동안 DNA를 스핀다운합니다.
  33. Nanodrop 분광광도계의 핵산 설정에서 dsDNA 애플리케이션을 선택합니다.
    1. 보푸라기가 없는 티슈와 물로 받침대를 청소하십시오. ddH2O를 사용하여 기기를 비운 다음 받침대에 DNA 샘플 2μL를 로드합니다.
    2. 농도 및 흡광도 비율(A260/280 및 A260/230)을 측정하여 순도를 결정합니다.
  34. DNA 샘플을 -20 °C에서 보관하십시오.

3. 중합효소연쇄반응(PCR) 증폭 선형 DNA의 침전을 통해 다양한 분자량에서 DNA 회수율을 확인할 수 있습니다.

  1. E. coli MG155의 게놈 DNA를 사용하여 PCR로 유전자 단편을 증폭하여 fusA, lacZ, gapA, rpsD, 16S rRNA, marR 유전자에서 선형 단편 풀을 생성합니다(프라이머 염기서열 및 PCR 조건은 표 2 참조).
  2. PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 산물을 정제하고 PCR 산물을 함께 합칩니다.
  3. 통합된 앰플리콘을 동일한 부피의 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 나누고 하나의 튜브를 '입력 DNA'로 레이블을 지정합니다.
  4. 'Input DNA'라고 표시된 튜브를 제외한 각 튜브에 원하는 조건(9%, 20%, 30% PEG-8000, 0.3M, 1.2M NaCl)에 따라 PEG와 NaCl을 첨가하고 최종 부피를 1mL로 구성합니다.
  5. 4 °C에서 밤새(~16-18시간) 튜브를 배양합니다.
    참고: 3.16까지의 나머지 단계 동안 '입력 DNA'는 냉장고에 변경되지 않은 상태로 보관됩니다.
  6. 4°C에서 1시간 동안 원하는 속도(15,000 x g 또는 20,000 x g)에 따라 탁상용 마이크로 원심분리기에서 튜브를 회전시킵니다.
  7. 마이크로피펫을 사용하여 펠릿 반대쪽에서 상층액 900μL를 조심스럽게 제거합니다.
  8. 첫 번째 에탄올 세척: 펠릿에 900μL의 냉각된 70% 에탄올을 추가하고 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.
  9. 3.6단계에서 사용한 것과 동일한 속도(15,000 x g 또는 20,000 x g)로 4°C에서 30분 동안 튜브를 회전합니다.
  10. 디캔팅으로 상층액을 제거합니다.
  11. 두 번째 에탄올 세척: 펠릿에 500μL의 냉각된 70% 에탄올을 추가합니다.
  12. 3.6단계에서 사용한 것과 동일한 속도(15,000 x g 또는 20,000 x g)로 4°C에서 30분 동안 튜브를 회전합니다. 디캔테이션으로 상층액을 버립니다.
  13. 튜브를 뒤집어 티슈 페이퍼에 부드럽게 두드려 모세관 작용으로 잔류 에탄올을 제거합니다.
  14. 모든 에탄올이 증발할 때까지 37°C에서 5-10분 동안 가열 블록에서 튜브를 열어 두어 DNA 펠릿을 완전히 건조시킵니다.
  15. 펠릿을 20μL의 오토클레이브 이중 증류수에 다시 현탁시킵니다.
  16. Nanodrop 분광 광도계 또는 형광계를 사용하여 다양한 조건과 '입력 DNA'에 의해 침전된 DNA의 농도를 측정합니다.
  17. DNA 시각화를 위해 침전된 DNA를 1% 아가로스 겔에 로드합니다.

