기계적으로 환기된 마우스의 과분극 129Xe 폐 MRI 및 분광학

요약

과분극 크세논 MRI는 중개 연구 및 임상 치료에서 국소 폐 미세 구조(공기 공간 치수) 및 생리학(환기 및 가스 교환)을 정량화할 수 있습니다. 까다롭긴 하지만, 전임상 연구에서 비슷한 폐 관련 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜은 생쥐에서 일상적인 크세논 폐 MRI를 수행하는 데 필요한 인프라와 절차를 설명합니다.

초록

과분극(HP) 크세논-129(¹²⁹Xe)는 환기, 제한 확산(폐포-공역 크기) 및 가스 교환을 포함한 폐 생리학을 정량화하는 데 활용할 수 있는 고유한 스펙트럼 및 물리적 특성을 가진 흡입 자기 공명 영상(MRI) 조영제입니다. 인간의 경우 다양한 폐 질환에서 질병의 중증도와 진행을 평가하는 데 사용되었으며 미국과 영국에서 임상 사용이 승인되었습니다. 임상 응용 외에도 폐 병태생리학을 비침습적으로 평가하고 공간적으로 해결된 정보를 제공하는 ¹²⁹Xe MRI의 기능은 전임상 연구에 중요합니다. 동물 모델 중에서 마우스는 유전자 변형 질병 모델의 접근성으로 인해 가장 널리 사용됩니다. 여기서 ¹²⁹Xe MRI는 폐 질환의 진행과 치료 반응(예: 신약 개발)을 종단적으로 모니터링할 수 있는 최소 침습적이고, 방사선이 없으며, 민감한 기법으로 유망합니다. 이 기술은 MRI로 작동되는 자유 호흡 장치 또는 기계식 인공호흡기를 통합하여 가스를 전달함으로써 전임상 응용 분야로 확장될 수 있습니다. 여기에서는 품질 관리를 위한 열 편광 크세논 가스 팬텀 생성, 편광 최적화, 동물 취급(진정제, 삽관, 인공호흡 및 생쥐 관리) 및 인공호흡, 제한 확산 및 가스 교환 데이터를 위한 프로토콜을 포함하여 강력한 데이터 수집 및 분석을 보장하기 위한 단계를 설명하고 체크리스트를 제공합니다. 전임상 ¹²⁹Xe MRI는 다양한 동물 모델(예: 쥐, 돼지, 양)에 적용할 수 있지만, 이 프로토콜은 생쥐의 작은 해부학적 구조로 인해 발생하는 문제로 인해 생쥐에 초점을 맞추고 있으며, 이는 경제성과 많은 질병 모델의 가용성으로 균형을 이룹니다.

서론

폐 질환은 여전히 전 세계 이환율 및 사망률의 주요 원인이지만¹, 지난 10년 동안 환자 예후가 극적으로 개선되었습니다. 이러한 개선은 부분적으로 두 가지 요인에 의해 주도됩니다. 첫째, 제3상 임상시험은 이제 폐 기능의 변화를 사망률보다 종점으로 우선시하여 약물 임상시험을 가속화하고 있습니다 ^2,3,4,5. 둘째, 개선된 동물 모델의 발전은 질병 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 치료 개발을 도왔습니다 ^6,7. 마우스 모델은 인간과 생리학적으로 유사하고, 경제성이 높으며, 질병이 빠르게 발병할 수 있기 때문에 중개 연구에 선호되는 경우가 많습니다. 유전 공학은 사용 가능한 모델의 범위와 품질을 확장했으며, International Mouse Strain Resource는 현재 32,000개 이상의^{마우스 균주}8를 자랑하는 반면 4,218개의 쥐 균주를 자랑합니다(Rat Genome Database⁹). 이러한 모델은 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)¹⁰, 낭포성 섬유증(CF)¹¹, 폐섬유증(pulmonary fibrosis)^12,13, 폐고혈압(pulmonary hypertension) ^14,15, 천식¹⁶을 포함한 다양한 폐 질환에 대한 기계론적 동인과 치료 반응을 조사하기 위한 새로운 길을 열었습니다.

불행히도 생쥐를 대상으로 한 폐 연구는 질병 부담을 정량화하는 데 사용할 수 있는 기술에 의해 제한됩니다. 연구는 종종 1) 전체 폐 정보(생화학적 분석) 또는 국소 정보(조직학)를 제공하고 2) 단면 설계와 큰 표본 크기를 요구하는 터미널 절차에 의존합니다. 따라서 그들은 공간적 또는 시간적 질병 역학을 포착하지 못합니다. 대조적으로, 비침습적 3차원 이미징은 시간이 지남에 따라 폐의 구조, 분자 과정 및 기능을 평가할 수 있습니다.

폐 구조(예: 기도 이상 및 간질성 섬유증)는 고해상도의 초단음반향시간(UTE) MRI 및 마이크로컴퓨터 단층촬영(μCT)으로 시각화할 수 있습니다. 기능적 및 기계론적 정보(예: 인공호흡, 관류, 종양 대사 및 염증 과정)는 외인성 조영제(예: 크세논 강화 CT 및 산소 강화 UTE) 및 이온화 핵의학 접근법(즉, 양전자 방출 단층 촬영[PET] 및 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영[SPECT])을 통해 얻을 수 있습니다. 그러나 기능적 이미징은 정상 수준보다 높은 방사선 수준을 가진 이온화 양식을 사용하지 않고 사용할 수 있는 적당한 대비(특히 T₁이 길어지는 전임상 MRI에 사용되는 높은 자기장 강도에서 산소 강화 UTE의 경우)로 인해 어렵습니다. 이러한 방식을 사용한 이미징은 기존 선량을 사용하는 동물 모델에서 잘 견디지만, 누적 방사선은 면역학, 염증 및 폐암에 대한 연구에서 결과를 혼란스럽게 할 수 있습니다¹⁷. 그러나 과분극(HP) xenon-129(¹²⁹Xe) 자기 공명 영상(MRI)은 최소 침습적, 비방사선 및 매우 민감한 구조 및 기능 정보를 제공합니다. 이 기술은 폐기종 ^18,19, 섬유증²⁰, 폐암²¹, COPD²² 및 방사선 유발 폐 손상²³을 포함한 상태를 단일 또는 다중 시점에서 특성화하기 위해 전임상 연구에서 사용되었지만 전임상 환경에서는 활용도가 낮습니다.

일상적인 전임상 ¹²⁹Xe MRI를 사용하려면 기관 규제 지원, 과분극 장치, ¹²⁹Xe 조정 무선 주파수(RF) 코일 및 다중 핵 가능 스캐너를 포함한 몇 가지 전제 조건이 필요합니다. 고급 애플리케이션 24,25,26,27,28,29,30,31,32,33은 이 프로토콜의 범위를 벗어나는 공급업체별 펄스 프로그래밍을 필요로 하지만, 기본 애플리케이션은 약간의 소프트웨어 수정으로 달성할 수 있습니다. 따라서 우리는 전임상 ¹²⁹Xe MRI에 고유한 품질 관리, 자화 처리, 데이터 수집 및 기계 환기를 포함한 동물 취급 절차에 중점을 둡니다(그림 1).

현재까지 소동물 ¹²⁹Xe 이미징은 자유 호흡, 피스톤 구동 및 압력 강하의 장점과 단점이 있는 세 가지 MR 안전 가스 전달 방법을 채택했습니다. 자유로운 호흡은 삽관이나 기관절개술로 인한 부상의 위험 없이 자발적으로 흡입할 수 있지만, 훨씬 더 많은 HP 가스를 소비하고 운동 아티팩트를 유발할 수 있다^34,35. 상용 피스톤 구동 장치는 자체 보정이 가능하고 즉시 사용하기 쉽지만 엄청나게 비쌀 수 있습니다³⁶. 여기에 사용된 압력 강하 기반 접근 방식은 문헌에 잘 설명되어 있으며, 모듈식, 사용자 정의 가능 및 오픈 소스 코드^37,38,39,40으로 실행됩니다. 또한 비용 효율적이며 일반적으로 총 $10k 미만이고 몇 주간의 전용 빌드 시간이 소요됩니다. 압력 강하 인공호흡기는 삽관된 마우스의 기도 압력을 모니터링하면서 가압 캐니스터 내의 투여 백에서 ¹²⁹Xe를 전달합니다.

그림 1: 마우스에서 일상적인 xenon-129(¹²⁹Xe) 자기 공명 영상(MRI)을 수집하기 위한 프로토콜 개요. (A) 초기 설정 단계. (참고: 스캐너 프로그래밍은 각 공급업체에 고유하며 이 프로토콜에 설명되어 있지 않습니다.) (B) 일일 품질 보증(QA) 및 동물 데이터를 수집하는 단계. (C) 성공적인 실험 결론 및 데이터 분석을 위한 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

여기에서는 ¹²⁹Xe MRI 데이터의 세 가지 일반적인 등급인 환기, 확산 가중 영상(폐포-공역 크기) 및 가스 교환을 수집하고 분석합니다. 환기 이미지는 흡입된 ¹²⁹Xe 가스의 분포를 보여줍니다. 공기 흐름이 감소한 폐 영역은 HP 가스 이미지에서 어둡게 나타나며, 병리학은 결함이 있는 인공호흡의 양으로 정량화됩니다. 인간의 경우, 환기 결함 비율(VDP)은 강력한 반복성^41,42과 COPD 43,44,45 및 천식 ^46,47과 같은 질병에서 폐폐색에 대한 높은 민감도를 보여주었습니다.

영공에서 ¹²⁹Xe 원자의 제한된 확산은 겉보기 확산 계수 (ADC)를 통해 측정 할 수 있으며 영공 크기에 대한 대리 장치 역할을합니다. ADC는 확산 가중치 없이 기준선 이미지(_b0)와 바이폴라 구배 유도 확산 가중치(_bN)가 있는 상태에서 획득된 하나 이상의 이미지를 획득하여 계산됩니다. ADC 상승은 노화 또는 폐기종 리모델링으로 인한 영공 크기의 증가를 반영합니다^18,48. 또한, 다중 b-값 이미지(≥4)를 사용하면 보다 상세한 형태 측정 정보(예: 평균 선형 절편)를 계산할 수 있습니다^49,50.

가스 교환은 1) 모세관 조직, 혈장 및 적혈구(적혈구)에서 ¹²⁹Xe의 용해도와 2) 이러한 구획에 용해될 때 ¹²⁹Xe의 >200ppm 다운필드 화학적 이동으로 인해 특성화될 수 있습니다. 분광 데이터와 영상 데이터 모두 심폐 질환(예: 폐고혈압 및 좌심부전 51,52,53)에 대한 통찰력을 제공합니다. 많은 종(인간, 개, 쥐)은 각 구획에서 발생하는 고유한 스펙트럼 피크를 나타내지만, 마우스는 헤모글로빈-크세논 결합 부위 상호 작용의 차이로 인해 고유한 적혈구 신호가 부족합니다. 대신에, 모든 용해된 성분은 마우스⁽⁵⁴)에서 단일 신호로 결합된다. 그러나, 겸상적혈구질환 모델에 사용된 것과 같은 인간 헤모글로빈을 발현하는 형질전환 마우스에서 뚜렷한 RBC 공명을 관찰할 수 있다⁵⁴. 전반적으로 용존 ¹²⁹Xe 분광법 및 이미징은 마우스^55,56의 심폐 병태생리학에 대한 고유한 통찰력을 제공합니다.

