방법 논문

기증자 심장 보존 전략을 테스트하기 위해 격리된 작업 쥐 심장 모델 사용

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DOI:

10.3791/66910

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2024년 10월 4일

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1Cardiac Physiology and Transplantation, Victor Chang Cardiac Research Institute, 2St Vincent's Healthcare Clinical Campus, University of New South Wales, 3Heart and Lung Transplant Unit, St Vincent's Hospital, 4Faculty of Medicine, University of New South Wales

이 논문에서

요약

기증자 심장 보존 전략을 테스트하기 위한 생체 외 격리 작업 쥐 심장 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 논문은 설치류 기증자 심장의 정적 냉장 보관에 사용하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 그러나 이 프로토콜은 순환사 및 뇌사 후 기증 후 얻은 기증자의 심장에도 사용할 수 있습니다.

초록

기증자 심장 보존 솔루션의 최적화는 장기 채취, 운송 및 이식 중 기증자 심장의 허혈 재관류 손상을 줄이는 데 중요한 역할을 했습니다. 우리 실험실의 이전 연구에 따르면 기증자 심장 보존 용액에 글리세릴 트리나이트레이트와 에리트로포이에틴을 추가하면 장기간 냉장 보관 후 및 순환성 사망 후 심장 기증 시 심장 기능 회복이 크게 향상될 수 있습니다. 이 보충제 프로토콜은 호주, 벨기에 및 영국 전역의 이식 병동에서 임상적으로 구현되었습니다. 여기에서는 IWRH(ex vivo isolated working rat heart) 관류 회로를 사용하여 보충제 전략을 테스트하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 방법론을 사용하여 보충 전략은 장기간 저온 정적 보관, 뇌사 후 기증 및 순환 사망 후 기증 기증자의 심장 보존의 맥락에서 테스트할 수 있습니다. 대동맥 흐름, 관상 동맥 흐름, 심박출량, 맥압 및 심박수로 측정한 심장 기능 회복은 특정 보존 전략이 기증자 심장의 허혈 재관류 손상을 최소화할 수 있는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

심장 이식의 성공 여부는 기증자의 심장에 사용되는 보존 방법에 따라 크게 영향을 받을 수 있습니다. 기증자의 심장은 장기 채취, 이송 및 이식 과정 전반에 걸쳐 허혈성 모욕을 당합니다. 기증자 장기에 대한 허혈성 손상의 정도는 적절한 기증자 심장 보존 전략을 선택함으로써 완화할 수 있습니다. 저온 정적 보관(CSS)은 기증자의 심장 보존을 위한 가장 실현 가능하고 일반적인 방법으로 남아 있습니다. 그러나 CSS가 모든 심장 기증 경로에 반드시 최선의 선택은 아닐 수 있습니다. 예를 들어, 순환사 후 기증(DCD) 경로를 통해 조달한 심장은 정상 보온 기계 관류를 사용하여 유지 및 생존 가능성을 평가하는 반면, 뇌사 후 기증(DBD) 경로를 통해 조달한 심장은 CSS 또는 저체온 기계 관류를 사용하여 보존할 수 있습니다. 사용된 보존 전략의 또 다른 중요한 결정 요인은 장기 조달 및 운송 중에 심장이 받는 온열 허혈(DCD의 경우) 또는 한랭 허혈(DBD의 경우)의 양입니다.

많은 센터에서는 허혈성 내성을 높이고 이식 후 심장 기능을 개선하기 위해 심장 보존 용액의 추가적인 약리학적 보충제를 사용합니다. 우리 실험실의 설치류 연구에 따르면 에리트로포이에틴과 글리세릴 트리니트레이트로 마비를 보충하면 기증자 심장을 장기간 냉장 보관한 후 심장 기능 회복을 크게 개선할 수 있었습니다 1,2. 그런 다음 이러한 연구는 기증자의 심장 보존에 대한 돼지 연구로 진행되었으며 정상 발열 기계 관류 3,4,5를 사용하는 DCD 경로를 통해 조달된 심장의 심정지 용액에 에리트로포이에틴과 글리세릴 트리니트레이트를 통합하도록 이끈 전임상 기초를 제공했습니다. 현재 에리스로포이에틴(erythropoietin)과 글리세릴 트리니트레이트(glyceryl trinitrate)를 보충하는 것은 CSS를 통합한 임상 DBD 심장 채취를 위한 호주 이식 병동에서도 사용됩니다. 아래에 설명된 IWRH(Isolated Working Rat Heart) 관류 프로토콜의 전반적인 목표는 실험실 환경에서 기증자 심장 보존 전략을 테스트하고 재관류 후 기증자 심장 기능을 보존하기 위한 효능을 테스트하는 것입니다. 설명된 격리된 작업 쥐 심장 프로토콜은 우리 실험실에서 20년 이상 사용되어 왔으며 기증자의 심장 보존을 개선할 수 있는 잠재적인 보충제 및/또는 전략을 스크리닝하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다 2,7,8,9.