  

결과

폐수 샘플에서 DNA의 고수율 추출을 위한 프로토콜 수립
물 샘플로부터 고품질 DNA 및 RNA를 추출하기 위해 이전에 확립된 프로토콜의 수정된 버전이 사용되었다17. 샘플은 인도 북부의 델리-NCR 지역에 있는 개방형 배수구와 하수 처리장에서 공급받았습니다. PEG 및 NaCl(그림 1)을 사용하여 전처리 한 후 토양 및 물에서 DNA를 추출하기 위한 키트를 통해 샘플을 처리했습니다. 모든 경우에서, 환경 시료37에서 전형적으로 나타나는 것처럼, 세포 내 박테리아 DNA 및 배경 도말에 해당할 가능성이 있는 두드러진 고분자량 띠가 관찰되었다(그림 2).

하수 처리장(STP) 폐수에서 효율적인 DNA 추출 부족
개방 배수 및 STP 유입수로부터 총 DNA의 합리적인 수율이 얻어졌지만(표 3), 최종 처리된 유출물로부터는 DNA를 얻을 수 없었다; 낮은 수율의 문제는 이전 작업에서도 설명되었습니다41 (그림 3). 폐수의 염소화 및 일부 경우에는 UV 및 한외여과 처리(42)를 모두 포함하는 후처리, 미생물 부하가 낮을 것으로 예상되며, 임의의 잔류 DNA(세포외 및 단편화된 DNA로 구성됨)는 희석될 것이다. 시료 농축 및 핵산 침전에 사용되는 초기의 낮은 농도의 PEG는 저분자량 DNA를 제외할 수 있습니다. 즉, 단편화된 DNA는 초기 농축 단계에서 손실될 수 있습니다.

PEG와 NaCl의 농도가 증가하면 저분자량 DNA가 침전됩니다
PEG 농도를 증가시키는 것이 저분자량 DNA를 풍부하게 하는 데 도움이 되는지 테스트하기 위해 다양한 길이의 PCR 단편에 대한 실험실 표준이 생성되어 다양한 선형 DNA 단편을 생성했습니다(그림 4). 표준물질은 9% PEG-8000 + 0.3M NaCl(원래 조합), 9% PEG-8000 + 1.2M NaCl(염만 올리기), 30% PEG-8000 + 0.3M NaCl(PEG만 올리기) 및 30% PEG-8000 + 1.2M NaCl(소금과 PEG를 모두 올리기)의 네 가지 다른 강수 조건을 적용했습니다. 조건은 SARS-CoV-2 감시17 에 사용되는 표준 프로토콜과 환경 샘플(33)에서 DNA를 추출하는 모듈식 방법에 대한 연구에서 보고된 조건에 따라 선택되었습니다. 두 가지 다른 원심분리 속도(15,000 x g 및 20,000 x g )는 DNA 펠릿화에 대한 차동 속도의 효과에 기초하여 사용되었다(43). PEG 및 NaCl 농도를 각각 30% 및 1.2M로 높이면 DNA의 총 회수율이 약 70% 증가했으며 150 염기쌍(bp)만큼 작은 DNA 단편이 효과적으로 침전되었습니다(그림 5). 속도의 차이는 수율에 큰 영향을 미치지 않았으며(그림 6A) 원심분리 시간이 오래 걸렸기 때문일 수 있습니다. 원래의 PEG/NaCl 조합에서 총 DNA 회수율이 더 낮았기 때문에 더 낮은 분자량 밴드가 존재하더라도 시각화 한계보다 낮은 농도에 있을 수 있었습니다. 이를 테스트하기 위해 침전을 위한 투입 DNA의 양을 늘리고 각 처리에 해당하는 과량의 DNA(1.5mg)를 시각화를 위해 아가로스 겔에 로드했습니다. 30% PEG를 사용한 처리만이 가장 낮은 분자량, 즉 150bp 밴드의 양호한 회수율을 보여주었습니다(그림 6B).