이 프로토콜을 시도하기 전에 마우스 연구에 필요한 MRI 스캐너, 기계적 환기 및 마우스 취급 기술에 대한 배경 정보를 이해해야 합니다. 동물연구를 시작하기 전에 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)⁵⁷의 승인을 받아야 합니다. 마우스 폐에서 사용할 수 있는 총 자기 모멘트가 본질적으로 낮기 때문에(즉, 일회 호흡량 ~250μL) 복셀 크기는 해부학적으로 동일한 분해능을 얻기 위해 인간보다 1000배 작아야 합니다. 쥐의 호흡 속도도 매우 빠릅니다(>100회/분). 따라서 인체 이미징에 일반적으로 사용되는 단일 호흡 참기 절차는 실현 가능하지 않습니다. 대신, 각 호흡 내에 몇 개의 RF 여기(RF excitation)만 적용할 수 있으므로 수십 번에서 수백 번의 호흡에 걸쳐 ¹²⁹개의 Xe 이미지를 인코딩해야 합니다. 펄스 프로그래밍은 획득의 외부 트리거링을 허용하고 신호 대 잡음비(SNR), 해상도 및 스캔 기간의 균형을 맞추면서 슬라이스, 위상 인코딩 및/또는 확산 가중 이미지를 적절하게 루프하는 데 필요할 수 있습니다. 여기서 인공호흡기는 호흡당 한 번씩 트랜지스터-트랜지스터 로직(TTL) 펄스를 출력하여 데이터 수집을 트리거합니다(그림 2).

그림 2: 대표적인 기계적 환기 및 데이터 수집 타이밍. (A) 사용자 제어 인공호흡은 말단 흡기 시, 호흡 참기 중 또는 호기 종료 시 데이터 수집을 트리거할 수 있습니다. (B) 이 3D 방사형 환기 시퀀스의 경우, 사용자는 획득된 총 돌출 수와 호흡당 투영 수를 정의합니다. (C) 슬라이스 선택적, 2D 확산 가중 이미지의 경우 사용자는 슬라이스, b-값 이미지 및 위상 인코딩의 순서를 정의합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

신뢰할 수 있는 인공호흡과 ¹²⁹Xe 전달을 위해서는 강력한 진정 및 삽관 절차가 필요합니다. 각 연구마다 분 환기, 심박수(HR) 및 혈압 58,59,60,61,62,63,64,65,66^의 변화를 포함하여 각 마취제의 다운스트림 효과를 고려해야 합니다. 전임상 HP 가스 MRI에는 다양한 진정제가 사용되었지만 가용성, 비용 효율성, 신뢰성 및 지속 시간^67,68로 인해 케타민, 자일라진 및 아세프로마진을 혼합하여 사용합니다. 진정제를 투여한 후에는 효과적인 기계적 환기를 위해 동물에게 삽관을 해야 합니다. 생쥐의 삽관은 해부학적 구조가 작기 때문에 어렵기 때문에 이 기술을 철저히 훈련하는 것이 중요합니다. 우리는 연구자들이 발표된 비디오 프로토콜^69,70을 검토할 것을 권장합니다. 대부분의 상업용 삽관 캐뉼러에는 스테인리스강이 포함되어 있기 때문에 기도 직경에 맞게 사용자 정의하여 마우스 기관 벽과 기밀 밀봉을 생성할 수 있는 금속이 없는(즉, MRI 및 HP 가스 호환) 쐐기 모양의 캐뉼러를 제작하는 기술을 소개합니다.

¹²⁹개의 Xe 영상이 여러 번의 호흡을 통해 수집되기 때문에 인공호흡기 설정이 매우 중요합니다. 폐 손상을 예방하기 위해 보호 환기 전략을 신중하게 고려해야 한다 71,72,73,74. 특히, 낮은 일회 호흡량(TV), 중등도의 호기말 양압(PEEP) 및 폐포 모집 조작(RM)의 사용은 인간 환자 및 동물 모델에서 인공호흡기로 인한 폐 손상의 위험을 줄입니다 75,76,77,78,79,80,81. 여기에서는 압력 강하 ¹²⁹Xe 기계 환기 장치와 호환되고 보호 기능이 있으며 충분한 ¹²⁹Xe 이미지 SNR을 제공하는 간단한 기술을 권장합니다. 구체적으로, 우리는 인공호흡기의 호기 라인에 상업용 PEEP 밸브를 추가하여 PEEP를 적용합니다. RM을 수행하려면 동물이 목표 압력과 지속 시간에 도달할 때까지 호기 없이 여러 번 흡입을 받을 수 있도록 호기 라인을 닫아야 합니다.

전반에 걸쳐 일반적인 환기 설정을 제공하지만 특정 연구 목표를 다루기 위해 문헌을 검토하는 것이 좋습니다^82,83. 기계적 환기 중 최대 흡기 압력을 모니터링하는 것 외에도 표준 마우스 온도 모니터링 방법을 사용하여 수행할 수 있는 동물의 온도를 모니터링하는 것이 중요합니다. 이미징에 필요하지는 않지만 심전도(ECG)를 통해 심박수를 모니터링하는 것이 유리할 수 있습니다. ECG는 동물이 진정제에서 깨어났는지, 과다 복용 상태인지, 괴로워하는지 여부를 나타낼 수 있어 연구원이 개입할 수 있습니다.

우리가 설명하는 프로토콜은 ¹²⁹Xe 3D 방사형 환기 데이터⁽⁶¹), 2D GRE 확산 가중 데이터⁽⁷⁶) 및 동적 펄스 획득 분광학 가스 교환 데이터를 수집하도록 설계되었습니다. 이 프로토콜은 소동물 모델의 전임상 연구와 ¹²⁹Xe MRI의 잠재력 사이의 격차를 해소하여 폐 질환에 대한 이해를 증진하는 것을 목표로 합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 방법은 신시내티 아동 병원 의료 센터의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다.

1. 초기 현장 준비

1. 열 편파된 ¹²⁹Xe 가스 팬텀을 만들고 테스트합니다(그림 3).
   1. 붕규산 유리 용기(~60mL), 전면 밀봉 O-링이 있는 플런저 밸브 및 최대 150psig 등급의 분쇄 붕규산 유리 스템을 구합니다. 자성 부품이 없는지 확인하십시오. 유리 스템에 압축 피팅을 부착합니다. 가스 밀폐 밀봉을 위해 조입니다.
   2. 그림 3A에 따라 용기를 진공 펌프와 산소 저장소에 연결합니다. 절대 압력이 100mTorr 미만인 진공 용기.
   3. 용기에 산소를 1.5기압의 압력으로 채우면 ¹²⁹Xe T₁ 이 > 30분에서 ~2초로 감소합니다(7T 자기장 강도에서; 9.4T 스캐너의 경우 1.6기압 산소 사용). 밀봉 용기.
      알림: 더 높은 전계 강도를 위해 T₁≤ 2 s⁸⁴를 달성하기 위해 다소 더 높은 산소 분압이 필요합니다.
   4. 기체 불투과성 용기에 동위원소가 풍부한 크세논 400mL(85% ¹²⁹Xe)를 채웁니다.
      참고: 자연적 존재량 크세논(26% ¹²⁹Xe)도 사용할 수 있지만 SNR의 ~3배 감소를 완화하려면 신호 평균화를 증가시켜야 합니다.
   5. 용기를 ¹²⁹Xe의 저장소에 연결하십시오. 절대 압력이 100mTorr 미만인 진공 튜브.
   6. 입을 벌리고 탁상형 액체 N₂ Dewar를 ~90%까지 채웁니다. 용기 바닥(~5cm)을 액체 질소에 담궈 O₂ 를 응축하고 진공을 만듭니다(그림 3B). 물에 잠긴 상태에서 밸브를 열어 저장소에서 ¹²⁹Xe가 용기로 흘러 들어갈 수 있도록 합니다(그림 3C).
   7. 플런저의 유입 구멍이 O-링을 지나 당겨질 때까지 스템을 천천히 당겨 플런저 밸브를 밀봉합니다. 구멍이 O-링을 통과한 직후 손으로 조여 용기를 밀봉합니다. 액체 질소에서 용기를 제거하고 해동시킵니다.
      참고: 해동되면 용기는 ~4.5기압(2기압 O₂ + 2.5기압 ^129Xe)으로 가압됩니다.
   8. 유리 제품을 보호합니다(예: 패딩 처리된 폴리염화비닐(PVC) 파이프 용기에 용기 삽입, 그림 3D).
      알림: 적절하게 유지 관리하면 팬텀은 10년 이상 압력을 유지할 수 있습니다.
   9. 팬텀의 T₁ 을 측정합니다(예: 분광 반전 복구 시퀀스 사용). 7 T 스캐너에 대해 T₁ < 2 s를 확인합니다. 품질 보증(QA)을 위한 시간 경과에 따른 추적 신호 및 T₁ .

그림 3: ^1.1단계에 자세히 설명된 프로토콜에 따라 안내되는 열 분극 129 Xe 가스 팬텀 생성. O2 및 ¹²⁹Xe 분압은 주어진 전계 강도⁸⁴에서 적절한 ¹²⁹Xe T₁ 회 및 신호 강도를 산출하도록_T1을 사용자 정의하도록 변경할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 열분극 가스 팬텀(thermally polarized gas phantom)으로 품질 보증을 수행합니다(표 1 및 그림 4).
   1. ¹²⁹Xe 코일을 자석의 등심점에 놓고 ¹²⁹Xe 가스 팬텀을 코일 내의 중앙에 놓습니다. 단일 펄스 및 획득 시퀀스("단일 펄스")에서 팬텀의 대략적인 ¹²⁹Xe 가스 주파수(83.07T에서 ~7MHz)와 일치하도록 작동 주파수를 설정합니다.
   2. 획득 및 여기 주파수를 ¹²⁹Xe Larmor 주파수로 중심에 두고, 이 주파수를 모든 팬텀 보정 및 품질 관리 ¹²⁹Xe 스캔에 사용합니다. 모든 QA 스캔에 대한 실험 매개변수는 표 1 을 참조하십시오. 팬텀이 팬텀 로컬라이저의 중앙에 있는지 확인합니다(그림 4A).
   3. 플립 각도를 보정하기 위한 장동요법 실험 수행: SNR이 충분하다고 가정하고 반복 시간(TR) 간격이 5 x T₁인 단일 RF 펄스를 사용합니다>. 각 수집에 대해 신호가 무효화되고 반전이 시작될 때까지 RF 전력을 점진적으로 증가시킵니다. 여기에 사용된 표준은 펄스 수 = 65입니다. TR = 10 초; 펄스 지속 시간 = 125μs; RF 전력 = 1-13.8W, 0.2W씩 증가
   4. 푸리에는 첫 번째 스펙트럼(즉, 가장 낮은 RF 전력으로 획득된 스펙트럼)을 변환하고 위상화합니다. 모든 스펙트럼에 대해 동일한 위상을 적용합니다. 실제 스펙트럼을 RF 펄스 전력의 함수로 플로팅합니다(그림 4B).
   5. 널 피크(즉, 최소 피크 높이)를 생성하는 전력은 180° 플립 각도에 해당합니다. 180° 플립 각도를 생성하는 데 필요한 펄스 길이의 절반에서 동일한 전력을 사용하여 90° 플립 각도를 달성합니다. 스캐너 소프트웨어가 허용한다고 가정하고 후속 플립 각도 조정을 위해 이 90° 기준 전력과 펄스 길이를 설정합니다.
   6. 단일 펄스를 사용하여 ¹²⁹Xe 스펙트럼의 최대 절반(TR ~ 1s)에서 전체 너비를 최소화하여 심(shim)합니다. 필요한 경우 shimming 후 주파수를 중심에 다시 맞춥니다. 전체 너비의 절반 최대값을 기록합니다.
   7. ¹²⁹Xe QA 스캔을 실행합니다(표 1 및 그림 4C). QA 데이터 기록: SNR, 평균 팬텀 신호 및 노이즈의 표준 편차.

