방법 논문

쥐 자궁내막 상피 줄기세포에서 쥐 자궁 오가노이드의 생성 및 특성화

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DOI:

10.3791/66928

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2024년 8월 2일

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1Meizhou Clinical Institute of Shantou University Medical College, 2Department of Pathology, Meizhou People's Hospital, 3Guangdong Engineering Technological Research Center of Clinical Molecular Diagnosis and Antibody Drugs, Meizhou Academy of Medical Sciences, Meizhou People's Hospital

이 논문에서

요약

여기에서는 쥐 자궁내막 상피 줄기세포(reESC)를 분리 및 배양하여 쥐 자궁내막 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 자궁내막 질환의 체외 연구를 용이하게 하여 유전자 편집 및 기타 세포 조작을 가능하게 합니다.

초록

자궁내막 오가노이드는 자궁내막 질환의 발병 및 병태생리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 약물 검사를 위한 플랫폼 역할을 합니다. 인간 및 마우스 자궁내막 오가노이드가 개발되었지만, 쥐 자궁내막 오가노이드에 대한 연구는 여전히 제한적입니다. 쥐가 자궁 내 유착과 같은 특정 자궁내막 병리를 더 잘 시뮬레이션할 수 있다는 점을 감안하여 이 연구는 쥐의 자궁내막 오가노이드를 확립하는 것을 목표로 했습니다. 쥐 자궁내막 상피 줄기세포(reESC)의 분리 및 배양과 쥐 자궁내막 오가노이드 생성을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 정제된 reESC 확장 배지를 사용하여 reESC를 성공적으로 분리하고 안정적으로 확장시켜 장기적인 배양 잠재력을 입증했습니다. 재ESC로 생성된 오가노이드는 호르몬 반응성을 포함하여 자궁내막의 전형적인 구조적 및 기능적 특성을 나타냈습니다. 본 연구의 결과는 쥐 자궁내막 오가노이드가 자궁내막 상피의 선구조, 세포 극성 및 기능적 특성을 유지하면서 안정적인 증식으로 장기간에 걸쳐 배양될 수 있음을 보여주었습니다. 이 새로운 쥐 유래 자궁내막 오가노이드 모델은 자궁내막 질환을 연구하고 치료 중재를 테스트하기 위한 귀중한 플랫폼을 제공하며, 다양한 포유류 종에 걸쳐 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

서론

인체에서 다재다능하고 재생되는 조직인 자궁내막은 난소 호르몬의 영향으로 주기적인 탈락, 재생, 분화를 겪는다1. 자궁내막의 이상은 자궁내막증, 자궁내막암, 불임과 같은 다양한 여성 생식계 질환과 관련이 있다2. 자궁내막에 대한 신뢰할 수 있는 연구 모델이 부족하기 때문에 이러한 질병의 발병기전, 임상적 진단 및 치료에 대한 심층적인 연구가 어려워지고 있습니다. 세포주와 동물 모델은 일반적으로 자궁내막 연구에 활용되지만, 세포주의 표현형 불안정성, 동물 모델의 종간 차이 및 기타 한계와 같은 문제로 인해 인간 자궁내막에서 복잡한 생리학적 구조와 동적 기능 변화를 복제하기 어렵습니다3.

오가노이드(organoid)는 세포외 환경에서 줄기세포를 배양하여 형성된 3차원 구조로, 자가 재생 및 자기 조직화 능력을 가지고 있습니다. 그들은 생리학적, 병리학적 조직의 구조와 기능을 모방할 수 있으며 인간 질병의 전임상 모델로 인식되고 있습니다4. 2017년, 효소 분해를 통해 얻은 단편화된 유리 자궁내막 조직을 세포외 기질 골격에 삽입한 다음 배양을 위한 특정 성장 인자와 신호 인자의 혼합물을 첨가하여 마우스 및 인간 자궁내막 오가노이드를 성공적으로 구축했습니다5. 그 결과, 체외(ex vivo ) 자궁내막 오가노이드(ex vivo endometrial organoids)는 점액 분비 및 호르몬 반응을 포함한 자궁내막 상피의 선구조, 세포 극성 및 기능적 특성을 유지하면서 장기적이고 안정적인 증식 능력을 나타내는 것으로 입증되었다6. 그러나 자궁내막 오가노이드를 형성하는 성체 줄기세포의 체외 배양은 분비선과 같은 구조적 지지를 필요로 하기 때문에 줄기세포 손실 및 계폐 배양의 어려움과 같은 문제가 발생합니다7.

현재 자궁내막 오가노이드의 배양은 조직 블록 소화 배양 방법에 의존하고 있습니다. 이전 연구에서 본 연구팀은 자궁내막 오가노이드를 구성하는 데 사용한 Y27632로 주로 구성된 1차 배양 배지를 사용하여 인간 자궁내막 상피 줄기세포를 장기간 체외에서 배양했습니다8. 이러한 성공을 바탕으로 소분자 화합물 배양 배지를 사용하여 쥐 자궁내막 조직에서 자궁내막 상피 줄기세포를 분리 및 배양하여 장기적인 체외 배양 시스템을 구축했습니다. 또한, 쥐 자궁내막 상피 줄기세포(reESC)를 활용하여 쥐 자궁내막 오가노이드를 생성했습니다. 이 모델의 개발은 쥐 모델과 함께 자궁내막 관련 질병에 대한 향후 체외 및 생체 내 연구를 향상시킬 것입니다.