원형 DNA(박테리아 게놈 및 플라스미드 DNA)의 침전은 동일한 경향을 따르지 않습니다.
대장균 MG155 게놈 DNA 및 플라스미드(pRSV, ~4kb)는 다양한 PEG 및 NaCl 농도의 침전에 사용되었습니다. 선형 DNA와 달리 PEG 및 NaCl 수치 상승의 큰 영향은 없었으며(그림 7), 이는 원형 및 고분자량 DNA(일반적으로 세포 내 DNA)의 수율이 PEG 상승에 영향을 받지 않음을 시사합니다. 이는 PEG 농도에 따라 용해도가 급격히 감소한 단백질 침전(44)에 대한 초기 관찰과 대조를 이룬다. PEG가 군집제로 작용한다는 점을 감안할 때, 상호 작용에 사용할 수 있는 거대분자의 표면적이 침전제로서의 효과에 중요한 역할을 한다는 가설이 세워져 있습니다. 선형 DNA의 경우 크기가 증가함에 따라 상호 작용할 수 있는 영역도 증가한다는 가설을 세우는 것이 합리적입니다. 원형 DNA를 사용하면 낮은 PEG 농도가 이미 분자를 포화시키기에 충분할 수 있으며 농도를 더 높여도 상호 작용을 위한 유효 표면적이 증가하지 않을 수 있습니다.

PEG 및 NaCl을 사용한 침전을 생략할 때 폐수에서 DNA의 수율이 저하됩니다.
전처리 폐수가 DNA 추출에 중요한지 테스트하기 위해 20mL의 열 비활성화(70°C, 4시간) 폐수를 이전에 준비된 선형 표준물질 10mg으로 스파이크하고 (a) PEG + NaCl 없이, (b) 9% PEG + 0.3M NaCl(원래 조합), (c) 20% PEG + 1.2M NaCl(증가된 PEG 및 염)로 4°C에서 밤새 배양했습니다. 그런 다음 샘플은 프로토콜에 설명된 대로 DNA 추출을 위해 토양 키트를 통해 처리되었습니다. 9% PEG + 0.3M NaCl로 폐수 시료를 전처리하면 전처리 단계가 없을 때보다 추출된 DNA의 수율이 60% 증가하는 것으로 나타났으며(그림 8), 이는 폐수 시료에서 고수율 DNA를 얻기 위해서는 PEG 및 NaCl 침전이 필수적임을 나타냅니다. 또한 고분자량 게놈 DNA(gDNA)를 포함한 전체 DNA 수율은 높은 PEG와 염분을 침전에 사용할 때 더 낮지만 저분자량 DNA의 비율이 높아진다는 점도 주목할 만합니다(그림 8). PEG 및 염을 올릴 때 전체 수율의 감소는 PEG의 점성이 높은 특성에 기인할 수 있으며, 이는 상층액을 제거하는 동안 DNA 펠릿의 손실로 이어질 수 있습니다. 이는 제안된 단계적 DNA 추출 방법(그림 9)에 대한 주장을 강화하며, 여기서 고분자량 DNA는 먼저 낮은 PEG 및 NaCl 침전을 사용하여 추출할 수 있고, 생성된 상층액은 증가된 PEG 및 NaCl로 또 다른 전처리를 거쳐 첫 번째 침전을 탈출한 저분자량 DNA를 효율적으로 추출할 수 있습니다.