그림 4: 사전 스캔 품질 보증. (A) 저해상도 2D GRE 코로나 팬텀 로컬라이저는 팬텀이 자석의 중앙에 오도록 합니다. (B) 90° 펄스를 설정하기 위한 장동화 실험은 180° 펄스에서 null 피크를 보여줍니다. (C) 플립 각도의 위치를 파악하고 보정한 후 더 높은 해상도의 2D GRE QA 이미지를 획득합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜 약식 이름	시퀀스 설명	TR (밀리초)	테네시(밀리초)	평균 / 반복 횟수	플립 각도 (°)	행렬 크기 또는 Npts	시야각(mm2)	RF BW (kHz)	슬라이스 / 슬래브 두께 (mm)	검사 기간
단일 펄스	펄스 획득	1000		1 / 1	60	2048		10		1들
팬텀 로컬라이저	2D 그레	200	3.7	20 / 1	48	60 × 32	120 × 48	3	60	2 분
플립 각도 보정	펄스 획득	7000		1 / 65	20	2048		5.12		7.5분
129의Xe 품질 보증	2D 그레	5000	3.3	8 / 1	90	재질 보기 322	재질 보기 322	3	40	21분

표 1: 팬텀 캘리브레이션 품질 보증 시퀀스 파라미터. TR = 반복 시간, TE = 에코 시간, N_pts = 포인트 수, FOV = 시야, BW = 대역폭. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

3. 편광을 계획합니다(그림 5A, B).
   1. 편광 ¹²⁹Xe 용량 및 축적 시간 선택: 이 프로토콜에는 15분에 400mL가 최적이지만(그림 5) 다른 응용 분야 및 장비에 맞게 쉽게 조정할 수 있습니다.
   2. 과분극자 내에서 알려진 데드 볼륨(dead volume)을 가정하고(예: V_{dead vol} = 80mL), _원하는 디스펜싱 볼륨 V에 대한 유속(SLM의 F_Xe), ¹²⁹Xe 기체 분율 f 및 축적 시간 t_acc를 계산합니다.
      (1)
      참고: 생산 시간이 길면 일반적으로 편광이 높아지지만 in vivo 이미징에는 실용적이지 않을 수 있습니다. 과분극기 ^85,86,87,88에 적합한 모델을 사용하여 생산 시간과 분극의 균형을 맞추는 유속을 결정하십시오. 여기에서는 J. W. Plummer et ^al.89(도 5A)의 모델을 사용하였다. 이는 연속-흐름 편광자에 적용되며, 정지-흐름 과분극자⁽⁹⁰)에는 적용되지 않는다.
   3. 이러한 매개변수에 따라 가스를 분극화하고, 상업용 또는 가정용 장치로 분극을 측정하고, 이를 QA를 위해 예측된 분극과 비교합니다.
   4. 운송 중 분극 손실을 측정합니다. 편광이 충분히 많이 감소하면(예: >10%) 운송 중 편광을 보호할 수 있는 마그네틱 휴대용 케이스를 구축하십시오. 보충 파일 1: Managing polarization during transportation 및 보충 그림 1을 참조하십시오.

그림 5: 편광 관리. (A) 편광과 생산량은 축적 시간과 유속의 함수입니다. 400mL 가스 백은 20분 동안 높은 초기 분극(~35%)을 제공합니다. 1L의 가스를 사용하는 것이 매력적으로 보일 수 있지만 초기 분극(~20%)이 더 낮습니다. (B) ~15분 환기 후 HP ¹²⁹Xe 1리터 배치는 <10%로 고갈되는 반면 600mL의 가스는¹¹⁶으로 유지되었습니다. 따라서 ¹²⁹Xe의 400mL 백을 여러 개 사용하면 더 높은 평균 전달 편광을 유지할 수 있습니다. C) 기본 자기장과 활성 차폐장이 교차하는 위치((N,N,N) 위치의 빨간색 상자)는 HP ¹²⁹Xe의 급격한 이완을 유발할 수 있습니다. 자석의 프린지 필드를 특성화하면 HP ¹²⁹Xe의 저장소를 급격한 이완 없이 배치할 수 있는 안전 구역을 식별하는 데 도움이 됩니다((0,0,n) 위치의 녹색 상자). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 운송 중 분극 관리. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

4. 프린지 필드 내에서 HP ¹²⁹Xe의 위치 종속 T₁을 측정합니다(그림 5C).
   1. X, Y, Z 차원을 따라 자석 등중심을 기준으로 알려진 거리와 위치를 가진 참조점을 만듭니다. isocenter에 레이블을 지정하고 다른 위치에는 n부터 N까지 레이블을 지정합니다. 조사할 위치의 수는 사용 가능한 공간에 따라 다릅니다.
   2. ^{소량의 129}Xe(~250 mL)를 과분극시켜 MRI 제어실로 운반합니다. 큰 주사기(50-100mL)에 ¹²⁹Xe를 채우고 자석 내의 등심점에 놓습니다(그림 5C의 위치 1). ~1° 플립 각도 펄스를 재생하여 신호를 측정합니다.
   3. 주사기를 ~10분 동안 제자리에 두었다가 다른 스펙트럼을 획득합니다. 신호가 최소 1 T₁ 감쇠할 때까지(즉, 신호가 초기 값의 ~1/3로 감소할 때까지) 10분마다 신호를 다시 측정합니다.
   4. 1.4.2단계를 반복하여 ¹²⁹Xe의 새 주사기로 새로운 T₁ 실험을 시작합니다.
   5. 주사기를 새 위치(예: 그림 5C의 위치 n)로 이동하고 10분 동안 그대로 둡니다. 주사기를 isocenter로 되돌려 추가 ~1° 플립 각도 스펙트럼을 얻습니다.
   6. 이 과정을 반복합니다: 주사기를 위치 n으로 옮기고, 10분 동안 기다렸다가 다시 등심원에 놓고, 적어도 1 T₁에서 감소할 때까지 신호를 다시 측정합니다.
   7. X, Y 및 Z 방향을 포함하는 나머지 참조 위치에 대해 1.4.4 - 1.4.6 단계를 반복합니다.
   8. 초기 신호(_S0)는 θ 플립 각도로 n개의 RF 펄스에서 단지수적으로 감소합니다. 신호(S)를 프린지 필드에 시간(t)의 함수로 피팅하여 각 위치에서 T₁을 계산합니다.
      (2)
   9. ¹²⁹Xe 저장소 배치를 위해 충분한 T₁(>20분)이 있는 위치를 식별합니다.
5. 금속이 없는 삽관 캐뉼러를 만듭니다(그림 6).
   1. Luer 커넥터가 있는 두 개의 정맥 내주 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 카테터를 얻습니다. 바늘은 날카로운 물건 폐기 용기에 버리십시오.
      참고: >25g 마우스의 경우 18G 및 20G 카테터를 사용합니다. 작은 동물의 경우 20G 및 22G 카테터를 사용하십시오.
   2. 카테터에서 Luer 커넥터를 자릅니다. 더 작은 카테터를 더 큰 카테터의 위쪽 끝에 공급하여 더 날카롭게 가늘어지고 더 긴 캐뉼라를 만듭니다. Luer 베이스를 포함하지 않고 끝이 비스듬한 복합 캐뉼라를 ~4.6cm로 자릅니다(그림 6A, B).
   3. 200μL 피펫 팁의 넓은 쪽 끝을 ~2.6cm 길이로 자릅니다(그림 6C).
   4. 피펫 팁 내부를 일반 이형 윤활제로 코팅합니다. 내부에 삽입된 다른 피펫 팁을 사용하여 윤활제를 얇게 분배합니다. 피펫 팁을 아세톡시 실리콘 가황 페이스트 에폭시로 채웁니다(그림 6D, E).
   5. 양쪽 끝에서 뻗어 있는 22G 와이어로 캐뉼라를 꽂습니다. 피펫 팁의 실리콘을 통해 캐뉼라 튜브를 공급합니다. 피펫 팁 끝을 지나 튜브를 ~7mm 연장합니다(그림 6F, G).
   6. 피펫 팁의 넓은 쪽에 있는 캐뉼라 튜브를 플라스틱 수 슬립 루어 커넥터를 통해 밀어 넣고 조각을 에폭시와 함께 붙입니다. Luer 커넥터를 지나 확장되는 튜브를 다듬습니다(그림 6H).
   7. 에폭시가 마를 때까지(>24시간) 기다린 다음 피펫 팁 몰드에서 실리콘 삽관 캐뉼라를 조심스럽게 제거합니다. 캐뉼러에서 와이어를 제거하여 튜브가 막히지 않았는지 확인합니다(그림 6I).
   8. 쉽게 삽관할 수 있는 손잡이를 만들려면 튜브(1/16" 또는 1/8")를 암 Luer 커넥터에 연결합니다. 삽관할 준비가 되면 이 암 Luer 커넥터를 남성 Luer 삽관 캐뉼라에 연결합니다. 이 조각은 삽관 후 쉽게 분리할 수 있습니다(그림 6J).
   9. 동물에게 사용하기 전에 소독하십시오 : 캐뉼라 외부를 70 % 알코올로 닦으십시오. 소독제로 20G 와이어를 닦은 다음 캐뉼라를 통해 와이어를 공급하여 내부를 소독하고 막힘이 없는지 확인합니다.

그림 6: MRI 및 HP ¹²⁹Xe 호환 마우스 삽관 캐뉼러 제작. 이러한 캐뉼러는 1.5단계에서 설명한 대로 정맥 카테터, 피펫 팁 및 실리콘 실란트로 구성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 일일 데이터 수집

참고: 보충 파일 2: 전임상 스캔 QA 체크리스트를 참조하십시오.