프로토콜

무게가 200-250g인 7/8주 된 암컷 Sprague-Dawley 쥐 6마리가 이 작업에 사용되었습니다. 쥐들은 기후가 조절되는 동물 시설에 수용되어 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었다. 동물을 대상으로 한 모든 실험 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 제도적 지침에 따라 수행되었으며, 메이저우 인민병원 연구 윤리 위원회의 동물 실험에 대한 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다.

다음 섹션에서는 주로 Y27632, A8301 및 CHIR990217 8,9로 구성된 정제된 reESC 확장 배지(REEM)를 사용하여 쥐 자궁내막 상피 줄기세포를 분리, 계역화, 동결 및 해동하는 프로세스를 간략하게 설명합니다. REEM 제형은 10μM Y27632, 3μM CHIR99021 및 0.5μM A8301과 같은 주요 성분의 특정 농도로 농축된 무혈청 DMEM/F12를 기반으로 합니다. 구성 요소에 대한 포괄적인 세부 정보는 재료 표에서 확인할 수 있습니다. 쥐가 이소플루란 흡입으로 마취되면 그림 1에 묘사된 후속 절차를 구현해야 합니다.

1. 수술 절차

  1. 이소플루란 흡입으로 쥐를 마취합니다.
    1. 산소와 혼합된 3-5% 이소플루란으로 채워진 유도 챔버에 쥐를 넣습니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없고 오른쪽 반사 작용이 상실되어 적절한 마취를 확인하십시오.
    2. 마취가 끝나면 절차 중에 콧방울을 통해 1-3% 이소플루란 이하로 쥐를 유지합니다. 쥐가 마취 상태에있는 동안 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.
  2. 자궁 뿔이 드러나도록 낮은 복부 정중선을 절개합니다.
    알림: 모든 수술 기구는 사용 전에 멸균해야 합니다. 쥐의 수술 부위는 면도하고 소독액으로 소독합니다. 외과의는 멸균 장갑, 마스크, 가운을 착용합니다. 수술 절차는 멸균 드레이프에서 수행됩니다.
  3. 자궁 양쪽을 세로 절개를 하여 내부 자궁내막을 노출시킵니다. T10 메스 날을 사용하여 자궁 내막이 거칠어질 때까지 긁어냅니다.
  4. 수술 후 쥐를 온도와 습도 수준이 조절된 무균 및 따뜻한 회복 구역으로 옮기고 완전한 의식을 회복하고 흉골 누운 자세로 몸을 지탱할 수 있을 때까지 면밀히 모니터링합니다. 수술 후 3마리의 쥐 그룹을 별도의 우리에 따로 수용합니다. 수술 후 통증을 완화하려면 부프레노르핀(0.05-0.1mg/kg, 피하)과 같은 진통제를 투여합니다. 필요에 따라 최대 48-72시간 동안 8-12시간마다 반복합니다.

2. 조직 처리

  1. 모든 자궁 자궁 내막 조각을 3.5cm 접시에 넣고 PBS로 3번 씻습니다.
  2. 자궁 자궁 내막 단편을 37°C에서 60분 동안 1% 콜라겐분해효소 I형(0.25% 트립신/1mM EDTA로 희석) 3mL와 혼합합니다. 100μm 세포 여과기를 사용하여 소화되지 않은 조직을 여과하여 추가 배양을 위해 여과액을 분리하고 수집합니다.
  3. 추가 배양을 위해 수집된 세포를 REEM 배지의 12웰 플레이트에 파종합니다. 원하는 세포 밀도(일반적으로 1.5mL의 REEM에서 ~1-2 × 105 개 세포/웰)를 달성하기 위해 12웰 플레이트의 각 웰에 세포를 시딩하는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산합니다.
  4. 2.2단계에서 수집된 세포를 PBS로 3회 세척합니다. 초기 세척 후 300 × g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오. 비특이적 결합을 최소화하기 위해 1% BSA(소 혈청 알부민)를 함유한 PBS에 세포 펠렛을 재현탁하고 얼음에서 15-30분 동안 배양합니다.
  5. 다른 marker( 재료 표 참조)에 특이적인 1차 항체가 있는 세포를 4°C에서 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 제조업체의 지침에 따라 PBS의 항체를 1% BSA로 희석합니다.
  6. 배양 후 PBS로 세포를 2x 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다. 최종 세척 후 유세포 분석을 위해 1% BSA를 사용하여 600μL의 PBS에 세포를 재현탁합니다.
  7. 실험에 사용된 형광단에 적합한 레이저와 필터(예: FITC, PE, APC)로 기기를 구성합니다. 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC) 설정을 사용하여 파편과 세포 응집체를 제외한 살아있는 단일 세포 집단을 게이트합니다. 적절한 정렬을 보장하기 위해 염색되지 않은 컨트롤을 사용하여 유세포 분석기를 보정합니다. 염색되지 않은 대조군을 기반으로 특정 게이트를 설정하여 관심 있는 각 마커에 대한 양성 모집단을 정의합니다(임계값은 0.02%).