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그림 1: 폐수 샘플의 전처리. 시료 채취부터 DNA 추출까지의 워크플로우를 보여주는 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 폐수 샘플에서 추출한 DNA의 일반적인 겔 프로파일. 다른 현장에서 샘플링 된 50-100mL의 폐수 (그림 참조)를 70 ° C에서 4 시간 동안 배양하여 열 비활성화 시켰습니다. 그런 다음 4°C에서 하룻밤 동안 9% PEG와 0.3M NaCl로 배양한 다음 토양 또는 물 키트를 사용하여 DNA를 추출하기 위해 처리했습니다. 추출된 총 DNA의 약 150ng를 마커로 1킬로-염기쌍(kb) 래더와 함께 1% 아가로스 겔에 로드하고 전기영동(90V, 30분)을 실시했습니다. DNA는 염료 SYBR SAFE를 사용하여 자외선(UV) 아래에서 시각화되었습니다. 오른쪽 표에는 각 레인에 대한 DNA 추출에 사용되는 키트, 샘플 수집 소스, 처리된 폐수의 양 및 키트가 자세히 나와 있습니다. (STP: 하수 처리장; UVR: Ultraviolet Radiation) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: STP 유출수 샘플은 총 DNA 수율이 낮음을 보여줍니다. STP 유입수 및 유출수에서 샘플링한 40mL의 폐수를 70°C에서 4시간 동안 배양하여 가열-비활성화시켰다. 그런 다음 4 °C에서 밤새 9 % PEG 및 0.3M NaCl로 배양 한 다음 토양 또는 물 키트 또는 박테리아 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 DNA를 추출하기 위해 처리했습니다. 추출된 총 DNA의 약 150ng를 마커로 1kb ladder와 함께 1% 아가로스 겔에 로드하고 전기영동(90V, 30분)을 실시했습니다. DNA는 염료 SYBR SAFE를 사용하여 자외선(UV) 아래에서 시각화되었습니다. 유출 샘플에 대해 추출된 DNA의 농도는 폐수 1ng/mL 미만이었기 때문에 시각화할 수 없었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 저분자량 DNA 침전의 효능을 테스트하기 위한 선형 DNA 크기 표준물질 생성. 표 2와 같이 E. coli(MG1655) 게놈 DNA를 주형으로 사용하고 프라이머 및 조건을 사용하여 PCR 증폭에 의해 5개의 서로 다른 크기의 DNA 단편을 생성하였다. PCR 정제 키트로 정제된 DNA(~1μg)를 마커로 1kb ladder와 함께 1% 아가로스 겔에 로드하고 전기영동(90V, 40분)을 실시했습니다. DNA는 염료 SYBR SAFE를 사용하여 자외선(UV) 아래에서 시각화되었습니다. lane은 단편이 증폭된 유전자 이름과 예상되는 앰플리콘 크기로 라벨링됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 저분자량 DNA는 가장 높은(30%) PEG 농도에서만 효율적으로 회수됩니다. 기존에 생성된 크기 표준물질로부터의 투입 DNA(3.34 μg)를 그림과 같이 PEG와 NaCl의 상이한 조합으로 처리하고, 프로토콜에 상세히 기술된 바와 같이 추출하였다. 사용된 원심분리 속도는 15,000 x g였습니다. 투입(레인 3) 및 1.2M NaCl + 30% PEG(레인 7)의 경우 0.8μg의 DNA를 겔에 로드했습니다. 나머지의 경우, 총 수율이 낮았기 때문에 16μL에서 추출된 DNA의 총량을 로딩하고 1kb ladder를 크기 마커로 1% 아가로스 겔에 로드하고 전기영동을 실시했습니다(80V, 45분). DNA는 염료 SYBR SAFE를 사용하여 자외선(UV) 아래에서 시각화되었습니다. 흰색 상자는 150bp의 가장 낮은 밴드를 강조 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 저분자량 DNA의 회수율은 높은 염 농도가 아닌 높은 PEG에 의해 결정됩니다. (A) 크기 표준의 입력 DNA(14μg)는 그림에 표시된 대로 PEG와 NaCl의 다양한 조합으로 처리되었으며 프로토콜에 자세히 설명된 대로 에탄올 침전을 사용하여 추출되었습니다. 사용된 원심분리 속도는 그림과 같이 15,000 x g 및 20,000 x g 였습니다. 투입된 DNA와 추출된 DNA의 전량을 1kb 래더와 함께 1% 아가로스 겔에 로드하고 전기영동(90V, 30분)을 거쳤습니다. DNA는 염료 SYBR SAFE를 사용하여 자외선(UV) 아래에서 시각화되었습니다. (B) 이전에 생성된 크기 표준물질로부터의 입력 DNA(15.67 μg)를 그림과 같이 PEG와 NaCl의 상이한 조합으로 처리하고, 프로토콜에 상세히 기술된 바와 같이 추출하였다. 사용된 원심분리 속도는 15,000 x g이었습니다. 추출된 DNA(1.5μg)를 각 레인에 로드하고 1kb ladder를 1% 아가로스 겔에 크기 마커로 로드하고 전기영동(80V, 45분)을 실시했습니다. DNA는 염료 SYBR SAFE를 사용하여 자외선(UV) 아래에서 시각화되었습니다. 흰색 상자는 150bp의 가장 낮은 밴드를 강조 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: 게놈 DNA 및 플라스미드 DNA의 회수는 PEG 및 NaCl 농도 증가에 크게 영향을 받지 않습니다. 입력 DNA(9μg, 4.5μg 플라스미드 및 4.5μg 게놈 DNA)를 그림에 표시된 대로 PEG와 NaCl의 다양한 조합으로 처리하고 프로토콜에 자세히 설명된 대로 추출했습니다. 사용된 원심분리 속도는 15,000 x g이었습니다. 투입된 DNA 및 추출된 DNA의 전량을 1kb 래더와 함께 1% 아가로스 겔에 로드하고 전기영동(90V, 45분)을 실시했습니다. DNA는 염료 SYBR SAFE를 사용하여 자외선(UV) 아래에서 시각화되었습니다. 흰색 상자는 게놈 DNA와 플라스미드 DNA를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 8: PEG 및 NaCl을 사용한 침전전은 폐수에서 DNA를 고수율로 추출하는 데 매우 중요합니다. 열-비활성화(70°C, 4시간) 폐수(20mL)를 이전에 제조된 선형 표준물질 10mg으로 스파이크하고, PEG 및 NaCl 또는 그림에 나타난 바와 같이 PEG 및 NaCl 농도를 변화시키지 않고 4°C에서 밤새 배양하였다. 그런 다음 토양 키트를 사용하여 DNA를 추출하기 위해 처리되었습니다. 스파이킹(lane 1)에 사용된 투입 DNA(4μg)와 9% PEG + 0.3M NaCl(lane 3)의 전처리 단계로 추출된 DNA(4μg)를 1% 아가로스 겔에 로딩하였다. 나머지 조건의 경우, 수율이 낮았기 때문에 추출된 DNA의 전체 양을 겔에 로드했습니다. 1kb 래더도 크기 마커로 로드되었습니다. 겔을 전기영동(70V, 2h)에 실시하였다. DNA는 염료 SYBR SAFE를 사용하여 자외선(UV) 아래에서 시각화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-9
그림 9: 고분자량 및 저분자량 DNA를 모두 농축하기 위해 폐수에서 DNA를 추출하는 단계별 방법을 제안했습니다. 낮은 PEG 및 NaCl 농도를 사용하는 초기 전처리 단계와 함께 폐수에서 DNA를 추출하는 2단계 방법을 보여주는 흐름도. 첫 번째 단계의 상청액은 PEG 및 NaCl이 증가된 또 다른 전처리 침전을 거쳐 폐수에서 고분자량 및 저분자량 DNA를 모두 효과적으로 추출합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1. 환경 샘플에서 DNA 추출을 위한 연구에서 PEG 및 NaCl의 사전 사용. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2. 표준 생성을 위한 프라이머 염기서열 및 PCR 조건. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 3. 2023년 2개월 동안 폐수 샘플에서 얻은 DNA 수율 및 품질. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

