방법 논문

유세포분석(Flow Cytometry)에 의한 Pyroptosis의 검사

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DOI:

10.3791/66912

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2024년 5월 31일

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1National Key Laboratory of Veterinary Public Health Security, 2Animal Epidemiology of the Ministry of Agriculture, 3College of Veterinary Medicine, China Agricultural University

이 논문에서

요약

이 논문에서는 닭 GSDME(chGSDME-NT) 및 요오드화 프로피듐(PI)의 N 말단 단편에 대한 항체로 이중 염색 후 유세포 분석을 사용하여 발열 세포를 식별하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

Pyroptosis는 주로 GSDM(cleaved Gasdermin) 계열 단백질에서 생성된 N-말단에 의한 원형질막 공극의 형성에 의해 유발되는 염증성 유형의 프로그램된 세포 사멸입니다. 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의한 멤브레인 부착 GSDM-NT 검사는 발톱증을 평가하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나 이 방법을 사용하여 pyroptosis가 있는 세포를 다른 형태의 세포 사멸과 구별하는 것은 어렵습니다. 이 연구에서는 감염성 점액낭 질환 바이러스(IBDV)에 감염된 DF-1 세포를 모델로 사용하여 닭 GSDME(chGSDME-NT)의 N-말단 단편에 대한 특이 항체 및 요오드화 프로피듐(PI) 염색에 대한 특이 항체를 활용하여 유세포 분석을 통해 pyroptosis를 겪는 세포의 비율을 정량화했습니다. chGSDME-NT 양성 세포는 Alexa Fluor 647 표지된 항-chGSDME-NT 항체를 사용하여 유세포 분석으로 쉽게 검출할 수 있었습니다. 또한, IBDV에 감염된 세포에서 chGSDME-NT/PI 이중 양성 세포의 비율(약 33%)은 모의 감염 대조군(P < 0.001)보다 유의하게 높았습니다. 이러한 결과는 유세포 분석에 의한 막 결합 chGSDME-NT의 검사가 세포 사멸을 겪고 있는 세포 중에서 발열 세포를 결정하는 효과적인 접근법임을 나타냅니다.

서론

Pyroptosis는 주로 포유류 1,2,3에서 Gasdermin (GSDM) D에 의한 원형질막 기공의 형성에 의존하는 프로그램된 세포 사멸의 염증성 유형입니다. 닭 4,5에서 GSDMD의 유전적 결핍으로 인해 닭에서 pyroptosis의 메커니즘은 파악하기 어려운 상태로 남아 있습니다. Gasdermin 계열은 GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME 및 DFNB59 3,6을 포함한 보존 단백질로 구성됩니다. 연구에 따르면 teleost 물고기와 오리의 GSDME는 caspase-1/3/7 또는 caspase-3/7에 의해 절단되어 발열 세포 사멸을 유도합니다 7,8. 그러나 닭의 병원성 감염에 대한 숙주 반응에서 GSDME 매개 pyroptosis의 역할은 아직 밝혀지지 않았습니다.

전염성 점액낭 질환(IBD)은 IBDV9에 의해 유발되는 급성, 전염성이 높은 면역 억제성 가금류 질병입니다. IBDV는 비외피(non-enveloped bi-segmented double-stranded, ds) RNA 바이러스로, Birnaviridae과(10)에 속하는 Avibirnavirus 속에 속합니다. 다른 연구자들과 우리 실험실의 이전 연구에 따르면 IBDV 감염은 다른 경로를 통해 숙주 세포에서 세포 사멸을 유도합니다 11,12,13,14. 이전 연구 결과는 IBDV 감염이 용해 세포 사멸의 지표인 젖산 탈수소효소(LDH)의 방출을 유발한다는 것을 보여주었으며 6,15, 이는 IBDV 감염이 숙주 세포에서 용해 세포 사멸을 유도한다는 것을 시사합니다. 또한, 이 데이터는 IBDV에 감염된 세포가 원형질막에서 불어오는 큰 기포를 동반한 세포 팽창 및 프로피듐 요오드화물(PI) 양성 염색을 포함하여 발열성 세포 사멸의 형태학적 특징을 나타내며, 이는 IBDV 감염이 세포에서 발열증을 유발한다는 것을 시사합니다.