3. 쥐 자궁 내막 상피 줄기 세포의 장기 배양

  1. 집락 형성 분석
    참고: 이 분석은 reESC에 대한 최적의 배양 배지를 결정하는 데 도움이 되었습니다.
    1. P0 reESC를 1,000개 세포/웰의 밀도로 6-well 플레이트에 시딩하고 A8301, Y27632 또는 CHIR99021이 없는 REEM 또는 REEM에서 14일 동안 배양합니다.
    2. 배양기간 후 실온에서 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정한 후 크리스탈바이올렛 용액으로 20분 더 염색한다.
    3. 50개 이상의 세포를 포함하는 세포 클러스터의 수를 정량화합니다. 세포 클러스터의 성장을 지원하는 배지를 기준으로 배양 배지를 선택합니다.
      참고: REEM에서 특정 요인이 누락되면 reESC의 증식 능력이 감소했습니다(그림 1B, C). 이러한 결과를 바탕으로 REEM은 배양 조건을 최적화하기 위해 reESC 배양에 선호되는 배지로 선정되었습니다.
  2. 2일마다 REEM을 변경합니다. 세포가 80-90% 합류점에 도달하면 5-6분 동안 0.25% 트립신/1mM EDTA로 소화합니다.
  3. REEM에서 1:3의 비율로 세포를 계대형성합니다.
  4. 증식 분석
    1. P1, P7 및 P14 reESC를 150μL의 REEM에서 4 ×10 3 cells/well의 밀도로 96-well plate에 seed합니다.
    2. 24, 48, 72 및 96시간의 배양 후 각 웰에 10μL의 CCK-8 시약을 첨가한 다음 37°C에서 2시간 배양합니다.
    3. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 확산 속도를 측정합니다.
  5. 냉동 원료 준비 및 사용
    1. 10% DMSO와 함께 REEM을 사용하여 냉동 원액을 준비합니다.
    2. 0.25% 트립신/1mM EDTA로 reESC를 수확합니다.
    3. 세포 펠렛을 냉동 원액에 1 × 106 cells/mL의 농도로 재현탁합니다. 세포 현탁액을 튜브로 옮깁니다.
    4. 튜브를 먼저 -80°C에서 동결한 다음 24시간 이내에 액체 질소로 옮깁니다.
      알림: 세포를 곧 해동하려는 경우 냉동 세포를 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관하는 것이 좋습니다.
    5. REEM을 37 °C로 예열합니다.
    6. 얼어붙은 reESC를 회수하여 37°C 수조에 1-2분 동안 담가둡니다.
    7. 해동된 reESC를 REEM에서 파종 밀도가 1 × 105 cells/well인 6-well plate로 옮깁니다.
  6. 면역형광 염색
    1. 로그 성장 단계의 reESC를 웰당 2 × 103 개의 세포 밀도로 u-Slide 8-well 플레이트에 파종하고 REEM에서 배양합니다.
    2. reESC가 90% 합류점에 도달하면 4% 파라포름알데히드로 20분 동안 고정합니다. 고정 전후에 PBS 2x로 reESC를 세척합니다.
    3. 0.2% Triton X-100으로 10분 동안 세포를 투과시킵니다.
    4. 실온에서 30분 동안 5% 소 혈청 알부민(BSA)에 희석된 30% 염소 혈청으로 세포를 차단합니다. 차단 전후에 PBS 2x로 reESC를 세척합니다.
    5. 1차 항체(anti-SSEA-1 및 anti-Cytokeratin)로 세포를 4°C에서 12시간 동안 배양합니다. 배양 후 PBS 2x로 reESC를 세척합니다.
    6. 실온에서 1시간 동안 2차 항체로 세포를 배양합니다. 배양 후 PBS 2x로 reESC를 세척합니다.
    7. 150μL의 DAPI로 세포를 대조염색하여 모든 핵을 라벨링합니다.
    8. 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 염색된 세포의 이미지를 캡처합니다.