항생제 내성은 WHO가 선정한 10대 건강 위협 중 하나이며, 항생제 내성에 대한 환경 감시는 전 세계적으로 중요한 도구로 인식되고 있습니다. 서론에서 언급했듯이 환경 AMR의 포괄적인 기록에는 저분자량, 단편화 및 세포외 DNA가 포함됩니다. 염(30% PEG 및 1.2M NaCl)과 결합된 고농도의 PEG를 사용하여 여기에 보고된 전처리 프로토콜은 고분자량 분획(주로 게놈 및 플라스미드 DNA)의 추출에 영향을 주지 않고 저분자량 DNA의 비율을 강화함으로써 이러한 결과를 달성합니다. 이는 더 낮은 PEG 및 직접 키트 프로토콜(사전 처리 없이)을 사용하는 이전의 농축 방법과 대조되며, 이는 많은 양을 처리해야 하기 때문에 번거롭습니다. 더 낮은 PEG 농도를 사용한 전처리는 저분자량 DNA를 회수하는 데 비효율적이었습니다(여기서 '낮은'은 600bp 미만의 DNA 밴드를 의미함). 전처리 중에 PEG를 사용하지 않으면 DNA 추출이 불량하여 PEG와 NaCl을 사용할 때 70%가 회수되는 반면 입력 DNA의 10%만 회수됩니다(그림 8). PEG 및 NaCl을 추가하는 것 외에도 또 다른 중요한 단계는 다운스트림 처리를 위한 순수한 DNA를 얻기 위해 키트에서 잔류 에탄올 사후 DNA 추출을 제거하는 것입니다. 용출 시 30-50mL의 부피에서 최소 ~300ng에서 5mg의 DNA를 얻는 데 필요한 물의 초기 부피를 결정하는 것이 중요합니다. 폐수27,41에서 DNA 추출을 위해 일반적으로 처리되는 1L 이상의 물과 대조적으로, 여기에서 제안된 전처리 단계를 사용하면 단지 27.5-40mL만으로도 다운스트림 처리를 위한 고품질 DNA를 얻기에 충분하다는 것이 밝혀졌습니다. 폐수에는 또한 흡착된 박테리아 세포와 세포외 DNA를 포함할 수 있는 미립자와 유기물이 포함되어 있습니다. 따라서 세포 용해를 동반한 세포와 DNA의 탈착은 DNA 수율을 높이기 위한 중요한 단계입니다. PEG 농도가 높으면 샘플의 점성이 높아지고 앞서 언급한 바와 같이 DNA 추출을 위한 용해 및 탈착 단계를 방해할 수 있습니다. 이를 피하기 위해 순서도에 요약된 대로 DNA 추출의 단계별 방법이 제안되었습니다(그림 9). 이 방법은 세포 내 고분자량 DNA(그림 7)와 세포 외 저분자량 단편화 및 원형 DNA를 모두 추출하는 데 도움이 될 것입니다.