프로토콜

모든 동물은 호주 국립보건의료연구위원회(National Health and Medical Research Council, Australia) 지침에 따라 인도적인 치료를 받았습니다. 모든 동물 시술은 Garvan Institute of Medical Research(호주 시드니)의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

1. Krebs-Henseleit(KH) 완충액의 제조

  1. 2.36 M NaCl, 0.094 M KCl, 0.024 M MgSO4, 0.024 M KH2PO4 를 포함하는 KH 완충액의 20x 스톡 용액 2 L를 준비합니다. 50mL 튜브에 분취하여 -20°C에서 보관합니다.
  2. 실험에 앞서 1900mL의 탈이온수, 100mL의 20x 스톡 KH 완충액, 4.20g의 NaHCO3 (25mM) 및 3.96g의 포도당(11mM)을 포함하는 1x KH 완충액의 2L Erlenmyer 플라스크 2개를 준비합니다.
    1. 버퍼 플라스크를 37°C 수조에 넣고 에어 스톤(슬립온 입구 필터)을 통해 카보겐(95% 산소, 5% 이산화탄소, 2L/min으로 설정된 유속)으로 용액을 5분 동안 가스화한 다음 2.8mL의 1M CaCl2 (1.4mM)를 추가합니다. 실험을 시작하기 최소 1시간 전에 용액을 계속 버블링합니다. 에어 스톤을 사용하면 완충액의 균일한 통기에 도움이 됩니다.
    2. -20°C의 둥근 금속 접시에 소량(~50mL)의 완충액을 넣어 냉각하고 얼음 완충액 층을 형성합니다.

2. 관류 회로의 준비

  1. 모든 튜브와 유리 제품이 눈에 띄는 성장/오염 없이 깨끗한지 확인하십시오.
  2. 1cm H2O가 1.36mmHg에 해당하므로 필요한 관류 압력에 해당하는 유리 챔버의 높이를 설정합니다: Langendorff-to-heart 100cm(약 75mmHg), 예압 작업 좌-심 15cm(약 11mmHg), 심압-후부하 챔버 100cm(약 75mmHg).
  3. 심장 관류 최소 10분 전에 회로 주변에 뜨거운 물 순환을 시작하십시오.
  4. 극세사 필터(1.2μm)를 필터 홀더에 넣고 단단히 고정합니다.
  5. KH 버퍼로 회로를 프라이밍하여 모든 공기가 제거되도록 하고 유량 제어 튜브 클램프를 사용하여 Langendorff 측(그림 1A, B)의 유량을 ~50mL/분으로 조정합니다. 흐름이 느리면 대동맥 캐뉼레이션이 쉬워지고 묶기 전에 심장이 빠지는 것을 방지할 수 있습니다. T자형 튜브 커넥터를 통해 회로 내에 온도계를 배치하여 ~37°C에서 버퍼의 온도를 모니터링합니다.

3. Lab Chart(데이터 분석) 소프트웨어 설정

  1. 데이터 분석 소프트웨어를 열기 전에 Powerlab(데이터 수집 시스템)과 유량계가 켜져 있고 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인하십시오.
  2. 새 파일을 엽니다.
  3. 설정 드롭다운 메뉴를 선택하고 채널 설정을 선택하여 데이터 수집을 설정합니다. 대동맥 압력(Aortic Pressure), 대동맥 흐름(Aortic Flow) 및 심박수(Heart Rate)를 선택합니다(그림 2A).
  4. 그림 2B에 표시된 설정으로 각 채널을 설정합니다.

4. 쥐 심장 격리를 위한 동물 준비

참고: 콜드 스태틱 보관을 위한 non-DBD 및 non-DCD 심장에 대한 쥐 심장 격리 및 관류 방법론은 아래에 설명되어 있습니다. 관류 회로에 심장 기구를 삽입하는 방법은 어떤 기증 방법을 사용하는지에 관계없이 비교적 유사합니다. DBD와 DCD 쥐의 심장 기증에 대한 프로토콜의 차이는 주로 동물 마취가 효력을 발휘한 시점부터 동물에서 심장을 절제할 때까지 발생합니다.