4. reESC로부터 쥐 자궁내막 오가노이드 확립

  1. 오가노이드의 생성
    1. reESC가 70% confluence에 도달하면 5-6분 동안 0.25% trypsin/1mM EDTA로 세포를 소화합니다.
    2. 5 × 105 reESC를 500 μL의 해동된 Matrigel에 재현탁하고 12웰 플레이트에 넣습니다. 겔화(gelification)를 위해 37°C에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다.
    3. 세포-마트리겔 혼합물이 응고되면 1.5mL/웰 REEM을 추가하여 마트리겔을 덮습니다. 2-3일마다 REEM을 교체하십시오.
  2. 면역형광 염색
    1. REEM을 흡입하고 12웰 플레이트에 1mL/웰의 사전 냉각된 오가노이드 회수 용액을 추가합니다. 얼음 위에서 40-60분 동안 배양합니다.
    2. 파스퇴르 피펫과 원심분리기로 300 × g 에서 4 °C에서 3분 동안 오가노이드를 수집합니다.
    3. PBS로 오가노이드를 2-3회 헹굽니다.
    4. 4% 파라포름알데히드로 오가노이드를 20분 동안 고정하고 5% BSA를 사용하여 60분 동안 차단합니다.
      알림: 각 단계 전후에 PBS로 2회 세척하십시오.
    5. 1% BSA에 희석된 1차 항체로 4°C에서 밤새 오가노이드를 배양합니다.
    6. 실온에서 1시간 동안 2차 항체로 오가노이드를 배양합니다.
    7. 200μL의 DAPI로 오가노이드를 대조염색합니다.
    8. 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.
  3. HE 염색
    1. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 통해 오가노이드를 탈수합니다: 30분 동안 70% 에탄올; 30 분 동안 80 % 에탄올; 30 분 동안 95 % 에탄올; 100% 에탄올 2 x 30분 동안 오가노이드를 자일렌에 2 x 30분 동안 담궈 제거합니다.
    2. 투명화된 오가노이드를 60°C에서 1시간 동안 용융된 파라핀에 담그십시오. 파라핀 침투 오가노이드를 임베딩 몰드로 옮기고, 용융된 파라핀으로 몰드를 채우고, 파라핀이 응고될 수 있도록 몰드를 냉각판에 넣습니다. 파라핀이 응고된 후 금형에서 파라핀 블록을 제거하고 여분의 파라핀을 다듬습니다.
    3. 파라핀 블록을 마이크로톰에 장착합니다. 5μm 두께의 절편을 잘라 따뜻한 수조(42-45°C)에 띄워 평평하게 만듭니다. 섹션을 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮기고 슬라이드 워머에서 건조시킵니다.
    4. 슬라이드를 자일렌에 2 x 5분 동안 담궈 섹션을 분리하십시오. 일련의 등급이 매겨진 에탄올을 통해 수분을 보충하십시오 : 2 x 3 분 동안 100 % 에탄올; 3 분 동안 95 % 에탄올; 3 분 동안 70 % 에탄올; 증류수로 헹굽니다.
    5. 5 분 동안 hematoxylin으로 염색; 그런 다음 흐르는 수돗물에 5분 동안 헹굽니다. 몇 초 동안 1% 산성 알코올을 구별하십시오. 흐르는 수돗물에 5 분 동안 헹굽니다. 30 초 동안 0.2 % 암모니아 물에 파란색으로 두십시오. 흐르는 수돗물에 5 분 동안 헹굽니다. 2분 동안 에오신 염색을 합니다. 등급이 매겨진 에탄올을 통한 탈수: 1분 동안 70% 에탄올; 1 분 동안 95 % 에탄올; 100% 에탄올 2 x 1분 동안 크실렌에서 2 x 1분 동안 클리어합니다.
    6. 얼룩진 부분에 장착 매체 한 방울을 추가합니다. 그런 다음 기포를 피하면서 티슈 부분에 커버슬립을 놓습니다. 광학 현미경으로 얼룩진 부분을 관찰하십시오.
  4. 형광 염색
    1. 4.3.1단계에 설명된 대로 탈파라핀화 및 재수화를 수행합니다. 4.3.4로.
    2. 항원 회수 용액을 전자레인지에서 예열합니다. 가열된 항원 회수 용액에 슬라이드를 넣고 20분 동안 비등 이하의 온도로 유지합니다. 항원 회수 용액에서 슬라이드를 40분 동안 식힙니다. 슬라이드를 탈이온수로 5분 동안 헹굽니다.
    3. 슬라이드를 메탄올 중 0.3% 과산화수소에 10분 동안 배양하여 내인성 과산화효소 활성을 억제합니다. PBS에서 슬라이드를 3 x 5분 동안 헹구고 가습 챔버에서 실온에서 1시간 동안 차단 용액에 배양합니다. 과도한 차단 용액을 두드리되 헹구지 마십시오.
    4. 제조업체의 지침에 따라 차단 용액에서 기본 항체를 희석합니다. 희석된 1차 항체를 조직 절편에 바르고 가습된 챔버에서 4°C에서 밤새 배양합니다.
    5. PBS에서 3 x 5분 동안 슬라이드를 세척합니다. HRP-conjugated secondary antibody를 제조업체의 지침에 따라 차단 용액에 희석합니다. 희석된 2차 항체를 조직 절편에 바르고 가습된 챔버에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다. PBS에서 3 x 5분 동안 슬라이드를 세척하여 결합되지 않은 2차 항체를 제거합니다.
    6. 키트의 지침에 따라 Fluorescein Tyramide 작업 용액을 준비합니다. 작업 용액을 조직 섹션에 바르고 가습 챔버에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. PBS에서 3 x 5분 동안 슬라이드를 헹굽니다.
    7. 4.4.1단계를 반복합니다. 세 가지 항체 모두로 염색이 완료될 때까지 4.4.5로. 각 조직 섹션에 DAPI가 포함된 형광 장착 매체 한 방울을 바릅니다. 기포를 방지하기 위해 티슈 섹션 위에 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다. 슬라이드 도립 컨포칼 현미경을 검사합니다.
  5. 정량적 PCR
    1. 4.2.1단계에 설명된 대로 오가노이드를 수집합니다. 4.2.3으로. PBS를 흡인하고 제조업체의 지침에 따라 오가노이드에서 총 RNA를 추출합니다.
    2. 시중에서 판매되는 역전사 키트를 사용하여 1μg의 총 RNA에서 cDNA를 합성할 수 있습니다. 키트 제조업체의 프로토콜에 따라 q-PCR 반응을 설정합니다. q-PCR에 사용되는 프라이머 서열은 재료 표를 참조하십시오.