보충 파일 2: 전임상 스캔 QA 체크리스트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

1. 일일 스캐너 품질 관리를 완료하고 인공호흡기를 설정합니다(그림 4).
   1. 팬텀을 사용하여 스캐너에서 QA 프로토콜을 실행합니다(QA 스캔 매개변수는 표 1 , 일일 품질 관리 단계는 1.2단계 참조).
   2. J. Nouls et ^al.38의 방법에 따라 인공호흡기를 보정합니다. 보충 파일 3: 인공호흡기 보정, 보충 그림 2 및 보충 그림 3을 참조하십시오.
   3. 말단 흡기에서 이미징을 위한 인공호흡기 설정을 지정합니다(표 2). 동물 침대를 스캐너 선반에 놓고 생명 유지 모듈(즉, 기계식 인공호흡기 부품)을 스캐너 옆 테이블에 놓습니다.
   4. 장소 특유의 동물 난방 시스템을 작동하세요. 히터를 35.5 - 40 °C로 설정하고, 순환 공기를 켠 다음, 스캐너의 구멍을 예열하기 위해 동물의 머리가 놓일 위치에서 ~5" 이내에 공기 호스를 놓습니다.

환기 설정	HP 129Xe MRI 권장사항	노트
일회식(TV)	이상적인 체중의 8–10 mL/kg	보통 TV; TV가 낮으면 더 높은 BR이 필요하므로 이미지에 모션 아티팩트가 발생할 수 있습니다.
호기말 양압(PEEP)	2–6cmH2영형
호흡수(BR)	80–120 BR/분
모집 기동(RM)	~35cmH2O, 6초 동안 5분마다
환기 기간; 위치	< 6 시간; 앙와위	가슴의 움직임을 더 잘 볼 수 있도록 누운 자세
흡기 산소의 분율 (FIO2 )	0.3–0.5	마취된 마우스의 저산소증 예방
흡기 대 호기 비율(I:E)	1:2–1:4
총 사이클 지속 시간에 대한 흡기	0.2–0.4
미세한 환기	≥0.57 mL·g-1·분-1
우리의 기준:
BR = 80 br/min, 흡기 지속 시간 = 200 ms, FIO2 = 0.3
흡기 종료 시 이미징: 숨 참기 = 200ms, 트리거 지연 = 흡기 시작 후 200ms
숨을 참는 동안 이미징: 숨을 참는 시간 = 250ms, 트리거 지연 = 흡기 시작 후 250ms
호기 종료 시 이미징: 호흡 참기 = 200ms, 트리거 지연 = 흡기 시작 후 650ms

표 2: ¹²⁹Xe 이미징을 위한 권장 인공호흡기 설정. 매개변수는 특정 연구 목표 및 실험 조건 117,118,119,120,121,122,123,124에 맞게 미세 조정할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 3: 인공호흡기 교정. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

2. 동물을 진정시키고 삽관하십시오.
   1. 인큐베이터를 27.7°C로 켜거나 전기 가열 패드를 37.7°C로 켭니다. 동물의 체질량을 측정하고 기록합니다. 질량을 기준으로 진정제 투여량을 계산합니다. 일반적인 투여 요법에 대해서는 표 3 을 참조하십시오.
   2. 진정제를 복강내로 주사합니다. 주사 시간을 기록하고 다음 진정제 투여를 위한 타이머를 설정하십시오.
      참고: 섹션 2(일일 데이터 수집)의 나머지 단계를 가능한 한 빨리 완료하여 진정제 투여 시간과 과다 복용 위험을 최소화하십시오.
   3. 동물의 눈에 눈 윤활제를 바르고 동물을 케이지에 넣어 발열 패드 또는 인큐베이터에 넣어 저체온증을 예방합니다.
   4. 진정제 주사 후 10-15분 후에 발가락 꼬집음 테스트를 수행하여 동물이 완전히 진정되었는지 확인합니다⁶⁸. Das et ^al.69에 설명된 절차에 따라 삽관합니다.
      참고: Das et ^al.69 의 기사에는 이 기술에 대한 포괄적인 비디오 데모가 함께 제공됩니다. 단계는 다음과 같습니다.
   5. 비스듬한 판자에 동물의 이빨을 옆으로 매달아 놓으십시오. 설치류 혀 억제기를 사용하여 혀를 빼냅니다.
   6. 성대가 보이도록 하려면 삽관 캐뉼라 내의 광섬유 케이블 또는 인후 바깥쪽에 배치된 밝은 빛을 통해 백색광을 공급합니다. 성대에서 5mm 미만으로 캐뉼라를 삽입합니다.
   7. 캐뉼라가 식도가 아닌 기관에 있는지 확인하고 내부에 작은 물방울이 있는 튜브 조각에 연결합니다. 물방울이 동물의 호흡에 맞춰 움직인다면 위치가 정확할 가능성이 높습니다.

대리인	복용량	경로	기간	코멘트
흡입제
이소플루란	유도: 4%–5% 유지 보수: 1%– 3% 또는 효과	흡입	연속적인 흐름 중	• 보정된 기화기를 사용해야 합니다.
주사제
권장: 케타민 + 자일라진 + 아세프로마진	90 + 9 + 3 밀리그램 / 킬로그램	복강내	20–60분	• 저체온증에 취약합니다.
				• 반복 투여의 경우 과다 복용을 방지하기 위해 케타민 + 자일라진 혼합물로 전환하는 것이 좋습니다.
				• 마모되면서 흔들림을 일으킵니다. 이미징의 경우 투여 일정을 엄격히 준수하십시오.
				• 서맥을 유발할 수 있습니다.
케타민 + 자일라진	90 + 9 밀리그램 / 킬로그램	복강내	20–40분	• 위 참조 (케타민 + 자일라진 + 아세프로마진)
펜토바르비탈	50 - 70 mg/킬로그램	복강내	20–60분	• 호흡수와 움직임을 억제합니다.
				• 비용이 엄청날 수 있습니다.
				• 제약 등급은 제공되지 않을 수 있습니다.
면책 조항: 이것은 일반적인 지침입니다. 구현하기 전에 수의사와 상담하여 자세한 정보를 확인하십시오.

표 3: 생쥐를 위한 일반적인 마취 처방집. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

3. 동물을 환기시킵니다(표 2).
   1. 삽관 캐뉼러의 Luer 커넥터를 통해 동물을 인공호흡기에 부착합니다. 횡격막 움직임과 최대 흡기 압력(체중 10mL/kg의 일회 호흡량에 대해 ~10-12cm H₂O)을 모니터링합니다. 압력이나 호흡 동작이 비정상인 경우 필요에 따라 캐뉼라의 목 각도와 깊이를 조심스럽게 조정하십시오.
   2. 모집 동작을 수행하여 삽관 캐뉼라가 밀폐되어 있는지 확인하십시오: 동물이 숨을 내쉬지 않고 여러 번 숨을 들이쉬도록 숨을 내쉬지 않도록 합니다(예: 손가락으로 날숨 포트를 막습니다).
      알림: 기도 압력이 ~6초 동안 35cmH₂O 최대 흡기 압력에 도달하면 기도 밀봉이 충분히 조여진 것입니다. 그렇지 않은 경우 문제 해결에 대한 설명을 참조하세요.
   3. 정상적인 호기가 다시 시작되도록 합니다. 폐 순응도를 유지하고 무기폐를 예방하기 위해 스캔 사이와 스캔하지 않을 때 ~5분마다 모집 조작을 수행합니다. PEEP 밸브를 호기 라인에 연결합니다. PEEP를 4cmH₂O로 설정합니다. 최대 흡기 압력이 그만큼 증가하는 것을 관찰합니다.
   4. 성공적인 삽관 후, 스캔 중에 동물이 깨어나는 것을 방지하기 위해 진정제 재투여 일정에 맞춰 HP ¹²⁹Xe의 생산을 계획하고 초기화합니다. 실험 내내 체온을 모니터링합니다.
4. 데이터 수집: 환기 이미지를 수집합니다.
   참고: 데이터 수집 단계 2.4, 2.5 및 2.6은 순서에 관계없이 수행할 수 있습니다
   1. 최종 흡기 시 이미징을 위해 표 2 에 따라 인공호흡기를 설정합니다.
   2. 다음 설정 프로토콜을 로드합니다: proton animal localizer, mouse lungs의 가스 주파수를 중심에 두는 단일 펄스 및 ¹²⁹Xe animal localizer. 스캔 매개변수는 표 4 를 참조하십시오.
   3. 동물을 등심원에 배치하고 흉강이 양성자 국소화와 함께 시야의 중앙에 있는지 확인합니다. 단일 주파수 코일을 사용하는 경우 양성자 코일을 ¹²⁹Xe 튜닝 RF 코일로 교체하십시오.
   4. ¹²⁹Xe 편광을 기록하고 MRI 스캐너로 운반합니다. 보충 파일 4: Xenon polarization QA checklist를 참조하십시오.
   5. ¹²⁹Xe 봉지를 인공호흡기 용기에 넣고 밀봉합니다. 캐니스터를 인공호흡기와 일직선으로 연결하고 캐니스터가 가압(3 - 6 psig)되도록 합니다.
   6. ¹²⁹Xe 기계 환기를 시작합니다. ¹²⁹Xe 인공호흡이 활성화될 때마다, 폐의 기능적 잔류 능력을 넘겨주기 위해 스캔을 시작하기 전에 동물이 ~5번의 호흡을 완료하도록 합니다.
      알림: 과분극 가스를 보존하기 위해 ¹²⁹개의 Xe 스캔 사이에 N₂/O₂ 혼합물로 전환하십시오.
   7. 단일 펄스를 사용하여 기체 ¹²⁹Xe(7T에서 ~83.07MHz)의 생체 내 공진 주파수와 일치하도록 작동 주파수를 조정합니다. 주파수를 모든 후속 기체 위상 ¹²⁹Xe 스캔에 복사합니다. ¹²⁹Xe 국소화를 수행하여 폐가 등중심에 있는지 확인합니다.
   8. ¹²⁹Xe 방사형 환기 시퀀스를 로드하고 실행합니다. 최대 흡기 압력을 모니터링합니다.
      참고: 프로토콜이 완료되기 전에 ¹²⁹Xe 가스가 소진되면 최대 흡기 압력이 급격히 감소합니다. ¹²⁹Xe 400mL 백은 이상적인 체중의 10mL/kg의 일회 호흡량으로 분당 80회 호흡으로 70% ¹²⁹Xe로 인공호흡 시 30g 마우스를 ~24분 동안 인공호흡할 수 있습니다.
   9. 스캔이 완료되면 N₂/O₂ 혼합물로 인공호흡으로 전환하고 ¹²⁹Xe의 빈 백을 제거합니다.
   10. 호기 종료 시 이미징의 경우 표 2 에 따라 호흡 참기 지속 시간과 트리거 지연을 변경하고 2.4.2 - 2.4.9 단계를 반복합니다.
   11. 스캐너에서 원시 데이터를 내보냅니다.