절단된 GSDM(GSDM-NT)의 N-말단 단편에 의한 발열세포 내 막의 형성이 발화증의 특징이라는 점을 고려할 때, 이론적으로는 특정 항체를 사용하여 세포막의 GSDM-NT를 검사하여 유세포법으로 발열세포를 검출할 수 있습니다. 조류 발열 세포에서 닭 Gasdermin E(chGSDME-NT)의 N-말단 단편은 막 공극을 형성하여 프로피듐 요오드화물(PI)이 DNA를 통과하여 결합할 수 있도록 합니다. 따라서, 유세포 분석을 사용하여 pyroptotic cell의 비율을 검출할 수 있으며, 이에 따라 pyroptosis를 apoptosis 및 necrosis와 같은 다른 형태의 세포 사멸과 구별할 수 있습니다. 그러나 유세포 분석에 의한 발열 세포를 검사하는 방법은 보고되지 않았습니다. 이 연구에서는 DF-1 세포를 IBDV에 감염시키고 유세포 분석을 수행하여 chGSDME-NT 단편(막 결합) 및 PI 염색에 대해 단클론 항체(McAb)를 사용하여 열세포 세포를 검사했습니다. 놀랍게도, pyroptotic cell은 유세포 분석에 의해 효과적으로 검출되었습니다. 또한, pyroptotic cell의 비율을 정량화할 수 있었습니다. 이러한 발견은 pyroptosis를 결정하는 강력하고 효과적인 수단을 제공합니다.

이 글에서는 anti-chGSDME-NT McAb 및 PI 염색을 사용하여 유세포 분석으로 IBDV에 감염된 세포의 pyroptosis를 검사하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 또한 다른 병원체에 감염된 세포로 확장될 수 있으며 pyroptosis가 있는 다양한 세포 유형을 검사하는 데 적용되어 다른 형태의 세포 사멸과 구별할 수 있습니다.

프로토콜

연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 시료 세포의 준비

  1. 38°C의 5% CO2 인큐베이터에서 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)을 사용하여 6웰 플레이트(웰당 5 x 10,5개 세포)에서 DF-1(불멸의 닭 배아 섬유아세포) 세포를 배양합니다.
  2. 세포가 80% 합류에 도달하면 혈청 함유 세포 배양 배지를 버리고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세 번 세척한 다음 각 웰에 무혈청 세포 배양 배지 2mL를 추가합니다.
  3. IBDV 바이러스 용액(계산된 MOI 포함)을 각 웰에 추가하고, 바이러스 용액과 동일한 DMEM의 부피를 추가하여 모의 감염 대조군을 설정합니다.
  4. 바이러스 흡착 1시간 후 배양 배지를 버리고 PBS로 세포를 세 번 세척한 다음 2% FBS가 보충된 DMEM 2mL를 각 웰에 추가하고 24시간 동안 세포 배양을 계속합니다.
  5. IBDV 감염 후 24시간 동안 트립신 처리(웰당 500μL)를 1분 동안 수행한 후 10% FBS(웰당 2mL)가 보충된 DMEM으로 중화합니다. 그 후, 세포를 수확하여 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 준비해야 합니다.
  6. 400 x g 에서 2-8 °C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 폐기하십시오.
  7. 세포 펠릿을 PBS에 재현탁시키고 튜브를 3초 동안 부드럽게 소용돌이칩니다.
  8. 1.6 단계 (2-8 ° C에서 5 분 동안 400 x g )에 설명 된대로 세포를 원심 분리합니다.
  9. 1.7단계 및 1.8단계에 설명된 대로 세포 세척을 반복합니다.
  10. 현미경으로 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행합니다. 그런 다음 적절한 부피의 유세포 염색 완충액에 세포를 재현탁시킵니다(최종 세포 농도가 1 x 107 cells/mL가 되도록). 서스펜션을 부드럽게 소용돌이치십시오.