5. 쥐 자궁 내막 오가노이드의 장기 배양

  1. REEM을 흡인하고 1mL의 오가노이드 회수 용액을 40분 동안 첨가하여 오가노이드를 분리합니다. 오가노이드의 무결성을 유지하기 위해 얼음 위에서 배양하십시오.
  2. 배양 후 파스퇴르 피펫과 원심분리기를 사용하여 300 × g 에서 4°C에서 3분 동안 오가노이드를 수집하여 추가 처리를 위해 펠릿화합니다.
    참고: 피펫 팁을 트리밍하면 손상 없이 더 큰 오가노이드(500μm 이상)를 처리하는 데 도움이 될 수 있습니다.
  3. 펠릿화된 오가노이드를 Matrigel에서 1:2 또는 1:3의 비율로 재현탁시켜 12웰 플레이트에 포매하고 후속 배양합니다.
  4. 냉동 원액 준비: 10% DMSO가 함유된 REEM.
  5. 오가노이드를 수확하여 냉동 원액에 재현탁시킨 다음 -80°C의 냉동고에 보관하거나 장기 보존을 위해 액체 질소에 보관합니다.
  6. 얼어붙은 오가노이드를 해동하려면 37°C 수조에서 REEM을 예열하고 얼어붙은 스톡 튜브를 수조에 담궈 오가노이드를 부드럽게 해동합니다.
  7. 해동 후 오가노이드를 500μL의 Matrigel에 재현탁시켜 12웰 플레이트에 다시 포매하고 배양합니다. 단계 4.1.2를 따릅니다. 4.1.3에.
    참고: 냉동 오가노이드는 -80°C에서 더 짧은 기간 동안 보관하거나 액체 질소로 옮겨 장기간 보관하는 것이 좋습니다.

6. 선택 사항: 오가노이드를 부착 배양으로 전환

참고: 이 프로토콜은 오가노이드를 부착 배양으로 전환하여 편평 배양 reESC를 얻는 대체 방법을 언급하여 오가노이드 형태를 재구성할 수 있도록 합니다.

  1. REEM을 흡입하고 1mL의 오가노이드 회수 용액을 첨가하여 오가노이드를 분리합니다. 오가노이드의 무결성을 유지하기 위해 얼음 위에서 배양하십시오.
  2. 배양 후 파스퇴르 피펫과 원심분리기를 사용하여 오가노이드를 수집하여 300 × g 에서 4°C에서 3분 동안 펠릿화합니다.
  3. 예열된 REEM 3mL에 오가노이드를 재현탁하고 재현탁된 오가노이드를 3.5cm 접시에 옮깁니다. 2일마다 REEM 미디어를 교체하십시오.
  4. 세포가 70% 포화도에 도달하면 5-6분 동안 0.25% 트립신/1mM EDTA로 소화합니다.
  5. 4.1.1에서 4.1.3까지의 단계에 따라 reESC로 오가노이드를 재구성합니다.

7. 에스트라디올(E2) 및 프로게스테론(P4)을 사용한 오가노이드의 순차적 배양

  1. DMSO에서 E2 및 P4 의 원액을 준비합니다. 원액을 원하는 작업 농도(E2: 10nM; P4: 1 μM)를 REEM에서 사용하여 세포 독성 효과를 피하기 위해 최종 DMSO 농도가 0.1%를 초과하지 않도록 합니다.
  2. REEM의 배양 오가노이드 단계 4.1.1. 4.1.3에. 4일 동안. 배지를E2 가 보충된 REEM으로 교체하고 7일 동안 배양합니다. 오가노이드의 성장과 형태를 매일 모니터링합니다. 2-3일마다 매체를 교체하십시오.
  3. 매체를E2 및P4가 보충된 REEM으로 교체합니다. 오가노이드의 성장과 형태를 매일 모니터링합니다. 2-3일마다 매체를 교체하십시오. 7일 동안 오가노이드를 계속 배양합니다.