프로토콜 약식 이름	시퀀스 설명	방아쇠	TR (밀리초)	테네시(밀리초)	반복	플립 각도 (°)	행렬 크기 또는 Npts	시야각(mm2)	RF BW (kHz)	슬라이스 / 슬래브 두께 (mm)	검사 기간
단일 펄스	펄스 획득(기체 상태)	선택적	1000		1	60	2048		10		1들
동물 로컬라이저	2D 그레	예	50	1.7	1	60	재질 보기 642	재질 보기 322	3	25	60 초
방사형 환기	3D 멀티 에코 방사형	예	20	캡션 보기	1	30	재질 보기 613	223	32.05	30	16분
용존 위상 단일 펄스	펄스 획득(용존 위상)	아니요	80		1	90	512		10.35		80 밀리세컨드
용존 위상 동적 사양	펄스 획득(용존 위상)	아니요	50		1000	90	512		10.5		50 초
확산 가중	2D 그레	예	12.2	8.1	4	45	재질 보기 642	재질 보기 322	3	1.5	18 분

표 4: In vivo 염기서열 매개변수. 앞서 설명한 3D 다중 에코 방사형 환기 시퀀스³⁹ 는 6 에코 시간에서 이미지를 획득합니다. 첫 번째 에코 이미지(TE = 1.12ms, 그림 7)에 대한 결과가 표시됩니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 4: 제논 편광 QA 체크리스트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

5. 데이터 수집: 동적 용존 위상 분광법을 실행합니다.
   1. 숨을 참는 동안 영상을 위해 표 2 에 따라 인공호흡기를 설정합니다. BR을 100호흡/분으로 설정합니다. 2.4.2 - 2.4.5 단계와 같이 ¹²⁹Xe가 든 새 가방을 준비합니다.
   2. ¹²⁹Xe 기계 환기를 시작합니다. 단일 펄스를 로드하고 실행하여 용존 주파수(7T에서 ~83.084MHz)와 일치하도록 작동 주파수를 조정합니다. 작동 주파수를 용존 위상 동적 분광법(dissolved phase dynamic spectroscopy)에 복사합니다.
      참고: 이것은 야생형 헤모글로빈⁵⁴를 가진 마우스에서 단일 피크가 될 것입니다.
   3. 동물 폐의 용존 주파수를 중심으로 dynamic spectroscopy sequence를 불러오고 실행합니다. 스캔이 완료되면 N₂/O₂ 혼합물로 인공호흡으로 전환하고 ¹²⁹Xe의 빈 백을 제거합니다. 스캐너에서 원시 데이터를 내보냅니다.
6. 데이터 수집: 확산 중점 이미지를 수집합니다.
   1. 숨을 참는 동안 영상을 위해 표 2 에 따라 인공호흡기를 설정합니다. 2.4.2 - 2.4.7 단계와 같이 ¹²⁹Xe가 든 새 가방을 준비합니다.
   2. diffusion-weighted sequence를 불러오고 실행합니다. 스캔이 완료되면 N₂/O₂ 혼합물로 인공호흡으로 전환하고 ¹²⁹Xe의 빈 백을 제거합니다. 스캐너에서 원시 데이터를 내보냅니다.

3. 실험 결론

1. 동물을 복구하세요.
   1. 삽관 캐뉼라를 동물의 입에서 똑바로 잡아당깁니다. 동물이 즉시 자발적으로 호흡을 시작하지 않으면 가벼운 흉부 압박을 시행하십시오. 가능한 경우 진정제 회복을 돕기 위해 동물의 얼굴 근처에 의료용 산소를 가볍게 투여합니다.
   2. 동물이 스스로 호흡을 꾸준히 하고 >2시간 동안 진정제를 투여한 경우 탈수를 방지하기 위해 0.5 - 1mL의 생리식염수를 피하로 투여합니다.
   3. 동물을 혼자 우리로 되돌려 보냅니다. 케이지를 인큐베이터 또는 가열 패드 위에 놓습니다.
      참고: 진정제를 투여한 동물은 식인 풍습에 취약하며 완전히 회복될 때까지(즉, 독립적으로 걸을 때까지) 케이지 메이트와 함께 케이지에 넣을 수 없습니다. 진정제를 투여받은 동물은 체온을 조절할 수 없습니다. 손등을 사용하여 몇 분마다 동물의 온도를 느껴보십시오.
   4. 동물의 오른쪽 반사 신경이 돌아올 때까지(즉, 누운 자세에서 엎드린 자세로 독립적으로 뒤집을 수 있음) 동물을 면밀히 관찰합니다.
   5. 동물이 독립적으로 걸을 수 있게 되면 열 지지대에서 동물을 제거하십시오. 동물을 우리 동료가 있는 우리로 되돌립니다.
      참고: 동물에게 케이지 짝이 없으면 진정제로 인한 저체온증에 더 취약합니다. 동물에게 여분의 침구를 제공하고, 가능한 경우 동물을 인큐베이터에 하룻밤 동안 두십시오.
   6. 동물의 건강을 모니터링하기 위해 2주 동안 일주일에 한 번 동물의 체중을 기록합니다.
      참고: 삽관으로 인해 동물이 입이나 식도에 부상을 입으면 먹는 것을 멈출 수 있습니다. 동물이 초기 체중의 >20%를 감량하면 안락사에 대해 수의사와 상담하십시오.
2. 환기 이미지를 분석합니다(그림 7).
   1. 원시 데이터를 프로그래밍 플랫폼에 로드합니다. non-Cartesian Images⁹¹에 대한 오픈 소스 재구성 프레임워크를 다운로드합니다.
   2. 오픈 소스 프레임워크 지침에 따라 이미지를 재구성합니다. 각 방사형 투영법의 첫 번째 점을 정규화합니다³⁹.
   3. ¹²⁹Xe 신호가 낮거나 없는 복셀을 포함하여 이미지에서 폐 실질을 분할합니다. 넓은 기도를 포함하지 마십시오. 영상에서 폐, 기도 및 이미징 아티팩트를 제외한 배경 잡음을 세그먼트화합니다.
      참고: 양성자 로컬라이저 이미지는 실질 경계를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.
   4. 다음 공식을 사용하여 SNR 을 계산합니다.
      (3)
   5. 결함이 있는 인공호흡을 정량화합니다.
      참고: 소동물 모델에서 환기 장애를 정량화하기 위해 다양한 방법이 제안되었습니다. 분석 방법은 여전히 탐구의 여지가 있지만, 쉽게 구현될 수 있는 접근법은 다음과 같습니다: (i) 반정량적 수동 세분화⁹², (ii) 실질 신호⁴⁷을 정규화하기 위해 기관의 신호를 사용하는 히스토그램 접근법, (iii) 총 폐 용적(TLV)을 분할하고 신호 임계값(예: <전체 폐 평균의 60%)을 정의하여 폐를 결함 있는 폐 용적과 환기 폐 용적(VV)으로 나누는 것입니다. VDP ^93,94는 다음에 따라 정량화합니다.
      (4)
3. 용존 위상 동적 분광법을 분석합니다(그림 8).
   1. 원시 데이터를 프로그래밍 플랫폼에 로드합니다. 고속 푸리에 변환을 수행하고 스펙트럼을 위상화합니다(이 응용 사례에는 스펙트럼의 동시 수동, 0차 위상화로 충분합니다).
   2. 표준 핵 자기 공명(NMR) 데이터^{계산 95,96}: SNR, 전체 너비 절반 최대, 통합 면적, 화학적 이동 및 두 피크의 위상.
   3. 크기 데이터에서 각 반복에 대한 가스 스펙트럼의 신호 진폭을 가스 스펙트럼의 신호 진폭으로 나누어 시간 경과에 따른 용존 대 기체 비율을 구합니다.
4. 확산 가중 이미지를 분석합니다(그림 9).
   1. 원시 데이터를 프로그래밍 플랫폼에 로드합니다. 3.2.3단계에서와 같이_b0 이미지의 폐 실질을 분할합니다. 각 b-값 이미지에 대한 SNR을 계산합니다.
   2. _b0 영상의 각 복셀에 있는 신호를 영상 잡음의 표준편차로 나누어 신호값 대 잡음비 SVNR₀을 계산합니다. SVNR이₀ < 이미지 노이즈⁹⁷의 2.5배인 복셀을 제외합니다.
      참고: SVNR₀ 은 개별 복셀 메트릭이고 실질 SNR은 전체 폐 메트릭입니다.
   3. 방정식 5^98,99에 따라 b-값(_b-i)에 대한 신호 감쇠를 피팅하여 ADC를 계산합니다.
      (5)

결과

환기 이미지

동물 준비 및 인공호흡 절차가 적절하게 구현되면 3D 방사형 이미징은 영감 또는 호기 시 데이터 수집이 수행될 때 인공호흡 패턴을 성공적으로 캡처할 수 있습니다(그림 7). 이러한 이미지는 여러 번의 호흡에 걸쳐 수집되지만 여기에 설명된 방법은 인간에게 사용되는 단일 호흡 이미징 방법과 유사합니다. 이는 k-공간의 모든 선이 호흡 주기 중 특정 시간(예: 모두 말단 흡기시)에 수집되어 단일 흡입을 대표하는 이미지를 누적적으로 생성하기 때문입니다. 이 이미지에서는 주요 기도(기관 및 기관지)가 명확하게 보이고, 뚜렷한 이미지 아티팩트가 없으며, 폐 실질이 높은 SNR(초기 편광에 따라 ~15 이상)로 완전히 팽창된 것처럼 보입니다. 직관적이지 않지만, 흡기 시 획득한 이미지(그림 7A, SNR = 15)는 만료 시 획득한 이미지(그림 7B, SNR = 27)보다 낮은 SNR을 나타냅니다. 이것은 이 마우스를 환기시킬 때 사용되는 적당한 구동 압력과 느린 흐름과 관련이 있습니다. 영감 이미지의 경우, HP 가스가 아직 폐의 실질로 완전히 씻겨 들어가지 않았기 때문에 ¹²⁹Xe(따라서 신호)가 더 큰 기도에 집중되었습니다. 이 효과는 높은 기도 신호가 데이터의 동적 범위를 지배하기 때문에 이미지 재구성 중 k-space scaling에 의해 시각적으로 악화됩니다. 그럼에도 불구하고, 실질이 큰 기도가 생략되도록 분할된 경우 분석은 간단해야 합니다.

그림 7: 이전에 발표된 방법을 사용하여 획득한 성인 C57BL/6J 마우스의 대표적인 3D 방사형 환기 이미지³⁹. 두 이미지 모두 상대적으로 높은 SNR을 가지고 있지만, (A) 흡기류의 이미지는 (B) 호기까지의 이미지보다 SNR이 낮은데, 이는 ¹²⁹Xe 가스가 아직 폐로 씻겨 들어갈 시간이 없었기 때문입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

병리학적으로 폐쇄된 인공호흡과 낮은 SNR의 다른 원인을 구별하는 것이 중요합니다. 그림 7A에서는 동물이 건강한 야생형 마우스였기 때문에 환기 방해(즉, 낮은 VDP)가 예상되지 않습니다. 환기가 막히면 결함은 일반적으로 ¹²⁹Xe 신호가 낮거나 전혀 없는 영역으로 나타납니다. 낮은 신호의 비병리학적 원인은 일반적으로 다음과 같습니다.