  1. 동물의 무게를 측정하여 무게가 >330g인지 확인하십시오. 수컷 쥐의 이상적인 체중 범위는 330-420g입니다.
  2. 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 복강내 주사를 투여합니다. 페달 반사(발가락 꼬집 반사)와 눈 깜박임 반사가 없는 경우 적절한 수술 마취면을 보장합니다.
  3. 동물을 누운 자세로 놓고 팔다리를 테이프로 고정합니다. 노즈 콘을 통해 동물에게 산소를 투여합니다.
  4. 해부 스테이션에서 KH 완충 얼음 슬러시 금속 용기와 얼음이 담긴 작은 금속 용기를 준비하십시오. 7.5cm x 7.5cm 거즈를 KH 버퍼에 담그고 얼음과 함께 용기에 놓습니다.
  5. 적절한 수술 마취가 확인되면 수술 절개 부위의 피부를 면도하고 베타딘 또는 70% 알코올과 같은 무균제로 피부를 청소합니다. 복부를 가로질러 측면을 절개하고(개복술) 위와 장을 옆으로 움직여 왼쪽 신장 정맥에 접근할 수 있도록 합니다. 1500IU의 헤파린을 주입하고 출혈이 멈출 때까지 주사 부위에 압력을 가합니다. 심장 채취를 계속하기 전에 헤파린이 순환할 때까지 1-2분 동안 기다립니다.
  6. 양쪽의 흉곽을 절단하고 횡격막을 가로질러 절단하여 흉강을 엽니다. 하행 대동맥을 따라 절단하면서 심장-폐 블록을 조심스럽게 잡고 들어 올려 대동맥궁이 손상되지 않도록 합니다. 이렇게 하면 캐뉼레이션을 위해 충분한 대동맥 길이가 유지될 수 있습니다.
  7. 쥐는 마취 상태에서 심장과 폐를 제거하여 안락사됩니다. 심장이 멈출 수 있도록 KH 완충 얼음 슬러시에 심장-폐 블록을 담그십시오.

5. 고립된 작동 심장 관류 회로에 심장을 캐뉼러로 만들기

  1. 심장-폐 블록을 얼음 위의 거즈에 옮깁니다. 대동맥 주변의 과도한 지방을 절개하고 대동맥을 다듬어 캐뉼레이션을 위해 3-5mm 길이로 남기고 폐동맥을 1~2mm 작게 절개합니다. 이렇게 하면 관상 동맥 유출물에 대한 경로를 허용할 수 있습니다.
  2. 잘린 심장-폐 블록(얼음 위에 있는 동안)을 캐뉼라 바로 아래에 놓습니다. 대동맥 캐뉼레이션을 용이하게 하기 위해 유량 제어 튜브 클램프를 사용하여 Langendorff 쪽에서 흐름을 조정합니다. 대동맥을 왼쪽 캐뉼라에 조심스럽게 캐뉼러하고 검은색 클램프로 잡고 2-0 실크 봉합사로 묶습니다.
  3. 유량 제어 튜브 cl을 완전히 열어 Langendorff 관류의 유량을 증가시킵니다.amp. 애프터로드 클램프를 엽니다. Langendorff 챔버에서 연속적인 흐름이 있는지 확인하십시오. 소프트웨어로 심장 활동 모니터링을 시작하세요.
    알림: 유량계 디스플레이의 대동맥 유량 값이 <10mL/min인 경우 폐동맥 절개술의 크기가 충분한지 확인하십시오. 낮은 대동맥 흐름 추적/값은 대동맥 캐뉼라가 너무 많이 삽입되었음을 나타낼 수도 있습니다.
  4. 폐의 전방 표면이 작업자를 향하도록 심장-폐 블록을 조정합니다. 왼쪽 폐엽을 2-0 실크 봉합사로 묶고 여분의 왼쪽 폐 조직을 잘라냅니다. 나머지 폐엽을 2-0 실크 봉합사로 한 번에 묶고 조직을 자릅니다. 묶인 폐가 뒤쪽을 향하도록 심장을 회전시킵니다.
  5. 작은 Vannas 가위를 사용하여 왼쪽 심방 부속기의 2-3mm 가장자리를 잘라 심방에 작은 구멍이 생기도록 합니다. 왼쪽 심방 부속기를 왼쪽 캐뉼라에 조심스럽게 캐뉼러하고 검은색 클램프로 잡고 2-0 실크 봉합사로 묶습니다. 그림 3A 는 두 캐뉼라의 배치를 보여줍니다.
  6. 심장이 챔버 중앙 내에 오도록 심박실 워터 재킷을 조정합니다.
  7. 압력 트랜스듀서를 열어 공기를 공급하고 대 동맥 압력 드롭다운 메뉴 > Bridge Amp > Zero를 선택하여 소프트웨어에서 압력 트랜스듀서를 영점 조정합니다. 확인을 클릭합니다.
  8. Langendorff 모드에서 10분 동안 심장을 관류합니다. Langendoff 대동맥 흐름이 10-20mL/분(이상적으로는 20mL/분)으로 측정되는지 확인합니다.
  9. 작업 모드를 전환하기 전에 Langendorff KH 버퍼 저장소의 에어 스톤(슬립온 입구 필터)이 작동 중인 KH 버퍼 저장소에 배치되었는지 확인하십시오.
  10. 대동맥 캐뉼라로 이어지는 큰 클램프를 닫고 좌심방 부속기로 이어지는 흐름을 열어 심장을 작동 모드로 전환합니다. 작업 관류액에서 이어지는 3방향 탭을 엽니다. 공통 리턴 튜브(KH 버퍼를 저장소로 다시 가져감)를 Langendorff 저장소에서 작업 저장소로 옮깁니다.
  11. 15분 동안 작동 모드에서 심장을 관류합니다. 대동맥 흐름량 값은 15분 관류가 끝날 때 >30mL/분이 이상적이어야 합니다. 심장이 안정되면 데이터 분석 소프트웨어에서 데이터 기록을 시작합니다.
  12. 관상동맥 유출물(관상동맥 흐름)을 1분, 5분, 10분, 15분으로 측정합니다.
    참고: 관상동맥 유속 값은 10-20mL/분 사이여야 합니다. 22mL/min 이상의 관상동맥 혈류는 일반적으로 묶이지 않은 폐혈관에서 누출이 발생했음을 나타냅니다. 심박수는 200-300bpm 사이여야 합니다. 관상동맥 폐수는 조직 손상 마커(예: 트로포닌-I, 젖산 탈수소효소 방출)의 다운스트림 분석을 위해 수집할 수 있습니다.