결과

reESC와 쥐의 자궁 오가노이드는 그림 1에 요약된 프로토콜에 따라 무게가 200g에서 250g 사이인 6마리의 암컷 Sprague-Dawley 쥐에서 확립되었습니다. 인간 자궁내막 상피 줄기세포의 장기 배양의 성공에 힘입어 REEM 제형은 주로 Y27632, A8301 및 CHIR99021로 구성되었습니다. 체외에서 reESC를 안정화하기 위해 처음에는 효소 및 기계적 기술을 사용하여 쥐 자궁내막에서 자궁내막 세포를 분리했습니다. 그림 2A 의 유세포 분석 결과, 일차 자궁내막 세포는 CD9(49.8%)를 발현하는 상피 세포의 약 50%로 구성되어 있으며, EpCAM(4.49%) 및 CD24(2.64%) 수치는 낮았습니다. reESC에 대한 SSEA-1 마커는 6.58%로 나타났으며, 내피 마커 CD31(30.9%) 및 CD45(70.3%)는 상대적으로 높았다.

그러나 REEM에서 배양하면 P1 reESC가 균일한 소용돌이 또는 다면체 형태를 나타내고 조밀한 클론 구조를 형성하게 되었습니다(그림 2D). REEM에서 개별 요인을 점진적으로 제거하면 reESC의 증식 능력이 감소하게 되었습니다. 클론 형성 분석은 reESC의 안정적인 배양에서 Y27632의 중요한 역할을 강조했습니다(그림 2B, C). 세 번째 계대에서 reESC는 SSEA-1 및 Cytokeratin의 일관된 발현을 보였으며, 이는 배양 중 1차 reESC의 성공적인 확장을 나타냅니다(그림 2F). 더욱이, reESC는 후기 계대에서도 견고하고 안정적인 증식 용량을 유지하여(그림 2E), 현재의 REEM 시스템에서 성공적인 분리 및 확장을 입증했습니다.

오가노이드 배양은 인간 자궁내막 줄기세포에서 유래한 이전에 보고된 시스템에 따라 확립되었습니다8. 3일 이내에 reESC는 중심이 비어 있는 오가노이드와 같은 구조로 빠른 자기 조직화를 보였으며, 이후 크기와 두께가 증가했습니다( 그림 3A 참조). reESC에 의한 오가노이드의 형성을 보여주는 일반적인 HE 염색 결과는 그림 3B에 나와 있습니다. 이러한 오가노이드 배양은 직접 계대성 배양과 동결-해동 주기 후에 Ki67 염색으로 나타나는 높은 세포 생존율에 의해 입증된 바와 같이 계대를 통해 지속될 수 있습니다. 또한, 10세대 오가노이드에서 HE 염색을 수행했으며, 그 결과 오가노이드 구조가 그대로 유지될 수 있는 것으로 나타났습니다( 그림 3E 참조). 또한 qPCR 결과는 Nanog, Sox2 및 Oct4가 P1 세대와 유사한 수준으로 발현되었음을 나타냅니다(그림 3F). 이 발견은 현재 시스템 내에서 오가노이드의 장기 배양 가능성을 시사합니다.

본 연구는 E2 및 P4에 대한 쥐의 자궁 유사 구조의 반응에 대한 예비 조사를 수행했습니다. 그림 4A의 면역형광 염색은 에스트로겐과 프로게스테론 수용체의 존재를 보여주었습니다. E2 보충제 후, 이러한 오가노이드는 속이 빈 구형 형태에서 더 조밀하게 채워진 내부 성장 패턴으로 전이되었습니다(그림 4C). P4에 대한 후속 노출은 조밀한 구조의 투과성을 감소시켜 궁극적으로 분해를 초래했습니다(그림 4B). 이러한 발견은 E2 가 잠재적으로 쥐의 자궁 유사 구조의 추가 분화를 유도하는 반면 P4 는 자가사멸 경로를 유발할 수 있음을 시사합니다.