(i) 낮은 ¹²⁹Xe 분극: 이것은 수반되는 인공물 없이 폐 실질과 기도에서 낮은 SNR을 유발합니다. 낮은 분극은 일반적으로 분극 절차를 잘못 따르거나, 운송 중 분극 제거, HP ¹²⁹Xe 전달 튜브의 과도한 O₂ 가스 함량(예: 잘못 보정된 인공호흡기)에 기인할 수 있습니다. 

(ii) 삽관 캐뉼라가 너무 깊숙이 삽입됨: 기관에 너무 깊게 삽입하면 캐뉼라가 왼쪽 또는 오른쪽 기관지 아래로 편향될 수 있습니다. 충분히 단단히 박혀 있다면, 전체 폐의 일회 호흡량은 단지 몇 개의 엽과 기도에만 국한될 수 있고 폐의 나머지 부분은 아무 것도 받지 못할 수 있습니다. 이 경우 과도하게 팽창된 엽이 손상될 수 있으며 동물을 안락사해야 할 수도 있습니다. 또는 캐뉼라의 끝이 조직과 직접 접촉할 수 있습니다. 이 경우, ¹²⁹Xe는 주로 캐뉼라 내부에 국한되어 눈에 띄게 직선 튜브에서 밝은 신호를 보내고 실질 내에서 최소한의 신호를 생성합니다. 이 경우 캐뉼라 위치를 즉시 수정해야 하며 동물에게 고통의 징후(예: 인공호흡기에 비해 비정상적이거나 부재 또는 비동시적인 흉부 움직임)가 있는지 모니터링해야 합니다.

(iii) 너무 얕게 배치된 삽관 캐뉼라: 가스 덩어리가 구인두에 너무 얕게 전달되면 폐로 유입되는 덩어리에 대한 저항이 캐뉼라 외부와 입 밖으로 흐르는 덩어리에 대한 저항보다 강할 수 있습니다. 이로 인해 폐 팽창이 저하될 수 있습니다. 기관 SNR은 높을 수 있지만 실질 SNR은 낮을 수 있습니다. 모션 아티팩트는 데이터 수집 중에 기관을 따라 흐르는 가스로 인해 존재할 수 있습니다. 아티팩트의 특성은 시퀀스 유형(GRE, 방사형 등)에 따라 달라집니다.

(iv) 잘못된 획득 타이밍: 흡기 또는 호기 가스 흐름 기간 동안 RF 펄스 및 데이터 수집이 발생한 경우 일반적으로 심각한 모션 아티팩트가 존재하며(특히 데카르트 시퀀스를 사용할 때) 실질 SNR이 낮습니다.

(v) 자발적 호흡: 데이터 수집 중에 동물이 충분히 진정되지 않으면 자발적 호흡 운동이 기계적 환기 패턴 위에 비동기적으로 중첩됩니다. 이로 인해 다양한 호흡 대 호흡 ¹²⁹Xe 전달, 중등도에서 중증의 운동 아티팩트 및 불량한 실질 SNR이 발생합니다. 진정제 투여량과 시기를 주의 깊게 추적하는 것이 중요합니다.

(vi) 동물의 죽음: 드문 경우지만 마우스가 죽을 수 있습니다(예: 잘못된 캐뉼러 위치, 불충분한 O₂ 전달, 진정제 과다 복용 또는 심각한 실험적 병리로 인해). 이런 일이 발생하면 폐 조직이 빠르게 뻣뻣해지고 폐 실질이 제대로 팽창하지 않습니다. 상부 기관은 밝게 유지될 수 있지만 폐 실질은 신호가 매우 낮습니다.

가스 교환 분광법

인간 피험자에서 분광학에서 파생된 매개변수(예: 신호 강도, 스펙트럼 폭, 화학적 이동 및 위상)는 심폐 역학 및 질병 상태에 대한 통찰력을 제공합니다^52,53. 인간⁸⁶, 개¹⁰⁰ 및 쥐^20,101와 달리, ¹²⁹Xe 자화가 폐 실질에 국한되었을 때 얻은 마우스의 전체 폐 스펙트럼은 모세관 막 조직, 혈장 및 적혈구⁵⁴에 용해된 ¹²⁹Xe에 해당하는 단일하고 넓은 용존 위상 공명을 나타냅니다(그림 8A, 197ppm). 혈류를 통해 더 많은 원위 조직으로 운반될 때, ¹²⁹Xe는 지방 조직⁵⁴, 근육, 회백질 및 백질^102,103을 포함한 다양한 조직으로부터 뚜렷한 공명 주파수를 생성한다. 그러나 상대적으로 긴 통과 시간(몇 초)과 적당한 용해도¹⁰⁴(오스트발트 용해도 = 0.1 - 0.3)로 인해 이러한 신호는 일반적으로 약하고 신중한 전용 실험 중에만 관찰됩니다. 예외는 지방 조직에 용해된 ¹²⁹Xe입니다(그림 8A, 189ppm). 이러한 조직으로부터 ¹²⁹Xe 신호가 몇 초 내에 나타날 수 있다(예: 동물 설정 중 처음 몇 번의 호흡 동안). 더욱이, ¹²⁹Xe의 오스트발트 용해도는 혈장에서보다 지방 조직에서 거의 20배 더 크기 때문에(즉, 37°C¹⁰⁴에서 각각 1.7 대 0.094) 신호 강도가 높을 수 있습니다. 종방향 이완 시간도 비교적 길어질 것으로 예상됩니다(생체 내 _T1은 지질¹⁰⁵에서 ~20초 대 혈액¹⁰⁶에서 3-8초). 그 결과, 지방 조직의 ¹²⁹Xe 신호는 다른 조직에 비해 상대적으로 높을 수 있습니다.

신호 역학이 다르기 때문에 ¹²⁹Xe 분광법 실험은 올바른 획득 매개변수를 선택하여 지방 조직(예: 갈색 지방 조직 체온 측정¹⁰⁷을 표적으로 함) 또는 폐의 가스 흡수를 조사하도록 조정할 수 있습니다. 표 4에 설명된 설정(즉, TR = 50ms 및 용존 위상 피크를 중심으로 한 90° 플립 각도)으로 폐에서 ¹²⁹Xe 스펙트럼을 획득하면 기체 위상 및 용존 위상 피크가 모두 관찰됩니다(그림 8A, B). 특히, 마우스 폐의 가스 부피는 조직 부피보다 2-3배 높으며 이 조직에서 ¹²⁹Xe의 용해도는 ~104,108,109,110,111^에 불과합니다. 그럼에도 불구하고, 용존 신호의 진폭은 기체 위상의 진폭을 약 2배 초과하는데, 이는 기체 위상 여기가 공진에서 멀리 떨어져 있기 때문입니다(7T에서 ~15kHz; 그림 8B, SNR = 102 대 43). 그러므로, 기체 상태에서 20-30배 더 큰 자화 풀은 호흡 주기의 정적 부분 동안 용해 위상 신호에 대한 안정된(즉, 고갈되지 않은) 저장소로 근사화될 수 있습니다.

~600ms마다 새로운 자화 호흡과 50ms의 TR로 기체 상태와 용존 위상 ¹²⁹Xe의 신호 강도가 진동합니다. 가스 신호의 경우, 이는 총 가스 부피의 변화(즉, 흡기 시 높고 호기 시 낮음)에 기인합니다. 소스 가스 자화,_T2* 및 모세관 혈액량이 팽창 상태에 따라 변동할 수 있기 때문에 용존 신호의 경우 상황이 더 복잡합니다. 결과적으로, 용존 대 기체 신호 진폭 비율도 호흡 주기에 따라 진동합니다(그림 8C, 평균 용존:기체 비율 = 1.9 ± 0.39).

그림 8: 성인 C57BL/6J 마우스의 대표적인 동적 분광법. (A) 단일 펄스 스펙트럼은 기체 상태의 ¹²⁹Xe에서 시작하여 지방 조직(189ppm)에 용해되고 모세 세포막과 혈액 조직 모두에 용해(197ppm)되는 신호를 보여줍니다. (B) 용존 및 기체 ¹²⁹Xe의 시변 신호 강도를 보여주는 동적 분광법(반복 시간 = 50ms). 시각화를 돕기 위해 5개의 스펙트럼만 표시됩니다. 시간 축의 대각선은 배율 구분선을 나타냅니다. (C) 2초 간격에 걸친 용존 대 기체 신호 진폭의 비율(패널 B의 적색 눈금 차단에 해당)은 호흡 주기(호흡당 0.6초)에 따른 명확한 변화를 보여줍니다). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

다음은 ¹²⁹Xe 가스 교환 분광법 결과를 손상시킬 수 있는 요인 목록입니다. 각각의 경우에서 가능한 결과는 낮은 SNR이며, 이로 인해 스펙트럼 피팅 및 결과 메트릭(예: 용존 대 기체 신호 진폭 비율, 화학적 이동, 스펙트럼 폭 및 위상)이 부정확해질 수 있습니다.

(i) 잘못된 작동 주파수: 가스 부피가 현저히 높고 조직 용해도가 낮기 때문에 가스 위상 주파수를 중심으로 하는 RF 펄스는 용존 위상 신호를 생성하지 않습니다. RF 펄스는 용존 위상 주파수 또는 그 근처의 중심에 있어야 합니다.

(ii) 대역폭이 너무 넓음: 여기 대역폭은 용존 대 기체 신호 진폭의 비율을 측정하기 위해 일부 기체 위상 ¹²⁹Xe가 여기될 수 있을 만큼 충분히 넓어야 합니다. 그러나 대역폭이 너무 넓으면 여기 펄스가 조직에 용해되기 전에 기체 상태의 자화를 파괴합니다. 이것은 펄스가 용존 위상 주파수에 중심을 두고 있음에도 불구하고 매우 높은 가스 신호와 낮거나 전혀 용존 위상 신호로 볼 수 있습니다.

(iii) 최적화되지 않은 TR: 호흡에 대한 신호 역학을 조사하기 위해 Nyquist-Shannon 샘플링 정리는 신호를 최소 주파수의 두 배로 샘플링해야 합니다(여기서 분당 100번의 호흡은 50ms마다 또는 호흡당 ~12번 샘플링되었습니다). 실험 조건에 따라 더 빠른 샘플링 속도에서 심폐 신호 역학에 대한 추가 조사가 가능합니다. 이러한 실험의 결과는 여기 대역폭, 호흡 속도 및 심박수를 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 크세논 교환 시간(즉, 크세논이 조직으로 용해되는 시간, ~56ms⁵⁴)과 폐 통과 시간(즉, 우심실에서 좌심실로 혈액이 흐르는 시간, ~436회/분¹¹²의 심박수에 대해 ~830ms)도 고려해야 합니다. 너무 자주 샘플링하면 자화가 조기에 파괴되고 신호가 낮아지지만 혈류의 영향도 줄어듭니다. 샘플링 빈도를 줄이면 자화가 더 많이 용해되고 더 많은 신호를 생성할 수 있지만 혈류에 더 의존하게 되고 폐포의 가스 교환 영역에 덜 국한됩니다.