6. 심장의 차가운 정적 저장을 위한 심정지 관리

  1. 심정지 챔버(약 40mmHg의 관류 압력을 얻기 위해 60cm 높이에 위치)를 지정된 심장 보존 용액 50mL(보충제 포함 또는 제외)로 채웁니다.
  2. 워터 재킷을 내리고 작업 모드 쪽의 3방향 탭을 닫습니다.
  3. 클램프를 닫아 왼쪽 심방 캐뉼라를 향한 흐름을 멈춥니다.
  4. 대동맥 캐뉼라로 가는 흐름을 엽니다.
  5. 클램프를 Langendoff 쪽과 애프터 로드에서 닫습니다.
  6. 심정지 라인에서 클램프를 열고 압력 라인에서 15mL의 심정지를 씻어냅니다. 압력 라인에서 탭을 닫습니다.
  7. 대동맥 캐뉼라를 통해 심장이 심정지로 씻겨지도록 하고 관상 동맥 유출물을 수집합니다. 3분 동안 심정지를 실행하고 투여된 심정지의 양을 기록합니다.
  8. 소프트웨어에서 데이터 기록을 중지하고 파일을 저장하십시오.
  9. 3분 후 심정지 클램프와 대동맥 캐뉼라로 이어지는 작은 파란색 클램프를 닫습니다.
  10. 대동맥 캐뉼라에 불독 클램프를 놓고 왼쪽 캐뉼라에 두 번째 불독 클램프를 놓습니다. 회로에서 심장 캐뉼라 블록을 분리하고 아이스 박스에 담긴 심정지가 들어 있는 비커에 넣습니다(그림 3B, C).
  11. 심장을 냉장고에 6시간(또는 원하는 냉장 보관 시간) 동안 보관하십시오.