비용 측면에서 이 프로토콜의 현재 한계 중 하나는 품질 향상을 위한 키트를 통해 농축된 저분자량 DNA를 지속적으로 처리한다는 것입니다. 이 제한은 페놀-클로로포름 추출과 같은 다른 DNA 세척 방법을 사용하여 잠재적으로 우회할 수 있습니다. 또 다른 실질적인 제한 사항은 용액의 높은 점도로 인해 펠릿이 손실될 수 있기 때문에 높은 PEG 농도를 처리하는 것입니다. 현재 PEG 및 NaCl을 사용한 전처리가 수행된 후 기존 키트 프로토콜의 수정된 버전, 즉 키트가 최종 DNA 정제에 계속 사용됩니다. DNA 수율은 높지만 순도가 낮은(여기에는 보고되지 않음) 키트 없이 DNA를 정제하는 것이 추출된 DNA의 품질을 개선하기 위해 최적화되고 있습니다. PEG 용액의 점성 특성으로 인해 다양한 DNA 크기를 생성하면서도 편안하게 처리할 수 있는 최적의 PEG 농도를 목표로 합니다. 농도를 20%로 낮추면(그림 6B) 낮은(9%) 및 높은(30%) PEG의 추출 효율에 대한 중간 결과를 얻을 수 있습니다. 이것은 향후 작업에서 후속 조치를 취할 가치가 있습니다.