확산 가중 이미지

폐포-공역 크기를 정량화하는 데 사용되는 확산 가중 이미지는 전통적인 조직형태 측정 방법을 통해 소동물 모델에서 엄격하게 검증되었습니다 ^98,113,114. 여기에서는 이전에 검증된 프로토콜⁹⁸과 일치시키면서 스캔 시간과 가스 사용을 최소화하기 위해 2D 슬라이스 선택적 이미징으로 논의를 제한했습니다. ADC를 계산하려면 최소 2개의 b-value 이미지만 있으면 충분하며, 고급 형태측정 계산(예: 평균 선형 절편)에는 4개 이상의 b-value 이미지가 필요합니다. 여러 b-value 이미지를 획득하면 계산의 정확성을 향상시켜 상당한 이점을 얻을 수 있습니다. 한 번의 숨을 참는 동안 사람을 촬영하는 것과 달리, 여러 번의 호흡에 걸친 전임상 영상은 지속적으로 보충된 신호를 제공합니다. 이 때문에 사용 가능한 HP 가스의 양과 동물 진정 시간에 의해서만 제한되는 많은 높은 SNR b-value 이미지를 획득할 수 있습니다. 여기에서는 18분의 스캔 시간 동안 400mL의 ¹²⁹Xe 가스를 사용하여 각각 SNR >15인 7개의 b-value 이미지를 획득했습니다(그림 9). 각 영상의 신호는 확산 구배 강도(b-value)가 증가함에 따라 감소합니다. 이 신호 감소는 폐 내 ¹²⁹Xe의 ADC에 비례합니다. 큰 기도는 b₀ 및 b₆ 이미지를 비교하여 acinar 조직과 구별할 수 있습니다. 해부학적으로 기도를 포함할 가능성이 있는 영역에서는 픽셀이 b₀ 이미지에서는 매우 밝게 나타나지만 b₆ 이미지에서는 어둡게 나타납니다(빨간색 화살표, 그림 9). 이러한 픽셀은 폐 실질(lung parenchyma) 분석에서 제외되어야 합니다.

그림 9: 성인 C57BL/6J 마우스의 대표적인 확산 가중 이미지. ¹²⁹Xe가 산소로 희석된 상태에서 자유롭게 확산되는 큰 기도(빨간색 화살표)는 폐 실질에 비해 증가된 신호 감쇠를 나타냅니다. 그 결과 b₀ 이미지에서는 밝은 기도가 나타나고 b₆ 이미지에서는 낮은 신호 기도가 나타납니다. 생쥐와 쥐는 인간에 비해 ADC 값이 비슷하게 작지만 값은 나이, 일회식, 압력 및 확산 매개변수와 같은 생물학적 및 실험적 요인에 따라 달라집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이 건강한 성체 야생형 마우스의 ADC는 문헌, 연령, SNR, 획득 매개변수 등을 기반으로 예상되는 결과를 따릅니다. ADC 결과의 정밀도와 정확도에 해로운 영향을 미칠 수 있는 요인은 다음과 같습니다.

(i) 낮은 SNR: 중요한 것은 이미지의 낮은 SNR이 ADC 계산을 더 낮은 값^99,115로 편향시킨다는 것입니다. 이러한 이유로 SVNR이₀ < 이미지 노이즈⁹⁷의 2.5배인 복셀을 제외합니다.

(ii) 부적절한 세분화: 잘못된 세분화(예: 품질 관리를 위한 육안 검사 없이 신호 임계값 사용)는 결과를 왜곡할 수 있습니다. 이미지에 아티팩트(예: 동작으로 인한 아티팩트)가 포함된 경우 임계값을 초과하여 실질로 잘못 분류될 수 있습니다. 또한, 큰 기도 근처의 픽셀을 제외하는 것이 특히 중요한데, 부분적인 부피 효과로 인해 ADC가 더 높은 값으로 편향될 수 있기 때문입니다.

(iii) 잘못 보정된 인공호흡기: 일반적으로 ¹²⁹Xe를 더 가벼운 가스(예:_O2 또는_N2)로 희석하면 ADC가 더 높은 값으로 이동할 수 있으므로 정량적 비교를 위해 알려진 가스 혼합물을 사용한 환기가 필요합니다. ¹²⁹Xe/O₂ 혼합물로 환기하는 경우, 분만 전에 산소 농도를 높이면_T1 이완이 증가하고 기체 전달 튜브의 ¹²⁹Xe 자화가 감소하여 SNR이 감소합니다.

(iv) 폐 탈동원(lung derecruitment): 마취 및 기계적으로 인공호흡을 한 동물에서는 시간이 지남에 따라 폐포 허탈(무기폐)이 발생할 수 있습니다. 일정한 체적 환기 중에 이것이 발생하면 동일한 일회 호흡량이 필연적으로 모집된 상태로 남아 있는 폐포로 재분배됩니다. 중등도에서 중증의 무기폐가 진행됨에 따라 폐의 나머지 부분이 과도하게 팽창하여 해당 부위에 손상이 발생하고 ADC가 증가할 수 있습니다. 정기적인 모집 동작과 PEEP는 폐포 허탈을 예방하고, 폐 순응도 감소를 방지하며, ADC 결과를 왜곡할 수 있는 폐 손상의 위험을 최소화합니다.

(v) 잘못된 데이터 피팅: ADC 추정 방법을 고려해야 합니다. 로그 선형 피팅은 계산 효율이 가장 높지만 낮은 SNR 영상에서 편향이 발생합니다. 따라서 높은 SNR 이미지(>20)에 가장 잘 적용됩니다. 가중 선형 방법은 이러한 편향을 줄이며 SNR > 15인 이미지에 적합합니다. 베이지안 추정은 SNR <10에서도 불확실성이 낮은 ADC의 추정치를 산출할 수 있지만 계산 비용이 많이 듭니다⁹⁹.

(vi) 차선의 확산 시간: 최적 확산 시간은 MRI 스캐너의 최대 기울기 강도와 마우스의 acinar 기도 반경(반경 ~100μm⁴⁹)의 영향을 받으며, 이는 인간보다 약 3배 작습니다. 최적의 조건을 보장하기 위해 확산 시간은 평균 폐포 반경보다 크지만 폐포관의 평균 길이보다 작은 확산 길이를 달성하도록 설정됩니다. 부위별 최대 구배 강도에 대한 최적 확산 시간은 Sukstanskii 및 Yablonskiy⁴⁹에 의해 요약된 방법을 사용하여 결정할 수 있습니다. 차선의 확산 시간을 사용하면 ¹²⁹Xe ADC에서 비선형 감소가 발생하여 결과 해석이 복잡해질 수 있습니다.

(vii) 차선의 b-값: SNR을 최대화하는 것과 b-값 이미지에서 생성된 CNR(contrast-to-noise ratio)을 최대화하는 것 사이에는 상충 관계가 있습니다. 낮은 b-값만 사용하여 CNR을 희생하는 경우(즉, 그림 9에서 처음 3개의 b-값 이미지만 획득하는 것처럼 확산 신호 감쇠), 잘못된 피팅으로 인해 ADC 추정이 부정확해집니다. 확산 가중치가 너무 강하면 결과 SNR이 불충분하고 ADC가 더 낮은 값으로 편향됩니다.

토론

과분극 ¹²⁹Xe MRI는 소동물 모델에서 폐의 미세 구조와 기능을 연구하기 위한 정교하고 강력한 기술로 부상하고 있습니다. 이 프로토콜은 초기 현장 준비를 안내하고 HP ¹²⁹Xe를 사용한 마우스 폐의 환기, 확산 및 가스 교환을 정량화하는 데 필요한 실험 절차를 설명하기 위한 것입니다. 실험을 위한 주요 전제 조건에는 ¹²⁹Xe 가스 팬텀을 설정하고 높은 가스 분극이 동물에게 전달되도록 하는 것이 포함됩니다. 후자는 편광 매개변수의 신중한 계획, 가스 운송 중 편광 손실 완화(예: 자기 운반 케이스 구축), 전임상 MRI 자석^116,125의 프린지 필드 내에서 T₁ 이완을 특성화(및 이상적으로는 방지)가 필요합니다. 필요한 HP ¹²⁹Xe 인프라를 개발하는 것과 병행하여 강력한 동물 취급 프로토콜 및 절차를 수립하는 것이 필수적입니다. 여기에는 강력한 기계적 환기를 가능하게 하는 효과적인 진정제, 종단 연구를 가능하게 하는 무해한 삽관, 높은 ¹²⁹Xe 자화와 안전하고 생리학적으로 관련된 환기 조건의 균형을 맞추는 환기 전략이 포함됩니다.

여기에 설명된 방법, 절차 및 결과는 사용된 특정 하드웨어(예: 인공호흡기, 편광판 및 MRI 스캐너 유형)에 따라 어느 정도 달라집니다. 대체 장비를 사용할 수 있는 경우 실험 기술을 비교적 쉽게 수정할 수 있습니다. 또한, 일일 품질 보증 절차를 최적화할 수 있습니다(단계 1.2, 그림 4 및 표 1). ~30분의 QA 동안 꼼꼼한 기록 보관은 새로운 사이트를 구축하는 동안 매우 중요합니다. 이를 통해 하드웨어 문제를 조기에 감지하고 문제 해결 중에 이를 배제할 수 있습니다. QA 메트릭의 일일 변동이 잘 특성화되면 플립 각도 보정 및 ~21분 QA 스캔을 효율성을 위해 축소할 수 있습니다. 또한, 일반적인 접근법은 마취 투여량, 인공호흡기 설정 및 획득 매개변수를 조정하여 다른 일반적인 작은 동물 종(예: 쥐 및 토끼)으로 확장할 수 있습니다. 기본 프로토콜은 호흡수, 부피 및 PEEP 수치가 가스 교환 또는 폐포 동원에 미치는 영향과 같은 인공호흡기 의존적 생리학을 탐구하는 데 사용할 수 있습니다. 종단 데이터가 필요하지 않거나 종단 연구가 완료된 경우, 삽관 캐뉼러를 통해 기관지 폐포 세척 또는 신속한 폐 고정 및 수확이 가능하며 기존 분석(예: 조직학 또는 형태 측정 측정)을 수행할 수 있습니다. 더욱이, 이 프로토콜의 수정 가능성은 MRI 염기서열 및 매개변수에까지 확장되어 ¹²⁹Xe MRI 연구의 역동적인 측면을 나타냅니다.