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그림 1: 쥐 자궁내막 상피 줄기세포와 쥐 자궁 오가노이드를 확립하는 데 사용되는 절차. 약어 : SD = Sprague-Dawley. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: in vitro에서 쥐 자궁내막 상피 줄기세포의 생성 및 장기 배양. (A) 쥐 자궁내막에서 양성 세포의 비율을 보여주는 유세포 분석 분석. (B) 각각 A8301, Y27632 또는 CHIR99021를 포함하거나 포함하지 않은 REEM에서 클론의 결정보라색 염색. 스케일 바 = 1cm. (C) 요인이 있거나 없는 REEM의 클론 번호. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. n = 3명의 기증자(***, p<0.001). (D) 결정 바이올렛 염색이 있거나 없는 P1 쥐 자궁내막 상피 줄기 세포의 광학 현미경 이미지. (E) 통로 1, 통로 7 및 통로 14에서 쥐 자궁 내막 상피 줄기 세포의 CCK-8 분석. 오차 막대는 표준 편차를 나타내며 n = 3을 나타냅니다. (F) 사이토케라틴(Cytokeratin)과 SSEA-1의 발현을 보여주는 면역형광 분석. 약어 : REEM = reESCs 확장 매체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: in vitro 에서 쥐 자궁내막 오가노이드의 생성 및 장기 배양.(A) P1 쥐 자궁내막 오가노이드의 광학 현미경 이미지. (B) 쥐 자궁내막 상피 줄기 세포의 P1 오가노이드에 대한 H&E 염색. (C) 사이토케라틴(Cytokeratin)과 SSEA-1의 발현을 보여주는 면역형광 분석. (D) Ki67 및 SSEA-1의 발현을 입증하는 면역형광 분석. (E) P 10 랫트 오가노이드에 대한 H&E 염색. (F) P1 및 P10 쥐 자궁내막 오가노이드에서 Nanog, Sox2 및 Oct-4의 발현에 대한 qPCR 분석. GAPDH로 정규화된 표현식(n = 3, 양측 쌍을 이루지 않은 t-검정, n.s. = 유의하지 않음). 약어: H&E = hematoxylin 및 eosin. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: E2 및 P4를 사용한 오가노이드의 순차적 배양. (A) 에스트로겐 수용체, 프로게스토겐 수용체 및 SSEA-1의 발현을 보여주는 면역형광 분석. (B) E2 및 P4에서 배양된 쥐 오가노이드의 광학 현미경 이미지 개요. (C) 광학 현미경 이미지는 E2에서 7일 동안 배양한 후 속이 빈 구체가 오가노이드의 내부 구멍 내에서 조밀하게 변형되는 것을 보여줍니다. 약어: ER = 에스트로겐 수용체; PR = 프로게스토겐 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 연구에서는 쥐 자궁내막 상피줄기세포(reESC)를 분리 및 배양하는 간단한 방법을 설명하고, 인간 자궁내막 상피줄기세포를 위해 이전에 확립된 체외(ex vivo ) 시스템을 개선하였다8. 당사의 접근 방식은 Y27632, A8301 및 CHIR99021를 핵심 구성 요소로 포함하는 저분자 배양 배지를 활용하여 안정적이고 장기적인 생체 외 배양을 가능하게 합니다. 또한, reESC를 사용하여 실시간으로 쥐 자궁내막 오가노이드를 성공적으로 생성했습니다. 이 새로운 시스템은 일반적으로 조직 블록에 의존하는 현재의 자궁내막 오가노이드 배양 방법을 단순화하여 세포 계통10에 대한 명확성을 제공합니다. 중요한 것은 당사의 시스템이 세포 수준에서 유전자 편집 및 기타 조작을 용이하게 하여 특정 유전자를 발현하는 오가노이드를 생성한다는 것입니다. 또한, 이 오가노이드 시스템은 쥐 자궁내막에서 특정 유전자의 표적 녹아웃 또는 과발현을 가능하게 하여 자궁내막 상피 줄기세포의 스크리닝 및 배양을 가능하게 하여 자궁내막 오가노이드를 생산할 수 있습니다. 이 포괄적인 연구 접근 방식은 생체 내 및 생체 외 관점에서 특정 유전자 기능을 규명하여 자궁내막 상피와 관련된 질병을 조사하기 위한 길을 닦습니다.

약물 스크리닝은 오가노이드의 중요한 응용 분야입니다. 그러나 현재 오가노이드의 출처와 제조 방법은 복잡하여 약물 스크리닝 연구의 결과에 영향을 미칠 수 있는 배치 간에 상당한 변동이 발생합니다11,12. 당사의 시스템은 안정적인 체외 배양 세포주에서 유래한 오가노이드가 형성된 오가노이드 간의 차이를 효과적으로 최소화하여 실험 설정의 균일성을 향상시킬 수 있음을 보여줍니다. 또한, reESC에 의해 형성된 랫드 오가노이드는 체외에서 에스트로겐 자극에 반응하는 능력을 입증하여 형태학적 변화를 일으켜 체외 약물 스크리닝을 위한 도구로 사용될 수 있음을 시사합니다. reESC는 자궁내막 조직에서 쉽게 분리할 수 있으며 인간 자궁내막 상피 줄기세포에 비해 더 적은 수의 작은 분자로 체외에서 확장할 수 있습니다. 이러한 특성은 줄기세포의 특성, 전구세포, 분화 과정 및 미세환경 상호작용을 조사하는 데 특히 유용합니다. 중요한 것은 이 접근 방식을 원숭이, 돼지, 개와 같은 다른 포유류 종으로 외삽할 수 있어 자궁내막 생물학, 기능, 질병 및 약물 반응을 연구하기 위한 생리학적으로 더 관련성 있는 모델 역할을 하는 자궁내막 오가노이드 배양 시스템을 구축할 수 있다는 것입니다. 장점에도 불구하고 이 기술에는 한계가 있습니다. 한 가지 주요 한계는 복잡하고 가변적인 세포 외 기질인 Matrigel에 의존하여 실험 간에 불일치를 유발할 수 있다는 것입니다. 더욱이, 쥐 모델이 귀중한 통찰력을 제공하기는 하지만, 종간 차이는 여전히 존재하며, 연구 결과가 인간의 자궁내막 생리학 및 병리학으로 완전히 변환되지 않을 수 있습니다. 향후 연구는 잠재적으로 보다 명확하고 일관된 세포외 기질의 개발을 통해 그리고 다른 종에 대한 이 모델의 적용 가능성을 탐구함으로써 이러한 한계를 해결하는 것을 목표로 해야 합니다.