7. 찬 정체되는 저장 후에 심혼 재관류

  1. 섹션 1에 따라 KH 버퍼를 준비합니다.
  2. 섹션 2에 따라 관류 회로를 프라임합니다.
  3. 베이스라인 관류에서 저장된 파일을 엽니다.
  4. 아이스 박스에서 심장 캐뉼라 블록을 조심스럽게 제거하고 관류 회로에 고정합니다. 대동맥 캐뉼라를 다시 연결하기 전에 KH 완충액으로 채워진 뭉툭한 끝 18G 주사기를 사용하여 캐뉼라에서 공기를 제거합니다. 대동맥 캐뉼라를 먼저 연결하고 Langendorff 쪽의 튜빙 클램프를 열고 후하중 튜빙 클램프가 열려 있는지 확인합니다.
  5. 왼쪽 심방 캐뉼라를 다시 연결하고 관류 회로에 연결하기 전에 캐뉼라에서 공기가 제거되었는지 확인합니다. 작업측 cl을 유지하십시오.amp Langendorff에서 작업 모드로 전환할 때까지 닫혀 있습니다.
  6. Langendorff 모드에서 15분 동안 심장을 관류합니다. Langendorff 재관류가 시작될 때 데이터 기록을 시작해야 합니다.
  7. 작업 모드로 전환하기 전에 두 버블링 스톤을 KH 버퍼에 넣고 작업 측의 3방향 탭을 연 다음 공통 리턴 튜브를 작업 저장소로 옮깁니다.
  8. 흰색 Langendorff 클램프를 닫고 흰색 작업면 클램프를 열고 30분 동안 심장을 관류합니다. 다운스트림 분석을 위해 지정된 시점에서 관상동맥 유출물을 측정하고 수집합니다(예: 심장 손상 마커). 소프트웨어 녹화를 중지-다시 시작하여 새 세그먼트를 시작해야 합니다(또는 주석 추가).
  9. 약 15분 작업 모드 재관류에서 3방향 탭을 닫습니다.
  10. 재관류가 끝나면 데이터 저장 file, 회로를 통한 흐름을 중지하고 심장 블록을 분리합니다. 조직학적 처리를 위해 좌심실 샘플을 수집하거나 향후 연구를 위해 스냅 냉동합니다(예: 웨스턴 블롯 연구를 위한 단백질 추출).
  11. 필터 홀더에서 필터를 제거하고 회로에서 버퍼를 배출한 다음 증류수 5L로 두 번 씻어냅니다.
    알림: 필수는 아니지만 수조 내의 큰 용기에 담긴 증류수를 미리 데우는 데 도움이 됩니다.

8. 기능 회복 분석

  1. LabChart 파일을 엽니다.
  2. 최소 30초 동안 녹화할 수 있는 영역을 강조 표시한 다음 Command > Add data selection(데이터 선택 추가) 또는 Multiple add to data(여러 데이터에 추가)를 클릭합니다. 이렇게 하면 원하는 매개변수가 소프트웨어 내의 DataPad 파일에 추가됩니다.
  3. DataPad> 창 드롭다운 메뉴를 선택합니다.
  4. 기능 복구 분석을 위해 DataPad의 복구 값을 강조 표시하고 스프레드시트로 복사합니다. 기능 복구를 해당 기준 값 1,6,7의 백분율로 계산합니다.

결과

기준선 관류의 결과에 따라 초기 실험(사전 보관)이 성공적이었는지 여부가 결정됩니다. Langendorff 모드에서 표시되는 대동맥 흐름은 14 - 22 mL/min 사이여야 합니다. Langendorff 유량은 대동맥의 역행 관류로 인해 유량계에 음수 값으로 표시됩니다. 허용 가능한 Langendorff 추적의 예가 그림 4A에 나와 있습니다.

작동 모드로 전환되면 심장이 안정되면 대동맥 흐름은 최소 30mL/분이 되어야 합니다. 유량이 처음에 약 50mL/분으로 급증한 다음 약 25mL/분으로 감소한 후 안정적인 기준선 대동맥 흐름으로 다시 증가하는 것은 정상입니다. 기준선 매개변수가 만족스러우면(AF > 30mL/분, CF 10-20mL/분, HR 200-300bpm) 심장을 보관할 수 있습니다. 양호한 기준선 추적의 예가 그림 4B에 나와 있습니다.

테스트한 보존 용액에 따라 일부 심장은 우수한 기준선을 가지고 있음에도 불구하고 장기간 냉장 정적 보관 후 좋은 회복을 얻지 못할 수 있습니다. 작업 모드에서 복구 불량을 나타내는 추적의 예가 그림 4C에 나와 있습니다.

대동맥 흐름에 대한 최종 기능 회복은 기준선 값의 백분율로 표시된 최종 대동맥 흐름 판독값을 기반으로 계산할 수 있습니다. 예를 들어, 심장 기준 AF가 40mL/분이고 냉간 정적 보관 후 재관류 종료 시점의 AF가 20mL/분인 경우 이 심장의 AF 회수율은 50%입니다. 이 데이터 표현의 예는 그림 5에 나와 있습니다.