캐뉼라 배치는 동물의 안전과 이미지 품질에 매우 중요합니다. 삽관 캐뉼러는 예를 들어 기관 주위를 봉합하여 단단히 고정되어 있지 않기 때문에 상대적으로 작은 변위(예: 생리학적 모니터링 장비를 연결할 때의 움직임)로 인해 기관과의 밀폐 밀봉이 깨질 수 있습니다. 이 기밀 밀봉은 폐 순응도를 유지하고 무기폐를 예방하는 데 중요한 모집 동작(~35cm H₂O 최대 흡기압)에 필요합니다. 모집 기동이 목표 압력에 도달하지 못하는 경우 조사자는 연구 목표의 맥락에서 교정 전략을 평가해야 합니다(예: 확산 가중 이미징 대 환기 이미징, 단일 시점 대 종단). 완화 전략에는 1) 캐뉼라 제거 및 재삽관, 2) 캐뉼라 위치를 조정하여 삽입된 상태에서 기관 벽과의 접촉을 증가시키고, 3) 기밀 밀봉을 얻지 않고 실험을 진행하는 것이 포함될 수 있습니다. 데이터 충실도의 관점에서 재삽관은 가장 강력한 옵션이지만 시간이 많이 걸리고 원치 않는 ¹²⁹Xe 자화 감쇠로 이어질 수 있습니다. 캐뉼라 위치를 조정하는 것이 더 빠르지만 부상의 위험이 더 크므로 신중하게 수행해야 합니다. RM 없이 실험을 계속하는 것은 폐 역학의 무기폐 유발 변화를 피하기 위해 마우스가 <20분 동안 인공호흡을 할 때 가장 잘 사용됩니다¹¹⁷.

동물을 안전하게 다루어야 한다는 명백한 필요성 외에도, 견고하고 신뢰할 수 있는 HP ¹²⁹Xe 마우스 MRI 프로그램을 개발하고 문제를 해결하기 위한 핵심은 꼼꼼한 기록 보관입니다. HP ¹²⁹Xe 생산의 경우 레이저 출력, 축적 시간, 유속 및 편광을 추적하는 것이 좋습니다. 팬텀 이미징 및 분광학 중에는 이미지 SNR, 피크 위치, 스펙트럼 선폭 및 90° 펄스를 얻는 데 필요한 RF 전력을 기록하는 것이 가장 좋습니다. 생체 내 이미징의 경우 생리학적 모니터링 매개변수(최대 흡기압, 체온 등) 및 동물 취급 이벤트에 대한 자세한 타임라인과 함께 유사한 QA 데이터를 기록해야 합니다. 몇 가지 주요 장비를 사용하면 인공호흡기 문제를 더 쉽게 해결할 수 있습니다. 여기에는 O₂ 센서, 작은 동물 폐활량계, 환기 및 PEEP 압력을 보정하는 압력계가 포함됩니다. 오실로스코프와 전압계는 인공호흡기 타이밍이 정확하고 MRI 스캐너 게이팅과 일치하는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로, 휴대용 가우스미터는 운송에 필요한 경우 마그네틱 휴대용 케이스의 무결성을 확인하는 데 필수적입니다. MRI 시퀀스 문제 해결과 관련하여 이 프로토콜에 설명된 가스 팬텀과 HP 가스로 채워진 주사기를 모두 사용하는 것이 좋습니다. HP ¹²⁹Xe 가스가 포함된 주사기를 사용하면 알려진 실측 자료(주사기 내 순수 ¹²⁹Xe의 자유 확산 계수)를 반영하는지 여부에 따라 데이터의 정확도를 평가할 수 있기 때문에 확산 가중 시퀀스 문제 해결에 특히 유용합니다.

이 프로토콜을 적용할 때 몇 가지 제한 사항을 인정해야 합니다. 첫째, 특수 장비와 전문 지식에 의존하므로 새로운 사이트에 대한 접근성이 떨어집니다. 그러나 최근 미국에서 임상사용에 대한 규제 승인으로 ¹²⁹Xe MRI 기능을 갖춘 사이트의 수가 증가할 것으로 예상됩니다. 이 기술은 또한 상대적으로 짧은 편광 수명과 신속한 데이터 수집의 필요성을 포함하여 과분극 가스의 고유한 한계에 의해 제한됩니다. 기계식 인공호흡기를 사용하면 일반적으로 이미지 SNR이 향상되고 본질적으로 모션 아티팩트를 피할 수 있지만, 자유 호흡 가스 전달 장치를 사용하여 캡처할 수 있는 자연스러운 호흡 역학을 가려줍니다. 또한, 이 프로토콜을 사용하는 소동물 모델의 결과는 상당한 종 다양성을 감안할 때 인간 생리학으로 외삽할 때 신중하게 해석해야 합니다. 또 다른 한계는 구강 삽관 및 기계 환기의 까다로운 특성으로, 체중이 25g 미만인 마우스에서는 어렵습니다. 이것은 전용 장비 및 절차를 사용하지 않는 한 ~8주 미만의 남성과 ~20주 미만의 여성을 제외할 수 있습니다. 이 프로토콜의 가장 두드러진 한계는 펄스 프로그래밍 및 고급 이미지 재구성 기술이 없다는 것입니다. 일반화된 프로토콜에 이러한 방법을 포함하는 것은 복잡한 기술 세부 사항과 전문 지식으로 인해 실용적이지 않습니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 SNR, VDP 및 ADC와 같은 기본적인 정량적 지표를 설명하지만 국소 분획 환기, 확산 형태 측정 및 가스 교환 이미징과 같은 고급 측정은 설명하지 않습니다. 이러한 고급 메트릭은 여기에 설명된 기본 인프라가 설정되면 더 쉽게 구현될 수 있습니다.

작은 동물을 대상으로 한 HP ¹²⁹Xe 가스 MRI는 자원 집약적이고 실험적으로 까다롭지만, 전임상 폐 연구를 크게 발전시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이는 지역 환기, 폐포-공역 크기 및 가스 교환 역학을 정량화하기 위한 최소 침습적이고 민감한 수단을 제공합니다. 따라서 시간이 지남에 따라 폐 생리학, 질병 진행 및 치료 개입을 평가할 수 있는 고유한 수단을 제공할 수 있습니다. 따라서 이는 조직학, 생화학 분석, 전리 이미징 양식 및 침습적 폐 역학 측정을 포함한 기존의 전임상 기술에 대한 개선을 나타냅니다. 더욱이, 소동물 ¹²⁹Xe MRI는 활발하게 발전하는 연구 하위 분야로 남아 있으며, 관련 이미징 물리학과 전임상 요구 사항의 균형을 맞추는 것은 그 자체로 상당한 연구 기회를 나타냅니다. 마지막으로, 임상 ¹²⁹Xe MRI가 더 널리 수용되고 임상적으로 사용됨에 따라 마우스에서 인간으로, 그리고 역번역 연구의 기회는 시간이 지남에 따라 계속 증가할 것입니다.

보충 그림 1: 마그네틱 휴대용 케이스의 회로도. 에나멜을 입힌 구리선, L1으로 만든 솔레노이드는 V1, 12 볼트 재충전용 밀봉한 납축 전지와 평행하게 연결됩니다. 저항 R1의 저항을 선택하여 V1 및 L1을 통과하는 전류를 제어할 수 있습니다. 패널 표시기 LED 램프, R2 및 D1도 V1과 병렬로 연결됩니다. 토글 온-오프 스위치 S1은 V1과 직렬로 연결됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 질소에 대한 인공호흡기 교정 결과. 30번의 호흡으로 출력되는 부피는 3회로 측정되었습니다. 관련 가스량을 생성하는 데 필요한 구동 압력을 결정하기 위해 선형 회귀가 수행되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 3: 인공호흡기 압력 설정 치트 시트. 각 기체의 선형 회귀에서 얻은 기울기 및 절편 결과는 방정식 S1에 사용됩니다. 이 방정식은 70% N₂ + 30% O₂ 및 해당 동물 체중에 대해 70% ¹²⁹Xe + 30% O₂ 의 가스 혼합물에 대해 이상적인 체중의 10ml/kg의 일회 호흡량을 생성하는 데 필요한 구동 압력을 결정하는 데 사용되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1 mL 주사기	fisher 과학	카탈로그 No.14-955-464	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464
10 mL 졸업 실린더	Cole-Parmer	UX-34502-69	https://www.coleparmer.com/i/cole-parmer-essentials-graduated-cylinder-glass-hexagonal-base-10-ml-2-pk/3450269?PubID=UX&persist=true&ip=no& gad_source=1& gclid=CjwKCAi A6KWvBhAREiwAFPZM7h3do -ssjascARuVviKd7V7kC5ztdIB6 _70DnMr-K3qk9RKeJ7-IrhoCeT 0QAvD_BwE
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20 G - 정맥 PFTE 카테터(비멸균)	Terumo Surflo	SROX2051CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-20-x-2inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source =google& utm_medium=google_ 쇼핑& gad_source=1& gclid= CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEsoW 87ggCkgToD_XF_UgpQBTpmN dgSNfCml6TkDKlW8k27Dq_daR itPuhoCnBQQAvD_BwE
22 G - 정맥 PFTE 카테터(비멸균)	Terumo Surflo	SROX2225CA	https://www.shopmedvet.com/product/iv-catheter-22-x-1inch?r=GSS17&p=GSS17&utm_source= google& utm_medium=google_ 쇼핑& gad_source=1& gclid =CjwKCAiA0bWvBhBjEiwAtEso W9IM6mpee6m7e-lBfR8dZhSN KYbMUs7qgEU4gYCRTW_rJAs W_lGkthoCm30QAvD_BwE
400mL 테들라 백	Jensen Inert Products	GST-001S-3507TJC	NA
60mL 주사기	fisher scientific	카탈로그 번호 14-955-461
https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955461 70% 알코올	콜-파머	UX-80024-34	https://www.coleparmer.com/i/labchem-isopropyl-alcohol-70-v-v-500-ml/8002434?PubID=UX&persist=true&ip= 아니오& gad_source=1& gclid=CjwKC AiA6KWvBhAREiwAFPZM7gGh p8g7MBHBBKadaRCAwfEMgV gna5fhYRsuXIuqoqOiToCC4fem nhoCGMEQAvD_BwE
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압력 강하 인공호흡기	부품 목록 다른 곳에 게시	NA	https://sites.duke.edu/driehuyslab/resources/
홈 디포	193682		용 PVC 파이프https://www.homedepot.com/p/IPEX-1-2-in-x-10-ft-White-PVC-SCH-40-Potable-Pressure-Water-Pipe-30-05010HD/319692959
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https://www.clippard.com/part/URH1-0402-CLT-050 진공 펌프	Cole-Parmer	UX-60062-11	https://www.coleparmer.com/i/environmental-express-diaphragm-pump-high-volume-120v/6006211?PubID=UX&persist=true&ip=no&gad _source=1& gclid=CjwKCAiA6K WvBhAREiwAFPZM7uFGwmW pRelHNFgZVvJJV09vDUVyfyG HoKeZTiFNIiVTe-05IpJJPxoCO PoQAvD_BwE
와이어 - 18 게이지	Digikey	2328-18H240-ND	https://www.digikey.com/en/products/detail/remington-industries/18H240/15202027?s=N4 IgjCBcoOwBxVAYygMwIYBsDOB TANCAPZQDa4YATPAGwgC6h ADgC5QgDKLATgJYB2AcxAB fQmAAMAFkqIQKSBhwFiZEA GZNATi0SGzNpE48BwsSErqw 6uQqV5CJSOQCsMF%2Bq11 GIVuy58QqLmss4gALbogvy4L AAEAO683LgMIkA
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