2. 유세포 분석을 위한 세포 염색

  1. 1.10단계에서 채취한 단일 세포 현탁액 100μL를 5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브(12mm × 75mm)에 추가합니다. 항-chGSDME-NT/CT 항체 염색을 위해 모의 및 IBDV 감염 세포를 준비하고 정상 마우스 IgG를 동형 대조군으로 사용합니다. 한편, IBDV에 감염된 세포가 있는 빈 대조군 및 단일 염색 튜브를 준비합니다.
  2. IBDV 감염 및 모의 대조 튜브에 각각 Alexa Fluor 647 라벨링 anti-chGSDME-NT McAb, anti-chGSDME-CT McAb 또는 정상 마우스 IgG(isotype control)를 1μg을 추가합니다. 그런 다음 튜브를 3초 동안 부드럽게 소용돌이칩니다.
  3. 염색된 세포를 2-8 °C 또는 어두운 곳에서 30분 동안 얼음 위에서 배양합니다. 10분마다 튜브를 부드럽게 소용돌이칩니다.
  4. 400 x g 에서 2-8 °C에서 5분 동안 원심분리하여 1mL의 유세포 분석 염색 완충액으로 세포를 세척합니다. 피펫을 사용하여 상층액을 폐기하십시오.
  5. 2.4단계에서 설명한 대로 세포 세척을 반복합니다.
  6. 펠릿을 100μL의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁시킵니다.
  7. IBDV 감염 그룹 및 모의 감염 그룹 및 PI 단일 염색 튜브의 세포를 실온에서 10분 동안 10μg/mL의 PI로 염색한 다음 유세포 분석을 위해 400μL의 유세포 염색 완충액을 추가합니다.

3. 유세포 분석 수행

  1. 유세포분석기를 켜서 기기를 초기화하고 소프트웨어를 실행합니다.
  2. 먼저 blank control tube를 실행한 다음 단일 stained tube를 실행하여 유세포분석기의 전압 및 보상 매개변수를 조정합니다. 635nm에서 방출하는 FL3 및 FL4 형광 채널을 활용하여 각각 PI 및 Alexa Fluor 647 형광단을 검출합니다.
  3. 모든 매개 변수를 구성한 후 모든 샘플을 순차적으로 실행합니다.

4. 유세포 분석 데이터 분석

  1. FL4 채널 히스토그램에서 각 샘플의 Alexa Fluor 647 염색을 분석합니다.
  2. 각 샘플에서 이중 양성 세포의 비율을 평가하려면 FL3/FL4의 4사분면 점 플롯을 활용하십시오.
  3. isotype control IgG/PI 이중 염색 샘플을 기반으로 양성 임계값을 설정하여 이중 양성 세포의 비율이 1% 미만으로 유지되도록 합니다. 이 접근법은 모든 샘플에서 이중 양성 세포의 비율을 쉽게 측정할 수 있습니다.

결과

IBDV에 감염된 DF-1 세포의 막에 있는 chGSDME-NT는 유세포 분석으로 쉽게 검출할 수 있습니다.
pyroptotic cell의 가장 중요한 특징 중 하나는 Gasdermin 절단에서 생성된 GSDM-NT 단편에 의한 막 기공의 형성입니다. 따라서 pyroptotic cell은 특정 항체를 사용하여 세포막에서 GSDM-NT를 검사하여 유세포 분석으로 이론적으로 검출 할 수 있습니다. 따라서 DF-1 세포를 IBDV에 감염시키고 Alexa Fluor 647 표지 anti-chGSDME-NT McAb 및 PI 염색을 사용하여 유세포 분석으로 pyroptotic 세포를 검사했습니다. IBDV 감염 후 유세포 분석으로 상당한 수의 chGSDME-NT 양성 세포가 검출되었습니다(그림 1). 대조적으로, 모의 감염 대조군 또는 동형형 대조군 IgG로 염색된 세포는 최소한의 Alexa Fluor 647 양성 세포를 보여주었습니다. 이러한 결과는 유세포 분석에 의한 막 결합 chGSDME-NT의 효과적이고 특이적인 검출을 보여줍니다. 주목할 점은, 절단된 chGSDME(chGSDME-CT)의 C-말단 단편이 chGSDME-NT와 같이 원형질막으로 전위되지 않고 세포질 내부에 잔류했기 때문에, chGSDME-CT 단편은 막 표면 항원 염색을 사용한 유세포 분석으로 거의 검출할 수 없었으며, 이는 pyroptosis가 막 결합 chGSDME-NT 단편과 관련이 있다는 사실과 일치했습니다.