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그림 1: 작동하는 심장 관류 회로. (A) 격리된 작동 쥐 심장 관류 회로의 사진. 빨간색 상자는 고립된 심장의 위치를 나타냅니다. (B) Langendorff(점선) 및 작업 모드(실선) 관류에 대한 회로를 통한 KH 버퍼의 흐름 방향을 나타내는 격리된 작동 심장 관류 회로의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: LabChart 소프트웨어 설정. (A) 대동맥 압력, 대동맥 흐름 및 심박수에 대한 채널 설정 설정. (B) 3개의 채널로 설정된 LabChart 템플릿의 예. 오른쪽 창에는 설정된 각 개별 채널이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 캐뉼레이션 및 심정지 상태. (A) 워터 재킷 챔버에 배치하기 전에 심장 캐뉼레이션. 좌측 캐뉼러는 대동맥에 삽입되고 우측 캐뉼러는 좌심방 부속기를 통해 좌심실에 삽입됩니다. 폐 혈관을 묶고 폐 조직을 절개했습니다. (B) 심정지 요법이 투여된 후, 심장을 심정지 용액이 들어 있는 비커에 넣습니다. 캐뉼러는 리그에서 분리하기 전에 불독 클립으로 고정되어 있습니다. (C) 장기간 냉장 보관을 위해 아이스박스 안에 넣은 하트의 예. 여기에는 재관류를 위해 두 개의 심장이 저장되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: LabChart 추적의 예. (A) 양호한 Langendorff 추적, (B) 작업 모드 재관류 중 양호한 회복, (C) 작업 모드 재관류 중 불량한 회복이 있는 심장의 압력(빨간색 그래프), 대동맥 흐름(파란색 그래프) 및 심박수(녹색 그래프) 추적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 기능 회복을 위한 대표적인 그래프. (A) 대동맥 흐름, (B) 관상 동맥 흐름, (C) 심박출량 및 (D) 심박수. 이 그림은 Gao et al.8의 허가를 받아 재사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

심장 기준선 기능의 민감한 특성을 감안할 때 관류 장비를 깨끗하고 호환되는 구성 요소로 유지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 예를 들어, 올바른 PVC 튜브를 사용해야 합니다. 실리콘과 같은 일부 튜브 재료는 대동맥 흐름과 수축력을 낮추는 데 기여할 수 있으며, 이는 튜브를 통한 산소 손실로 인한 것일 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 고립된 작동 쥐 심장 관류 회로가 있지만, 이들 중 대부분은 주로 Langendorff 관류에만 사용됩니다. 일반적으로 기능 측정은 좌심실에 풍선 카테터를 삽입하여 좌심실 이완기 혈압(LVDP) 측정을 얻음으로써 Langendoff 관류 모델에서 얻을 수 있습니다. 그러나 Langendoff 관류 시스템에서 원시 대동맥 흐름 측정 및 심박출량을 측정하는 기능은 불가능합니다. IWRH 프로토콜의 주요 장점은 심장의 추가 개입(예: 풍선 카테터) 없이 대동맥 흐름 및 심박출량 기능 측정을 얻을 수 있다는 것입니다. 작동하는 쥐 심장 관류 시스템에 대한 상업적 옵션이 있으며 개별 연구 요구 사항에 맞게 사용자 정의할 수 있지만 이러한 시스템은 비용이 많이 들 수 있습니다.

관류 중 설치류 심장의 최적 기준 기능을 보장하기 위한 프로토콜에는 중요한 단계가 있습니다. KHB 완충 원료 용액의 준비는 4주를 넘지 않아야 합니다. 관류 회로는 프라이밍할 때 기포가 없어야 합니다. 좌심방 부속기를 캐뉼러로 만들 때 주의를 기울여야 합니다. 조직을 과도하게 다루면 찢어질 위험이 높아지고 심장의 기능적 과민성을 가중시킬 수도 있습니다.

IWRH 관류 회로 성능 품질은 일반적으로 심장에서 얻은 기준선 판독값(AF > 30mL/분, CF ~20mL/분)에 의해 결정될 수 있습니다. CSS 모델의 추가 품질 관리 테스트는 1μmol/L 조니포라이드와 0.1mg/mL 글리세릴 트리나이트레이트가 보충된 Celsior 보존 용액에 심장을 정지시키고 보관하여 수행할 수 있습니다. 글리세릴 트리니트레이트와 조니포라이드가 보충된 Celsior로 정지된 심장은 즉각적인 Langendorff 재관류 회복과 6시간 냉장 보관 후 40-60% 사이의 최종 기능 회복을 보장합니다. 장비가 잘 작동하고 있는지 여부가 의심되는 경우 이 품질 관리 보충 자료를 테스트하는 것이 유용합니다.