PEG는 환경 샘플에서 DNA를 추출하는 여러 단계에서 일상적으로 사용됩니다. 그러나 AMR 감시의 맥락에서 DNA 추출을 위한 PEG의 사용은 표준화되지 않았습니다. 폐수 감시는 STP (유입 및 유출) 및 개방 및 폐쇄 배수구 8,27을 포함한 다양한 틈새에서 항생제 내성을 감지하는 것을 수반합니다. 유입 지역의 AMR에 대한 정보는 지역 사회에서 순환하는 내성에 대한 중요한 정보를 제공하지만, 유출 물질 내 AMR 유전자의 존재는 내성 발병의 출현을 측정하고 잠재적으로 예측하는 데 똑같이 중요합니다. 유출된 시료는 대부분의 세포가 처리 과정에서 사멸되어 세포 DNA 수율이 매우 낮기 때문에 일반적으로 미생물 부하가 낮습니다. 그러나 폐수에는 고분자량 게놈 DNA와 저분자량 플라스미드, 파지미드 및 단편화된 DNA를 모두 포함하는 세포외 자유 부유 DNA가 포함되어 있습니다. 저분자량 DNA(단편화 및 플라스미드/파지미드 모두)에 존재하는 AMR 유전자는 폐수 내의 나머지 살아있는 세포로 전달될 수 있으며, 이는 내성30,41,45의 확산으로 이어질 수 있다. 따라서 폐수에서 저분자량의 세포외 DNA를 검출하는 것이 중요합니다. AMR을 평가하는 동안 폐수에서 DNA를 추출하기 위해 사용되는 다른 방법은 일반적으로 저분자량 DNA의 초기 농축을 보장하지 않습니다. 폐수에서 DNA를 추출하는 이러한 접근 방식은 환경의 포괄적인 저항성에 대한 정보를 제공하는 데 사용할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

우리는 APSI India 팀(Alliance for Pathogen Surveillance Innovations https://data.ccmb.res.in/apsi/team/)의 일환으로 Rockefeller Foundation(Rockefeller Foundation Grant Number 2021 HTH 018)의 자금 지원을 인정합니다. 우리는 또한 이 연구를 지원하기 위해 Axis Bank가 제공한 재정 지원과 장비 및 기타 지원을 위해 Ashoka University의 Trivedi School of Biosciences를 인정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
24인승 마이크로 원심분리기Eppendorf Centrifuge 5425 REP5406000046
Absolute Ethanol (Emsure ACS, ISO, Reag. Ph Eur 분석용 에탄올 절대 사용)Supelco100983-0511
AgaroseInvitrogen16500500
Bench top refrigerated centrifugeEppendorf Centrifuge 5920 REP5948000131
ChemiDoc Imaging SystemBioRad12003153
DNeasy PowerSoil Pro KitQiagen47014
DNeasy PowerWater 프로 키트Qiagen14900-100-NF
dNTP (dNTP 믹스 10mM 각, 0.2 mL, R0191)Thermo FisherR0191
DreamTaq DNA 중합효소, 5 U/µ L + 10x DreamTaq Buffer*ThermofscientificEP0702
E-Gel 1 Kb Plus Express DNA LadderInvitrogen10488091
Maxiamp PCR 튜브 0.2 mLTarsons510051
분자 생물학 등급 PCR 용 물HiMediaML065-1.5ML
NanoDrop OneC 미량 UV-Vis 분광 광도계Thermo Scientific13400519
파라필름베미스S37440
PEG-8000SRL54866
QIAquick PCR & 겔 클린업 키트Qiagen28506
Qubit 4 형광측정기(WiFi 포함)ThermofisherQ33238
큐비트 어세이 튜브, ThermofisherQ32856
큐빗 시약 키트, ds DNA, 광범위Thermo ScientificQ32853(500 어세이)
염화나트륨HiMediaTC046M-500G
SYBR 안전 DNA 겔 염색InvitrogenS33102
T100 Thermal CyclerBioRad1861096
Thermo Cycler(ProFlex 3 x 32웰 PCR 시스템)Applied Biosystems4484073
Wizard 게놈 DNA 정제 키트PromegaA1125
,

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