DF-1 세포의 Pyroptosis는 fluorescein-labeled anti-chGSDME-NT McAb 및 PI로 세포의 이중 염색을 사용하여 유세포 분석으로 측정할 수 있습니다.
세포를 Alexa Fluor 647 표지된 항-chGSDME-NT McAb 및 PI로 이중 염색한 후 FL3 및 FL4 형광 채널에서 유세포 분석을 수행했을 때 chGSDME-NT 및 PI 염색이 양성이므로 열줄기 세포를 확인할 수 있었습니다. 그림 2A,B에서 볼 수 있듯이, IBDV 감염이 있는 상당한 수의 chGSDME-NT 양성 세포가 유세포 분석 분석에 의해 검출되었으며, IBDV 감염 세포에서 chGSDME-NT/PI 이중 양성 세포의 비율(약 33%)은 모의 감염 대조군보다 유의하게 컸으며(P < 0.001), 이는 chGSDME-NT에 의한 막 기공의 형성을 시사합니다 세포막의 파괴와 동시에 발생하여 이러한 IBDV에 감염된 세포가 발열 세포 사멸을 겪게 되었습니다. 이러한 데이터는 IBDV 감염이 숙주 세포에서 chGSDME 매개 pyroptosis를 유발한다는 것을 명확하게 보여줍니다. 반면 PI 단일 양성 세포는 IBDV 감염에 의해 유도된 다른 형태의 세포 사멸을 나타낼 수 있습니다. 따라서 유세포 분석에 의한 기공 형성 chGSDME-NT의 검사는 다른 형태의 세포 사멸을 겪고 있는 세포와 발열 세포를 구별하는 데 유용한 방법을 제공합니다.

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그림 1: 유세포 분석을 통한 chGSDME-NT 결합 세포 검사. DF-1 세포는 MOI 1에서 모의 감염 또는 IBDV에 감염되었습니다. 감염 후 24시간 후, 세포를 채취하여 Alexa Fluor 647 표지된 anti-chGSDME-NT /anti-chGSDME-CT McAb 또는 isotype control IgG로 염색하고 유세포 분석법으로 분석했습니다. chGSDME-NT 염색 양성 유세포 분석 분석은 IBDV 유발 열혈증이 있는 막 결합 chGSDME-NT 세포를 입증했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: chGSDME-NT 및 PI를 사용한 이중 염색을 사용한 유세포 분석에 의한 pyroptosis의 검사. (A) 유세포 분석에 의한 pyroptotic cell의 점도표 분석. DF-1 세포는 MOI 1에서 IBDV에 감염되었습니다. 감염 후 24시간 후 세포를 채취하고 Alexa Fluor 647 표지된 anti-chGSDME-NT /anti-chGSDME-CT McAb 및 PI로 염색하고 유세포 분석으로 분석했습니다. (B) (A)의 각 그룹에서 발열 세포의 비율을 표시하고 통계적으로 분석했습니다. 통계적 유의성을 분석하기 위해 양원 분산 분석(two-way ANOVA)이 사용되었다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 나타내며 SD± 수단으로 제시되었습니다. ***P < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 글에서는 Alexa Fluor 647 표지된 anti-chGSDME-NT McAb 및 PI로 감염된 세포를 이중 염색하여 얻은 유세포 분석을 사용하여 pyroptosis를 검사하는 효과적인 방법에 대해 설명합니다. 이 접근법은 또한 pyroptosis를 apoptosis 및 necrosis와 같은 다른 유형의 세포 사멸과 구별하기 위해 다양한 세포 유형에 적용될 수 있습니다.

포유류 1,2,3에서 주로 Gasdermin(GSDM) D-유도 원형질막 기공 형성에 의존하는 염증성 유형의 프로그램된 세포 사멸인 Pyroptosis는 전통적으로 LDH 방출 6,15, 형태학적 특징16 및 Western Blot 또는 IFA 분석을 통한 GDM-NT/GSDM-CT 단편 검출과 같은 방법을 통해 평가되어 왔습니다 17. 그러나 이러한 방법 중 어느 것도 발열 세포의 비율을 정확하게 정량화하지 않습니다. 이 연구는 GSDM-NT 단편에 의해 형성된 열세포 세포의 특징적인 원형질막 기공을 활용하여 측정을 위한 유세포 분석 기반 전략을 개발합니다.

세포를 chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 및 PI로 이중 염색한 후 FL3 및 FL4 형광 채널에서 유세포 분석을 통해 분석했을 때, pyroptosis는 두 가지 매개변수를 동시에 식별할 수 있었습니다: chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 염색, 절단된 chGSDME의 N 말단 단편에 의한 원형질막 공극 형성 및 원형질막 파열을 나타내는 PI 염색. 이 데이터는 IBDV에 감염된 세포에서 chGSDME-NT/PI 이중 양성 세포의 비율(약 33%)이 모의 감염 대조군(P < 0.001)보다 유의하게 높았음을 보여줍니다.