장점에도 불구하고 이 기술에는 한계가 있습니다. 한 가지 주요 한계는 복잡하고 가변적인 세포 외 기질인 Matrigel에 의존하여 실험 간에 불일치를 유발할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 연구의 핵심 기술은 Matrigel을 제거하는 것입니다. 부드러운 매트릭스 젤 소화제의 사용, 얼음 위의 작업 보장, 충분한 소화 시간은 성공에 매우 중요합니다. 파스퇴르 피펫의 직경이 더 크기 때문에 파스퇴르 피펫 흡인을 사용하면 오가노이드의 손상을 줄이고 매트릭스 겔의 분해를 가속화할 수 있습니다. 후속 연구에서는 다양한 세포외 기질 겔 배양 방법을 비교하여 오가노이드의 배양 및 소화 시스템을 더욱 최적화할 수 있습니다. 향후 연구는 잠재적으로 보다 명확하고 일관된 세포외 기질의 개발을 통해 그리고 다른 종에 대한 이 모델의 적용 가능성을 탐구함으로써 이러한 한계를 해결하는 것을 목표로 해야 합니다.

기존 문헌에서는 상피 오가노이드의 체외 배양 기술을 기술하고 있지만, 이 연구는 투명 세포에서 유래한 쥐 자궁내막 오가노이드를 배양하고 확장하기 위한 새롭고 간단하며 쉽게 재현할 수 있는 시스템을 제시합니다. 이러한 발전은 여성의 생식 생물학 영역에서 연구 속도를 높일 준비가 되어 있습니다.

공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

본 연구는 광동기초 및 응용기초연구재단(GuangDong Basic and Applied Basic Research Foundation, 2023A1515110760)의 지원을 받았다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항-CD15 (SSEA-1)Abcamab135377토끼, 1:200 (IHC)
항-에스트로겐 수용체 알파Abcamab32063토끼, 1:200 (IHC)
항-판 사이토케라틴Abcamab7753마우스, 1:250 (IHC)
항-프로게스테론 수용체Abcamab101688토끼, 1:200 (IHC)
항-Ki67Abcamab279653마우스, 1:250 (IHC)
A8301TargetMol909910-43-6
β-에스트라디올머크E8875
세포 계수 키트-8BeyotimeC0038
CD9BioLegend1098191:20 (FC), Pacific Blue
CD24BioLegend1018061:20 (FC), FITC
CD31BioLegend3031201:20 (FC), APC
CD45BioLegend3017031:20 (FC), PE
CHIR99021TargetMolCT99021
Cultrex 오가노이드 수확 솔루션R& D 시스템3700-100-01
Cy3 TSA 형광 시스템 키트APExBIOK1051
Cy5 TSA 형광 시스템 키트APExBIOK1052
DAPI시그마D95421 & g/mL
DMEM/F-12Invitrogen11330032
EpCAMBioLegend3698031:20 (FC), PerCP
플루오레세인 TSA 형광 시스템 키트APExBIOK1050
염소 항토끼 IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500
염소 항마우스 IgG, Alexa Fluor 555InvitrogenA-214221:500
염소 항토끼 IgG/HRP 항체APExBIObs-0295G-HRP
녹아웃 혈청 대체Invitrogen10828028
MatrigelCorning356234
PrimeScript RT 마스터 믹TakaraRR063A
프로게스테론Merck57-83-0
Sprague-Dawley rat Shanghai JieSiJie Laboratory Animals Co., LTD, 중국
SSEA-1BioLegend3230471:20 (FC), APC
TB 그린 패스트 qPCR 믹스타카라RR820A
TriZOLInvitrogen15596026CNRNA 추출
u-슬라이드 8웰 플레이트Ibidi80827
Y27632TargetMol146986-50-7
적 유전자의 qPCR 프라이머  <
strong>GenesCompanySequences
rat GAPDH F산곤 바이오GACATGCCGCCTGGAGAAAC
쥐 GAPDH R산곤 바이오AGCCCAGGATGCCCTTTAGT
쥐 Nanog FSangon 바이오GACTAGCAACGGCCTGACTCA
쥐 Nanog R 상곤 바이오CTGCAATGGATGCTGGGATA
쥐 Sox2 F산곤 바이오 테크ATTACCCGCAGCAAAATGAC
쥐 Sox2 R산곤 바이오 테크ATCGCCCGGAGTCTAGTTCT
쥐 Oct4 F상곤 바이오 테크CCCAGCGCCGTGAAGTTGGA
쥐 Oct4 R상곤 바이오ACCTTTCCAAAGAGAACGCCCA
GG
스 표

참고문헌

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