순환기 사망 후 기증을 통해 조달된 설치류 심장을 사용하는 방법은 이전에 설명되었습니다10,11. 간단히 말해서, 쥐를 마취하고, 경동맥을 캐뉼러하고, 압력 판독 값을 얻습니다. 헤파린(500IU)은 경동맥 캐뉼라를 통해 주입됩니다. 생명 유지 장치의 철수를 시작하기 위해 기관을 결찰합니다. 필요한 따뜻한 허혈 시간에 도달하면 심장을 절제하고 관류 회로에 캐뉼레이션할 수 있습니다. DCD 심장에 보존 용액을 투여하기 위해 60mL의 보존 용액이 회로의 압력 라인을 통해 대동맥(~20mL/분)을 통해 플러시됩니다. 폐혈관을 묶고, 폐를 절개하고, 왼쪽 캐뉼라를 삽입한 다음, 40mL의 보존 용액을 압력 라인을 통해 세척합니다. 그런 다음 심장은 위의 프로토콜에 따라 관류됩니다. 기능적 회복은 기능적 혈류역학의 원시 값으로 간주되며, 통계적 분석은 가짜 작동된 심장과 값을 비교하여 수행됩니다(그러나 DCD는 없지만 리그에서 플러시됨).

뇌사 후 확보한 설치류의 심장을 사용하는 방법은 이전에 설명한 바 있다12. 간단히 말해서, 동물은 마취, 삽관 및 환기를 거치며 DCD 설치류 프로토콜에 따라 혈류역학적 모니터링을 실시합니다. 측두두엽 두개골에 버 홀을 삽입하고 3F 색전절제술 카테터를 경막하로 배치합니다. 가짜 컨트롤에는 버 구멍이 있지만 카테터 삽입은 없습니다. 풍선을 2분 동안 0.3mL의 물로 팽창시키고 1시간 동안 팽창 상태를 유지합니다. 1시간의 혈류역학적 관찰 후, 심장을 이식하여 격리된 작동 심장 관류 회로에 배치하고, 기준선 측정을 기록하고, 심정지를 투여하고, 위에서 설명한 대로 심장을 냉장 보관합니다.

IWRH 관류 회로 사용의 주요 제한 사항은 혈액 기반 관류 완충액을 사용하여 시스템을 순환할 수 없다는 것입니다. 관류액에 첨가할 충분한 설치류의 피를 구하는 것은 불가능할 것이다. 따라서 혈액 기반 관류는 실현 가능하지 않습니다. 설치류 이종성 심장 이식 또는 대형 동물 기교성 심장 이식 연구와 같은 대체 모델은 혈액 기반 관류의 영향을 테스트하기 위해 수행해야 할 것입니다. 그러나 이러한 대체 방법은 미세 수술 기술 및/또는 대형 동물 수술 시설에 대한 전문 지식과 숙련된 마취 전문의, 관류 전문의 및 흉부외과 의사가 필요합니다.