실험 방법은 정확성과 신뢰성을 보장하기 위해 몇 가지 고려 사항이 필요합니다. 첫째, 흐름 분석에 사용되는 각 샘플 튜브에는 흐름 분석의 정밀도를 유지하기 위해 1 x 106 셀 이상이 포함되어야 합니다. 프로토콜의 여러 세척 단계를 감안할 때, 2.1단계에서 각 튜브의 초기 셀 수를 그에 따라, 예를 들어 2 x 106 셀로 늘리는 것이 좋습니다. 세포 세척 및 이식을 다룰 때는 세포 무결성이 의도치 않게 중단되지 않도록 매우 주의해야 합니다. 또한 세포 밀도, 항체 농도 및 작업 기간은 모두 최적의 파라미터 설정에 영향을 미칠 수 있음을 명심하십시오. 따라서 특정 실험 조건에 따라 유세포 분석기의 매개변수와 설정을 조정해야 합니다. 이 연구에서 사용된 매개변수는 FSC AmpGain을 1.40으로 설정하고 SSC 전압을 490V로 설정했습니다. FSC/SSC 플롯의 게이트는 후속 FL3/4 채널 분석을 위해 모든 세포 집단을 포괄하도록 설정되었습니다. 형광 전압은 FL3 채널(PI)의 경우 600V, FL4 채널(Alexa Fluor 647)의 경우 600V로 설정되었습니다. 보정은 FL4 채널과 FL3 채널 사이에서 38.0%로 설정되었습니다. 유속은 200 events/s로 설정되었으며 이벤트 임계값은 10,000으로 설정되었습니다.

새로운 접근법의 도움으로 닭의 병원성 감염에 대한 숙주 반응에서 GSDME 매개 pyroptosis의 역할과 기본 메커니즘에 대한 이해가 크게 발전했습니다. 특정 항체를 사용하여 유세포 분석을 통해 기공 형성 chGSDME-NT를 검사할 수 있었으며, 이를 통해 발열 세포를 다른 세포와 구별하고 발열 세포의 비율을 쉽게 결정할 수 있었습니다. 결과적으로 이 방법은 발열 세포 검출에서 Western Blot 또는 IFA 분석에 비해 뚜렷한 이점을 제공합니다.

그러나 이 프로토콜의 한계는 IBDV에 감염된 세포에서 닭 GSDME의 N-말단 단편을 pyroptosis를 연구하기 위한 실험 모델로 사용하는 데 있습니다. 그럼에도 불구하고 이 연구는 pyroptosis를 결정하기 위한 유세포 분석의 첫 번째 성공적인 활용입니다.

요약하면, pyroptosis를 검사하기 위해 여기에 설명된 유세포 분석 방법은 포유류와 조류 모두에서 pyroptosis의 배후에 있는 메커니즘에 대한 이해를 발전시킬 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이 방법은 생명 과학에서 세포 사멸 연구에 기여하는 효과적인 도구입니다.

공개 사항

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

친절한 도움을 주신 Jue Liu 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 중국 국가중점연구개발프로그램(No. 2022YFD1800300), 중국국가자연과학재단(No. 32130105), 현대농업산업기술연구시스템(No. CARS-40), 중국.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브(12회; 75mm)Corning Falcon352052
6웰 세포 배양 플레이트Corning3516
Alexa Fluor 647 항체 라벨링 키트Thermo Fisher ScientificA20186
Anti-chGSDME-CT McAbSAE Biomedical Tech Company(중국 중산)EU0228
Anti-chGSDME-NT McAbSAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China)EU0227
CellQuest 소프트웨어BD Biosciences
CO2 incubatorThermo Fisher Scientific3100
Cryogenic Freezing CentrifugeEppendorf5810R
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco by Life TechnologiesC11995500BT
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF0193-500ML
유세포분석기BD BiosciencesFACSCalibur
유세포 분석 염색 완충액Thermo Fisher Scientific00-4222-26
혈구분석기Qiu-jing 생화학 시약 & Instrument Company (Shanghai, China)YX-JSB52
IBDV Lx 변형IBDV Lx 균주는 중국 베이징 농업 임업 아카데미 Jue Liu 박사가 친절하게 제공했습니다
도립 현미경충칭 광전 기기 회사XDS-1B
일반 마우스 IgG산타 크루즈 생명 공학sc-2025
인산염 완충 식염수 (PBS)엠앤드 씨  유전자 기술CC017
프로피듐 요오드화물(PI)시그마-알드리치P4170
트립신-EDTA, 0.25%M& 씨  Gene TechnologyCC008
와류 발진기MIULABMIX-28+

참고문헌

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