공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

여기에 설명된 연구는 호주 국립보건의료연구위원회(National Health and Medical Research Council Australia), 세인트 빈센트 클리닉 재단(St Vincent's Clinic Foundation) 및 NSW Health Cardiovascular Research Capacity Senior Investigator Grant에서 P.S Macdonald에게 수여한 보조금으로 자금을 지원받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 무색 Eppendorff 튜브, 상자당 1000Bio Strategy Pty Ltd0030.125.150
15 mL 센트/튜브 (S) 슬리브/25 PP ctn/500Sigma-aldrich Pty LtdCLS430791-500ea
BP 변환기/케이블 키트ADInstrumentsMLT1199데이터 수집
브리지 앰프ADInstrumentsFE221데이터 수집
Carbogen 555G2BOCBOC002
Checktemp1 온도계Hanna InstrumentsHI98509Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12Thomas Scientific2848Y40Rig Construction
Clamp w/Extension Stem Med.토마스 사이언티픽8847T08리그 건설
클램프 W/확장 스템 Sm.Thomas Scientific8847T02리그 구성
클립, 용기, 60g PressureCoherent Scientific14121수술 장비
폐쇄 커넥터Thomas Scientific8847E25리그 건설
Covidien Sofsilk 2-0 블랙 프리컷 45cm 24전문 의료 용품상자 S195수술 소모품
맞춤형 250mL 재킷 탈기 장치맞춤형 블로운 글라스웨어 Pty LtdN/A리그 구조
맞춤형 750 mL 리저버커스텀 블로운 글라스웨어 Pty LtdN/A리그 건설
D-(+)-글루코스 무수 SigmaUltra Sigma-aldrichPty LtdG7528-1KgKrebs 버퍼
듀얼 채널 콘솔AD를산업용 TS402데이터 수집
Erlenmyer 플라스크 2 L 
필터 극세사 유형 GF/C 유리 섬유 47mm, 100Bio-strategy Pty Ltd1822047
집게, 15cm, 0.3mm, CRVDCoherent Scientific14114수술 장비
2-70mm 직경 물체를 고정하기 위한 9mm x 115mm 길이의 암이 있는 4구 클램프. 비닐 코팅Met-App Australia Pty Ltd1352리그 건설
히터 순환기. 디지털 솔리드 스테이트 제어. (1020와트/240볼트)Thermoline ScientificTU3Rig 구조
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd1258693Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mLCenvet Australia Pty LtdX5010마취제
Johns Hopkins Bulldog ClampCoherent Scientific CS-WPI-14117
케타민 100 mg/50 mLProvet (NSW) Pty LtdKETAI1마취
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트 AR 500 g ChemsupplyBio Strategy Pty LtdMA048-500gKrebs 버퍼
Male/Female 힌지 어댑터만들기 Thomas Scientific8847V08리그 구조
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS RotorJohn Morris1015164Rig Construction
Metzenbaum 가위, 11.5cm 곡선Coherent ScientificWPI-501748수술 장비
Metzenbaum 가위, 14.5cm 직선Coherent ScientificWPI-501252수술 장비
장착 하드웨어 F/2-HEADS SSJohn Morris1014414펌프 헤드용 장착 나사
개방형 커넥터토마스 사이언티픽8847E05리그 건설
파라포마데히드시그마-알드리치P6148-500G샘플 처리
염화칼륨 (AnalaR NORMAPUR) 500 gVWR 화학물질 26764.26크렙스 버퍼
인산칼륨 모노베이직을 만들기 위해 Sigma-Aldrich Pty LtdP5379-500gKrebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 채널 레코더 + Labchart 소프트웨어AD를ML826컴퓨터 하드웨어 및 소프트웨어
Precision XN 인라인 플로우 센서, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XFADInstrumentsME4PXNRig Construction
일회용 핸들 포함 메스 #11 pkt/10BSN Medical (Aust) Pty Ltd73252-36
Swinnex 47 mm 5/PKMerck MilliporeSX0004701Rig 구조
실리콘 O-Ring 5-329 10/PKMerck MilliporeXX1104707Rig 구조
단일 부렛 클램프Thomas Scientific8847T32Rig 구조
슬립온 입구 필터 기공 크기 10 &마이크로; m (bubbler)Sigma-aldrich59277Rig Construction
Sm. 360 Rotation ConnectorThomas Scientific8847E35Rig Construction
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich Pty LtdS6297 - 250gTo make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mmMerck Millipore SX0004700Rig Construction
주사기 1 mL box/100Becton Dickinson Pty Ltd302100
9mm 직경 x 125mm 길이의 암과 5-80mm 고정용 트윈 나사가 있는 세 갈래 클램프Met-App Australia Pty Ltd1356Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410ADInstrumentsTS410Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear, DEHP phthalate free, food grade meets REACThermo FisherNAL 8701-0600리그 건설
튜빙 PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft 롤 15.24m, 투명, DEHP 프탈레이트 프리, 식품 등급 REACThermo FisherNAL 8701-0900장비 건설
튜빙 PVC 9.52mm ID x 12.7mm OD 100ft 롤Thermo FisherNAL 8701-4120장비 건설
Vannas 가위, 8.5cm, 스트레이트, 7mm 블레이드Coherent ScientificWPI-500-086수술 장비
수조 30리터(서스펜션 트레이 포함)Thermoline ScientificTLWB-30Rig Construction
개 개 만들기 위해 만들기 위해

참고문헌

  1. Kwan, J. C., Gao, L., Macdonald, P. S., Hicks, M. Cardio-protective signalling by glyceryl trinitrate and cariporide in a model of donor heart preservation. Heart Lung Circ. 24 (3), 306-318 (2015).
  2. Watson, A. J., et al. Enhanced preservation of the rat heart after prolonged hypothermic ischemia with erythropoietin-supplemented Celsior solution. J Heart Lung Transplant. 32 (6), 633-640 (2013).
  3. Chew, H. C., et al. Outcomes of donation after circulatory death heart transplantation in Australia. J Am Coll Cardiol. 73 (12), 1447-1459 (2019).
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